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RESOLUCIÓN OIV/OENO 351/2009
DETERMINACIÓN DE LA CAPACIDAD DE UNA PREPARACIÓN ENZIMÁTICA PARA CORTAR LAS
CADENAS DE PECTINA MEDIANTE LA MEDICION DE LA VISCOSIDAD
LA ASAMBLEA GENERAL,
Visto el artículo 2 párrafo 2 iv del Acuerdo del 3 de abril de 2001 por el cual se creó la
Organización Internacional de la Viña y el Vino,
Según propuesta de la Subcomisión « Métodos de análisis » y del grupo de expertos
«Especificidad de los productos enológicos»,
DECIDE, según propuesta de la Comisión II “Enología”, completar el capítulo II del Código
enológico internacional con las técnicas analíticas siguientes.
1. PRINCIPIO
Se pretende medir la cantidad de enzima necesaria para reducir a la mitad la viscosidad de
una disolución patrón en un tiempo determinado y a una temperatura y un pH también
determinados.
Se trata de una medición tecnológica para probar la eficacia real de la enzima en la
clarificación. Se pone de relieve la actividad pectinasa, que no puede deducirse directamente
a partir de la liberación de ácido galacturónico en el medio.
Nota
Para medir la actividad enzimática, se puede proceder de dos maneras:
- Medir el tiempo que tarda una concentración de enzima determinada para que la
viscosidad de la disolución de pectina disminuya a la mitad.
- Medir la concentración de enzima necesaria para que la viscosidad de la disolución de
pectina se reduzca a la mitad en un tiempo determinado.
Varios experimentos demuestran que, mientras el sustrato no sea un factor limitante:
- En el primer caso, el logaritmo de la viscosidad (tiempo de flujo) es inversamente
proporcional al tiempo de reacción.
- En el segundo caso, el logaritmo de la viscosidad es inversamente proporcional a la
cantidad de enzima presente en el medio.
En ambos casos, se puede determinar fácilmente el tiempo o la cantidad de enzima
necesarios para reducir la viscosidad a la mitad a partir de un intervalo elegido
cuidadosamente.
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2. CONDICIONES DE LA REACCIÓN
Medio: tampón fosfato 70 mmol/l y citrato 30 mmol/l, sustrato: pectina de manzana
esterificada al 70-75 % (por ejemplo, Sigma P 8471), diluida (10 g/l) en el tampón.
pH = 3,5
Temperatura: 30 °C
Tiempo de reacción: 15 minutos.
Pectinasa: intervalo de concentraciones que incluya 10 mg/l de peso seco de la enzima en la
muestra, por ejemplo, 0,5 mg en 50 ml de sustrato. Esta concentración corresponde a la
cantidad de enzima que puede reducir a la mitad la viscosidad del sustrato en 15 minutos en
las condiciones descritas más arriba.
3. INSTRUMENTAL
3.1 Termostato a 30 °C ±1 °C
3.2 Viscosímetro capilar (A 3.1., fig. 2) con un valor de flujo para el agua de entre 18 y 20
segundos aproximadamente (un capilar de entre 0,5 y 0,6 mm de diámetro)
3.3 Cronómetro
3.4 Balanzas de precisión (sensibilidad 0,001 g)
3.5 pHmetro
3.6 Agitador magnético y matraces
3.7 Filtros de papel (filtración rápida)
3.8 Micropipetas o jeringuillas micrométricas para volúmenes de entre 5 y 500 µL
4. SUSTANCIAS PURAS
4.1 Ácido cítrico puro (99,5 %)
4.2 Hidrogenofosfato disódico (dihidrato) puro (Na2HPO4·2H2O) (99,0 %)
4.3 Pectina de manzana esterificada al 70-75 % y de una pureza superior al 90 % (ej. Sigma
P 90)
4.4 Agua destilada o desionizada
4.5 Hidróxido de sodio puro (98 %)
4.6 Ácido clorhídrico puro (11,5 M) (33,5 %)
4.7 Pectinasa (cuya actividad se va a medir)
5. SOLUCIONES
Se debe homogeneizar cada solución antes de su utilización
5.1 Hidróxido de sodio (2 M)
Pesar 80 g de hidróxido de sodio puro (4.5). En un matraz aforado de 100 ml, disolver
completamente con agua desionizada (4.4) y dejar enfriar antes de enrasar.
5.2 Ácido clorhídrico (2 M)
En un matraz aforado de 100 ml lleno hasta la mitad de agua desionizada, diluir la cantidad
necesaria de ácido clorhídrico puro (4.6) para obtener una disolución final 2 M (concentración
una vez enrasada).
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5.3 Tampón fosfato 47 mmol/l y citrato 53 mmol/l (pH 3,5)
5.3.1 Poner 800 ml de agua desionizada (4.4) en un matraz aforado de 1000 ml.
5.3.2 Pesar 11,22 g de ácido cítrico (4.1).
5.3.3 Pesar 8,30 g de hidrogenofosfato disódico (dihidrato) puro (Na2 HPO4·2H2O) (4.2).
5.3.4 Añadir ambas sustancias al matraz de 1000 ml sin dejar de remover.
5.3.5 Mezclar hasta que se disuelvan completamente.
5.3.6 A temperatura ambiente, ajustar el pH a 3,50 ±0,05 con hidróxido de sodio 2 M (5.1) o
ácido clorhídrico 2 M (5.2), dependiendo del pH inicial.
5.3.7 Enrasar con agua desionizada (4.4). Mezclar.
Caducidad: 8 días a temperatura ambiente.
5.4. Sustrato: pectina de manzana (4.3)
5.4.1 Colocar un vaso de precipitados de 400 ml en un baño María a 40 °C ±3 °C sobre un
agitador.
5.4.2 Añadir 250 ml de tampón de pH 3,5 (5.3), medido con exactitud, al vaso de
precipitados.
5.4.3 Mantener una agitación suave a 40 °C.
5.4.4 Pesar 2,500 g ±0,01 g de pectina (4.3).
5.4.5 Añadir la pectina lentamente y con agitación intensa.
5.4.6 Continuar con la agitación suave a 40 °C durante 60 minutos más.
5.4.7 Parar el agitador y enfriar a 30 °C ±3 °C.
5.4.8 Filtrar en papel de filtro rápido (3.8) si fuera necesario (formación de grumos).
Caducidad: 24 horas a temperatura ambiente.
5.5 Disolución de pectinasa a 100 g/l en peso seco (4.7)
5.5.1 Pesar 2,50 g ±0,01 g de pectinasa en polvo o granulado.
5.5.2 Transferir a un matraz aforado de 25 ml.
5.5.3 Enrasar con tampón de pH 3,5 (5.3).
5.5.4 Mezclar durante 20 minutos en un agitador magnético.
Filtrar con papel si la enzima se presenta sobre un material insoluble.
5.5.5 Si la preparación enzimática es líquida, utilizarla directamente.
Caducidad: 4 horas a temperatura ambiente.
6. MEDICION
6.1 Disponer el viscosímetro en el baño María a 30 °C o utilizar los medios necesarios para
que la medida de la viscosidad se realice a 30 °C.
6.2 Medir la viscosidad de la disolución tampón de pH 3,5, es decir, el tiempo que tarda en
recorrer la longitud comprendida entre las dos marcas del viscosímetro (to). En un capilar de
0,5-0,6 mm de diámetro, to debe ser del orden de 20 segundos.
6.3 Medir el tiempo de flujo de la disolución de pectina (10 g/L) o Tp, que debe ser del orden
de 200 segundos o más.
6.4 Preparar una serie de 4 matraces aforados con 50 ml de pectina (10 g/L) y ponerlos al
baño María (30 °C).
6.5 En el primer matraz, añadir 5 µL de la disolución de la enzima (100 g/L) y mezclar.
Cada 15 minutos se añaden sucesivamente en los demás matraces 15 µl, 35 µL y 100 µL de
la disolución enzimática (100 g/L) y mezclar.
6.6 Cronometrar el tiempo de flujo de las distintas disoluciones exactamente 15 minutos
después añadir la enzima.
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7. REPRESENTACIÓN GRÁFICA DE LOS VALORES OBTENIDOS
Restar to (tiempo de flujo del tampón) a los tiempos de flujo obtenidos.
Preparar una gráfica que represente la variación del logaritmo del tiempo de flujo en función
de la concentración de la enzima.
Debe haber al menos tres puntos alineados que correspondan a las disoluciones más
concentradas. En caso contrario, se utiliza una disolución enzimática más diluida, por ejemplo
con una concentración de 50 g/l o incluso de 10 g/l.
8. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Calcular la ecuación de la recta de regresión que pasa por los tres puntos alineados:
T=ax+b
Deducir la concentración (C) de enzima necesaria para que la viscosidad de la disolución de
pectina se reduzca a la mitad (Tp - to)/2, o lo que es lo mismo T0,5.
9. EJEMPLOS
9.1 Determinación de la concentración de enzima necesaria para que la viscosidad de la
disolución de pectina se reduzca a la mitad (Tabla 1)
Tiempo de flujo del tampón to = 19,3 s
Tabla 1:
Vol (µl) de enzima
(100g/l) / 50 ml de
pectina
Concentración
(g/l)
Tiempo de
flujo (s)
Tiempo
corregido (s)
Log. del
tiempo
corregido
210,7 (Tp – to)
0
0
230 (Tp)
5
0,01
190
170,7
25
0,05
107
87,7
100
0,2
32,8
13,5
500
1
23,8
4,5
Tiempo corregido = tiempo de flujo – tiempo de flujo del tampón de pH 3,5
* valor descartado
ecuación de la recta de regresión (fig. 3)
y = –5,8366x + 2,2844
2,32
2,23
1,94
1,13
0,65*
(Tp - to) /2 = 105 s
Log 105 = 2,02 → C = (2,28–2,02)/5,84 = 0,044
Es decir, hacen falta 0,044 g/l de enzima para reducir a la mitad la viscosidad de una
disolución de pectina de manzana de 10 g/l, a 30 °C y en 15 minutos.
Podemos concluir que, en 15 minutos y con 1 g/l de enzima, la viscosidad de la disolución de
pectina disminuye hasta casi desaparecer.
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Log temps d'écoulement
Log del tiempo de flujo
2,4
2,2
2
1,8
1,6
1,4
y = -5,8366x + 2,2844
1,2
1
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
Enzym (g/l)
e (g/l)
Enzima
Fig. 1. Disminución de la viscosidad de una disolución
de pectina en función de la concentración de la
enzima.
9.2 Reducción de la viscosidad de una disolución de pectina de 10 g/l en función del tiempo
de reacción a 30 °C de una enzima a 0,1 g/l de concentración. (fig. 2) - A título informativo
El tiempo de flujo del tampón es de 19,6 segundos.
Tabla 2:
Tiempo de
reacción
(mn)
Tiempo
de flujo
(s)
Tiempo de flujo
corregido*
(s)
Logaritmo del
tiempo de flujo
0
170 (Tp)
150,7 (Tp – to)
2,18
11,5
101,4
82,1
1,91
15,6
86
66,7
1,82
21,08
72,8
53,5
1,73
29
59,83
40,53
1,61
40,31
48,79
29,49
1,47
57
40,08
20,78
1,32
90
32,25**
12,95
1,11
167
26,25**
6,95
0,84
* Tiempo de flujo corregido
** Valores descartados dado que la cantidad de pectina se convierte
en un factor limitante.
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2,2
2,1
140
Log
tiempo
de flujo
Logdel
temps
d'écoulement
Tiempod'écoulenent
de flujo (s) (s)
Temps
160
120
100
80
60
40
20
0
0
50
100
1,9
1,8
1,7
y = -0,0197x + 2,1546
1,6
1,5
150
0
tem ps de réaction (m n)
Tiempo de reacción (min)
Fig. 2. Evolución de la viscosidad de una
disolución de pectina de 10 g/l en función del
tiempo de reacción de una enzima a una
concentración de 0,1 g/l y a 30 °C.
2
10
20
30
tem
de réaction
(m n)
Tiempo
de ps
reacción
(min)
Fig. 3. Evolución de la viscosidad de una
disolución de pectina de 10 g/l en función del
logaritmo del tiempo de reacción de una
enzima a una concentración de 0,1 g/l y a
30 °C.
Interpretación de los resultados
Según los valores de la tabla 2 hacen falta 13,3 minutos de reacción (T/2) para reducir a la
mitad la viscosidad de la disolución de pectina de 10 g/l a 30 °C.
A partir de la recta de regresión de la figura 3:
Log 75,35 = 1,877
T0/2 = (2,1545 – 1,877)/0,0197 = 14,1 minutos
10. BIBLIOGRAFIA
Bertrand A. Détermination de la capacité d'une préparation enzymatique de type
polygalacturonase a couper les chaînes pectiques par la mesure de la viscosité OIV FV 1260
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