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ISOENZIMAS CONCEPTO DE ISOENZIMAS Las isoenzimas (isozimas) son formas moleculares múltiples de una enzima. Catalizan la misma reacción, pero sus propiedades cinéticas (Vmax y Km), físico-químicas e inmunológicas son diferentes. Generalmente están constituidas por mezclas de diferentes clases de cadenas polipeptídicas íntimamente asociadas. Una forma de regulación metabólica muy importante que tienen los organismos es a través de la utilización de las isoenzimas. La distribución de las mismas puede variar de un tejido a otro, por ejemplo la piruvato kinasa de mamífero, que cataliza el tercer paso limitante en la glucólisis, tiene dos isoformas: la hepática (L) y la muscular (M). Las propiedades catalíticas de la isoforma L son reguladas negativamente por la acción de distintas hormonas, como por ejemplo el glucagón, mientras que la forma M no lo es, así cuando el requerimiento de glucosa por el resto del organismo es grande, la glucólisis en el hígado se detiene rápidamente. En algunos casos hay simultáneamente isoenzimas diferentes dentro de una misma célula, por ejemplo las malato-deshidrogenasas de mitocondria y de citosol. En otros casos se cambia de una isoenzima a otra con el paso del tiempo, así algunas enzimas de la glucólisis en el feto son diferentes de las mismas enzimas en el adulto. Es interesante destacar que en células de ciertos tumores cancerosos aparecen de nuevo formas fetales de determinadas enzimas. El estudio de las isoenzimas ha tomado mucho auge en los últimos tiempos, debido a que el aumento de algunas de ellas en sangre periférica (LDH, creatinfosfoquinasa y fosfatasa alcalina) ha sido aplicado al diagnóstico y pronóstico de ciertas enfermedades ISOENZIMAS DE LA LACTATO DESHIDROGENASA Nombre sistémico: L-lactato:NAD+ oxidoreductasa (código: 1.1.1.27) La LDH cataliza la siguiente reacción: Piruvato + NADH + H+ L-lactato + NAD+ En determinadas condiciones de concentraciones y tiempo la cantidad de piruvato transformado en lactato es directamente proporcional a la actividad de LDH. La enzima no tiene especificidad estricta por el sustrato pues puede actuar sobre otros α-ceto o α-hidroxiácidos estructuralmente similares al pirúvico (por ejemplo sobre el α-cetobutírico). Página 1 Tampoco es estricta su especificidad por la coenzima, pues puede utilizar también el NADPH, aunque las velocidades de reacción son mucho menores. A pH 7,3 - 7,8 el equilibrio de la reacción está desplazado hacia el lactato, pero a pH más alcalino (pH 8,5 - 10,0) el equilibrio se desplaza hacia el piruvato; entonces, la reacción puede ocurrir en cualquiera de los dos sentidos, dependiendo del pH y de la concentración de los sustratos que se encuentren presentes. La LDH es una enzima que abunda en hígado, músculo esquelético y eritrocitos; también se encuentra en menor cantidad en corazón, riñón y aún menos en páncreas y pulmón. Existen dos genes que codifican dos polipéptidos diferentes: M (Muscle, músculo) y H (Heart, corazón). Estos monómeros se combinan formando los tetrámeros activos (PM 134.000). Se han podido separar por electroforesis nativa en geles de poliacrilamida 5 isoenzimas de LDH las cuales están conformadas como se muestra en el siguiente esquema: % de la LDH total (suero normal) H-H H-H ó H4 LDH1 23,4 ± 3 LDH2 44,0 ± 4 LDH3 25,0 ± 1,5 LDH4 6,0 ± 2 LDH5 2,0 ± 1 H-H H-M ó H3M H-H M-M ó H2M2 H-M M-M ó HM3 M-M M-M ó M4 Como las isoenzimas LDH1 y LDH5 tienen una conformación proteica diferente, cada una presenta propiedades distintas. Tienen diferente estabilidad a la desnaturalización por temperatura (LDH1 es estable a 65oC por 30 min y LDH5 es lábil al calor y al frío) y diferente resistencia a varios agentes químicos inhibidores. También difieren en su movilidad electroforética: LDH1 es de migración rápida y LDH5 es la más lenta, mientras que LDH2, LDH3 y LDH4 tienen migraciones intermedias, como se muestra en la Figura 1. Página 2 Lugar de siembra Suero Normal LDH 1 LDH2 LDH3 LDH4 (+) LDH5 (-) Figura 1 Las isoenzimas de la LDH tienen diferente afinidad por los sustratos (especialmente por el piruvato) y coenzimas. Por ejemplo la LDH1 tiene un Km elevado para el piruvato, la Vmax a la cual lo reduce es baja y además resulta inhibida por un exceso de éste, mientras que LDH5 tiene un Km muy bajo para el mismo sustrato y la Vmax a la cual lo reduce es elevada. Las otras isoenzimas tienen propiedades intermedias entre las LDH1 y LDH5 y se parecerán más a una o a otra dependiendo de que tengan mayor proporción de monómero H o M. Estas características cinéticas son muy importantes pues se relacionan con la función metabólica que estas isoenzimas cumplen en los diferentes tejidos. Es de interés el hecho de que la proporción de las diversas isoenzimas de LDH varíe de un tejido a otro, y por lo tanto los perfiles electroforéticos de las isoenzimas de la LDH de distintas fuentes son diferentes. En los órganos con alto consumo de oxígeno y pequeña resistencia a la anoxia (músculo cardíaco y cerebro) y en eritrocitos, predominan las isoenzimas LDH1 y LDH2, mientras que en otros órganos con mayor reserva de glucógeno (hígado y músculo esquelético), hay preponderancia de las LDH4 y LDH5, indicando su adaptación a un determinado tipo de metabolismo energético (Figura 2). En mamíferos en estado de reposo, el tipo de sustancia y la proporción que utiliza cada órgano como fuente de combustible es variable. El cerebro depende exclusivamente de la glucosa sanguínea mientras que el corazón obtiene el 70% de su energía a partir de los ácidos grasos y el 30% restante la aportan cuerpos cetónicos, glucosa sanguínea y también el lactato (participación de las LDH1 y LDH2). El músculo esquelético y el hígado obtienen el 90% de su energía a partir de los ácidos grasos. Página 3 Durante una actividad física intensa, el cerebro consume aproximadamente la misma cantidad de glucosa y oxígeno que en estado de reposo mientras que el requerimiento energético del músculo esquelético y el corazón Músculo esquelético aumenta considerablemente. En los dos primeros minutos de Acetil-CoA esta actividad el miocardio obtiene esa energía a partir de glucosa tanto Ciclo de los ácidos tricarboxílicos Glucógeno ADP ATP Piruvato Glucosa NAD + NADH NADH sanguínea como de sus propias NAD LDH 5 Lactato reservas de glucógeno, y aunque el + Cadena respiratoria O2 H 2O consumo de oxígeno aumenta unas cuatro veces, un 50% del piruvato Glucógeno Hígado Glucosa formado se convierte en lactato ADP (participación de la LDH1 y LDH2), Este cambio metabólico temporal le ATP NAD hasta metabolismo que para adapte lograr su CICLO DE CORI + permite al corazón obtener la energía necesaria Piruvato NADH LDH 5 Lactato un incremento en el consumo de ácidos grasos. El músculo Figura 2 esquelético utiliza (en los primeros segundos) la energía almacenada como creatinafosfato hasta que se activa la degradación del glucógeno muscular para aportar glucosa como fuente de energía. Aunque en este tejido durante una actividad intensa el consumo de oxígeno aumenta unas veinte veces, gran parte del piruvato formado se convierte en lactato (participación de la LDH5 y LDH4). Este cambio metabólico le permite a este órgano obtener energía extra utilizando la glucólisis anaeróbica. El pasaje de piruvato a lactato es una vía de recuperación de NAD+ para que la glucólisis continúe. La mayor parte del lactato formado en esta etapa es recuperado lentamente y reconvertido a glucosa en el hígado mediante un proceso que requiere el aporte de energía (ver Figura 2). Aquí la oxidación de lactato a piruvato (participación de la LDH5 y LDH4) es favorecida por la baja relación NADH/NAD+ y la casi inexistencia de piruvato intracelular. El corazón también puede consumir parte del lactato producido por el músculo esquelético, favorecido por la cinética de sus isoenzimas. La LDH se localiza en el citoplasma de las células de los distintos órganos y por lo tanto cuando se produce un daño celular es fácilmente liberada al medio, desde donde pasa al plasma, alterando la cantidad y relación de las isoenzimas de LDH presentes en la sangre. La mayor parte de la LDH del suero normal proviene de la degradación fisiológica de los eritrocitos y plaquetas. Página 4 Las determinaciones de las isoenzimas de LDH ayudan al diagnóstico y pronóstico de algunas patologías. Así por ejemplo, analizando las isoenzimas por electroforesis es posible diferenciar una hepatopatía de un infarto de miocardio, cosa que no puede hacerse midiendo LDH total por su inespecificidad diagnóstica. En un suero normal hay una relación: LDH1 (25%) —————— ≈ 0,5 LDH2 (50%) mientras que en un infarto de miocardio, en las primeras 24 horas, la relación LDH1/LDH2 se va acercando a la unidad por aumento de la LDH1, sin que la actividad de LDH total aumente significativamente. Luego, cuando el enfermo evoluciona satisfactoriamente, esta relación tiende a volver a la normalidad. Un aumento en el valor de esa relación durante la convalecencia, indica un reinfarto. La aparición o el aumento de LDH5 en el suero está indicando un compromiso hepático, o un daño en el músculo esquelético. En los infartos pulmonares está elevada la LDH3 dando valores similares a la LDH2, con disminución de LDH1. ISOENZIMAS DE CREATINA QUINASA La Creatin Kinasa (CK), también conocida como Creatin FosfoKinasa (CPK) es una enzima, presente en varios tipos de tejido muscular. Se ubica en el citolplasma de las células y cataliza la siguiente reacción: Fosfocreatina + ADP ATP + creatina La creatina-fosfocinasa está compuesta de tres isoenzimas ligeramente diferentes: CPK-1 (también llamada CPK-BB) se encuentra en el cerebro y los pulmones; CPK-2 (también llamada CPK-MB) se encuentra en el corazón; CPK-3 (también llamada CPK-MM) se encuentra en el músculo esquelético. En el organismo humano existen básicamente dos tipos de músculos; los lisos y los estriados. El movimiento de cualquier parte del cuerpo tiene lugar gracias al trabajo de los músculos estriados, el cual consiste en un proceso de contracción y relajación, que requiere de dos elementos esenciales: la energía y un mecanismo de control. Dicho mecanismo de control lo constituyen los impulsos nerviosos que provienen desde el cerebro, y que llegan a los músculos a través de las terminaciones nerviosas que conectan con éstos. Por su parte, la energía requerida para Página 5 la realización del proceso se genera en una reacción química en la que interviene precisamente la CPK. La molécula de ATP constituye en sí misma el reservorio para el almacenamiento de la energía necesaria para que se lleve a cabo la contracción muscular. Durante la contracción se desprende de una molécula de ATP uno de sus tres fosfatos, el cual es captado por la creatina. Así el ATP se convierte en una molécula de Adenosina-Difosfato o ADP, mientras la creatina, más el fosfato que captó se convierte en Fosfocreatina o CP. Con dicho desprendimiento, la energía química almacenada en la molécula de ATP se convierte en energía mecánica que hace que se mueva la cabeza de los filamento de miosina y actina, y volviendo inmediatamente después a su posición original. Es entonces que la Fosfocreatina (CP) libera su fosfato, donándolo a la molécula de ADP en presencia de la enzima CPK, convirtiéndose nuevamente en ATP. Por su parte, la creatina ya utilizada se transforma en creatinina que es liberada al torrente sanguíneo para ser luego será eliminada por vía renal. Así, la función de la CPK es la hidrólisis de la Fosfocreatina para que ésta done su fosfato a la molécula de ADP, convirtiéndola en ATP, y haciendo de ésta un nuevo reservorio de energía química, lista para ser convertida en la energía mecánica necesaria para el proceso de contracción del músculo. Debido a la distribución diferencial de las 3 isoformas de la CK en el organismo, es posible la utilización de las mismas en el diagnóstico de enfermedades que afectan a distintos órganos. Debido a que la isoenzima CPK-1 se encuentra principalmente en el cerebro y los pulmones, una lesión a cualquiera de estas áreas puede incrementar sus niveles en suero, como por ejemplo una lesión cerebral por trauma o accidente cerebrovascular, infarto pulmonar o crisis epiléptica. Los niveles de CPK-2 aumentan de tres a seis horas después de presentarse un ataque cardíaco. El aumento en los niveles de CPK-2 también pueden deberse a lesiones por electricidad o inflamación del músculo cardíaco debido generalmente a virus (miocarditis). La CPK-3 es la isoenzima más abundante dentro de la CPK total en personas sanas; los niveles de CPK-3 por encima de lo normal generalmente son un signo de lesión o fatiga muscular y pueden deberse a: distrofia muscular, miositis (inflamación de músculo esquelético), ejercicio extenuante, etc. Para diferenciar la distintas isoformas que presentan aumentos en sangre periférica en algunas de estas patologías, se utiliza un método que se basa en la inhibición específica de las subunidades CKM con anticuerpos monoclonales anti CK-M. Los anticuerpos inhiben tanto la isoenzima MM como las subunidades M correspondientes a CK-MB. Las subunidades B se determinan mediante el empleo de un sistema reactivo con N-acetilcisteína como activador, adicionado de anticuerpos Página 6 monoclonales anti CK-M. Luego por diferencia con la determinación de CK total, se puede conocer cual es la isoforma predominante. PARTE EXPERIMENTAL OBJETIVOS DEL PRÁCTICO En extractos de diferentes tejidos de rata, se medirá la actividad de LDH total y CK total por métodos espectrofotométricos. Se determinarán además las proteínas de las muestras para expresar las actividades como actividades específicas de cada extracto. OBTENCIÓN DE LOS EXTRACTOS DE TEJIDOS Los extractos de los diferentes órganos de rata (hígado, corazón, cerebro, músculo esquelético, riñón y pulmón) serán preparados en buffer Tris-HCl 80 mM (pH 8), utilizando una relación de volumen del buffer/peso del tejido de 10/1. El tejido será homogeneizado a alta velocidad en frío, y luego la suspensión será centrifugada a 8.500 X g durante 10 minutos a 4oC. El sobrenadante, enriquecido en la fracción citosólica de la célula, será alicuotado y guardado a -20oC hasta el momento de su utilización. DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS DE LOS EXTRACTOS DE TEJIDO Para la determinación de las proteínas se utilizará la técnica de Bradford, un método colorimétrico de valoración cuantitativa de las proteínas. A la muestra se añade un reactivo que forma un complejo coloreado con las proteínas, siendo la intensidad de color proporcional a la concentración de proteínas, según la ley de Lambert-Beer. Este es un método rápido, sensible, relativamente barato y específico. Fundamento: Se basa en el uso de un colorante, el Coomassie Blue Brilliant G-250, que en medio ácido reacciona con las proteínas dando un color azulado. Mediante estudios de espectrofotometría, se pudo comprobar que el colorante presenta tres especies activas que poseen distintos espectros de absorción de acuerdo a la carga de cada una. Estas especies son dependientes del pH y se interrelacionan mediante el siguiente equilibrio: Anión Neutro Catión (595 nm) (650 nm) (470 nm) Azul Verde Rojo Página 7 O sea que a medida que se desprotona la forma catiónica, se generan las formas neutra y aniónicas, cambiando el espectro de absorción del colorante. La especie que posee capacidad de unirse a las proteínas es la aniónica, por lo tanto el equilibrio mostrado arriba se desplaza hacia la izquierda a medida que se va formando el complejo aniónproteína. Especificidad: La especificidad del método ha sido demostrada por la ausencia de respuesta a una amplia gama de compuestos incluyendo aquellos con nitrógeno en sus moléculas. Compuestos como el ácido policitidílico, poliadenílico, poliguanílico, adenina, cafeína, etc. dieron menos de 0,01 unidades de absorbancia (U.A.). También se ensayaron aminoácidos libres como ser arginina, lisina, triptofano, alanina, glicina y ácido aspártico, no dando ninguno de ellos color significativo (0,006 U.A.) Los requerimientos estructurales que permiten la unión del colorante a las proteínas están todavía siendo estudiados, pero las últimas evidencias muestran que una proteína debe tener un peso molecular alto (por lo menos tres veces el del colorante), y grupos funcionales básicos y aromáticos. Al igual que para todos los otros métodos de dosaje de proteínas, excepto el de Kjeldalh, ésta es la principal desventaja. Como interferente se pueden citar al SDS y ciertos flavonoides. Curva Patrón (Standard) Reactivos: 1) Solución patrón: se preparara una solución de albúmina 0,1 mg/ml 2) Reactivo para desarrollar color: Coomassie Blue Brilliant G-250.....................60 mg Ácido perclórico 3%........................................1 Litro Se disuelve el CBBG-250 en 50 ml de etanol y se lleva a 1 litro con ácido perclórico al 3%, se deja reposar 2 horas por lo menos y se ajusta la absorbancia hasta 1,3-1,5 a 495 nm con agua Protocolo Tubo Albúmina H2O Reactivo B - 0,8 ml 0.2 ml 1 0,1 ml 0,7 ml “ 2 0,2 ml 0,6 ml “ 3 0,3 ml 0,5 ml “ 4 0,4 ml 0,4 ml “ 5 0,5 ml 0,3 ml “ muestra 0,1 ml 0,7 ml “ Página 8 Abs 595 nm Se calcula la concentración final en mg/ml de las soluciones patrones preparadas y se mide absorbancia a 595 nm de las mismas. Se grafica la curva de calibración. Se calcula la concentración de proteínas presentes en los extractos mediante la siguiente fórmula: Abs V 1 mg 595 nm reaccion concentrac ión _ proteína m V dil ml alicuota donde “m” es la pendiente de la recta y “dil” la dilución del extracto de órgano empleada. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LDH TOTAL La actividad de la enzima será determinada de dos maneras: a) Siguiendo la oxidación del cofactor NADH (cambio de absorbancia a 340 nm). b) Siguiendo la reducción de una sal de tetrazolio, acoplada a la reacción enzimática (cambio de absorbancia a 570 nm). a) -Determinación de la actividad LDH en base a la oxidación del NADH Fundamento: Se basa en la diferencia entre los espectros de absorción del NAD+ ó NADP+ (oxidados) y el NADH Abs. NAD ó NADPH (reducidos). Como se muestra en la Figura + 3, la forma reducida absorbe entre 320 y 380 nm, con un máximo a 340 nm, mientras que la forma oxidada no absorbe en esta zona. Se mide la variación de NADH absorbancia a 340 nm o a 366 nm (dependiendo del espectrofotómetro con que se cuente) durante el curso de la reacción enzimática. Habrá un incremento de la absorbancia si la reacción transcurre en el sentido: 250 300 350 400 Longitud de onda (nm) Figura 3 NAD+——› NADH o una disminución si transcurre en el sentido: NADH ——› NAD+ En el práctico se medirá la actividad de la LDH en el sentido de la formación de NAD+ (disminución de la absorbancia a 340 ó 366 nm). Reactivos: Página 9 Se utilizará un equipo de reactivos que incluye: - Buffer fosfato 50 mM (pH 7,5), conteniendo piruvato 0,6 mM. - Un vial conteniendo NADH desecado Reactivo de trabajo: Disolver el contenido del vial en 3 ml del buffer (estable 24 h a 4oC) Técnica: En un tubo de lectura de espectrofotómetro colocar: 1 ml de reactivo de trabajo Termostatizar en un baño a la temperatura en que se medirá la reacción (puede ser 25oC, 30oC ó 37oC, dependiendo del baño termostatizado disponible). Luego agregar: 30 µl muestra Mezclar y disparar el cronómetro, leer inmediatamente la absorbancia de partida (aproximadamente 1 si se lee a 340 nm ó 0,3 si se lee a 366 nm - esto está dado por la cantidad de NADH) y medir luego la absorbancia cada 30 segundos durante 4 minutos. Graficar absorbancia en función del tiempo. En el rango de la curva en que la disminución de la absorbancia es directamente proporcional al tiempo [velocidad inicial (vo)], determinar la disminución de absorbancia/minuto (∆A). Página 10 Advertencias: 1) Después de cierto tiempo, la cinética de la reacción ya no es lineal, por eso la lectura de la absorbancia debe ser efectuada lo más rápidamente posible después de la adición de la muestra, y seguirse durante 3 - 4 min. como máximo. 2) Si la velocidad de descenso de la absorbancia es mayor de 0,10 por minuto, diluir la muestra 1/5 o 1/10 con solución fisiológica y repetir el ensayo, para poder trabajar en la zona lineal de la reacción (vo). Hay que recordar que el valor obtenido en estos casos deberá ser multiplicado por 5 o por 10 según la dilución que se haya realizado, para informar el valor correcto de la actividad enzimática. 3) Si la actividad de la LDH es muy alta, todo el NADH puede ser consumido antes de la primera lectura y entonces no se observa ninguna variación en la absorbancia Por lo tanto hay que repetir la reacción diluyendo la muestra. b) - Determinación de la actividad LDH en base a la reducción de una sal de tetrazolio acoplada a la reacción enzimática Fundamento: La reacción se mide en el sentido de la oxidación del ácido láctico y reducción del NAD+. El NADH formado reduce a la sal de tetrazolio (MTT) a un formazán coloreado soluble que absorbe a 570 nm. El transporte de electrones desde el NADH al MTT es mediado por el PMS (phenazine metasulphate): LDH Lactato + NAD+ ——————› Piruvato + NADH + H+ NADH + PMSox ——————› NAD+ + PMSred PMSred + MTTox ——————› PMSox + MTTred (violeta de formazán) En condiciones adecuadas (vo) la formación del formazán coloreado será directamente proporcional a la actividad de LDH. Se lee la absorbancia del formazán a 570 nm en función del tiempo. Reactivos: Buffer Tris-HCl (80 mM - pH 8): Página 11 9,69 g de Tris, se disuelven en 300 ml de agua destilada, se ajusta el pH con ácido clorhidrico 1 N y se completa a 1 litro con agua destilada. Solución de L-lactato (10 mM): 144 mg de L-lactato se disuelven en 15 ml de agua destilada Solución de NAD+: 1 mg de NAD+ se disuelve en 1 ml de buffer (guardar refrigerado). MTT (Dimetiltiazolyl difenyltetrazolium): 9 mg de MTT se disuelven en 15 ml de agua destilada (guardar al abrigo de la luz). PMS (Phenazine metasulphate): 18 mg de PMS se disuelven en 15 ml de agua destilada (guardar al abrigo de la luz). Técnica : En dos tubos de lectura de espectrofotómetro rotulados como blanco (B) y muestra (M) colocar: Reactivos Blanco Muestra 1- Buffer Tris 0,66ml 0,63 ml 2- NAD+ 0,033 ml 0,033 ml 3 - Muestra --- 0,03 ml 4 - MTT 0,1 ml 0,1 ml 5 - PMS 0,1 ml 0,1 ml Preincubar a 30oC durante unos 5 minutos y luego agregar 6 - L-lactato 0,1 ml 0,1 ml Cada minuto se lee la absorbancia a 570 nm, contra el blanco, manteniendo los tubos incubados a 30oC. Las lecturas se realizan hasta que la reacción deje de estar en vo. El blanco varía con el pH, temperatura y tiempo de incubación. Se calcula luego la variación media de absorbancia/min (∆A) en el rango de vo. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE CK TOTAL FUNDAMENTOS DEL METODO El método usado en el práctico está basado en el siguiente esquema de reacción: creatina kinasa Página 12 creatina fosfato + ADP creatina + ATP hexoquinasa ATP + glucosa ADP + glucosa-6-P G-6-PDH glucosa-6-P + NADP+ gluconato-6-P + NADPH + H+ En el práctico se medirá la actividad de la CK en el sentido de la formación de NADPH (aumento de la absorbancia a 340 ó 366 nm). Reactivos: Se utilizará un equipo de reactivos que incluye: - Buffer imidazol pH 6,7 - Un vial conteniendo todos los sustratos necesarios desecados Reactivo de trabajo: Disolver el contenido del vial en 2.5 ml del buffer (estable 24 h a 4oC) Técnica: En un tubo de lectura de espectrofotómetro colocar: 0.5 ml de reactivo de trabajo Termostatizar en un baño a la temperatura en que se medirá la reacción (puede ser 25oC, 30oC ó 37oC, dependiendo del baño termostatizado disponible). Luego agregar: 10 µl muestra Mezclar y disparar el cronómetro, leer inmediatamente la absorbancia de partida y medir luego la absorbancia cada 30 segundos durante 4 minutos. Graficar absorbancia en función del tiempo. En el rango de la curva en que el aumento de la absorbancia es directamente proporcional al tiempo [velocidad inicial (vo)], determinar la variación de absorbancia/minuto (∆A). CALCULO DE LOS RESULTADOS Generalmente a la actividad de una enzima se la expresa en Unidades Intenacionales (UI) y se la refiere a la cantidad de muestra que la contiene. Una UI es la cantidad de enzima capaz de transformar un micromol (µmol) de sustrato por minuto. Entonces con el valor de cada una de los ∆A y el del coeficiente de extinción molar (E) de acda una de las sustancias utilizadas en el práctico se calculan los µmoles de sustrato transformados por minuto: ∆A ∆A = c . E . l ——› c = —— E.l Página 13 E para NADH y NADPH es 6,23 . 103 L . mol-1 . cm-1 a 340 nm E del MTT es 1,7 . 103 L . mol-1 . cm-1 l = trayecto óptico de la cubeta en cm, =1 Luego se realiza la transformación de moles a µmoles y finalmente se lo expresa por litro de muestra (teniendo en cuenta la alícuota de muestra tomada y el volumen final de la mezcla de incubación), de lo cual resulta lo siguiente: V c . —— . 106 = UI/L de muestra [µmol/L.min] v V= volumen total del ensayo, en ml v= volumen de la alícuota de muestra, en ml Para expresar los resultados como actividad específica de la enzima, se realizará el cálculo teniendo en cuenta el valor de proteínas obtenido para cada extracto. Para ello se utilizará el ∆A obtenido de las curvas y se lo relacionará con la concentración de proteínas usada para realizar la medición (teniendo en cuenta la alícuota de muestra tomada y la concentración de proteínas de las diferentes muestras por el método de Lowry) Activiadad específica = ∆A x E.l 1 Valic x Conc. prot. muestra Página 14 x 106 [µmol/mg prot]