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ISSN 0568-3076
agron. 17(2): 7 - 24, 2009
DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES DE PLANTAS DE ORIGEN
BIÓTICO
Óscar Adrián Guzmán-Piedrahita*, Jairo Castaño-Zapata* y Bernardo Villegas-Estrada*
*
Programa de Maestría en Fitopatología, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad de Caldas, Manizales. Correo electrónico: [email protected]
Recibido: 18 de enero; aprobado: 28 de abril de 2009.
“Diagnóstico de enfermedades de plantas es un arte. Progreso es el resultado de práctica. Es similar al
progreso obtenido jugando golf o tocando violín, asumiendo que uno tiene aptitud para ello. Se requiere
mucho tiempo desarrollar destreza. No hay sustituto para la experiencia”.
Rubert B. Streets, SR; 1972
RESUMEN
Las enfermedades de las plantas ocasionadas por
microorganismos infecciosos como hongos, bacterias,
nematodos y protozoarios flagelados, y por agentes
como virus y viroides, son el producto de la interacción
dinámica entre un patógeno, un hospedante y el medio
ambiente. El primer paso para el manejo correcto de una
enfermedad es conocer su verdadera etiología. Se conocen
más de 1.300 especies de hongos que causan enfermedades
en los principales cultivos alimenticios, además de 4.105
especies de nematodos fitoparásitos, 950 especies de
virus y 30 de viroides, y alrededor de 100 especies de
bacterias fitopatógenas. Existen varios procedimientos
para determinar la etiología de enfermedades de plantas
tales como, la observación directa del agente causante al
microscopio compuesto, técnicas inmuno-enzimáticas,
bioquímicas y moleculares, y microscopía electrónica. Para
un diagnóstico correcto, se debe disponer de laboratorios
adecuados de Diagnóstico Fitosanitario, a los cuales deben
enviarse muestras frescas y representativas de plantas que
presenten síntomas típicos de la enfermedad, para poder
conocer con exactitud su etiología. El diagnóstico es el
fundamento técnico y científico para adoptar medidas de
manejo rápido y oportuno.
Palabras clave: bacteria, etiología, hongos, nematodos,
patógeno, viroides, virus.
ABSTRACT
DIAGNOSIS OF PLANT DISEASES OF
BIOTIC ORIGIN
Plant diseases caused by living infectious microorganisms
such as fungi, bacteria, nematodes, and flagellate protozoa,
and by agents such as viruses and viroids, are the result of
the dynamic interaction between a pathogen, a host and the
environment. The first step for the correct management of
a plant disease is to know its real etiology. More than 1.300
fungi species which cause diseases in the main foodstuff are
well recognized along with 4.105 phytoparasite nematodes
species, 950 viruses and 30 viroids species, and around 100
phytopathogenic species of bacteria. There exists a variety
of procedures to determine the etiology of diseases in
plants including direct observation of the causing agent
through the compound microscope, immune-enzymatic,
bio-chemical and molecular techniques, and electron
microscopy. In order to carry out a correct diagnosis,
adequate Phytosanitary Diagnosis Laboratories must be
available where fresh and representative plant samples, with
typical symptoms of the disease, can be sent in order to
know exactly their etiology. The diagnosis is the technical
and scientific fundamental to take measures for a quick
and appropriate management.
Key words: bacteria, etiology, fungi, nematodes,
pathogen, viroids, viruses.
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Óscar Adrián Guzmán-Piedrahita, Jairo Castaño-Zapata y Bernardo Villegas-Estrada
INTRODUCCIÓN
Las enfermedades de las plantas son ocasionadas
por microorganismos infecciosos o bióticos
como hongos, bacterias, nematodos y protozoarios
flagelados, y por agentes infecciosos como virus
y viroides (Figura 1); así mismo, por factores no
infecciosos o abióticos, como alteraciones edafoclimáticas y toxicidad por plaguicidas, entre otros
(Agrios, 2005).
La enfermedad es una interacción dinámica entre
un patógeno, un hospedante y el medio ambiente,
la cual causa en los hospedantes cambios anormales
de tipo fisiológico y morfológico. Por consiguiente,
enfermedad no es una propiedad del hospedante, sino
un producto de la interrelación del hospedante y el
patógeno, bajo un ambiente específico. La enfermedad
Figura 1.
A.
C.
puede considerarse también como las respuestas
visibles e invisibles de las células y tejidos de las
plantas a un agente infeccioso o factor no infeccioso,
que resulta en cambios adversos en la forma,
función o integridad de la planta, interfiriendo con
la formación, traslocación o utilización de nutrientes
minerales y agua, de tal manera que la planta afectada
cambia en apariencia y rinde menos que una planta sana
de la misma variedad (Agrios, 2005).
La etiología se define como la determinación del
agente causante de una enfermedad. Para tal fin, se
debe recolectar una muestra fresca adecuada de los
tejidos de las plantas que presenten los síntomas
típicos de la enfermedad, que permita realizar un
análisis correcto, para poder establecer las medidas
de manejo apropiadas (Agrios, 2005).
Enfermedades del plátano con sus respectivos microorganismos o agentes
infecciosos. A. Sigatokas negra y amarilla (Mycosphaerella fijiensis “arriba” y M.
musicola “abajo”), B. Rayado del banano (Banana streak Badnavirus, BSV), C.
Moko (Ralstonia solanacearum, raza 2) y D. Cabeza negra (Radopholus similis).
(Fotos: Autores).
B.
D.
Diagnóstico de enfermedades de plantas de origen biótico
IMPORTANCIA DE LAS
ENFERMEDADES
Existen aproximadamente 350.000 especies de plantas,
de las cuales unas 3.000 son empleadas como alimento
por los humanos, constituyendo el 99% de suministro
de su alimento. De estas, solo 300 especies son
ampliamente cultivadas y solo 11 cultivos: arroz, maíz,
trigo, sorgo, caña de azúcar, papa, yuca, frijol, patata,
banano y coco, constituyen el 95% del suministro de
alimentos a la humanidad (Castaño-Zapata, 1994). Más
de 1.300 especies de hongos causan enfermedades en
estos cultivos (Farr et al., 1989).
Se conocen 26.646 especies de nematodos, distribuidas
entre especies de vida libre (10.681); y parásitos de:
invertebrados (3.501), vertebrados (8.359) y plantas
(4.105) (Hugot et al., 2001). Estos últimos causan
pérdidas anuales del 11 y el 14% en cultivos de
importancia como las leguminosas, granos, banano,
yuca, coco, remolacha azucarera, caña de azúcar, papa,
hortalizas y varios frutales, equivalentes a US$80
billones año­¹ (Agrios, 2005).
De las 2.290 especies de virus descritas por el Comité
Internacional de Taxonomía de Virus, se conocen
alrededor de 950 que afectan plantas, equivalente al
41% (ICTV, 2010). Se reportan alrededor de 30 viroides
que afectan cultivos importantes como: papa, tomate,
lúpulo, aguacate y cítricos (Hammond & Owens, 2006).
Se conocen cerca de 1.600 especies de bacterias,
de las cuales 100 causan enfermedades en plantas,
equivalente al 16% (Agrios, 2005).
agron. 17 (2): 7 - 24, 2009
Las enfermedades de importancia económica producen
pérdidas en los cultivos en una o varias formas:
1. Reducción en el rendimiento de las
plantas. Se puede generalizar que las enfermedades
de las plantas reducen el potencial de producción en
los países desarrollados en un 15 y 20% y aún hasta
en el 100%, como el caso del Tizón tardío de la
papa [Phytophthora infestans (Mont.) de Bary], que en
9
1845 causó la destrucción de los cultivos de papa en
Irlanda. En Ceilán, hoy Sri Lanka, en 1868, la Roya
del café (Hemileia vastatrix Berk. & Br.) fue responsable
de la substitución del cultivo de café por el té, cacao
y otros, debido a la imposibilidad de cultivar café en
aquel país. En Brasil, esta enfermedad causa pérdidas
que oscilan entre el 20 y 30% (Zambolim & Ribeiro do
Vale, 1997). En Colombia, la Secadera del maracuyá
[Nectria haematococca Berk. & Broome, anamorfo
Fusarium solani (Mart.) Sacc.], en el Valle del Cauca,
causó pérdidas del 90 y 100% (Torres et al., 2000).
En musáceas, la reducción en el rendimiento por el
nematodo Barrenador (Radopholus similis Cobb.) puede
llegar hasta un 80% (Moens et al., 2003); mientras
que en soya, pérdidas del 10 y 30% son ocasionadas
por el nematodo Quiste (Heterodera glycines Ichinohe)
(Davis & Tylka, 2000). La enfermedad viral de mayor
importancia que afecta al frijol en América Latina es
el Mosaico dorado amarillo del frijol (Bean golden
yellow mosaic Begomovirus, BGYMV), el cual causó
pérdidas entre el 40 y el100% en Argentina y Bolivia
(Morales, 2000). El Moko del plátano y banano
causado por Ralstonia solanacearum E. F. Smith raza
2, causó pérdidas del 100% en la década del setenta
en el departamento del Caquetá en donde destruyó
20.000 ha de plátano (Belalcázar et al., 2004).
2. Reducción de la calidad del producto
cosechado. La Roña del maracuyá [Cladosporium
herbarum (Pers.:Fr.) Link] ha tenido incidencias del
79 y el 100% (Torres et al., 2000), que demeritan la
calidad de los frutos.
3. Contaminación del suelo. El aumento
de inóculo de un patógeno en el suelo lo torna
eventualmente inapropiado para la siembra de
un cultivo susceptible en particular y requiere de
medidas directas de manejo, como tratamiento
químico del suelo, u otra medida como rotación de
cultivos (Castaño-Zapata, 1994). Un buen ejemplo
en pasifloráceas es N. haematococca, que produce
clamidosporas, las cuales pueden sobrevivir en el
suelo por varios años. Los nematodos Quiste de
la soya y la papa (H. glycines y Globodera rostochiensis
10
Óscar Adrián Guzmán-Piedrahita, Jairo Castaño-Zapata y Bernardo Villegas-Estrada
(Wollenweber) Behrens, respectivamente) producen
quistes que les permiten sobrevivir por más de 20
años en el suelo (Perry & Moens, 2006).
4. Pérdidas de poscosecha. En el departamento
de Boyacá se ha registrado la Antracnosis de la curaba
[Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & H. Schrenk,
anamorfo Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. &
Sacc. en Penz] como responsable del 50% del ataque
de frutos (Jácome & Barreto, 1984).
5. Formación de productos tóxicos. Los
patógenos de plantas, especialmente hongos, producen
toxinas como las aflatoxinas causadas por especies
de Aspergillus P. Mich. ex Link:Fr., en maíz y otros
productos almacenados. Por ejemplo, la aflatoxina
B1 es producida por tres especies estrechamente
relacionadas: A. flavus Link:Fr., A. parasiticus Speare y
A. nomius Kurtzman, Horn & Hesseltine. Se conocen
unas 300 toxinas fúngicas (Carrillo, 2003).
6. Incrementos en el costo de producción.
Los patógenos causan enfermedades que resultan en
reducción del rendimiento y calidad, lo cual provoca un
incremento en los costos de producción como el caso
de la Sigatoka negra (Mycosphaerella fijiensis Morelet) del
banano, cuyos costos de control varían entre US$700
y 900 ha/año, representando cerca del 13,8% de los
costos totales de producción del cultivo y el 46% de los
costos de los agroquímicos (Chica et al., 2004).
7. Costos de manejo. El costo de la aspersión
semanal de un cultivo de maracuyá con productos
cúpricos para manejar la Bacteriosis [Xanthomonas
campestris (Pammel) Dowson pv. passiflorae Pereira]
se refleja posteriormente en un incremento de
precio al mayorista, al intermediario y, finalmente, al
consumidor. A mayor número de aspersiones, mayor
es el incremento en los costos de manejo (Botero et
al., 2006; Castillo & Granada, 2005).
8. Predisposición a otras enfermedades.
Según Paul Sorauer (1905), los patógenos afectan
plantas solamente si el medio ambiente las predispone
para que se tornen susceptibles. Algunos factores
bióticos o abióticos pueden causar pérdidas indirectas,
predisponiendo a las plantas a ataques subsecuentes
por otros patógenos como los nematodos, que
atacan las raíces de plantas y permiten la entrada
de otros microorganismos (Castaño-Zapata, 1994).
El proceso de colonización de Fusarium oxysporum
Schlechtend.:Fr., en presencia de Meloidogyne javanica
(Treub) Chitwood, ha sido estudiado de tal manera
que hay mayor colonización de los tejidos de las
plantas por Fusarium, a medida que aumenta el
número de individuos de Meloidogyne (Perry et al.,
2009).
Las enfermedades que afectan las plantas pueden ser
causadas por diferentes microorganismos o agentes,
los cuales se describen a continuación.
Hongos. Esta palabra proviene del griego sphongos,
que significa esponja (Harper, 2010). Las hifas miden
entre 2 y 10 µm de diámetro hasta varios centímetros
de longitud. La mayoría de las especies están
compuestas por filamentos tubulares que pueden ser
cenocíticos o septados, cuyo conjunto se denomina
micelio. Los componentes principales de las paredes
celulares de los hongos son celulosa, pectona y
quitina, y se distinguen por la carencia de clorofila,
posesión de núcleos y nucléolos con membranas
bien definidas (eucariotas). Su reproducción se realiza
mediante esporas de origen sexual o asexual (CastañoZapata, 1994).
Bacterias. Palabra que deriva del griego bakterion, y
significa bastón pequeño cuyo tamaño oscila entre 1
y 2 mm (Harper, 2010). Estos microorganismos son
unicelulares, cuyo material genético (ADN) carece de
una membrana celular y por ello no está organizado
en un núcleo (procariotas). Sus células consisten
de citoplasma que contienen ADN y ribosomas
pequeños (70S). El citoplasma está rodeado por
una membrana y una pared celular. La mayoría de
bacterias fitopatógenas tienen forma de bastón o
bacilo y poseen flagelos, usualmente en los polos, y
fimbrias o pili (Vidaver & Lambrecht, 2004; Agrios,
2005).
Diagnóstico de enfermedades de plantas de origen biótico
Mollicutes. Nombre proveniente del latín mollis
(suave) y cutis (piel), son bacterias que carecen
de pared celular pero están provistas de una
membrana celular trilaminar. Incluyen los llamados
anteriormente fitoplasmas y espiroplasmas, que son
organismos celulares más pequeños con un tamaño
de 0,3-1,2 µm de diámetro y se autorreplican (Fletcher
& Wayadande, 2002).
Nematodos. Provienen de los vocablos griegos
nema (hilo) y eidés u oidos (con aspecto de), son
definidos como animales filiformes con cuerpo sin
segmentos y más o menos transparentes, cubierto
de una cutícula hialina, la cual está marcada por
estrías o anillos; son redondeados, poseen boca y
carecen de apéndices; aunque las hembras adultas
de algunos géneros son abultadas, como Meloidogyne
Goeldi y Heterodera Schmidt (Siddiqi, 2000; Perry &
Moens, 2006). La mayoría son microscópicos, con
una longitud entre 300 y 1.000 mm, y entre 15 y 35
mm de diámetro (Agrios, 2005; Luc et al., 2005; Perry
& Moens, 2006).
Los nematodos parásitos de plantas tienen un estilete
hueco, también llamado lanza, pero hay algunos con
estilete sólido modificado. El estilete es usado para
perforar o penetrar las células de la planta, y a través
de él se extraen los nutrientes desde la célula (Luc et
al., 2005; Perry & Moens, 2006).
11
Virus. Proviene del latín ‘virus’, que significa veneno.
Los virus son agentes infecciosos compuestos de
una o varias moléculas de ácido nucleico (ADN o
ARN de cadena sencilla o doble) cubiertas por una
o varias capas de proteína o lipoproteína capaces de
replicarse en las células de un hospedante susceptible
(Hull, 2009). Su tamaño oscila entre 20 y 70 nm de
diámetro para los virus isométricos y 150 a 2.200
nm de longitud para virus con forma de varilla. La
traducción del genoma (para producir proteínas) o
transcripción y replicación (para producir más ácido
nucleico) ocurre dentro de las células del hospedante
usando su “maquinaria” metabólica (Adams &
Antoniw, 2010).
Viroides. Proviene de la unión de la palabra latina
“virus” que significa veneno y del sufijo “oid” que
significa imperfecto o incompleto. A diferencia
de los virus, los viroides son moléculas de ácido
ribonucleico (ARN) de cadena sencilla que ocasionan
enfermedades en varias especies de plantas. Sus
genomas son de 239 a 401 nucleótidos de ARN
circular de cadena sencilla; además, no codifican
proteínas (Hammond & Owens, 2006).
PROCEDIMIENTOS PARA EL
DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES
DE PLANTAS
Protozoarios flagelados. Provienen de las raíces 1. Clave para el diagnóstico de agentes
griegas proto (primero) y zoo (animal), y del latín causantes de enfermedades
agron. 17 (2): 7 - 24, 2009
flagellum, que significa flagelo, pero más largo y capaz
de realizar movimientos (RAE, 2010).
Los protozoarios flagelados son microorganismos
unicelulares con uno o más flagelos largos y delgados
en algunos o todos los estados de su ciclo de vida.
Los fitopatógenos pertenecen al género Phytomonas
(Kinetoplastida: Trypanosomatidae); tienen cuerpo en
forma de huso con extremos aguzados, entre 12 y 18
µm de longitud y 1 a 2,5 µm de ancho y con un flagelo
de 12 a 18 µm de largo; su núcleo está situado a un tercio
del extremo anterior; se multiplican en el floema, y son
transmitidos por hemípteros fitófagos (Agrios, 2005).
Una secuencia para iniciar el diagnóstico consiste en
seguir la clave de French y Hebert (1982):
A1 Manchas y Chancros
B1 Signos de patógenos visibles al
microscopio estereoscópico.
C 1 Signos de hongos: Realice
preparaciones microscópicas de las
estructuras con tinción cuando sea
apropiado………………………I
12
Óscar Adrián Guzmán-Piedrahita, Jairo Castaño-Zapata y Bernardo Villegas-Estrada
C2 Signos de bacterias (exudado
o manchas húmedas): Realice
preparaciones microscópicas para
observar flujo bacterial en campo
oscuro, luego efectúe tinción de
Gram….……………………….II
B2 Ausencia de signos de patógenos.
C1 Incube la muestra en cámara
húmeda y luego regrese a
A1……………………………...III
C 2 Mosaicos, moteados u otros
síntomas virales posibles.
C3 Decoloración y otros síntomas
de desnutrición.
A2 Marchitez
B1 Sistema radical afectado.
C1 Presencia de nematodos o sus
síntomas.
C2 Pudrición radical, tratar como A1
B2 Sistema vascular descolorado. C1 Prueba de flujo bacterial en agua,
luego efectúe tinción de Gram .….II
C2 Ausencia de flujo, hacer corte
para observar hongos…………...I
A3 Pudriciones
B1 Tallo o raíz, tratar como A1
B2 Órganos de reserva (tubérculos, raíces)
C1 Realice preparaciones
microscópicas y obser ve para
hongos, con tinción cuando sea
indicado…………………………I
C 2 Hag a pre paraciones para
obser var bacterias en campo
oscuro (microscopio de contraste
de fase), luego realice la tinción de
Gram…………………………..II
C3 Inocule tejidos sanos con los
afectados cuando la pudrición es
avanzada; luego observe como C1
y C2…...……………………......IV
2. Secuencia para realizar un diagnóstico
correcto
Para realizar un diagnóstico correcto se recomienda
seguir la secuencia propuesta por Rubert Streets (1972):
a) Identifique la planta hospedante, adicionando
el nombre de la variedad.
b) Síntomas en el campo. Utilice su propia
información o use la proporcionada por quien
envía la muestra.
c) Condiciones de cultivo. Información del
tipo de suelo, prácticas de riego, fertilización y
aplicación de plaguicidas.
d) Síntomas en detalle. Observación de manchas,
añublo foliar, pudrición de semillas o frutos,
cancros en las ramas o tallos, pudrición o agallas
en las raíces, etc.
e) Observación en aumento bajo. Observación
con una lupa de alto aumento en el campo o un
estereoscopio en laboratorio de la superficie de las
lesiones o tejidos muertos; esto permitirá observar
la presencia de esporas, cuerpos fructíferos de
hongos o exudados bacteriales.
f) Observación en aumento alto. Observación
a través del microscopio compuesto para detallar
las estructuras anteriores.
g) Aislamiento. Aislar el microorganismo
sospechoso en condiciones asépticas de laboratorio.
h) Patogenicidad. Si el patógeno observado es
el causante de la enfermedad, pero no existen
informes previos, entonces se debe recurrir a los
postulados de Robert Koch, establecidos en 1876:
1. Debe haber una asociación constante
entre el organismo y el hospedante
enfermo.
Diagnóstico de enfermedades de plantas de origen biótico
2. Se debe aislar el patógeno sospechoso
del hospedante enfermo y obtenerlo
en cultivo puro.
3. Se debe inocular un hospedante sano
con el cultivo puro del organismo
sospechoso y reproducir los síntomas
típicos de la enfermedad.
4. Se debe reaislar el patógeno en
cultivo puro a partir del hospedante
inoculado y enfer mo y sus
características deben ser exactamente
iguales a las observadas en el cultivo
obtenido en el segundo postulado.
i) Diagnóstico. Si el patógeno en observación es
identificado con manuales especializados, o cuando
los postulados son demostrados, el patógeno
aislado es el responsable de la enfermedad.
j) Recomendaciones. Después de diagnosticar
correctamente el agente causante de la enfermedad,
el agricultor se preguntará: ¿qué puedo hacer
acerca de la enfermedad? y ¿cuál es el manejo?
Especificar la mejor medida de manejo de
cada enfermedad está fuera del alcance de
cualquier libro. La respuesta correcta a estos
interrogantes se obtiene consultando referencias
selectas, fundamentalmente a través de la buena
experiencia que tenga el fitopatólogo, pues como
lo expresó Rubert Streets, “no hay sustituto para
la experiencia”.
Si no se encuentra algún organismo o agente asociado
a la enfermedad, se asume que es causada por un
factor ambiental, el cual puede interferir con las
funciones fisiológicas normales de las plantas.
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3. Técnicas inmuno-enzimáticas
Constituyen una metodología rápida para identificar
patógenos de plantas. El ensayo de inmuno-absorción
ligado a una enzima (ELISA, por sus siglas en inglés)
es el más ampliamente usado por su especificidad,
simplicidad y bajo costo. Esta técnica que se realiza
13
en platos de poliestireno, utiliza la habilidad de los
anticuerpos (inmunoglobulinas) producidos por
el sistema linfático de un vertebrado de sangre
caliente (conejos, ratones, etc.) para reconocer
un antígeno específico (proteínas, epítopes o
determinantes antigénicos), es decir, el agente,
sustancia o microorganismo extraño inyectado en
el torrente sanguíneo del mismo; por lo tanto, la
reacción será específica de cada anticuerpo para su
respectivo antígeno (Dewey, 2002).
4. Técnicas bioquímicas y moleculares
La identificación de bacterias se ha basado en
combinaciones de pruebas fisiológicas y bioquímicas,
mientras que la identificación de hongos se ha
realizado con base en características morfológicas,
tales como tipo de espora, forma y color. Sin
embargo, en los últimos 40 años, los avances en
la bioquímica microbial y biología molecular han
permitido la expansión de los métodos de diagnóstico
y procedimientos de identificación de diferentes
patógenos de plantas (Bridge, 2002).
La detección de actividades fisiológicas y bioquímicas
se realiza fundamentalmente sobre medios sólidos o
líquidos, y se basa en la apariencia del crecimiento
o un cambio de color. Estas pruebas involucran la
adición de sustratos apropiados al medio, junto con
un sistema que permite la detección bien sea de su
degradación o de uno de los productos asociados con
ella (Bridge, 2002).
Las bacterias han sido identificadas por sus funciones
metabólicas, tales como su habilidad para metabolizar
ciertos sustratos mediante el sistema API (Analytical
Profile Index) para diferenciar cepas de Erwinia y
Pseudomonas. Adicionalmente, el análisis de proteínas
solubles mediante electroforesis en geles ha sido
adoptado para hongos y bacterias (Strange, 2003).
La principal herramienta de diagnóstico molecular
de microorganismos fitopatógenos es la Reacción
en Cadena de la Polimerasa (PCR, por sus siglas en
14
Óscar Adrián Guzmán-Piedrahita, Jairo Castaño-Zapata y Bernardo Villegas-Estrada
inglés) basada en los genes ribosomales. La PCR
es rápida, económica y permite producir un gran
número de copias de moléculas de ADN vía catálisis
enzimática, para mostrar diferencias en secuencias
de genes del ARN ribosomal (rARN) o ADN
mitocondrial (mADN) (Luc et al., 2005; Atkins &
Clark, 2004). Para el caso de agentes fitopatógenos
como los virus de ARN, es necesario sintetizar
una cadena de ADN complementario (cADN) por
medio de la enzima transcriptasa reversa (RT) como
paso previo. Esta técnica tiene muchas variaciones
como la PCR “anidada” que consiste en dos PCR
sucesivas cuyos amplicones de una reacción son
usados como molde de la siguiente. Otra variación
incluye la captura de partículas virales mediante
anticuerpos llamada Inmunocaptura PCR (IC-PCR)
cuando las concentraciones de partículas virales son
muy bajas (Harper et al., 1999; Webster et al., 2004).
La detección conjunta de diferentes virus a partir de
la combinación de cebadores específicos para cada
uno de ellos es una variación de esta técnica llamada
RT-PCR múltiple (Ito et al., 2002).
Hibridación molecular mediante sondas: Se
basa en la capacidad que tienen los ácidos nucleicos
de desnaturalizarse y volverse a unir con hebras
complementarias en condiciones apropiadas en
membranas de nylon o nitrocelulosa (Conci, 1999).
Las técnicas de hibridación más utilizadas son
el “Southern blot”, la cual detecta secuencias
específicas de ADN, el cual se aísla del tejido mediante
extracción y separación por electroforesis, se purifica
y se digiere (fragmenta) con enzimas de restricción
específicas. Northern blot” es una variante del
método anterior en el que se usa el ARN como objeto
de estudio (Corvalán, 2002). “Dot blot” y “Slot blot”
son procedimientos similares al “Northern blot”
con la diferencia de que las muestras son colocadas
directamente sobre la membrana de nitrocelulosa
(Dijkstra & De Jager, 1998; Hull, 2002).
ARN de cadena doble (cdARN): Es utilizada para
el diagnóstico de virus fitopatógenos, asociados con la
infección de virus de ARN monocatenario (csARN),
ya que estos durante su proceso de replicación
forman una cadena doble intermedia con un ARN
complementario que sirve de molde para la síntesis
de ARN mensajero (Fisher, 2008).
Mapas de restricción: Esta técnica se basa en que
de una molécula de ADN se pueden obtener siempre
los mismos fragmentos cada vez que sea expuesta
a una enzima de restricción particular. Una de las
técnicas más utilizadas es el análisis de polimorfismos
de longitud de fragmentos de restricción (RFLP,
por sus siglas en inglés), en la cual se determinan las
variaciones en la constitución genética de la población
(polimorfismo genético), demostrando diferencias
entre los individuos en cuanto al número y longitud
de los fragmentos producidos (Granner, 1992).
5. Técnicas de microscopía de luz
La microscopía de luz permite la observación
de inclusiones virales, es decir, la acumulación
de partículas virales, proteínas, material celular
modificado o mezcla de estos. Las inclusiones
deben observarse a magnificaciones de 1.000X con
el objetivo 100X. Se hacen cortes de los tejidos
epidérmicos de hojas de muestras frescas y se ponen
en contacto con soluciones de tintes como, por
ejemplo, calcomina naranja o Azure A. Esto permite
la clasificación de varios géneros de virus (Christie &
Edwardson, 1977; Conci, 1999).
6. Técnicas de microscopía electrónica
Permite la observación del macerado de tejidos de
plantas infectadas con virus, con el fin de detectar
y medir el tamaño de partículas virales a través del
Microscopio Electrónico de Transmisión, usando la
técnica de tinción negativa con acetato de uranilo.
También con la ayuda de antisueros específicos se
aplica la técnica de inmuno-microscopía electrónica
(ISEM, por sus siglas en inglés) para atraer partículas
virales a las rejillas de observación en caso de
Diagnóstico de enfermedades de plantas de origen biótico
existir relación antigénica (Morales et al., 2006). El
microscopio electrónico permite magnificar entre
200.000 y 600.000 veces el tamaño de las partículas.
o base del tallo. Por consiguiente, la muestra debe
corresponder al sitio real de ataque de la enfermedad
(Figura 2F).
IMPORTANCIA DE LAS MUESTRAS
EN EL DIAGNÓSTICO CORRECTO DE
ENFERMEDADES
Revise la presencia de lesiones, agallas, cancros
(heridas) u otros síntomas que puedan tener las raíces,
tallos, ramas o frutos, para escoger las partes de la
planta que presenten los síntomas característicos de
la enfermedad (Figura 2G).
Para un buen diagnóstico no basta con observar
los síntomas; en lo posible, debemos apoyarnos
en laboratorios de Diagnóstico Fitosanitario, los
cuales requieren del envío de muestras frescas,
representativas de plantas enfermas, o partes de ella
como: raíces, tallos, hojas, flores o frutos (Dees et al.,
1986; Hansen & Wick, 1993; ICA, 1996; Putnam,
1995) (Figura 2A), que presenten los síntomas
típicos de la enfermedad, para poder conocer con
exactitud la etiología de la enfermedad bajo estudio
(Ocampo et al., 1994; Horst, 2001). El diagnóstico
es el fundamento técnico-científico para adoptar
medidas de manejo rápido y oportuno (ICA, 1996).
Una muestra óptima debe mostrar el tejido de la
planta realmente enfermo (Figura 2B).
La muestra colectada debe tener tejido sano y
enfermo, es decir, todos los estados de desarrollo de
la enfermedad, mostrando los síntomas iniciales y
finales de la enfermedad (Figura 2C).
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15
La cantidad de material vegetal recolectado debe ser
adecuado, que permita analizar el tejido enfermo
y dejar muestras para análisis posteriores. Si las
plantas son de porte bajo o arbustos, seleccione al
menos cinco plantas completas con el problema e
incluya una planta con apariencia normal o sana para
comparación (Figura 2D); si son árboles, seleccione
únicamente la(s) parte(s) del árbol que tenga(n) los
síntomas, es decir, hojas, partes del tallo, flores o raíces
afectadas (Figura 2E).
Las hojas marchitas o necróticas no necesariamente
contienen el patógeno, debido a que puede ser el
resultado de la acción de este en el sistema radical
Si sospecha que es un hongo el que está causando
la enfermedad, cerciórese de que esté esporulando
sobre el tejido vegetal. Si cree que es una bacteria,
observe si hay marchitamiento de la planta, pudrición
de raíces o cuello de la planta o lesiones foliares sin
estructuras reproductivas (Figura 2H).
No recolecte tejidos con exceso de humedad por
lluvia, riego o rocío y tampoco en descomposición,
ya que cuando estos son empacados en cajas de
cartón, el exceso de humedad favorece el crecimiento
de microorganismos secundarios que deterioran y
contaminan la muestra dificultando el diagnóstico
(Figura 2I).
Procure tomar fotos de plantas completas con los
síntomas de la enfermedad, al igual que de plantas
sanas, y envíelas rápido al laboratorio (Figura 2J).
En plántulas y plantas de porte bajo o anual, se
recomienda extraer la planta completa con las raíces
y suelo que la rodea, luego colóquela en una bolsa
de plástico y sujeta con cinta, o envuelta en papel
periódico o caja de cartón, para evitar que el suelo
se desprenda de las raíces (Figura 2K).
En arbustos, árboles anuales, bianuales y perennes,
las raíces gruesas (primarias y secundarias) y delgadas
(terciarias y cuaternarias) NO deben ser lavadas con
agua para retirar el suelo. Estas se envuelven en papel
absorbente o toallas de papel, para luego empacarlas
en una bolsa de plástico o caja de cartón (Figura 2L).
Si los tejidos enfermos son tallos y ramas, se cortan
trozos del tejido afectado y en los extremos se puede
colocar parafina para evitar la pérdida de humedad
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Óscar Adrián Guzmán-Piedrahita, Jairo Castaño-Zapata y Bernardo Villegas-Estrada
(deshidratación). Estas muestras pueden empacarse
en sobres de manila, papel grueso parafinado o cajas
de cartón (Figura 2M).
Hojas, yemas y flores afectadas se envían secas o
sin humedad exterior, extendidas en medio de papel
toalla, servilletas, papel periódico o bolsas de papel
absorbente. Después, se pueden envolver en papel
aluminio o protegerlas dentro de bolsas plásticas,
procurando que no se dañen en el transporte (Figura
2N).
Si se trata de frutos, tubérculos y bulbos enfermos,
se seleccionan como muestra aquellos que presenten
síntomas iniciales e intermedios de la enfermedad.
Cuando se requiera, dejarlos secar al ambiente
para eliminarles el exceso de humedad y evitar
su daño. Posteriormente, se envuelven en papel
toalla, servilletas, papel periódico o bolsas de papel
absorbente; y cuando sea posible, envolverlos en
papel aluminio para luego empacarlos dentro de una
caja de cartón o bolsa de plástico (Figura 2O).
Tejidos que se sospechen están afectadas por virus
y mollicutes no deben estar muertos o demasiado
afectados; las hojas deben presentar síntomas como
amarillamientos, mosaicos, clorosis o necrosis foliar,
deformaciones y manchas anulares; las flores con
variegación y deformaciones, y los frutos con necrosis
y deformaciones (Figura 2P). El tejido vegetal se
envuelve en papel toalla, servilletas, papel periódico o
bolsas de papel absorbente. Para evitar que se dañen
deben colocarse dentro de dos láminas de cartón,
después empacarlas en papel aluminio y, luego,
en bolsa de papel. Nunca en bolsa plástica. Las
muestras de diferentes plantas deben empacarse por
separado, no deben mezclarse. Así mismo, no deben
refrigerarse ni congelarse, y preferiblemente se deben
enviar al laboratorio inmediatamente (Figura 2Q).
De un lote donde se va establecer un cultivo y
se quiere recolectar una muestra para análisis de
nematodos, las arvenses (malezas) y residuos deben
ser retiradas del sitio. Recolecte las muestras según las
condiciones de suelo, muestreando por separado áreas
de diferente topografía (plana, ondulada, pendiente),
áreas de diferente cultivo (maíz, frijol, café) y áreas
de diferente textura (arenosos, arcillosos, limosos)
(Figura 2R). La muestra debe estar conformada por
40 submuestras/ha, tomadas a la profundidad de las
raíces alimenticias (entre 5 y 30 cm) con un palín.
Para cubrir todo el terreno, la distancia entre sitios
donde se tomen las submuestras debe ser similares,
por ejemplo, cada 7 m (Dees et al., 1986) (Figura 2S).
En cultivos anuales o perennes la muestra se recolecta
del plato de 20 plantas que estén bien distribuidas
en una hectárea. En cada planta, se recolecta una
submuestra por punto cardinal (Oriente, Occidente,
Norte y Sur) a una distancia que varía según el área de
raíces en el plato del árbol (ejemplo: 0,5; 1,0; 1,5 y 2,0
m para frutales como guayabo y cítricos; 10, 20, 30 y
50 cm, para plátano y pitahaya) y a una profundidad
entre 5 y 30 cm, se toman 200 g de raíces y suelo de
cada planta, y se depositan en un balde. Después de
recolectar las 20 submuestras, se mezclan bien para
conformar una muestra compuesta de 2 kg de suelo
y raíces que se depositan en una bolsa de plástico
(Figura 2T).
CONSIDERACIONES PARA TENER
EN CUENTA DESPUÉS DE LA
RECOLECCIÓN DE LA MUESTRA
1. Evite que los tejidos se deterioren por el
calor, metiendo la muestra en una caja de
icopor con hielo, nevera o en un lugar fresco,
ya que el diagnóstico se dificulta cuando las
muestras llegan al laboratorio marchitas,
maltratadas o podridas.
2. La muestra debe ser entregada tan rápido
como sea posible al Laboratorio de
Diagnóstico (máximo en dos días). En caso
extremo, debe colocarse en un refrigerador
o en un cuarto frío, entre 4 y 8ºC, para evitar
su deterioro y enviarla al día siguiente.
3. Las muestras de suelo o raíces para análisis
de nematodos fitoparásitos deben conservar
humedad para evitar su muerte.
Diagnóstico de enfermedades de plantas de origen biótico
4. La muestra recolectada debe ir acompañada
del respectivo protocolo completamente
diligenciado. En el caso de no tener el
formato, se debe anotar en una hoja
la información general de la finca, las
Figura 2.
A.
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B.
C.
17
características principales de la muestra que
se va a procesar, los aspectos generales del
cultivo, las condiciones edafo-climáticas, los
diferentes productos químicos que se haya
aplicado, entre otros.
A. Muestra vegetal. B. Muestra óptima. C. Componentes de una buena muestra. D. Cantidad
óptima de una buena muestra. E. Muestras de plantas de porte bajo, arbustos o árboles. F.
Muestras indicando el sitio real de infección. G. Muestras con presencia de lesiones agallas o
cáncros. H. Muestras con signos del agente causante. I. Muestras con exceso de humedad. J.
Síntomas de enfermedades en plantas completas. K. Muestras de raíces de plántulas y plantas
de porte bajo o anuales. L. Muestras de raíces de arbustos, plantas anuales, bianuales y perennes.
M. Muestras de tallos y ramas. N. Muestas de yemas y flores. O. Muestras de frutos, tubérculos
y bulbos. P. Muestas afectadas por virus y fitoplasmas. Q. Empaque de muestras afectada por
virus y Mollicutes. R. Recolección de muestras para nematodos. S. Recolección de submuestras.
T. Recolección de muestras en cultivos anuales y perennes. (Fotos: Autores).
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D.
E.
F.
G.
H.
I.
J.
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K.
L.
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O.
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P.
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Óscar Adrián Guzmán-Piedrahita, Jairo Castaño-Zapata y Bernardo Villegas-Estrada
Q.
S.
R.
T.
T.
Diagnóstico de enfermedades de plantas de origen biótico
21
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Adams, M. J. & Antoniw, J. F. (2010). Descriptions of plant viruses. Recuperado de http://www.dpvweb.net/intro/index.
php [Consultado en noviembre de 2010].
Agrios, G. N. (2005). Plant pathology. 5th ed. Nueva York: Elsevier Academic Press.
Atkins, S. & Clark, I. (2004). “Fungal molecular diagnostics: A mini review”. Journal of Applied Genetics, 45(1), 3-15.
Belalcázar, S., Rosales, E.C. & Pocasangre, L.E. (2004). El Moko del plátano y banano y el rol de las plantas hospederas en su
epidemiología. pp.16-35. En: XVI Reunión Internacional ACORBAT. Oaxaca, México.
Botero, M. J., Ramírez, M.C. & Castaño-Zapata, J. (2006). “Determinación del período de incubación de Xanthomonas
campestris pv. passiflorae Pereira, agente causante de la Bacteriosis del maracuyá (Passiflora edulis var. flavicarpa Degener)”.
Boletín FITOTECNIA, 107. [Enero].
Bridge, P. (2002). “Biochemical and molecular techniques”. In: Waller, J.M., Lenne, J. M. & Waller, S. J. (eds.), Plant
Pathologist´s Pocketbook. 3rd ed. (pp. 229-244). Wallingford, UK: CAB International.
Carrillo, L. (2003). “Micotoxinas”. En: Microbiología Agrícola. Argentina: Universidad Nacional de Salta.
Castaño-Zapata, J. (1994). Principios básicos de fitopatología. 2ª ed. Tegucigalpa: Zamorano Academic Press.
Castillo, N. M. & Granada, G. A. (2005). “Estudio sobre la Bacteriosis del maracuyá en el Valle del Cauca: Etiología,
hospederos y control”. Fitopatología Colombiana, 19(1), 55-61.
Chica, R., Herrera, M., Jiménez, I., Lizcano, S., Montoya, J. A., Patiño, L. F. & Rodríguez, P. A. (2004). Impacto y manejo de la
Sigatoka negra en el cultivo de banano de exportación en Colombia. (pp. 53-62). En: XVI Reunión Internacional Acorbat. Oaxaca,
México.
Christie R. G. & Edwardson, J. R. (1977). “Light and electron microscopy of plant virus inclusions. Florida Agricultural
Experiment Station”. Monography, 9.
Conci, V.C. (1999). “Sondas de hibridación molecular”. En: Campo, D. M. & Lenardon, S. L. (eds.), Métodos para Detectar
Patógenos Sistémicos. (pp. 51-55). Córdoba, Argentina: Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Pugliese Siena.
Corvalán, A. (2002). “Biología molecular en Infectología Parte I: Desarrollo y metodologías”. Revista Chilena de Infectología,
19(1) Recuperado de http://www.scielo.cl/scielo.php?pid=S0716-10182002000100003&script=sci_arttext#12
[Consultado en enero de 2011].
agron. 17 (2): 7 - 24, 2009
Davis, E. L. & Tylka, G. L. (2000). “Soybean cyst nematode disease. The Plant Health Instructor”. En: APSnet.
Recuperado de http://www.apsnet.org/edcenter/intropp/lessons/Nematodes/Pages/SoyCystNema.aspx. [Consultado
en noviembre de 2010].
Dees, J., Barriga, R., Nieto, L. E. & Guerrero, O. (1986). “Técnicas nematológicas para trabajos con el nematodo Quiste
de la papa”. Manual de Asistencia Técnica, 033. [Tibaitatá, Bogotá, junio].
Dewey, F. M. (2002). “Inmunological techniques”. In: Waller, J. M., Lenne, J. M. & Waller, S. J. (eds.), Plant Pathologist´s
Pocketbook. 3rd ed. (pp. 221-228). Wallingford, UK: CAB International.
22
Óscar Adrián Guzmán-Piedrahita, Jairo Castaño-Zapata y Bernardo Villegas-Estrada
Dijkstra J. & De Jager, C. P. (1998). Practical plant virology, protocols and exercises. Berlín: Springer.
Farr, D. F. Bills, G. F., Chamuris, G. P. & Rossman, A.Y. (1989). Fungi on plants and plant products in the United States. St. Paul,
Minnesota: APS.
Fisher, J. R. (2008). “Double-stranded RNA analysis as a tool for diagnosing plant viruses”. NPDN News, National Plant
Diagnostic Network, 3(5). Recuperado de http://www.npdn.org/webfm_send/20 [Consultado en enero de 2011].
Fletcher, J. & Wayadande, A. (2002). “Fastidious vascular-colonizing bacteria. The Plant Health Instructor”. En: APSnet.
Recuperado de http://www.apsnet.org/edcenter/intropp/PathogenGroups/Pages/Fastidious.aspx [Consultado en
noviembre de 2010].
French, E. R. & Hebert, T.T. (1982). Métodos de investigación fitopatológica. San José, Costa Rica: IICA.
Granner, D. K. (1992). “Tecnología de recombinación del ADN”. En: Murray, R. K., Granner D. K., Mayes, P.A. &
Rodwell, V.W. (eds.), Bioquímica de Harper. 12ª ed. (pp. 429-445). México: El Manual Moderno.
Hammond, R.W. & Owens, R. A. (2006). “Viroids: New and continuing risks for horticultural and agricultural crops”. In:
APSnet Features. Recuperado de http://www.apsnet.org/publications/apsnetfeatures/Pages/Viroids.aspx [Consultado
en noviembre de 2010].
Hansen, M. A. & Wick, R.L. (1993). “Plant disease diagnosis: present and future prospects”. Advances in Plant Pathology,
10, 65-126.
Harper, D. (2010). “Bacteria”. En: Etymology dictionary. Recuperado de http://www.etymonline.com/index.
php?term=bacteria [Consultado en noviembre de 2010].
Harper, G., Dahal, G., Thottappilly, G. & Hull, R. (1999). “Detection of episomal Banana streak Badnavirus by IC–PCR”.
J. Virol. Methods, 79, 1-8.
Horst, R. K. (2001). Westcott’s plant disease handbook. 6th ed. Dordrecht, The Netherlands: Kluwer Academic Publishers.
Hugot, J. P., Baujard, P. & Morand, S. (2001). “Biodiversity on helminths and nematodes as a field of study: an overview”.
Nematology, 3, 199-208.
Hull, R. (2002). Matthews’ plant virology. 4th ed. San Diego. CA: Academic Press.
______. (2009). Comparative plant virology. 2nd ed. Burlington, MA: Elsevier-Academic Press.
Instituto Colombiano Agropecuario. (1996). El diagnóstico vegetal depende de buenas muestras. ICA. Centro de Diagnóstico
Vegetal Antioquia – Chocó. Medellín: Editorial Piloto.
International Committee on Taxonomy of Viruses - ICTV. (2010). In: ICTV. Recuperado de http://talk.ictvonline.
org/files/ictv_documents/m/msl/1231.aspx [Consultado en octubre de 2010].
Ito, T., Ieki, H. & Ozaki, K. (2002). “Simultaneous detection of six citrus viroids and apple stem grooving virus from
citrus plants by multiplex reverse transcription polymerase chain reaction”. J. Virol. Methods, 106, 235-239.
Diagnóstico de enfermedades de plantas de origen biótico
23
Jácome, A. & Barreto, M. (1984). Reconocimiento e identificación de organismos fungosos en la curuba de Castilla “Passiflora mollisima”
(H.B.K.) Bailey en el municipio Nuevo Colón, Boyacá. Trabajo de Grado. Facultad de Ciencias Agropecuarias, UPTC, Tunja,
Boyacá.
Luc, M., Sikora, R. & Bridge, J. (2005). Plant parasitic nematodes in subtropical and tropical agriculture. 2nd ed. UK. CABI
Publising.
Moens, T., Araya, M., Swennen, R., Waele, D. de & Sandoval, J. (2003). “Effect of growing medium, inoculum density,
exposure time and pot volume: factors affecting the resistance screening for Radopholus similis in banana (Musa spp.)”.
Nematropica, 33(1), 9-26.
Morales, F.J. (2000). El Mosaico dorado y otras enfermedades del frijol común causadas por geminivirus transmitidos por Mosca blanca
en América Latina. Palmira, Colombia: Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT).
Morales, F. J., Castaño, M., Arroyave, J.A., Olaya, C., Velasco, A. C. & Martínez, A. K. (2006). “Detección de virus en
especies frutales cultivadas en Colombia”. Fitopatología Colombiana, 30(2), 39-49.
Ocampo M., L. E., Cardona, G. W., Yépes, R. F., Moreno, M. M. A. & Velilla, G. J. A. (1994). “Toma y envío de muestras
para análisis fitopatológico, entomológico y de suelos”. Publicación Técnica No. 20. Medellín. Gobernación de Antioquia.
Convenio de Sanidad Agropecuaria Secretaría de Agricultura de Antioquia - Instituto Colombiano Agropecuario.
Perry, R. & Moens, M. (2006). Plant nematology. London: CAB International.
Perry, R., Moens, M. & Starr, J. (2009). Root knot nematodes. London: CAB International.
Putnam, M. L. (1995). “Evaluation of selected methods of plant disease diagnosis”. Crop Protection, 14, 517-525.
Real Academia Española - RAE. (2010). Diccionario de la lengua española. 22ª ed. recuperado de http://buscon.rae.es/
draeI/ [Consultado en: octubre de 2010].
Siddiqi, M. R. (2000). Tylenchida: Parasites of plants and insects. 2nd edition. CABI Bookshop.
Sorauer, P. (1905). “The nature of disease”. In: Colemanm, E. & Damrosch, B. (eds.), The Other Side of the Tapestry. Yale
University.
Strange, R. N. (2003). Introduction to plant pathology. Chichester, England: John Wiley & Sons.
Streets, R. B. (1972). The diagnosis of plant disease. A field and laboratory manual emphasizing the most practical methods for rapid
identification. Tucson, Arizona: The University of Arizona Press.
agron. 17 (2): 7 - 24, 2009
Torres, C. M., Sánchez, M., Bravo, N., Marmolejo de la Torre, F. & Gómez, E. D. (2000). “Enfermedades fungosas y
bacterianas en el cultivo de maracuyá Passiflora edulis Simsé var. flavicarpa Degener en dos agroecosistemas”. Fitopatología
Colombiana, 26(2), 47-54.
Vidaver, A. K. & Lambrecht, P. A. (2004). Bacteria as plant pathogens. APSnet, Introduction to the Pathogen Groups. Recuperado
de http://www.apsnet.org/edcenter/intropp/PathogenGroups/Pages/Bacteria.aspx [Consultado en enero de 2011].
Webster, C. G., Wylie, S.J. & Jones, M.G.K. (2004). “Diagnosis of plant viral pathogens”. Current Science, 86, 1604-1607.
24
Óscar Adrián Guzmán-Piedrahita, Jairo Castaño-Zapata y Bernardo Villegas-Estrada
Zambolim, L. & Ribeiro do Vale, F. X. (1997). “Control de las enfermedades de las plantas. 7.1. Principios de Fitopatología”.
En: Curso de Especialización por Enseñanza a Distancia. Brasil: Universidad Nacional de Vicosa.