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Sector agroalimentario Plantas biofactoría Informe de Vigilancia Tecnológica Plantas biofactoría Informe de Vigilancia Tecnológica El presente Informe de Vigilancia Tecnológica ha sido realizado en el marco del convenio de colaboración conjunta entre Genoma España y Parque Científico de Madrid (PCM), entidad que, por delegación de la Universidad Complutense de Madrid, gestiona el Círculo de Innovación en Agroalimentación (CIAA), perteneciente al Sistema de Promoción Regional madri+d. Los autores de este informe agradecen la colaboración ofrecida por toda la comunidad científica y empresarial para la realización de este informe, en especial a: - Dra. Covadonga Alonso Martí (INIA) - D.ª Isabel Bronchalo Bronchalo (AGRENVEC) - Dra. Sonia Castañón de la Torre (NEIKER) - Dr. Juan Antonio García Alvarez (CNB - CSIC) - Dra. Dolors Ludevid Múgica (IBMB - CSIC) - Dr. Luis Enjuanes Sánchez (CNB - CSIC) - Dr. José Angel Martínez Escribano (INIA) - Dr. Angel Mingo Castel (Univ. Pública de Navarra) - Dr. Ignacio Moreno Echanove (Plant Bioproducts) - Dr. Juan Plana Durán (Fort Dodge Veterinaria) - Dr. Fernando Ponz Ascaso (INIA) - Dr. Javier Pozueta Romero (Instituto de Agrobiotecnología y Recursos Naturales. UPN) - D.ª Lucía Roda Ghisleri (Ministerio de Medio Ambiente) - Dra. Julia Rueda Muñoz de San Pedro (Univ. Complutense de Madrid) La reproducción parcial de este informe está autorizada bajo la premisa de incluir referencia al mismo, indicando: Plantas Biofactoría. GENOMA ESPAÑA / CIAA-PCM. Genoma España no se hace responsable del uso que se realice de la información contenida en esta publicación. Las opiniones que aparecen en este informe corresponden a los expertos consultados y a los autores del mismo. © Fundación Española para el Desarrollo de la Investigación en Genómica y Proteómica / Parque Científico de Madrid. Autores: Olga Ruiz Galán (CIAA) Esther García Iglesias (CIAA) Lara Gago Cabezas (CIAA) Víctor González Rumayor (CIAA) Coordinador: Miguel Vega García (Genoma España) Edición: Silvia Enríquez (Genoma España) Referencia: GEN-ES05001 Fecha: Febrero 2005 Depósito Legal: M-10665-2005 ISBN: 84-609-4621-5 Diseño y realización: Spainfo, S.A. 4 PLANTAS BIOFACTORÍA Índice de contenido • RESUMEN EJECUTIVO 7 1. INTRODUCCIÓN. PLANTAS BIOFACTORÍA 9 2. TECNOLOGÍAS PARA LA OBTENCIÓN DE PLANTAS BIOFACTORÍA 14 2.1. Sistemas de expresión de proteínas recombinantes. 2.1.1. Transformación genética estable de las plantas. 2.1.2. Expresión transitoria. 2.2. Estrategias tecnológicas para optimizar la obtención de proteínas recombinantes en plantas. 2.2.1. Aumento del rendimiento de producción. 2.2.2. Autenticidad estructural. 14 15 21 CULTIVOS DE INTERÉS EN AGRICULTURA MOLECULAR 35 3.1. 3.2. 3.3. 3.4. 36 37 38 39 3. 4. Plantas de hoja y forrajeras. Semillas de cereales y leguminosas. Frutas, tubérculos y hortalizas. Oleaginosas y de fibra. 24 24 32 MOLÉCULAS DE INTERÉS 41 4.1. Proteínas recombinantes. 4.1.1. Proteínas de interés biosanitario. 4.1.2. Proteínas de interés industrial. 4.2. Ingeniería metabólica. 4.2.1. Modificación de rutas enzimáticas existentes. 4.2.2. Introducción de nuevas rutas enzimáticas. 41 41 55 56 56 60 5. LEGISLACIÓN 61 6. ASPECTOS DE MERCADO 67 7. ASPECTOS SOCIOECONÓMICOS 74 5 8. EJEMPLOS DE GRUPOS DE INVESTIGACIÓN ESPAÑOLES 78 9. CONCLUSIONES 92 10. ANEXOS Anexo Anexo Anexo Anexo Anexo I. II. III. IV. V. 94 Proyecto Pharma-Planta. Proyectos financiados por la Unión Europea. Centros públicos de investigación y proyectos. Empresas. Patentes. 94 96 102 103 108 11. REFERENCIAS 122 12. LISTA DE ABREVIATURAS 126 13. GLOSARIO 127 6 PLANTAS BIOFACTORÍA Resumen ejecutivo La ingeniería genética de plantas surgió a transformación del material vegetal hasta la principios de los años 80, cuando se descubre comercialización del producto final, presenta una cómo transferir fragmentos de información serie de factores críticos, que en ocasiones pueden genética de un organismo vegetal a otro, llegar a ser limitantes (riesgos ambientales, permitiendo la expresión de caracteres deseables. riesgos sobre la salud y rendimiento de Desde entonces, el desarrollo de las tecnologías producción). Se han diseñado distintas estrategias de transformación y regeneración de plantas ha tecnológicas que contribuyen a minimizar el sido tal que ha permitido realizar modificaciones impacto de estos factores. que parecían impensables. Las aplicaciones en el campo biofarmacéutico son Las primeras aplicaciones comerciales de la especialmente interesantes. La utilización de modificación genética de plantas se encaminan a microorganismos modificados genéticamente la obtención de cultivos que presenten ventajas para la obtención de moléculas de interés agronómicas como tolerancias a herbicidas, terapéutico comenzó hace dos décadas con la resistencias a plagas y patógenos o tolerancia a producción de insulina humana recombinante. condiciones adversas como salinidad o sequía. En 2002, veinte años después, ya existían El cultivo de estas plantas proporciona beneficios aproximadamente 90 fármacos desarrollados y/o a los agricultores debido a que implican mayores producidos por métodos biotecnológicos en el rendimientos y/o menores costes de producción. mercado, que movieron cerca de 35 billones de dólares. Las estimaciones indican que en el año La segunda generación de plantas transgénicas 2010 los biofármacos serán un 35% del mercado corresponde a plantas que presentan mejores farmacéutico, con unos beneficios estimados de propiedades organolépticas y nutricionales. Las 20 billones de dólares. modificaciones que se realizan en estas plantas son más complejas, ya que se encuentra Sin embargo, parece que el aumento de la implicado un mayor número de genes. demanda de este tipo de productos será tal que Se considera que los beneficios de este tipo de los actuales sistemas de producción no podrán plantas repercuten tanto en los productores de hacer frente a la misma. Por ello, será necesario el alimentos como en el consumidor final. desarrollo de nuevos sistemas de producción que permitan la obtención de estos biofármacos en En ambos casos se trata de plantas modificadas cantidades más elevadas y a un coste asequible. genéticamente utilizadas para la elaboración de La utilización de plantas como biofactorías de alimentos destinados al consumo humano y animal. estos productos se perfila como una posible solución. En el campo específico de plantas como Existe una tercera generación de plantas biofactorías, se estima que los primeros productos transgénicas que corresponde a plantas llegarán al mercado en el año 2006, y que el valor modificadas genéticamente para producir de mercado, sólo en EE.UU., alcanzará los 2.200 compuestos de alto valor añadido. En este caso no millones de euros en 2011. se busca la producción de alimentos, sino que se pretende que la planta se convierta en una El desarrollo de plataformas biotecnológicas de biofactoría de productos de interés en los campos producción de proteínas recombinantes en plantas biosanitario, farmacéutico o industrial. Este se encuentra liderado por los Estados Unidos y informe pretende describir de manera detallada Canadá, donde ya existen productos comerciales. cuál es el estado en el que se encuentra el Europa sufre un retraso en la implantación de desarrollo de esta tercera generación de plantas estos sistemas, debido fundamentalmente a la transgénicas, tanto en el ámbito tecnológico como moratoria que impedía el uso de nuevos en lo referente a los aspectos legislativos, transgénicos. El sector se encuentra formado por socioeconómicos y comerciales. grupos de investigación de centros públicos y universidades, y por empresas generalmente de La primera parte del informe analiza las pequeño y mediano tamaño. tecnologías que se están utilizando en la actualidad para la obtención plantas biofactoría. Con el fin de reflejar el estado en el que se El proceso productivo, que incluye desde la encuentra actualmente este mercado se realiza 7 una descripción de algunas de las empresas tipo dedicadas a esta actividad. Dentro de esta descripción se incluyen las tecnologías que utilizan, los productos en desarrollo y la fase en la que se encuentran, así como las estrategias que siguen en cuanto a la propiedad industrial. La legislación aplicable a las plantas biofactoría condiciona extraordinariamente los sistemas de producción. La normativa europea referente al control de las actividades en las que se produzcan o empleen OMGs es muy estricta. Su objetivo es asegurar que estas actividades se lleven a cabo en condiciones en las que los riesgos para la salud y para el medio ambiente sean mínimos. Se ha dedicado un apartado a estudiar la legislación en el que se incluyen referencias a la normativa aplicable a la utilización confinada, liberación y comercialización de OMGs, así como a los procedimientos administrativos de autorización de las mismas. Por último, se analizará cuál es la posición de nuestro país en el desarrollo de plantas transgénicas de tercera generación. Para ello se ha realizado un mapa de las empresas y grupos de investigación que en la actualidad desarrollan sus actividades en este campo. Se han recogido los datos referentes a las líneas y proyectos de investigación y patentes desarrolladas por estos grupos, así como la percepción de los investigadores principales en cuanto al futuro de las plantas biofactoría en nuestro país. 8 PLANTAS BIOFACTORÍA 1. Introducción. Plantas biofactoría La utilización de plantas como biofactorías de productos de alto valor añadido despierta un elevado interés tanto en los científicos como en las empresas de biotecnología, debido a las ventajas de tipo económico, técnico y de seguridad que presentan las plantas para ser usadas como sistemas de producción1. Cuando hablamos de plantas como biofactorías nos referimos al cultivo a escala agrícola de plantas superiores que han sido transformadas de modo que pasen a expresar productos que no expresaban anteriormente (o que expresaban en cantidades muy pequeñas) y que poseen un elevado valor añadido. Pueden usarse plantas tradicionalmente utilizadas para la obtención de alimentos, piensos u otros productos como fibras, u otras especies. La modificación genética de la planta da lugar a la expresión de una nueva proteína que la planta no poseía. Esta proteína puede ser el producto de interés que se desea obtener, o bien puede ser una enzima que modifique una ruta metabólica de la planta, y como consecuencia ésta pasa a expresar un nuevo compuesto que anteriormente no producía. En el primer caso se habla de agricultura molecular y en el segundo de ingeniería metabólica. Agricultura molecular La expresión “agricultura molecular” procede de la expresión en inglés “molecular farming” y consiste en la aplicación de la biotecnología de plantas para introducir en una planta genes que codifican para determinadas proteínas con interés biomédico o industrial para el hombre, como vacunas, anticuerpos, biofármacos, polímeros o enzimas, de modo que la planta sea capaz de producirlos. Ingeniería metabólica La ingeniería metabólica consiste en la modificación de las rutas metabólicas de la planta para incrementar la síntesis de moléculas deseables, bien mediante la introducción de genes que codifican para enzimas que completan una ruta metabólica existente en la planta, o genes que codifican para todas las enzimas de una ruta metabólica que no posee la planta. Para que la planta exprese estos productos es necesario introducir los genes que los codifican, lo cual puede hacerse mediante distintos sistemas que se indicarán más adelante. La planta transformada podrá cultivarse en el campo tal y como se hace con los cultivos tradicionales, o bajo distintos sistemas de confinamiento o de contención y una vez que alcance el desarrollo adecuado se recolectará. El material vegetal recolectado contendrá el compuesto de interés y en función de su uso, puede ser purificado para su envasado y comercialización en forma pura, o bien puede comercializarse sin purificar tal y como ocurre con las vacunas comestibles. 1 Twyman, R. M.; Stoger, E.; Schillberg, S.; Christou, P.; Fischer, R. (2003). Molecular farming in plants: host systems and expression technology. Trends in Biotechnology, 21, 570-578. 9 Construcción de un vector de transferencia Introducción del vector en la célula vegetal Célula modificada genéticamente Aislamiento del gen de interés Cultivo de las células Trasplante a un campo de cultivo confinado Consumo directo Elaboración de fármacos Consumo animal Figura 1. Esquema general 10 Consumo humano PLANTAS BIOFACTORÍA Este informe se centra principalmente en la obtención de proteínas recombinantes de interés biosanitario e industrial mediante agricultura molecular, ya que es ésta la aplicación que concentra mayor número de empresas y mayor cantidad de productos cercanos a la comercialización. Nos referiremos a la ingeniería metabólica en el apartado dedicado a los productos, explicando los puntos más importantes. Las proteínas recombinantes son moléculas complejas cuya obtención a escala industrial mediante síntesis química es muy difícil o costosa. Por este motivo, en la actualidad se obtienen mediante la utilización de cultivos celulares de microorganismos (bacterias, levaduras y hongos) o células de organismos superiores entre los que se incluyen insectos, mamíferos o plantas. Uno de los principales inconvenientes que presentan estos sistemas es que implican costes elevados, debido a que requieren aportes de nutrientes y energía y deben llevarse a cabo en condiciones de esterilidad. Estos sistemas además presentan riesgos de contaminación de los productos con distintos agentes que pueden resultar peligrosos para la salud de las personas y los animales. En el caso de las bacterias estos agentes son las endotoxinas bacterianas, mientras que cuando se trata de células de mamíferos son virus, priones y secuencias oncogénicas. Una alternativa a los cultivos celulares es la utilización de plantas y animales completos. En el caso de los animales se está investigando la expresión de las proteínas en huevos o leche, por ejemplo, lo cual permitiría una recolección continua relativamente sencilla. Sin embargo, este tipo de sistemas presenta inconvenientes relativos a la seguridad debido a la posible presencia de agentes contaminantes y patógenos. La utilización de plantas completas presenta ventajas de tipo económico, técnico y de seguridad del producto frente a los sistemas de expresión que se utilizan en la actualidad para obtener proteínas recombinantes, y además presenta ventajas de seguridad frente los animales transgénicos. A continuación se indican las principales ventajas que presentan las plantas para su utilización como biofactorías. VENTAJAS DE LA UTILIZACIÓN DE PLANTAS BIOFACTORÍA 2, 3, 4 • De tipo económico5, 6, 7 – Permiten usar los recursos y la infraestructura agrícola existente (maquinaria para la siembra, cosecha y procesado del material vegetal, silos, etc.), lo que resulta en una reducción del capital inicial que se debe invertir. – Presentan costes de producción bajos. La energía necesaria para el crecimiento del cultivo procede del sol y los nutrientes son el dióxido de carbono atmosférico y los minerales del suelo o procedentes de la fertilización. – Permite un escalado sencillo tanto para aumentar la producción como para reducirla, simplemente aumentando o reduciendo la cantidad de terreno dedicada al cultivo. – El cultivo de plantas produce una gran cantidad de biomasa en la que se acumula la proteína recombinante, por lo que pueden alcanzarse producciones elevadas. – Las líneas transgénicas pueden mantenerse durante un tiempo largo en forma de semillas, de modo que la planta se encuentra en un estado de latencia en el que no se necesitan condiciones de mantenimiento costosas. Por el contrario otros sistemas de expresión requieren condiciones muy controladas o incluso es necesario reproducir las células con el consiguiente gasto de nutrientes y energía. – En el caso de proteínas que necesitan ser purificadas los costes de procesado son similares a los de otros sistemas de expresión, pero en el caso de proteínas que no se purifican estos costes se eliminan. (continúa en pág. siguiente) 2 3 4 5 6 7 Horn, M. E.; Woodard, S. L.; Howard, J. A. (2004). Plant molecular farming: systems and products. Plant Cell Rep., 22, 711-720. Giddings, G. (2001). Transgenic plants as protein factories. Current Opinion in Biotechnology, 12, 450–454. Daniell, H.; Streatfield, S. J.; Wycoff, K. (2001). Medical molecular farming:production of antibodies, biopharmaceuticals and edible vaccines in plants. Trends in Plant Science, 6, 219-226. Yoshida, K.; Shinmyo, A. (2000). Transgene expression systems in plant, a natural bioreactor. Journal of Bioscience and Bioengineering, 90, 353-362. Maliga, P. (2002). Engineering the plastid genome of higher plants. Current Opinion in Plant Biology, 5, 164-172. Twyman, R. M.; Stoger, E.; Schillberg, S.; Christou, P.; Fischer, R. (2003). Molecular farming in plants: host systems and expression technology. Trends in Biotechnology, 21, 570-578. 11 VENTAJAS DE LA UTILIZACIÓN DE PLANTAS BIOFACTORÍA (continuación) • De tipo técnico8, 9 – Las plantas son sistemas relativamente fáciles de transformar. – Puede aumentarse la estabilidad de las proteínas recombinantes mediante su acumulación o síntesis en determinados compartimentos celulares (orgánulos subcelulares) donde se encuentran protegidas de la degradación. – La síntesis de proteínas y sus modificaciones postraduccionales son semejantes a las que realizan los animales, existiendo sólo pequeñas diferencias en cuanto a glicosilación. – La pared celular protege a la proteína contra la degradación en el tracto gastrointestinal, permitiendo la administración por vía oral sin purificación. – Pueden utilizarse sistemas mediante los cuales las moléculas recombinantes se almacenen en determinados órganos o tejidos de la planta como raíces, semillas, tubérculos, frutos, etc. • Referentes a la seguridad de los productos obtenidos – Las proteínas procedentes de plantas no son susceptibles de estar contaminadas por virus animales o humanos, priones o secuencias oncogénicas que puedan afectar al ser humano o a animales. Aunque la utilización de plantas completas como sistemas de expresión presenta ventajas muy importantes, existe una serie de factores críticos que es necesario tener en cuenta, ya que tienen un papel fundamental en el éxito de la agricultura molecular. Estos factores se refieren principalmente a problemas de seguridad ambiental, posibles efectos negativos sobre la salud humana y animal y retos técnicos, entendidos como aquellos que afectan al proceso de producción y purificación. De estos factores críticos, los retos técnicos están siendo abordados mediante el desarrollo de tecnologías que optimizan el proceso productivo. 8 9 Sin embargo, parece que algunos factores críticos relacionados con el medio ambiente y con la salud humana y animal necesitarán de esfuerzos adicionales, ya que no siempre es posible el desarrollo de tecnologías adecuadas que permitan reducir su impacto. Esto hace que, de momento, sea necesaria la utilización de buenas prácticas de cultivo y de medidas de confinamiento para poder prevenir algunos de los riesgos asociados a este tipo de cultivos. Además, al tratarse de riesgos sobre la salud y sobre el medio ambiente, entra en juego la aceptación de estos cultivos por distintos agentes socioeconómicos. Dentro de éstos se incluyen agentes implicados en la cadena alimentaria (agricultores y ganaderos, productores, distribuidores, consumidores, etc.), grupos ecologistas, legisladores y la opinión pública en general. Koprowski, H.; Yusibov, V. (2001). The green revolution: plants as heterologous expression vectors. Vaccine 19, 2735–2741. Fischer, R.; Stoger, E.; Schillberg, S.; Christou, P.; Twyman, R. M. (2004). Plant-based production of biopharmaceuticals. Current Opinion in Plant Biology, 7, 152–158. 12 PLANTAS BIOFACTORÍA FACTORES CRÍTICOS DE LAS PLANTAS BIOFACTORÍA10, 11, 12 • Ambientales – Riesgo de escapes por flujo de polen, que dan lugar a problemas de coexistencia con otros cultivos. El polen de las plantas modificadas genéticamente puede dispersarse por el viento, o a través de insectos polinizadores llegando a otros cultivos en los que podrá introducir los transgenes que contiene. – Contaminación cruzada por mezcla de semillas. Puede tener lugar en todas las fases del proceso de cultivo incluyendo contaminación a través de la maquinaria agrícola durante la siembra y recolección, y en el almacenamiento, transporte y procesado. Esta mezcla de semillas puede ocasionar problemas ambientales en caso de siembra de las mismas y podría tener implicaciones en la salud de animales y personas si se produjera el paso a la cadena alimentaria. – Riesgo de ingestión por los animales que existan en el campo de cultivo, como pequeños mamíferos, aves o invertebrados. – Riesgo de permanencia en el suelo de restos procedentes de las plantas transformadas como semillas o brotes, a partir de los que puede volver a crecer la planta. – Riesgo de permanencia en el medio de proteínas transgénicas potencialmente peligrosas que podrían acumularse en otros organismos. • Salud humana y animal – Posible riesgo de pasar a la cadena alimentaria. Este hecho podría producir distintos problemas en función del tipo de sustancia que se esté expresando (tolerancia en el caso de las vacunas u otros efectos en el caso de los fármacos). – Riesgo de contaminación con herbicidas o insecticidas que se utilizan en el cultivo de plantas. Como consecuencia de la utilización de estos compuestos pueden quedar residuos que pueden ser perjudiciales para la salud humana y animal en caso de ingestión. – Riesgo de contaminación con micotoxinas. Son toxinas que se producen como consecuencia del crecimiento de hongos sobre el material vegetal cosechado, principalmente durante el almacenamiento. Son sustancias que presentan efectos nocivos sobre la salud animal y humana. • Técnicos – El tiempo necesario para la obtención de la primera cosecha de la planta que expresa la proteína recombinante es mayor que en otros sistemas de expresión como microorganismos o células de mamíferos. Es necesario preparar los vectores de expresión, transformar, regenerar y cultivar las plantas, así como evaluar varias generaciones con el fin de asegurar que la expresión de estas sustancias es estable y que la sustancia de interés es bioquímicamente activa. – Pueden existir problemas de expresión baja para algunas proteínas. – Las modificaciones postraduccionales que llevan a cabo las plantas no son exactas a las que llevan a cabo los mamíferos, siendo las diferencias principalmente en la glicosilación. – Dificultad para la dosificación en el caso de vacunas comestibles. Cuando la administración de la molécula es mediante la ingesta de la planta, es necesario conocer con seguridad los niveles de expresión de la molécula en la planta con el fin de poder ajustar la dosis de manera adecuada. 10 11 12 Daniell, H.; Streatfield, S. J.; Wycoff, K. (2001). Medical molecular farming:production of antibodies, biopharmaceuticals and edible vaccines in plants. Trends in Plant Science, 6, 219-226. Twyman, R. M.; Stoger, E.; Schillberg, S.; Christou, P.; Fischer, R. (2003). Molecular farming in plants: host systems and expression technology. Trends in Biotechnology, 21, 570-578. Fischer, R.; Stoger, E.; Schillberg, S.; Christou, P.; Twyman, R. M. (2004). Plant-based production of biopharmaceuticals. Current Opinion in Plant Biology, 7, 152–158. 13 2. Tecnologías para la obtención de plantas biofactoría A continuación se explican los sistemas más utilizados para la expresión de proteínas foráneas en plantas, así como aquellos sistemas que permiten la optimización de la producción de moléculas de interés en plantas, principalmente encaminados a aumentar el rendimiento de la proteína y a mejorar la autenticidad estructural. 2.1. Sistemas de expresión de proteínas recombinantes13, 14 animales o microbianas), consiguiendo que la La obtención de plantas para su utilización como En este apartado distinguiremos entre las biofactorías de moléculas de interés se lleva a modificaciones genéticas estables transmisibles a cabo mediante el empleo de la tecnología del ADN la descendencia y modificaciones que dan lugar a recombinante. Esta tecnología permite introducir la expresión transitoria de proteínas en una planta material genético procedente de recombinantes, que no se transmiten a la otros organismos (otras especies vegetales, descendencia. Vector planta modificada pase a expresar nuevas proteínas o bien que modifique la expresión de sus propias proteínas. Célula transformada Semillas Regeneración Planta transformada Nueva planta transformada Figura 2. Transformación estable. 13 14 Mason, H. S.; Warzecha, H.; Mor, T.; Arntzen, C. J. (2002). Edible plant vaccines: applications for prophylactic and therapeutic molecular medicine. Trends in Molecular Medicine, 8, 324-329. Koprowski, H.; Yusibov, V. (2001). The green revolution: plants as heterologous expression vectors. Vaccine, 19, 2735–2741. 14 PLANTAS BIOFACTORÍA Vector Semillas Planta no transformada Planta transformada Figura 3. Expresión transitoria. 2.1.1. Transformación genética estable de las plantas La transformación genética estable de plantas puede realizarse mediante la introducción del material genético en el núcleo celular o bien en los Mediante transformación genética estable se plastos, que son orgánulos característicos de las obtienen plantas modificadas genéticamente en plantas que poseen material genético que puede las que el material genético introducido aparece ser transformado. en todas las células de la planta y se transmite a la descendencia. Son lo que se denomina Lo más frecuente es realizar la transformación del “plantas transgénicas”. material nuclear. Mediante distintas técnicas que se explicarán a continuación es posible introducir La principal ventaja que presenta este tipo de en el núcleo de la célula el transgén de interés y transformación es que la modificación se transmite a conseguir que éste se exprese dando lugar a la la descendencia, tanto por reproducción sexual proteína foránea. A continuación se indican las (mediante semillas), como por reproducción asexual principales ventajas e inconvenientes de este tipo (mediante esquejes, micropropagación, etc.). de transformación. VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LA TRANSFORMACIÓN NUCLEAR Ventajas • Existen protocolos de transformación y regeneración para muchos vegetales, entre los que se incluyen muchas especies comestibles. Inconvenientes • La inserción del material genético ocurre al azar, existiendo fenómenos que disminuyen la producción como el efecto de posición o el silenciamiento. • La acumulación de las proteínas recombinantes en el citoplasma puede tener efectos tóxicos para la planta o interferir en el desarrollo. • Es necesario utilizar marcadores para seleccionar las plantas transformadas. • La modificación genética puede transmitirse a través del polen, lo que da lugar a riesgos de escape. La transformación de plastos es una técnica relativamente nueva muy interesante en agricultura molecular, debido a que presenta múltiples ventajas frente a la transformación nuclear, en lo referente a seguridad ambiental o a los niveles de expresión. Los plastos son orgánulos subcelulares característicos de las células vegetales, que poseen varias copias de un cromosoma circular de pequeño tamaño denominado plastoma. Se encuentran en los distintos tejidos y órganos de las plantas pudiendo presentar distintas morfologías y funciones. Algunos ejemplos de plastos 15 son los cloroplastos de tejidos verdes y hojas, que eficaces. Por este motivo, el interés principal realizan la fotosíntesis, los cromoplastos de flores se está dirigiendo hacia la transformación y frutas maduras, los amiloplastos, que aparecen de cloroplastos, aunque el potencial de transformar en órganos de almacén como tubérculos o los cromoplastos de frutas y verduras presenta ventajas leucoplastos, que aparecen en raíces15. obvias para la obtención de vacunas de subunidades comestibles16. Aunque todos los tipos de plastos presentan varias copias del plastoma, no todos poseen la Las ventajas e inconvenientes que presenta la misma capacidad de expresar los genes transformación genética de cloroplastos frente a la que contienen, siendo los cloroplastos los más transformación nuclear son las siguientes: VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LA TRANSFORMACIÓN DE CLOROPLASTOS17, 18, 19, 20 Ventajas • Integración del ADN transformante mediante recombinación homóloga, lo que previene el efecto de posición. • Ausencia de efectos epigenéticos como silenciamiento, cosupresión, etc. • Elevados niveles de expresión debido a que cada cloroplasto presenta un gran número de copias de su cromosoma, y cada célula presenta un número elevado de cloroplastos. El número copias del ADN del cloroplasto por célula puede ser hasta 10.000, lo que puede dar como resultado una acumulación de hasta el 47% de las proteínas totales solubles. • Las proteínas recombinantes se acumulan en el interior del cloroplasto previniendo problemas de toxicidad o interferencia en el desarrollo de la planta. • Permite la expresión de operones policistrónicos, por lo que se pueden introducir varios genes en un solo evento de transformación bajo el control de un solo promotor. Esto puede ser muy interesante en la ingeniería metabólica donde en ocasiones es necesario introducir varios genes que codifican para enzimas distintas de una ruta metabólica y se desea que se sinteticen de manera coordinada. • Los cloroplastos no se transmiten a través del polen ya que su herencia es materna en la mayor parte de las plantas, disminuyendo el riesgo de contaminación cruzada debido al aislamiento del transgén en el cloroplasto. • Permite eliminar los marcadores que se usan para seleccionar aquellas plantas en las que se ha introducido el ADN. Inconvenientes • Riesgo de transferencia horizontal de los transgenes a bacterias debido a la homología que presentan el genoma bacteriano y el de los cloroplastos. • La transformación de cloroplastos sólo se hace de manera rutinaria en tabaco y en el alga C. reinhardii y aunque se ha logrado transformar cloroplastos en algunas especies comestibles como zanahoria y tomate, todavía es necesario optimizar el proceso. • Los cloroplastos no son capaces de llevar a cabo algunas modificaciones postraduccionales como la glicosilación. • No se produce la exportación de las proteínas sintetizadas hacia otros orgánulos o compartimentos celulares. 15 16 17 18 19 20 Heifetz, P. B.; Tuttle, A. M. (2001). Protein expression in plastids. Current Opinion in Plant Biology, 4, 157–161. Fischer, R.; Stoger, E.; Schillberg, S.; Christou, P.; Twyman, R. M. (2004). Plant-based production of biopharmaceuticals. Current Opinion in Plant Biology, 7, 152–158. Daniell, H.; Khan, M. S.; Alison. L. (2002). Milestones in chloroplast genetic engineering: an environmentally friendly era in biotechnology. Trends in Plant Science, 7, 84–91. Maliga, P. (2002). Engineering the plastid genome of higher plants. Current Opinion in Plant Biology, 5, 164-172. Heifetz, P. B. (2000). Genetic engineering of the chloroplast. Biochimie, 82, 655-666. Heifetz, P. B.; Tuttle, A. M. (2001). Protein expression in plastids. Current Opinion in Plant Biology, 4, 157–161. 16 PLANTAS BIOFACTORÍA Existen algunos ejemplos de productos obtenidos de plantas de tabaco en las que se han transformado los cloroplastos y se han conseguido rendimientos elevados21 como la producción de hormona del crecimiento humana (8% de la proteína soluble total o PST 22), albúmina sérica humana (11% PST 23), fragmentos de las toxinas colérica y tetánica (25% PST), y producción de una xilanasa termoestable (6% PST)24. La transformación de cloroplastos ha tomado un gran impulso en los dos últimos años. En 2002 se constituyó una empresa llamada Chlorogen dedicada a la obtención plantas transplastómicas mediante bombardeo con microproyectiles, para el desarrollo de fármacos y otros productos. A continuación se explican los sistemas de transformación estable más utilizados, entre los que se encuentran la transformación con Agrobacterium, microinyección, bombardeo con microproyectiles o transformación de protoplastos. Algunos de estos métodos permiten realizar transformación nuclear y de cloroplastos. 2.1.1.1. Transformación mediada por Agrobacterium 25 En la transformación mediada por Agrobacterium se utiliza este microorganismo como vector para introducir el material genético recombinante en la planta que se desea transformar. Agrobacterium es una bacteria del suelo patógena para plantas dicotiledóneas y algunas coníferas, capaz de inducir en estas plantas la formación de nódulos y agallas que pueden producir incluso la muerte de la planta. El mecanismo de infección de Agrobacterium consiste en la inserción en la planta de una parte de su material genético, conocido como T-DNA, y contenido a su vez en el 21 22 23 24 25 denominado plásmido Ti. El plásmido Ti es una molécula de ADN circular y contiene un grupo de genes denominados vir, que dirigen el proceso de infección, junto con genes implicados en la formación de los nódulos en la planta y genes implicados en la síntesis de aminoácidos denominados opinas que sirven de nutrientes para la bacteria. La inserción del T-DNA en la planta provoca la formación de nódulos y la síntesis de las opinas. Mediante manipulación genética del plásmido Ti, es posible eliminar los genes implicados en la formación de nódulos y de opinas y sustituirlos por los genes que deseamos que exprese la planta. Junto con los genes de interés es necesario introducir marcadores que permitirán seleccionar aquellas células que hayan sido infectadas y hayan integrado este material genético. Con estas bacterias recombinantes se pueden transformar células, tejidos e incluso órganos de plantas completas. Posteriormente se seleccionan aquellas células que han sido transformadas y a partir de ellas se regeneran plantas completas que presentarán la modificación en todas sus células. La regeneración de plantas es, en algunos casos, un proceso dificultoso que necesita un tiempo relativamente largo, respecto del cultivo de microorganismos o células animales, lo cual encarece el producto final. Por otra parte, existen fenómenos de variación somaclonal asociados al cultivo in vitro de células vegetales, que deben ser tenidos en consideración, puesto que pueden afectar a la producción final. Otro de los inconvenientes que plantea este sistema es que muchas monocotiledóneas se han mostrado tradicionalmente como resistentes a la infección por Agrobacterium. Las monocotiledóneas incluyen familias tan Fischer, R.; Stoger, E.; Schillberg, S.; Christou, P.; Twyman, R. M. (2004). Plant-based production of biopharmaceuticals. Current Opinion in Plant Biology, 7, 152–158. Staub, J. M.; Garcia, B.; Graves J.; Hajdukiewicz, P.; Hunter, P.; Nehra, N.; Paradkar, V.; Schlittler, M.; Carroll, J. A.; Spatola, L.; Ward, D.; Ye, G.; Russell, D. A. (2000). High-yield production of a human therapeutic protein in tobacco chloroplasts. Nature Biotechnology, 18, 333-338. Fernández-San Millán, A.; Mingo-Castel, A.; Miller, M.; Daniell, H. (2003). A chloroplast transgenic approach to hyperexpress and purify Human Serum Albumin, a protein highly susceptible to proteolytic degradation. Plant Biotechnology Journal, 1, 71-79. Twyman, R. M.; Stoger, E.; Schillberg, S.; Christou, P.; Fischer, R. (2003). Molecular farming in plants: host systems and expression technology. Trends in Biotechnology, 21, 570-578. Staub, J. M.; Garcia, B.; Graves J.; Hajdukiewicz, P.; Hunter, P.; Nehra, N.; Paradkar, V.; Schlittler, M.; Carroll, J. A.; Spatola, L.; Ward, D.; Ye, G.; Russell, D. A. (2000). High-yield production of a human therapeutic protein in tobacco chloroplasts. Nature Biotechnology, 18, 333-338. 17 importantes como las gramíneas, por lo que ha sido necesario desarrollar otros sistemas de transformación. No obstante se ha conseguido transformar mediante este método algunas monocotiledóneas muy importantes como maíz, trigo y arroz. La inserción del material genético es aleatoria y puede ocurrir en varios sitios dentro de una misma célula, pudiendo originar problemas de silenciamiento o efectos posicionales. Por ello, es importante seleccionar posteriormente plantas con elevados niveles de expresión. Construcción del plásmido Ti con el gen interés Integración del ADN exógeno en el núcleo Agrobacterium Infección de la célula vegetal con Agrobacterium modificado Figura 4. Transformación mediante Agrobacterium. 2.1.1.2. Transformación biolística26 La transformación biolística consiste en el bombardeo del tejido que se desea transformar con partículas micrométricas o submicrométricas de oro o tungsteno recubiertas con el material genético que se desea insertar en la planta. Estas partículas penetran a través de la pared celular y la membrana plasmática llegando a zonas profundas de las células donde ocurre la inserción. Permite realizar la transformación del material genético del núcleo o del sistema plastidial (de hecho, es la técnica más utilizada para la transformación de cloroplastos y se ha probado su éxito con varias especies). Como en el caso de la transformación con Agrobacterium, se introducen los genes con un marcador y se seleccionan aquellas células en las que se ha insertado el material correctamente y a partir de ellas se regeneran plantas completas que presentarán la modificación en todas sus células. Normalmente este método implica la integración de un número de copias elevado, lo que potencia la expresión, aunque es necesario controlar el número de copias que se inserta, ya que un nivel de expresión muy elevado puede causar fenómenos de silenciamiento que llevan a una baja expresión. Por este motivo, se suelen seleccionar aquellas líneas que llevan entre una y tres copias del transgén, siempre y cuando estén en tándem. 26 Lessard, P. A.; Kulaveerasingam, H.; York, G.M.; Strong, A.; Sinskey, A. J. (2002). Manipulating Gene Expression for the Metabolic Engineering of Plants. Metabolic Engineering, 4, 67-79. 18 PLANTAS BIOFACTORÍA Es el método de elección para la transformación de cereales como arroz, trigo y maíz, y para leguminosas como la soja. Percutor Pólvora Proyectil Bolas de ADN Se carga el proyectil con los fragmentos de ADN de interés Célula vegetal Los fragmentos de ADN traspasan las paredes y membranas celulares Inserción del ADN en el cloroplasto o núcleo Figura 5. Transformación biolística. 2.1.1.3. Microinyección La incorporación del ADN puede facilitarse mediante distintos tratamientos que alteran la La técnica de microinyección implica la inyección permeablidad de la membrana. Entre estos directa del material genético mediante tratamientos se incluyen la aplicación de pulsos microcapilares o microjeringas bajo control eléctricos de elevado voltaje que inducen la microscópico en la célula. Resulta poco efectiva formación de poros reversibles en la membrana porque es necesario inyectar las células una a una del protoplasto (electroporación), o tratamientos y es necesario inyectar al menos 10.000 células con agentes químicos que desestabilizan la para tener la seguridad de que al menos una de membrana celular como el polietilenglicol (PEG). ellas ha incorporado el material genético. En los protoplastos los plastos se sitúan cerca de Entre las ventajas principales de este sistema se la membrana celular, por lo que se puede encuentra la posibilidad de introducir el material conseguir una permeabilización simultánea de la genético en orgánulos distintos del núcleo como membrana celular y de la doble membrana de los los plastos. plastos que permita la introducción del material genético en estos orgánulos. 2.1.1.4. Transformación de protoplastos27 La obtención de protoplastos con capacidad regenerativa puede hacerse a partir de distintos tejidos de la planta, aunque en el caso de cereales Los protoplastos son células de cualquier tejido sólo ha sido posible obtenerlos a partir de tejidos vegetal a las que se elimina la pared celular inmaduros. mediante procesos químicos o enzimáticos, que en suspensión son capaces de incorporar de manera La principal desventaja de este sistema es la natural fragmentos de ADN que se encuentren en dificultad de regenerar plantas a partir de el medio. protoplastos. 27 Lessard, P. A.; Kulaveerasingam, H.; York, G. M.; Strong, A.; Sinskey, A. J. (2002). Manipulating gene expression for the metabolic engineering of plants. Metabolic Engineering, 4, 67-79. 19 En algunos cereales como el maíz, se ha descrito una alternativa a la electroporación de protoplastos, que consiste en la electroporación de tejidos. Este tipo de electroporación presenta la ventaja de que la regeneración de plantas a partir de estos tejidos es más sencilla que a partir de protoplastos.28 COMPARACIÓN DE LOS DISTINTOS SISTEMAS DE TRANSFORMACIÓN ESTABLE Transformación mediada por Agrobacterium Ventajas Inconvenientes – Requiere regeneración mediante cultivo de tejidos. – Efectiva. – Barata. – Simple. – Número de copias bajo. – Las plantas monocotiledóneas generalmente son reticentes a esta transformación. – La integración del transgén se produce al azar pudiendo dar lugar a efectos de posición, silenciamiento de genes, etc. – Requiere regeneración mediante cultivo de tejidos. – Riesgo de silenciamiento y/o inestabilidad de genes. Biolístico – Eficiencia alta. – Simple. – Permite transformar monocotiledóneas. – Permite transformación plastidial. – Riesgo de pérdida de material genético en el disparo o preparación de las partículas. – Riesgo de modificación del ADN por ataque químico del tungsteno. – Riesgo de inserción doble en plastos y núcleo. – Requiere equipos costosos. – En ocasiones puede conducir a una expresión transitoria difícil de superar. Protoplastos Microinyección – Integración del transgén al azar. – Puede optimizarse la cantidad de ADN que se introduce. – Permite la elección de la célula a transformar. – Descarga precisa y predecible. – Requiere personal muy especializado. – Requiere instrumental. – Sólo una célula es transformada. – Integración del transgén al azar. – Pueden transformarse plastos. – Permite transformación plastidial. – Equipos relativamente sencillos comparado con biolísticos. – Requiere regeneración. – Sólo existen protocolos de regeneración para determinadas especies. – Integración del transgén al azar. Tabla 1. Ventajas e inconvenientes de los distintos sistemas de transformación estable. 28 Alexander, P. Sorokin; Xia-Yi, Ke; Dong-Fang Chen and Malcolm C. Elliott (2000). Production of fertile transgenic wheat plants via tissue electroporation. Plant Science, 156, 227-233. 20 PLANTAS BIOFACTORÍA 2.1.2. Expresión transitoria La expresión transitoria de genes generalmente se utiliza para evaluar la funcionalidad de las La expresión transitoria de genes en plantas construcciones que se usan para transformar plantas implica la expresión de proteínas recombinantes de manera estable, y para evaluar la calidad del sin necesidad de transformación del material producto que se obtiene29. Sin embargo, debido a los genético de la planta. El ADN recombinante no se inconvenientes que presenta la transformación inserta en el genoma o plastoma de la planta, sino nuclear estable, principalmente en cuanto a tiempo, que mediante distintos métodos se consigue la expresión transitoria ha ido tomando mayor producir grandes cantidades de ARN mensajero, importancia para su utilización como sistema de que se traduce a proteínas en el citoplasma de producción de proteínas recombinantes30. Puede parte de las células de la planta. Una vez que el llevarse a cabo mediante la utilización de vectores ARN mensajero es traducido a proteínas la planta virales o mediante agroinfiltración. lo degrada, de modo que no se transmite a la descendencia. Normalmente la expresión También es posible la expresión transitoria en transitoria no da rendimientos muy elevados y plastos, como los sistemas in organello de requiere un procesado rápido del tejido vegetal introducción de ADN en plastos aislados y para evitar la degradación de la proteína métodos in vivo utilizando tecnologías de recombinante. bombardeo de microproyectiles o microinyección. VENTAJAS DE LA EXPRESIÓN TRANSITORIA • Expresión rápida y flexible. • No está influida por efectos de posición. • Puede inducirse en plantas adultas, previniendo cualquier efecto negativo que la proteína recombinante pudiese tener en el desarrollo de la planta. • No es una modificación genética permanente, lo que desde el punto de vista de la seguridad es una ventaja. • Ideal para obtener pequeñas cantidades de proteínas “a medida” en pocas semanas31. 29 30 31 Twyman, R. M.; Stoger, E.; Schillberg, S.; Christou, P.; Fischer, R. (2003). Molecular farming in plants: host systems and expression technology. Trends in Biotechnology, 21, 570-578. Fischer, R.; Stoger, E.; Schillberg, S.; Christou, P.; Twyman, R. M. (2004). Plant-based production of biopharmaceuticals. Current Opinion in Plant Biology, 7, 152–158.. Horn, M. E.; Woodard, S. L.; Howard, J. A. (2004). Plant molecular farming: systems and products. Plant Cell Report, 22, 711-720. 21 2.1.2.1. Agroinfiltración32, 33 2.1.2.2. Vectores Virales 35 Consiste en la infiltración mediante vacío de cepas de Agrobacterium tumefaciens recombinante que La expresión transitoria de proteínas mediante contengan los genes que se desean expresar en la planta. Como en el caso de la transformación planta con virus recombinantes, que contienen las estable mediada por Agrobacterium, las proteínas bajo el control de promotores fuertes. de la bacteria facilitan la transferencia de los genes de interés a algunas de las células de la Los virus infectan la planta y utilizan su hoja. El transgén se introduce en el núcleo celular, pero no se integra en el material genético de la planta. vectores virales consiste en la inoculación de la secuencias que se desean expresar en la planta maquinaria de síntesis proteica para expresar la secuencia que se ha introducido, dando como resultado la acumulación de la proteína En este caso, no es necesario incluir marcadores recombinante36. La secuencia que se desea para seleccionar las células transformadas, ya que expresar, por tanto, nunca se integra en el no es preciso regenerar una planta, lo que permite utilizar plásmidos de menor tamaño. La utilización genoma de la planta y se expresa sólo en la planta de plásmidos permite introducir construcciones de mayor tamaño que utilizando vectores virales. por polen o semillas. Puede elegirse el momento Un inconveniente de la agroinfiltración es que permite producir elevados niveles de proteína recombinante pero durante períodos de tiempo muy infectada, sin que se transmita a la descendencia del desarrollo en el que se desea infectar la planta con el fin de evitar posibles problemas que podría causar en el desarrollo la acumulación de la proteína recombinante. cortos, que generalmente son insuficientes para la producción a escala comercial. Este hecho se debe a Pueden usarse distintos tipos de virus vegetales que se producen fenómenos de silenciamiento para la construcción de los vectores, aunque lo postranscripcional. Existen datos que indican que el silenciamiento postranscripcional puede reducirse más frecuente es utilizar virus de cadena sencilla mediante la coexpresión junto con la proteína recombinante de proteínas virales supresoras de la alfalfa y del caupí, el virus X de la patata, el éste, como es el caso de la proteína p19 del virus del potyvirus de la viruela del ciruelo. Las ventajas enanismo ramificado del tomate, que se ha demostrado que es efectiva en Nicotiana que presentan los virus para ser utilizados como benthamiana y en Arabidopsis34. siguiente. 32 33 34 35 36 de ARN, como el virus del mosaico del tabaco, de virus del enanismo ramificado del tomate y el sistemas de expresión se indican en la página Fischer, R.; Stoger, E.; Schillberg, S.; Christou, P.; Twyman, R. M. (2004). Plant-based production of biopharmaceuticals. Current Opinion in Plant Biology, 7, 152–158. Fischer, R.; Vaquero-Martin, C.; Sack, M.; Drossard, J.; Emans, N.; Commandeur, U. (1999). Towards molecular farming in the future: transient protein expression in plants. Biotechnology and Applied Biochemistry, 30, 113-116. Voinnet, O.; Rivas, S.; Mestre. P.; Baulcombe. D. (2003). An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus. The Plant Journal, 33,949-956. Fischer, R.; Vaquero-Martin, C.; Sack, M.; Drossard, J.; Emans, N.; Commandeur, U. (1999). Towards molecular farming in the future: transient protein expression in plants. Biotechnology and Applied Biochemistry, 30, 113-116. Sala, F.; Rigano, M. M.; Barbante, A.; Basso, B.; Walmsley, A. M.; Castiglione, S. (2003). Vaccine antigen production in transgenic plants: strategies, gene constructs and perspectives. Vaccine, 21, 803-808. 22 PLANTAS BIOFACTORÍA VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LA EXPRESIÓN MEDIANTE VECTORES VIRALES Ventajas • Presentan genomas pequeños fácilmente manipulables. • Poseen un elevado nivel de multiplicación que permite altos rendimientos. • Algunos tienen un rango de hospedadores elevado, lo que permite usar un mismo vector con distintas especies. • Puede realizarse una infección simultánea con varios vectores, consiguiendo la producción de distintas proteínas en una misma planta. • Al ser virus vegetales, no existe riesgo de infección a animales o personas. Inconvenientes • Es necesario inocular cada generación de plantas. • Algunas construcciones son inestables, existiendo el riesgo de que se pierdan los transgenes de un tamaño superior a 1 kb. Introducción del vector en el virus Virus transformado Se pone en contacto el virus modificado con la planta Planta infectada con un virus transformado genéticamente Figura 6. Expresión transitoria de proteínas mediante vectores virales. 23 2.2. Estrategias tecnológicas para optimizar la obtención de proteínas recombinantes en plantas Como se ha indicado, uno de los factores críticos en la agricultura molecular es la obtención de una cantidad de proteína suficientemente elevada37 y, en algunos casos, además es necesario que la proteína que se obtiene sea estructuralmente idéntica a la proteína nativa. mani Purificación c za i Producto final ón Proteína recombinante (vacuna comestible) Hu Síntesis Autenticidad estructural Degradación A continuación se indican las estrategias que se Además de obtener un rendimiento elevado de la han desarrollado que permiten aumentar el producción, en el caso de proteínas que serán rendimiento de la producción de proteínas en utilizadas en forma pura, es necesario optimizar la plantas y asegurar la autenticidad estructural. purificación del producto final. A continuación se explicarán de manera detallada las principales estrategias desarrolladas encaminadas a aumentar 2.2.1. Aumento del rendimiento de producción Para conseguir que el rendimiento final de la la síntesis de la proteína recombinante, reducir su degradación y optimizar su purificación. 2.2.1.1. Aumento de la síntesis proteína recombinante sea elevado es necesario optimizar todos los pasos implicados en su Para obtener una elevada producción de la síntesis, así como asegurar su estabilidad una vez proteína recombinante, en primer lugar es sintetizada protegiéndola de la degradación. Las necesario que la expresión de los genes estrategias para conseguir una síntesis proteica introducidos sea elevada. elevada se centran principalmente en optimizar la expresión génica mediante un diseño cuidadoso El material genético que se introduce en la planta del transgén que se va a introducir. En cuanto a la incluye el gen o genes que codifican para la protección contra la degradación, la principal proteína de interés junto con secuencias estrategia consiste en el direccionamiento de las reguladoras que permiten que estos genes se proteínas hacia compartimentos celulares en los expresen correctamente y den lugar a la proteína. que se encuentren protegidas de la degradación. Para optimizar la expresión del gen introducido es 37 Twyman, R. M.; Stoger, E.; Schillberg, S.; Christou, P.; Fischer, R. (2003). Molecular farming in plants: host systems and expression technology. Trends in Biotechnology, 21, 570-578. 24 PLANTAS BIOFACTORÍA necesario elegir de manera adecuada estas proteína en aproximadamente 24 horas. La secuencias. Las principales secuencias reguladoras empresa CropTech Corp. desarrolló un de la expresión son secuencias promotoras, sistema de producción utilizando este secuencias terminadoras, y otras secuencias no promotor, que denominaron MeGa (mechanical traducidas como secuencias líder e intrones38. gene activation) para la producción de glucocerebrosidasa en tabaco40, 41. 39 • Secuencias promotoras . Son secuencias que regulan la transcripción del ADN a ARN. En cuanto a los promotores inducibles Permiten controlar en qué momento y lugar y químicamente existen varios tipos, pero no bajo qué condiciones se expresa el gen todos pueden utilizarse en cultivo de campo. introducido. Se pueden diferenciar varios tipos Las características que debe tener este tipo de promotores: de promotores son: niveles basales de expresión bajos, un tiempo de respuesta – Promotores constitutivos. Son aquellos que rápido, elevada expresión una vez que se hacen que el gen se transcriba en todos los activan y que el compuesto inductor no sea tejidos y en todo momento, sin necesidad de tóxico. En la tabla 2 se indican algunos de estímulos. Se utilizan cuando se desea que la estos promotores42. planta produzca la proteína recombinante en todos sus tejidos. – Promotores específicos de tejido o de órgano. Se trata de promotores que dirigen la – Promotores (regulados) inducibles. Son expresión del gen a determinados tejidos u aquellos promotores que se activan bajo órganos. Se han identificado promotores determinados estímulos, que pueden ser específicos de órganos como hojas, tubérculos, químicos o físicos. En este tipo de promotores frutos o semillas. Cada tipo de promotor se incluyen promotores regulados por factores presenta distintas ventajas y la elección del ambientales o por condiciones fisiológicas de mismo dependerá del tipo de producto que se la planta, que se activan sólo en determinados desee obtener, así como de la plataforma de momentos del desarrollo. Son especialmente producción. Así por ejemplo, pueden utilizarse útiles para la producción de proteínas promotores que se expresen en órganos que recombinantes cuya acumulación en la planta se forman antes de la floración como hojas y tiene efectos desfavorables sobre el tubérculos, previniendo la aparición en el crecimiento, o para prevenir escapes. polen. O bien promotores específicos de tejidos en los que la acumulación de proteínas 38 39 40 41 42 43 44 Un ejemplo de promotor inducible por sea elevada, ya que estos órganos presentan estímulos físicos es el promotor de la enzima un ambiente protector frente a la degradación, hidroxil-3-metilglutaril CoA reductasa 2 como es el caso de las semillas. La expresión (HMGR2) de tomate. Esta enzima se activa en órganos comestibles presenta ventajas para cuando en la planta se produce un daño la expresión de moléculas dirigidas a una mecánico produciéndose la síntesis de la administración por vía oral43, 44. Sala, F.; Rigano, M. M.; Barbante, A.; Basso, B.; Walmsley, A. M.; Castiglione, S.(2003). Vaccine antigen production in transgenic plants: strategies, gene constructs and perspectives. Vaccine, 21, 803-808. Yoshida, K.; Shinmyo, A. (2000). Transgene expression systems in plant, a natural bioreactor. Journal of Bioscience and Bioengineering, 90, 353-362. Ma, J. K.; Drake, P.M.; Christou, P. (2003). The Production of Recombinant Pharmaceultical Proteins in Plants. Nature, 4, 794-805. Fischer, R.; Stoger, E.; Schillberg, S.; Christou, P.; Twyman, R. M. (2004). Plant-based production of biopharmaceuticals. Current Opinion in Plant Biology, 7, 152–158. Voinnet, O.; Rivas, S.; Mestre, P.; Baulcombe, D. (2003). An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus. The Plant Journal, 33, 949-956. Lessard, P. A.; Kulaveerasingam, H.; York, G. M.; Strong, A.; Sinskey, A. J. (2002). Manipulating gene expression for the metabolic engineering of plants. Metabolic Engineering, 4, 67-79. Yoshida, K.; Shinmyo, A. (2000). Transgene expression systems in plant, a natural bioreactor. Journal of Bioscience and Bioengineering, 90, 353-362. 25 PROMOTORES UTILIZADOS EN AGRICULTURA MOLECULAR Promotores constitutivos Nombre Origen 35 S Virus del Mosaico de la Coliflor (CaMV) Ubiquitina-1 Vegetal Actina Vegetal Promotores inducibles Nombre Inductor Probado en GVHvEcR Tebufenozida Tabaco GVCfEcR Metoxifenozida Maíz y tabaco AlcR Etanol Arabidopsis, tabaco y patata ADEI Cobre Arabidopsis y tabaco PR-1a Benzotiadiazol Tabaco In2-2 Agroquímicos Arabidopsis MeGa Daño mecánico Tabaco Promotores específicos de tejido Tejido Nombre β-conglicinina Opaque-2 AmA27 OsGT1 Lox de guisante Psl de guisante NapA de colza Bn-III de colza Semillas Arc5-I de judía Phas de judía α-bcsp de soja P-Lh de Lesquerella Amy1A de arroz GluB-1 de arroz Z4 de maíz Tapuro-b de trigo Fruto 2A11 de tomate Patatin Tubérculos StMPI Hojas Lhcb3 de Arabidopsis Polen Lat52 Tabla 2. Ejemplos de promotores utilizados en agricultura molecular45, 46. 45 46 Lessard, P. A.; Kulaveerasingam, H.; York, G. M.; Strong, A.; Sinskey, A. J. (2002). Manipulating gene expression for the metabolic engineering of plants. Metabolic Engineering, 4, 67-79. Yoshida, K.; Shinmyo, A. (2000). Transgene expression systems in plant, a natural bioreactor. Journal of Bioscience and Bioengineering, 90, 353-362. 26 PLANTAS BIOFACTORÍA • Secuencias terminadoras de la transcripción. Son secuencias que influyen en la estabilidad del mRNA. Las secuencias terminadoras más utilizadas son las señales de poliadenilación derivadas del gen de la nopalina sintasa de Agrobacterium tumefaciens y del gen ssu del guisante47. Existen estudios que señalan otros terminadores que podrían ser más efectivos, al menos en dicotiledóneas, como las regiones no codificadoras en 3´ del gen Me1 y del gen H3 de la histona de trigo48. • Otras secuencias. En este tipo de secuencias se incluyen intrones y secuencias líder en 5’. Los intrones son secuencias de ADN que son transcritas a ARN y que posteriormente se eliminan durante el proceso de maduración, de modo que no se traducen a proteínas. No se conoce bien el mecanismo por el que producen el aumento de la expresión, pero distintos estudios señalan que influyen tanto el tipo de intrón del que se trate, como su posición, siendo los más adecuados los que se encuentran en la región 5’ codificante. Algunos ejemplos de intrones que se han utilizado para aumentar la expresión son el intrón 1 del gen de la actina de arroz, el intrón 1 del gen de la ubiquitina de maíz, el intrón 1 del gen de la sacarosa sintasa de maíz y el intrón 1 del gen de la alcohol deshidrogenasa de maíz49. Entre las secuencias líder en 5’ no traducidas que aumentan la expresión se encuentra la secuencia líder en 5’ derivada del virus del mosaico del tabaco, denominada secuencia omega50. 47 48 49 50 51 52 • Eliminación del silenciamiento. El silenciamiento es un conjunto de fenómenos epigenéticos que pueden inhibir la expresión de los transgenes tanto a nivel transcripcional como postranscripcional. Es muy importante tenerlo en cuenta a la hora de diseñar una planta transgénica, ya que puede dar lugar a la ausencia de expresión de la proteína recombinante. El silenciamiento transcripcional se relaciona con la inserción del transgén cerca de zonas de cromatina inactiva. La transformación de cloroplastos es la principal estrategia para eliminar este tipo de silenciamiento, ya que la inserción del transgén no se produce al azar, sino que ocurre por recombinación homóloga en lugares determinados51. El silenciamiento postranscripcional en plantas parece estar relacionado con mecanismos de defensa frente a virus vegetales, mediante la degradación del material genético de los mismos. Existen investigaciones que señalan la existencia de determinados virus que expresan proteínas virales supresoras del silenciamiento como es el caso de la proteína p19 del virus del enanismo ramificado del tomate. Se ha demostrado que la coexpresión de la proteína recombinante de interés junto con esta proteína supresora, es efectiva para reducir el silenciamiento postranscripcional en Nicotiana benthamiana y en Arabidopsis52. Se ha descrito otro tipo de secuencias denominadas MARS (matrix attachment regions) que facilitan la unión a la matriz nuclear. La Ma, J. K.; Drake, P. M.; Christou, P. (2003). The Production of Recombinant Pharmaceultical Proteins in Plants. Nature, 4, 794-805. Lessard, P. A.; Kulaveerasingam, H.; York, G. M.; Strong, A.; Sinskey, A. J. (2002). Manipulating gene expression for the metabolic engineering of plants. Metabolic Engineering, 4, 67-79. Lessard, P. A.; Kulaveerasingam, H.; York, G. M.; Strong, A.; Sinskey, A. J. (2002). Manipulating gene expression for the metabolic engineering of plants. Metabolic Engineering, 4, 67-79. Fischer, R.; Twyman, R. M.; Schillberg, S. (2003). Production of antibodies in plants and their use for global health. Vaccine, 21, 820–825. Yoshida, K.; Shinmyo, A. (2000). Transgene expression systems in plant, a natural bioreactor. Journal of Bioscience and Bioengineering, 90, 353-362. Voinnet, O.; Rivas, S.; Mestre. P.; Baulcombe. D. (2003). An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus. The Plant Journal, 33,949-956. 27 inclusión de estas secuencias en los extremos del compartimentos celulares u orgánulos en los que trasgén no sólo parece aumentar la expresión del ésta se encuentre protegida. El direccionamiento gen, sino que además reduce los fenómenos de de proteínas se lleva a cabo mediante secuencias silenciamiento. denominadas péptido señal que se encuentran en la proteína y contienen información sobre el lugar 2.2.1.2. Protección contra la degradación. Aumento de la estabilidad53, 54 El rendimiento total se refiere a la proteína almacenada en los tejidos de la planta, por lo que además de conseguir una elevada síntesis de la hacia el que debe dirigir55. Los compartimentos celulares que presentan un ambiente favorable para el almacenamiento de proteínas hacia los que se puede realizar un direccionamiento de las mismas son retículo endoplásmico (RE), vacuolas y cloroplastos. proteína recombinante, es necesario lograr que permanezca estable y evitar que sea degradada Existe otra estrategia para proteger a las proteínas por los sistemas proteolíticos que posee la célula de la degradación que es la acumulación en para eliminar las proteínas foráneas. semillas. Las semillas son órganos de la planta que presentan un alto contenido en proteínas y un La síntesis de las proteínas nativas de la planta se ambiente protector contra la degradación de las produce en el citosol de la célula, donde pueden mismas debido a su bajo contenido en humedad. ser liberadas o bien dirigirse hacia otros La acumulación en este órgano puede realizarse, compartimentos celulares. Uno de los principales tal y como se ha indicado en el apartado dedicado sistemas que permiten proteger a las proteínas de a los promotores, mediante el uso de promotores la degradación es el direccionamiento hacia específicos de semillas. DIRECCIONAMIENTO DE PROTEÍNAS HACIA COMPARTIMENTOS CELULARES Retículo endoplásmico (RE) Es un compartimento celular que presenta un ambiente favorable para la acumulación de proteínas debido a la baja cantidad de proteasas que contiene, así como a su ambiente oxidante. El direccionamiento de proteínas hacia este orgánulo permite una acumulación de varios órdenes de magnitud mayor que la acumulación en el citoplasma. Presenta otras ventajas relacionadas con la conformación y maduración de la proteína, que se explicarán más adelante. Para realizar el direccionamiento hacia el RE es necesario adicionar en el extremo amino terminal de la proteína péptidos señal. Una vez en el RE, en caso de que no existan más señales, la proteína pasará al aparato de Golgi y de aquí al espacio que existe entre la membrana plasmática y la pared celular (apoplasto), desde donde las proteínas de menor tamaño serán secretadas y las de mayor tamaño quedarán retenidas. Para conseguir que las proteínas queden retenidas en el RE se adiciona un péptido denominado H/KDEL en el extremo carboxilo terminal, consiguiendo que las proteínas que han pasado al aparato de Golgi regresen al RE. Este péptido es la señal que llevan las proteínas residentes en el RE y su adición a las proteínas evita que se produzcan las modificaciones que ocurren en el aparato de Golgi56, 57. (continúa en página siguiente) 53 54 55 56 57 Twyman, R. M.; Stoger, E.; Schillberg, S.; Christou, P.; Fischer, R. (2003). Molecular farming in plants: host systems and expression technology. Trends in Biotechnology, 21, 570-578. Ma, J. K.; Drake, P.M.; Christou, P. (2003). The Production of Recombinant Pharmaceultical Proteins in Plants. Nature, 4, 794-805. Lessard, P. A.; Kulaveerasingam, H.; York, G. M.; Strong, A.; Sinskey, A. J. (2002). Manipulating gene expression for the metabolic engineering of plants. Metabolic Engineering, 4, 67-79. Twyman, R. M.; Stoger, E.; Schillberg, S.; Christou, P.; Fischer, R. (2003). Molecular farming in plants: host systems and expression technology. Trends in Biotechnology, 21, 570-578. Fischer, R.; Stoger, E.; Schillberg, S.; Christou, P.; Twyman, R. M. (2004). Plant-based production of biopharmaceuticals. Current Opinion in Plant Biology, 7, 152–158. 28 PLANTAS BIOFACTORÍA DIRECCIONAMIENTO DE PROTEÍNAS HACIA COMPARTIMENTOS CELULARES (continuación) Vacuolas Las células vegetales poseen distintos tipos de vacuolas con diferentes funciones, entre las que se incluyen vacuolas de acumulación de proteínas. La acumulación de proteínas en estas vacuolas se produce mediante secuencias específicas denominadas determinantes de direccionamiento vacuolar C-terminal (ct-VSD en sus siglas en inglés), que dirigen a las proteínas procedentes del RE o del aparato de Golgi hacia la vacuola. Se han identificado secuencias ct-VSD en pro-regiones de proteínas de almacenamiento como en la lectina de la cebada y la albúmina 2S de la nuez de brasil, y en proteínas relacionadas con patogénesis como la osmotina, chitinasa y β-1,3-glucanasa. A pesar de la identificación de estas secuencias, los datos sobre el direccionamiento de proteínas recombinantes a este tipo de vacuolas parecen insuficientes para el desarrollo de un sistema de acumulación de proteínas en elevada concentración en estos orgánulos58, 59. Cloroplastos En el apartado dedicado a las tecnologías de transformación se han explicado en detalle las tecnologías que permiten la expresión de proteínas en cloroplastos mediante la inserción del material genético que codifica para las mismas en el material genético del cloroplasto. Otra alternativa que permite acumular proteínas en este orgánulo es el direccionamiento de proteínas sintetizadas en el citosol hacia el cloroplasto, mediante la adición en el extremo amino terminal de la secuencia de los 23 primeros aminoácidos de la subunidad pequeña de la proteína rubisco de guisante60. 2.2.1.3. Aumento del rendimiento de la purificación coste de su extracción y purificación es muy elevado, pudiendo llegar a ser el 95% del coste de producción, principalmente en proteínas en las Puede ocurrir que el producto de interés que se que se requiere un grado de pureza alto. El grado produce en una planta pueda utilizarse sin de pureza dependerá del tipo de uso que tendrá la purificar, como sería el caso de la expresión proteína recombinante. En el caso de productos de productos de administración en tejidos uso terapéutico que se administrarán por vía comestibles. No obstante, lo más frecuente es que parenteral se necesita un grado de pureza muy el producto deba ser extraído y purificado. elevado y se deben cumplir las indicaciones de la agencia de control correspondiente (FDA, La extracción del producto de interés incluye una EMEA, etc.). En los productos para uso industrial serie de etapas comunes en la extracción de la como enzimas, por ejemplo, generalmente no se proteína que son el pre-procesamiento del requiere un grado de pureza tan alto. material mediante molienda o troceado, la extracción de las proteínas y una posterior Un elevado contenido de proteína facilita la purificación61. purificación, pero como se ha indicado, no siempre es posible conseguirlo, de modo que es necesario La etapa de purificación de las proteínas el desarrollo de métodos de purificación que recombinantes es una etapa clave, debido a que el permitan recuperar gran parte de la proteína a 58 59 60 61 Yoshida, K.; Matsui, T.; Shinmyo, A. (2004). The plant vesicular transport engineering for production of useful recombinant proteins. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 28, 167-171. Jiang, L.; Sun, S-M. (2002). Membrane anchors for vacuolar targeting: application in plant bioreactors. Trends in Biotechnology, 20, 99-102. Lessard, P. A.; Kulaveerasingam, H.; York, G. M.; Strong, A.; Sinskey, A. J. (2002). Manipulating gene expression for the metabolic engineering of plants. Metabolic Engineering, 4, 67-79. Nikolov, Z. L.; Woodard, S. L. (2004). Downstream processing of recombinant proteins from transgenic feedstock. Current Opinion in Biotechnology, 15, 479-486. 29 costes económicos. A continuación se indican lipídicos del grano, pasando a formar parte de algunas de las estrategias: esta estructura. Posteriormente las semillas se molturan y mediante centrifugación se separa la fracción lipídica en la que está incluida la • Proteínas de fusión. Consiste en fusionar la proteína de fusión. proteína de interés a una proteína que presenta afinidad por distintos componentes celulares. A continuación se indican algunos ejemplos: La purificación de la proteína recombinante se realiza finalmente mediante tratamiento con – Proteínas de fusión con oleosinas. Las una endoproteasa que rompe la proteína de oleosinas son proteínas lipofílicas que se fusión, quedando la proteína recombinante expresan en semillas oleaginosas y forman libre y la oleosina unida a los cuerpos lipídicos, parte de estructuras denominadas cuerpos que se separan de nuevo por centrifugación. lipídicos, en los que se almacenan aceites. La La proteína de fusión permanece estable en fusión se realiza mediante ingeniería genética las semillas desecadas durante largos períodos añadiendo al gen de la proteína de interés el de tiempo y en los cuerpos lipídicos durante gen de la oleosina, y se combina con una 3 ó 4 semanas de media62. Es un método expresión dirigida en el grano, donde la patentado por la empresa SemBioSys concentración de aceite es mayor. Genetics Inc.; que se ha utilizado para la producción de hirudina, proteína La presencia de la oleosina hace que la anticoagulante producida por las glándulas proteína de fusión se dirija hacia los cuerpos salivares de la sanguijuela. Secuencia genética de la oleosina Secuencia genética de la proteína de interés Material genético de la planta Célula modificada genéticamente Proteína de interés Oleosina Cártamo Cártamo modificado genéticamente Cuerpo lipídico Semillas Adición de la proteasa Fracción lipídica Fracción proteica Molturación de las semillas Centrifugación Figura 7. Proteínas de fusión con oleosinas. 62 Van Rooijen, G. J.; Moloney, M. M. (1995). Plant seed oil-bodies as carriers for foreign proteins. Biotechnology, 13, 72-77. 30 PLANTAS BIOFACTORÍA – Fusión de oleosinas con la proteína A para purificación de anticuerpos. Esta tecnología es una adaptación de la fusión con oleosinas para la purificación de anticuerpos producidos en cártamo. En la planta se producen dos proteínas recombinantes que son el anticuerpo de interés y una proteína de fusión compuesta por una oleosina fusionada a la proteína A, que es una proteína con gran afinidad por los anticuerpos. La producción de las proteínas se dirige para que se sinteticen en compartimentos celulares Secuencia genética de la oleosina distintos y no exista contacto entre ambas durante el crecimiento de la planta. Una vez que se muele el grano y las proteínas entran en contacto, se forman complejos entre el anticuerpo y la proteína A que está anclada a los cuerpos lipídicos a través de la oleosina. Al igual que sucede con la hirudina, se separa la fase lipídica y, en este caso, mediante tratamiento con ácido se produce la disociación de los complejos formados por el anticuerpo y la proteína A unida a la oleosina. Secuencia genética de la Proteína A Célula modificada genéticamente Material genético de la planta Anticuerpo Retículo endoplásmico Cártamo Proteína A Oleosina Cártamo modificado genéticamente Cuerpo lipídico Semillas Complejos Anticuerpo y Proteína A-Oleosina Anticuerpos libres Acidificación y lavados Molturación de las semillas Anticuerpo Proteína A Oleosina Figura 8. Fusión de oleosinas con la proteína A. 31 – Fusión de la proteína recombinante a 2.2.2. Autenticidad estructural 66 dominios de membrana. Los dominios de membrana permiten anclar la proteína de fusión a la membrana plasmática, que se puede aislar de una manera sencilla. Una vez aisladas las membranas en las que se encuentra la proteína de fusión, ésta se extrae mediante el uso de detergentes y disoluciones reguladoras. Además, el anclaje de las proteínas a la membrana las protege de la degradación. Existen distintos dominios con estas funciones como el dominio de membrana del receptor de la célula T humana63, o los motivos dilisina o diarginina64. • Direccionamiento a la vía secretora. Existen dos estrategias descritas recientemente que son la rizosecreción y la filosecreción y consisten en la secreción de la proteína recombinante por exudados de las raíces o de las hojas. Estas estrategias permiten obviar el paso de extracción de los tejidos, aunque presentan otros inconvenientes relacionados con la Existen proteínas relativamente simples como es el caso de la insulina, el interferón o la hormona de crecimiento humano que no requieren un procesamiento postraduccional o plegamientos para tener actividad biológica, pero en la mayor parte de los casos este tipo de modificaciones son necesarias para que la proteína sea activa. Las plantas son capaces de realizar algunas de estas modificaciones postraduccionales, siendo ésta una de sus principales ventajas frente a otros sistemas de expresión como bacterias y levaduras. Los anticuerpos son un ejemplo de proteínas formadas por varias cadenas que deben plegarse y ensamblarse con el fin de que la molécula sea funcional. El retículo endoplásmico posee el ambiente necesario para que se produzca el plegado y ensamblado de las cadenas, por lo que es preciso el direccionamiento de las cadenas que forman los anticuerpos hacia este compartimento. recolección de los exudados. En el retículo endoplásmico además del plegado y En el caso de la rizosecreción puede dirigirse la ensamblado de las cadenas de los anticuerpos se producción de la proteína recombinante hacia las produce una modificación postraduccional raíces e inducirse la formación de raíces aéreas, denominada glicosilación. de modo que la proteína puede recuperarse mediante cultivo hidropónico. La glicosilación consiste en la adición de precursores de oligosacáridos, denominados En el caso de las secreciones por las hojas se N-glicanos, en aminoácidos específicos de la trata de la gutación, que es un fenómeno que cadena polipeptídica. Las proteínas en el retículo ocurre de manera natural en las plantas. La endoplásmico se van transportando hacia el gutación consiste en el exudado de gotas de aparato de Golgi y durante este transporte el líquido en los márgenes de las hojas, N-glicano añadido va sufriendo reacciones de principalmente en estructuras denominadas maduración que consisten en la eliminación y hidátodos, aunque puede ocurrir también a adición de distintos residuos de azúcares. través de la cutícula y de los estomas. Mediante el direccionamiento de la proteína recombinante La N-glicosilación en plantas es ligeramente diferente hacia el retículo endoplásmico, se consigue la a la glicosilación que realizan los mamíferos debido a secreción de la proteína hacia el apoplasto de las las modificaciones que ocurren en el aparato de Golgi hojas, de donde pasa al fluido secretado lejano. Las diferencias consisten en la adición de mediante la gutación65. residuos de xilosa y cambios en los enlaces que unen las fucosas, que en mamíferos son de tipo α-(1,6) y 63 64 65 66 Ambos sistemas constituyen sistemas de en plantas son de tipo α-(1,3). Además, en el caso producción de proteínas recombinantes de mamíferos se añade ácido siálico, que parece que continuos y no destructivos. está implicado en tiempos más largos de eliminación Fischer, R.; Stoger, E.; Schillberg, S.; Christou, P.; Twyman, R. M. (2004). Plant-based production of biopharmaceuticals. Current Opinion in Plant Biology, 7, 152–158. Lessard, P. A.; Kulaveerasingam, H.; York, G. M.; Strong, A.; Sinskey, A. J. (2002). Manipulating gene expression for the metabolic engineering of plants. Metabolic Engineering, 4, 67-79. Komarnytsky, S.; Borisjuk, N. V.; Borisjuk, L. G.; Alam, M. Z.; Raskin, I. (2000). Production of Recombinant Proteins in Tobacco Guttation Fluid. Plant Physiology, 124, 927–933. Gomord, V.; Faye, L. (2004). Posttranslational modification of therapeutic proteins in plants. Current Opinion in Plant Biotechnology, 7, 171-181. 32 PLANTAS BIOFACTORÍA de las proteínas del torrente circulatorio. Estas dar lugar a la aparición de respuestas alérgicas en diferencias, aunque parecen pequeñas, podrían tener personas, debido a que los residuos de fucosa efectos en la actividad, la distribución y la vida media α-(1,3) y xilosa forman parte de epítopos de de las proteínas recombinantes. determinados alérgenos de plantas y se han encontrado anticuerpos en suero humano que son Existen estudios que indican la existencia de reactivos contra estos residuos. Aunque la diferencias en la glicosilación entre distintas existencia de anticuerpos contra este tipo de especies, y dentro de una misma especie en glicanos en el suero no implica una reacción diferentes estados del desarrollo. Este hecho debe adversa, parece que su presencia podría inducir ser tenido en cuenta a la hora de elegir la planta una eliminación más rápida de este tipo de que se usará como biofactoría, aunque todas las proteínas del torrente sanguíneo, lo cual unido a la especies que se han usado hasta ahora para ausencia del ácido siálico, que aumenta el tiempo producir proteínas terapéuticas tienen la de eliminación, podría comprometer su eficacia capacidad de asociar los residuos de fucosa y de terapéutica in vivo 68. 67 xilosa tal y como se ha indicado . Todo esto ha llevado a la búsqueda de estrategias Se ha considerado también la posibilidad de que que permitan “humanizar” el patrón de los glicanos específicos de las plantas pudiesen glicosilación de las proteínas en plantas. ESTRATEGIAS DE “HUMANIZACIÓN” DE PROTEÍNAS EN PLANTAS • Almacenamiento de las proteínas en el retículo endoplásmico, evitando que pasen al aparato de Golgi donde se añaden este tipo de residuos. Se consigue mediante la adición de secuencias H/KDEL, como se ha explicado en el apartado de protección contra la degradación. • Inhibición de las enzimas glicosiltransferasas de plantas, que son las enzimas que catalizan la unión de los residuos de N-glicanos. Se han clonado los genes de varias enzimas de este tipo y se ha comprobado en el musgo Physcomitrella patens, que el bloqueo de los genes de dos de estas enzimas previene la producción de los epítopos específicos de plantas sin afectar a la secreción de la proteína. • Expresión de glicosiltransferasas de mamíferos en las plantas. La expresión de estas enzimas en plantas permitiría completar la maquinaria del aparato de Golgi para la maduración de proteínas y podría competir con la maquinaria que realiza las modificaciones específicas de las plantas. • Eliminación de las secuencias de reconocimiento para la N-glicosilación. Esta estrategia se utiliza en aquellos casos en los que no se requiere la glicosilación de la proteína para que sea funcional69. 67 68 69 Elbers, I. J. W.; Stoopen, G. M.; Bakker, H.; H. Stevens, L.; Bardor, M.; Molthoff, J. W.; Jordi, W. J. R. M.; Bosch, D.; Lommen, A. (2001). Influence of growth conditions and developmental stage on N-glycan heterogeneity of transgenic immunoglobulin G and endogenous proteins in tobacco leaves. Plant Physiology, 126 1314–1322. Ma, J. K.; Drake, P. M.; Christou, P. (2003). The Production of Recombinant Pharmaceultical Proteins in Plants. Nature, 4, 794-805. Stoger, E.; Sack, M.; Fischer, R.; Christou, P. (2002). Plantibodies: applications, advantages and bottlenecks. Current Opinion in Biotechnology, 13, 161-166. 33 TECNOLOGÍAS DISEÑADAS PARA REDUCIR EL IMPACTO DE LOS FACTORES CRÍTICOS DE LAS PLANTAS BIOFACTORÍA Factores Críticos Tecnologías Uso de promotores constitutivos, inducibles y específicos de tejido. Secuencias terminadoras. Intrones y secuencias líder. Eliminación del silenciamiento. Baja producción Direccionamiento a orgánulos (retículo endoplásmico, vacuolas, membranas celulares y cloroplastos). Transformación de cloroplastos. Proteínas de fusión. Direccionamiento a la vía secretora. Direccionamiento a retículo endoplásmico. Inhibición de las enzimas implicadas en la glicosilación en plantas. Autenticidad estructural Expresión de enzimas implicadas en la glicosilación en mamíferos. Inhibición de la glicosilación mediante la eliminación de los lugares de glicosilación. Tiempos de desarrollo largos Expresión transitoria. Transformación de cloroplastos. Riesgos por flujo de polen Expresión transitoria. Androesterilidad. Riesgo de ingestión por animales silvestres Riesgo de contaminación de semillas Riesgo de entrada en la cadena alimentaria Promotores inducibles tras el cosechado por daño mecánico. Expresión de la proteína en forma inactiva que debe ser procesada (proteínas de fusión). Uso de genes “terminator”. Promotores inducibles tras el cosechado. Direccionamiento a retículo endoplásmico. Inhibición de las enzimas implicadas en la glicosilación en plantas. Riesgos de alergias Expresión de enzimas implicadas en la glicosilación en mamíferos. Inhibición de la glicosilación mediante la eliminación de los lugares de glicosilación. Tabla 3. Resumen de las tecnologías diseñadas para reducir el impacto de los factores críticos de las plantas biofactoría. 34 PLANTAS BIOFACTORÍA 3. Cultivos de interés en agricultura molecular Existe un número elevado de cultivos, entre los cuanto a pureza. Por ejemplo, para proteínas que que se incluyen tabaco, cereales, tienen un elevado valor económico se podría leguminosas, frutas, hortalizas, etc., que son justificar la utilización de plantas cuyo cultivo resulte susceptibles de ser utilizados como biofactorías de más caro, o para proteínas que se administren por moléculas de interés. vía oral sería necesario usar plantas comestibles70. Por tanto, la elección del cultivo que se va a utilizar Aunque existen una serie de factores importantes a para la expresión de una proteína recombinante tener en cuenta a la hora de realizar la elección del debe hacerse de manera individual para cada tipo de cultivo, como el rendimiento, la estabilidad del tejido proteína. en el que se expresa la proteína, el coste de almacenaje y distribución, la facilidad de purificación, Una vez seleccionado el cultivo, en función del riesgos ambientales, etc., no existe una norma órgano o tejido en el que se desee expresar la general que pueda seguirse, ya que no todas las proteína recombinante se deberán utilizar los proteínas recombinantes tendrán el mismo precio en promotores más adecuados tal y como se ha el mercado ni tienen los mismos requerimientos en explicado en el apartado de tecnologías. FACTORES A TENER EN CUENTA PARA LA ELECCIÓN DE UN CULTIVO PARA SU USO COMO UNA BIOFACTORÍA • Disponibilidad de protocolos de transformación que permitan expresar la proteína que se desea obtener de la manera más sencilla posible. • Velocidad de escalado. • Rendimiento del cultivo por unidad de superficie cultivada (rendimiento de biomasa). • Rendimiento de la proteína transgénica por unidad de biomasa cosechada. • Coste del cultivo (necesidad de invernaderos o requerimientos de nutrientes especiales). • Existencia de infraestructura que permita la recolección y procesado. • Estabilidad de la proteína en el tejido en el que se acumula. • Coste del almacenamiento y transporte del órgano o tejido de la planta en el que se encuentra la proteína recombinante. • Coste de purificación. • Presencia de sustancias tóxicas que haya que eliminar en el procesado. • Riesgos ambientales de escapes a través de polen o de consumo por animales herbívoros o insectos del tejido que contiene la proteína recombinante. 70 Ma, J. K.; Drake, P.M.; Christou, P. (2003). The Production of Recombinant Pharmaceultical Proteins in Plants. Nature, 4, 794-805. 35 A continuación se indican los cultivos más usados proteínas es necesario realizar un procesado en agricultura molecular. La clasificación no se ha inmediato tras la recolección y, si esto no es realizado teniendo en cuenta la familia a la que posible, debe desecarse o congelarse el tejido. pertenecen, sino el órgano en el que se expresan las proteínas71. Otros posibles inconvenientes que puede presentar la expresión de las proteínas recombinantes en las hojas estarían relacionados con una posible 3.1. Plantas de hoja y forrajeras interferencia en el desarrollo de la planta o con riesgos ambientales debido al consumo de estas hojas por insectos o animales herbívoros. En este grupo de cultivos se incluyen aquellas plantas que se usan en agricultura molecular en las que se produce la acumulación de proteínas en la parte aérea de la planta, principalmente en el tejido foliar, como es el caso del tabaco, alfalfa, lechuga o soja. Las ventajas que presenta este tipo de plantas en general son el elevado rendimiento en biomasa, el Tabaco72 El tabaco (Nicotiana tabacum) es un cultivo con una gran importancia en biotecnología de plantas ya que se utiliza como modelo de experimentación debido principalmente a la facilidad que presenta para ser transformado. Éste es el motivo principal gran potencial para escalado que poseen y la por el que el tabaco es el cultivo más utilizado en existencia de infraestructura para su procesado. agricultura molecular, ya que existen distintos protocolos de expresión de proteínas El inconveniente principal que presentan es debido recombinantes que pueden usarse de manera al elevado contenido en agua que posee el tejido rutinaria en este cultivo. En el siguiente cuadro se foliar, que hace que las proteínas sean inestables y indican las principales ventajas e inconvenientes pueda producirse una disminución del que presenta el tabaco para ser usado como rendimiento. Para evitar o reducir esta pérdida de biofactoría de proteínas recombinantes. VENTAJAS E INCONVENIENTES DEL TABACO COMO BIOFACTORÍA Ventajas • Existe una tecnología muy desarrollada para la transferencia y expresión de genes en tabaco. • Única especie en la que la transformación de cloroplastos se hace de manera rutinaria. • Posee un alto rendimiento de biomasa. • Produce gran cantidad de semillas. • Fácil reproducción. • Potencial para un escalado rápido. • Disponibilidad de infraestructuras para el procesado a gran escala. • No es una planta comestible, por lo que se reduce el riesgo de paso a la cadena alimentaria. • No es necesario completar el ciclo biológico para obtener la proteína recombinante, lo que disminuye el riesgo de contaminación cruzada. Desventajas • Baja estabilidad de las proteínas en el tejido una vez cosechado, por lo que debe ser congelado o secado para su transporte o procesado. • Posee compuestos fenólicos que se liberan durante la extracción de las proteínas recombinantes. • Produce elevados niveles de alcaloides tóxicos, aunque existen variedades con bajo contenido en alcaloides. • No es comestible, de modo que es necesario purificar la proteína. 71 72 Twyman, R. M.; Stoger, E.; Schillberg, S.; Christou, P.; Fischer, R. (2003). Molecular farming in plants: host systems and expression technology. Trends in Biotechnology, 21, 570-578. Ma, J. K.; Drake, P. M.; Christou, P. (2003). The Production of Recombinant Pharmaceultical Proteins in Plants. Nature, 4, 794-805. 36 PLANTAS BIOFACTORÍA En la mayor parte de los casos se usa transformación nuclear para la producción de Existe una compañía canadiense llamada proteínas en tejido foliar pero, como se ha permiten acumular niveles elevados de proteínas indicado en el apartado de tecnologías, puede en las hojas de alfalfa. Medicago, que ha aislado nuevos promotores que realizarse un direccionamiento hacia la vía secretora consiguiendo que las proteínas se exuden por las hojas o por las raíces. Esta tecnología está bajo desarrollo comercial para la producción de fosfatasa alcalina humana Otras especies secretada por la empresa Phytomedics Inc. Existen otras especies de plantas de hoja que se Otras empresas que han elegido el tabaco como están usando para producir proteínas plataforma son Planet Biotechnology, Meristem Therapeutics, Plant Biotechnology recombinantes como por ejemplo la lechuga, la Inc y Chlorogen, así como la empresa española ventaja frente a la alfalfa y el tabaco de ser Plant Bioproducts. comestibles. Se están utilizando para la expresión soja y las espinacas. Estas plantas presentan la de antígenos para elaborar vacunas comestibles. Como se ha indicado en el apartado de tecnologías se puede hacer transformación de cloroplastos de En el caso de la lechuga se han realizado ensayos manera rutinaria generalmente mediante hepatitis B73 y el caso de las espinacas se ha bombardeo con microproyectiles con las ventajas expresado un antígeno del antrax74. clínicos para una vacuna contra el virus de la que presenta este tipo de transformación. La soja al igual que la alfalfa pertenece a la familia de las leguminosas y puede fijar nitrógeno de la Alfalfa atmósfera. Se ha utilizado para producir la fitasa de un hongo llamado Aspergillus. La alfalfa (Medicago sativa) es una planta perteneciente a la familia de las leguminosas, que posee un enorme rendimiento de biomasa debido a que es perenne. Esto significa que la planta puede ser segada sin que muera, pudiendo realizarse hasta nueve siegas por año, tras las cuales la planta vuelve a crecer produciendo hojas exactamente iguales a las que se segaron. Además, se puede propagar de manera vegetativa, lo que permite la obtención de 3.2. Semillas de cereales y leguminosas En este tipo de cultivos se incluyen plantas en las que la acumulación de la proteína recombinante se realiza en las semillas como es el caso de las leguminosas de grano y los cereales. Estos “clones” idénticos, sin necesidad de que exista cultivos se caracterizan por producir semillas que floración o formación de semillas. Es además una presentan un elevado contenido de proteínas, que planta capaz de fijar el nitrógeno atmosférico, de modo que permite reducir los aportes de nitrógeno pueden secarse fácilmente y almacenarse a en forma de abonos. durante muchos meses, debido a que presentan temperatura ambiente sin pérdida de propiedades un ambiente protector frente a la degradación La alfalfa se emplea para alimentación animal, lo proteica. La utilización de promotores específicos cual tiene la ventaja de que podría utilizarse para de semillas hace que la producción en este tipo de la expresión de vacunas comestibles para animales, pero tiene el inconveniente de que cultivos pueda llegar a ser muy elevada. puede pasar a la cadena alimentaria. Otro Los cereales en los que se ha investigado son inconveniente que presenta esta planta es que contiene grandes cantidades de ácido oxálico. arroz, trigo y maíz, y entre las leguminosas 73 74 destacan el guisante y la soja. Kapusta, J.; Modelska, A.; Figlerowicz, M.; Pniewski, T.; Letellier, M.; Lisowa, O.; Yusibov, V.; Koprowski, H.; Plucienniczak, A.; Legocki, A. B. (1999). A plant-derived edible vaccine against hepatitis B virus. The FASEB Journal, 13, 1796-1799. Sussman, H. E. (2003). Spinach makes a safer anthrax vaccine. Drug Discovery Today, 8, 428-430. 37 Desde el punto de vista económico la soja y el La principal desventaja que presenta la patata es maíz son los cultivos más eficientes para la que aunque los tubérculos pueden consumirse producción de proteínas recombinantes. crudos, son poco palatables, por lo que sería necesario cocinarlos ligeramente lo que puede El maíz es el cereal elegido por Prodigene Inc llevar a una pérdida de proteínas por para la producción de proteínas. Las ventajas que desnaturalización. presenta este cereal son el elevado rendimiento en biomasa y la existencia de infraestructuras y Se han realizado al menos tres estudios clínicos maquinaria para su recolección y transformación. hasta el momento en los que se han administrado patatas transgénicas que expresan proteínas de interés biosanitario a personas. 3.3. Frutas, tubérculos y hortalizas75 Hortalizas En este grupo se incluyen plantas en las que la acumulación de la proteína recombinante se hace La hortaliza más utilizada para expresar proteínas en órganos comestibles de la planta, que pueden recombinantes es el tomate. Al igual que ocurre consumirse crudos o con un procesado mínimo, con la patata, existen sistemas de expresión de como es el caso de las frutas, tubérculos y proteínas recombinantes muy eficientes y se hortalizas. El interés de expresar proteínas dispone de promotores específicos para la recombinantes en órganos comestibles es la expresión en el fruto. Otras ventajas son la obtención de productos que puedan administrarse posibilidad de consumo en crudo y la posibilidad por vía oral sin necesidad de purificación, lo que de expresar varios antígenos en una misma planta les hace especialmente útiles para la obtención de mediante cruzamiento. vacunas de subunidades, aditivos y proteínas utilizadas en inmunoterapia pasiva tópica. Entre los inconvenientes principales se encuentra el bajo contenido en proteínas que presenta el fruto. Además algunos frutos pueden contener Tubérculos Los principales tubérculos en los que se pueden expresar proteínas recombinantes son patatas y zanahorias. La patata es una planta muy útil para expresar elevadas cantidades de ácidos, que son incompatibles con muchos antígenos y pueden hacer que los frutos no sean adecuados para su administración a niños de corta edad. Otro inconveniente es la ausencia de un sistema in vitro para evaluar la expresión de la proteína recombinante en el fruto. proteínas recombinantes, ya que es fácil de transformar y existen promotores específicos que permiten expresar las proteínas en el tubérculo. Frutas Además se puede propagar de manera clonal mediante la siembra de tubérculos sin que exista Existe un gran interés en expresar proteínas floración ni formación de semillas, previniendo el recombinantes en bananas, debido a que el riesgo de contaminación cruzada. banano es un árbol muy cultivado en países en 75 Mason, H. S.; Warzecha, H.; Mor, T.; Arntzen, C. J. (2002). Edible plant vaccines: applications for prophylactic and therapeutic molecular medicine. Trends in Molecular Medicine, 8, 324-329. 38 PLANTAS BIOFACTORÍA desarrollo. Este árbol puede ser propagado de manera clonal y una vez que ha alcanzado la madurez produce frutos de manera abundante con ciclos de 10 a 12 meses. Estos frutos pueden ser consumidos tanto por adultos como por niños. Este cultivo presenta algunos inconvenientes ya que no existen sistemas de transformación eficientes y se dispone de pocos datos sobre expresión génica, especialmente en lo referente a promotores específicos del fruto. Además requiere espacios muy grandes que resultan muy caros si es necesario cultivar en invernadero. 3.4. Oleaginosas y fibra En este apartado se incluyen especies que se caracterizan por producir semillas con un elevado contenido en aceites como soja o cánola y otras que además producen fibras como es el caso del algodón y el lino. Este tipo de plantas es muy interesante para su utilización en ingeniería metabólica de lípidos, ya que de manera natural contienen rutas de síntesis de compuestos lipídicos y producen éstos en cantidades elevadas. Además, como se ha indicado existen estrategias de purificación que se basan en el anclaje de la proteína recombinante a cuerpos lipídicos que conviene utilizar en plantas que produzcan semillas con alto contenido en aceites. Las especies productoras de fibras como el lino tienen interés en ingeniería metabólica para la producción de materiales formados por combinación de fibras y bioplásticos76. 76 Wróbel, M.; Zebrowski, J.; Szopa, J. (2004). Polyhydroxybutyrate synthesis in transgenic flax. Journal of Biotechnology, 107, 41-54. 39 VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LOS CULTIVOS UTILIZADOS EN AGRICULTURA MOLECULAR Plantas de hoja Ventajas – Gran potencial para el escalado. Inconvenientes – Elevado rendimiento de biomasa. – Elevado contenido en agua que hace las proteínas inestables. – Existencia de infraestructura para su procesamiento. – Se puede cosechar antes de la floración previniendo la liberación de polen y los riesgos de contaminación cruzada que esto implica. – Necesidad de congelado o desecación inmediatos de las hojas para evitar la degradación. – La acumulación de proteínas recombinantes en las hojas podría interferir en el desarrollo de la planta. – Riesgos ambientales por un posible consumo de las hojas por animales herbívoros o insectos. Inconvenientes Ventajas Semillas de cereales y leguminosas – Permiten almacenar las proteínas en las semillas de manera estable durante años incluso a temperatura ambiente. – No contienen los compuestos fenólicos que presentan las hojas de tabaco. – La exposición a herbívoros es menor que en plantas de hoja. – Es necesario que ocurra un ciclo floral para producir semillas. – La purificación es más compleja que en hojas y tiene un coste mayor. Ventajas Frutas, tubérculos y hortalizas – Son órganos que pueden consumirse crudos o semicocinados, permitiendo la producción de vacunas de subunidades, nutracéuticos y anticuerpos para aplicaciones orales. – Los tubérculos pueden almacenarse a temperatura ambiente. – No presentan compuestos tóxicos. Inconvenientes – Purificación más económica que en semillas. – Muchas necesitan cultivarse en invernadero, lo que aumenta el coste. Inconvenientes Ventajas Fibra y oleaginosas – Muy útiles para la purificación mediante fusión a oleosinas. – Existencia de infraestructura para su procesamiento. – Permiten almacenar las proteínas en las semillas de manera estable durante años incluso a temperatura ambiente. – La fibra y el aceite pueden interferir en el procesado por lo que se aplica para proteínas que no necesitan estar muy purificadas. – Es necesario que ocurra un ciclo floral para producir semillas. Tabla 4. Ventajas e inconvenientes de los distintos cultivos utilizados en agricultura molecular. 40 PLANTAS BIOFACTORÍA 4. Moléculas de interés El número de moléculas que potencialmente se pueden obtener utilizando plantas modificadas genéticamente como biofactorías es muy elevado. Como se ha indicado se pueden diferenciar a grandes rasgos dos tipos de biofactorías. Por una parte, aquellas en las que la modificación genética conduce a la expresión de una proteína foránea, que es la molécula de interés; y aquellas en las que la modificación genética conduce a la modificación del metabolismo de la planta, como resultado de la cual se sintetiza un compuesto que es la molécula de interés. MOLÉCULAS DE INTERÉS Proteínas recombinantes Interés biosanitario Ingeniería metabólica Interés industrial Modificación de rutas enzimáticas existentes Introducción de nuevas rutas enzimáticas Vacunas Anticuerpos Biofármacos 4.1. Proteínas recombinantes Las proteínas son moléculas complejas formadas por pequeñas subunidades denominadas aminoácidos, cuya secuencia se encuentra codificada en los genes. En muchos casos, para que la proteína sea funcional, es necesario que ocurra una serie de modificaciones postraduccionales. Éstas pueden ser relativamente sencillas como el establecimiento de puentes disulfuro y puentes de hidrógeno entre distintos aminoácidos que conducen a la adquisición de una estructura tridimensional adecuada. Otro tipo de modificaciones más complejas incluye la modificación de aminoácidos concretos y la adición de determinados grupos como fosfatos (fosforilación) o hidratos de carbono (glicosilación), procesos proteolíticos y otros procesos no enzimáticos. Estas modificaciones más complejas en muchas ocasiones ocurren en determinados orgánulos subcelulares y no son comunes en todos los organismos. Esta complejidad estructural hace que la obtención de proteínas mediante síntesis química sea prácticamente imposible, excepto para pequeñas cadenas peptídicas, de modo que sea necesario utilizar sistemas vivos. 4.1.1. Proteínas de interés biosanitario Las plantas presentan un gran potencial para la obtención de moléculas para uso terapéutico debido a sus ventajas en cuanto a seguridad, capacidad de producción y coste. Las principales proteínas de interés biosanitario que pueden obtenerse mediante la modificación genética de plantas son antígenos para elaborar vacunas, anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, proteínas estructurales y otro tipo de biofármacos. En la tabla 5 se incluyen las proteínas de interés sanitario que se están expresando actualmente en plantas. 41 PROTEÍNAS DE INTERÉS BIOSANITARIO EXPRESADAS EN PLANTAS Proteínas de Interés Biosanitario Contra enfermedades infecciosas. Vacunas Contra tumores. Contra enfermedades autoinmunes. Inmunoglobulina G. Anticuerpos Inmunoglobulina A secretora. Fragmentos de anticuerpos. Productos sanguíneos humanos. Hormonas. Reguladores del crecimiento. Biofármacos Enzimas para uso terapéutico. Antitumorales. Antivirales. Analgésicos opiáceos. Proteínas estructurales Colágeno y gelatina. Tabla 5. Proteínas de interés biosanitario expresadas en plantas. 4.1.1.1. Vacunas77 Una vacuna consiste en una preparación de un organismo patógeno completo (atenuado o muerto), o de alguno de sus componentes, que se denominan antígenos, que administrado sea capaz de inducir una respuesta inmune duradera y protectora contra este patógeno. En el caso de que se administre el organismo completo muerto, se trata de vacunas inactivadas, y si está vivo pero atenuado, se habla de vacunas atenuadas. En el caso de las vacunas elaboradas a partir de componentes del patógeno que dan lugar a una respuesta inmune en lugar del patógeno completo, se habla de vacunas de subunidades. Mediante la tecnología del ADN recombinante es posible identificar y aislar los genes del organismo patógeno que codifican para proteínas capaces de inducir la respuesta inmune (antígenos). Estos genes pueden introducirse en plantas y fabricar una biofactoría capaz de producir grandes 77 78 cantidades del antígeno que servirán para elaborar la vacuna contra ese patógeno. El antígeno producido en la planta puede purificarse para su administración por vía parenteral, tal y como se hace en otros sistemas de expresión, o puede realizarse la expresión en plantas o en tejidos comestibles que puedan consumirse crudos o con un procesado mínimo, evitando la etapa de purificación. En este último caso se habla de vacunas comestibles. Además de las ventajas generales de la expresión de proteínas en plantas, la expresión de proteínas o péptidos antigénicos en plantas comestibles presenta ventajas adicionales relacionadas con la facilidad de administración y almacenamiento y con la eliminación de la fase de purificación, que suponen una reducción en el coste. A continuación se incluye un cuadro con las principales ventajas de la expresión de antígenos en plantas para la elaboración de vacunas comestibles78. Sala, F.; Rigano, M. M.; Barbante, A.; Basso, B.; Walmsley, A. M.; Castiglione, S.(2003). Vaccine antigen production in transgenic plants: strategies, gene constructs and perspectives. Vaccine, 21, 803-808. Streatfield, S. J., Howard, J. A. (2003). Plant-based vaccines. International Journal for Parasitology, 33, 479-493. 42 PLANTAS BIOFACTORÍA VENTAJAS DE LAS VACUNAS COMESTIBLES • Permiten una administración en una forma segura y palatable, tal y como se hace con un alimento o con un pienso en el caso de los animales. • Al evitar el uso de jeringuillas y agujas se reducen los costes de material y personal asociados, así como los riesgos relacionados con este tipo de administración. • Su expresión en órganos que se puedan almacenar a temperatura ambiente (semillas de cereales o tubérculos) permitiría eliminar los costes que conlleva la cadena del frío. • Es posible expresar más de un antígeno por planta pudiendo administrarse varias vacunas de forma simultánea. • En el caso de los animales, al evitarse las inyecciones se previenen posibles pérdidas de calidad en las canales de animales de abasto. • Posibilidad de inmunización de animales silvestres reservorio de enfermedades como la rabia (murciélagos y ratas). Todas estas características hacen que este tipo de Por último, la producción de vacunas en plantas vacunas sea muy interesante para su aplicación a comestibles presenta el riesgo de que éstas pasen gran escala, por ejemplo para realizar a la cadena alimentaria con las implicaciones que vacunaciones en zonas subdesarrolladas o para esto tendría para la salud de las personas. La vacunaciones masivas en caso de epidemias o ingestión accidental de este tipo de plantas podría riesgo de ataques terroristas. dar lugar a la inducción de tolerancia oral, que consiste en la inhibición de la respuesta inmune Los principales retos técnicos de la expresión de del organismo frente a determinados antígenos antígenos en plantas para elaborar vacunas presentados por vía oral, como consecuencia de comestibles se refieren a la concentración de una exposición repetida a los mismos. Para evitar antígeno. En primer lugar, es necesario conseguir estos riesgos es necesario realizar un control muy una concentración elevada del antígeno, con el fin estricto de los cultivos y las plantas una vez de reducir la cantidad de tejido vegetal que debe cosechadas. ingerirse para obtener una dosis efectiva. Por otra parte, debe conseguirse una concentración A continuación se incluyen varias tablas en las que homogénea para que se pueda ajustar la dosis de se recogen los antígenos que se han expresado en manera adecuada. plantas para la elaboración de vacunas contra enfermedades infecciosas. Las tablas 6 y 7 La administración por vía oral supone que la contienen información sobre plantas transgénicas proteína debe ser resistente a los jugos gástricos que expresan antígenos para elaborar vacunas e intestinales, lo cual puede conseguirse mediante contra enfermedades humanas y animales. Las la expresión de las proteínas en semillas, donde tablas 8 y 9 se refieren a expresión mediante existe una matriz de polímeros de hidratos de vectores virales de antígenos para elaborar vacunas carbono que la protegen. contra enfermedades humanas y animales. 43 ANTÍGENOS PARA ELABORAR VACUNAS CONTRA ENFERMEDADES HUMANAS EXPRESADOS EN PLANTAS TRANSGÉNICAS Enfermedades humanas Nivel de expresión Agente patógeno Antígeno Planta Órgano Proteína soluble total (%) Peso fresco (g) Hojas 0,001 0,0002 Cloroplastos 2,5 — Patata Tubérculo 0,2 0,001 Maíz Semillas 10 0,1 Tabaco Hojas 8 1 Patata Tubérculo 0,3 0,002 Tabaco Hojas 4 0,5 Tomate Hojas y frutos 0,04 0,005 Tabaco Hojas 0,07 0,0008 Patata Tubérculo 0,002 — Patata Tubérculo 0,006 0,00004 Lechuga Hojas — 0,0000006 Patata Tubérculo 0,001 0,000009 Tabaco Hojas 0,2 0,03 Patata Tubérculo 0,4 0,003 Tabaco E. coli enterotoxigénica79 (*) E. coli enteropatógena Vibrio cholerae Hepatitis B Subunidad B de la toxina termolábil Subunidad A estructural del BFP Subunidad B de la toxina colérica Antígeno de superficie Proteína media Virus Norwalk Proteína de la cápsida Sarampión Hemaglutinina Tabaco Hojas — — Citomegalovirus humano Glicoproteína B Tabaco Semillas 0,1 0,00007 Virus respiratorio sincitial Proteína de fusión Tomate Fruto — 0,003 Bacillus anthracis Antígeno protector Tabaco Hojas — — Clostridium tetani Fragmento TetC de la toxina colérica Tabaco Cloroplastos 25 — VIH80 Péptido de la región V3 de la proteína gp120 fusionada con la subunidad B de la toxina colérica Patata Tubérculos 0,0041 — Rotavirus81 VP7 Patata Hojas 38,4 — 82 Tabla 6. Antígenos de enfermedades humanas expresados en plantas transgénicas . (*) Enfermedad humana y animal. 79 80 81 82 Tregoning, J.; Maliga, P.; Dougan, G.; Nixon, P. J. (2004). New advances in the production of edible plant vaccines: chloroplast expression of a tetanus vaccine antigen, TetC. Phytochemistry, 65, 989-994. Kim, T-G.; Gruber, A.; Langridge, W. H. R. (2004). HIV-1 gp120 V3 cholera toxin B subunit fusion gene expression in transgenic potato. Protein Expression and Purification, 37, 196-202. Wu, Y-Z.; Li, J-T.; Mou, Z-R.; Fei, L.; Ni, B.; Geng, M.; Jia, Z-C.; Zhou, W.; Zou, L-Y.; Yan Tang, Y. (2003). Oral immunization with rotavirus VP7 expressed in transgenic potatoes induced high titers of mucosal neutralizing IgA. Virology, 313, 337-342. Streatfield, S. J.; Howard, J. A. (2003). Plant-based vaccines. International Journal for Parasitology, 33, 479-493. 44 PLANTAS BIOFACTORÍA ANTÍGENOS PARA ELABORAR VACUNAS CONTRA ENFERMEDADES ANIMALES EXPRESADOS EN PLANTAS TRANSGÉNICAS Enfermedades animales Nivel de expresión Agente patógeno Antígeno Planta Órgano Virus de la rabia(*) Glicoproteína Tomate Proteína estructural VP1 Fiebre aftosa Péptido de la proteína estructural VP1 fusionado a β-glucuronidasa Virus de la gastroenteritis transmisible porcina Proteína soluble total (%) Peso fresco (g) Hojas y frutos 1 0,1 Arabidopsis Hojas — — Alfalfa Hojas — — Patata Hojas 0,01 0,001 Alfalfa Hojas 0,004 0,0005 Arabidopsis Hojas 0,06 0,008 Patata Tubérculo 0,07 0,0005 Tabaco Hojas 0,2 0,03 Maíz Semillas 2 0,02 Glicoproteína S Rotavirus grupo A bovino Proteína VP6 de la cápsida Patata Tubérculo 0,002 0,00001 Pasteurelosis neumónica bovina Leucotoxina fusionada a una proteína fluorescente Trébol blanco Hojas 0,5 0,0009 Enfermedad hemorrágica de los conejos Proteína estructural VP60 Patata Hojas 0,3 0,04 Péptido de la proteína de la cápsida VP2 fusionado a β—glucuronidasa Arabidopsis Hojas 0,1 0,0003 Péptido 2L21 fusionado con la subunidad B de la toxina colérica Tabaco Hojas 31 7,49 mg/g Virus de la diarrea epidémica porcina84 Epítopo neutralizador Tabaco — — — Virus de la bronquitis infecciosa aviar85 Proteína S de IBV Patata Tubérculo — — Cacahuete Hojas — — Peste bovina86, 87 Hemaglutinina Tabaco — 0,75 — 83 Parvovirus canino Tabla 7. Antígenos de enfermedades animales expresados en plantas transgénicas88. (*) Enfermedad humana y animal. 83 Molina, A.; Hervás-Stubbs, S.; Daniell, H.; Mingo-Castel, A. M.; Veramendi, J. (2004). High-yield expression of a viral peptide animal vaccine in transgenic tobacco chloroplasts. Plant Biotechnology Journal, 2, 141-153. Bae, J-L.; Lee, J-G.; Kang, T-J.; Jang, H-S.; Jang, Y-S.; Yang, M-S. (2003). Induction of antigen-specific systemic and mucosal immune responses by feeding animals transgenic plants expressing the antigen. Vaccine, 21, 4052–4058. 85 Ji-Yong Zhou, Li-Qin Cheng, Xiao-Juan Zheng, Jian-Xiang Wu, Shao-Bin Shang, Jin-Yong Wang and Ji-Gang Chen (2004). Generation of the transgenic potato expressing full-length spike protein of infectious bronchitis virus. Journal of Biotechnology, 111, 121-130. 86 Khandelwal, A.; Renukaradhya, G. J.; Rajasekhar, M.; Sita, G. L.; Shaila, M. S. (2004). Systemic and oral immunogenicity of hemagglutinin protein of rinderpest virus expressed by transgenic peanut plants in a mouse model. Virology, 323, 284-291. 87 Khandelwa,l A.; Sita, G. L.; Shaila, M. S. (2003). Expression of hemagglutinin protein of rinderpest virus in transgenic tobacco and immunogenicity of plant-derived protein in a mouse model. Virology, 308,207-215. 88 Streatfield, S. J.; Howard, J. A. (2003). Plant-based vaccines. International Journal for Parasitology, 33, 479-493. 84 45 ANTÍGENOS PARA ELABORAR VACUNAS CONTRA ENFERMEDADES HUMANAS EXPRESADOS MEDIANTE VECTORES VIRALES Enfermedades humanas Nivel de expresión Agente patógeno Antígeno Virus** Planta E. coli enterotoxigénica89 Subunidad B de la toxina termolábil TMV Hepatitis C Región hipervariable de la proteína 2 de la cubierta fusionada a la sub B de la toxina colérica Rotavirus Proteína soluble total (%) Peso fresco (g) Tabaco 0,75 - TMV Hojas de tabaco 0,04 0,005 Proteína VP6 PVX Hojas de tabaco — 0,005 Péptido de la proteína gp41 CMV Hojas de caupí — — Péptido de la región V3 de la proteína gp120 AMV Hojas de tabaco — — Péptido de la región V3 de la proteína gp120 TBSV Hojas de tabaco — 0,03 CMV Hojas de caupí — 0,002 PVX Hojas de tabaco — — Nucleocápsida proteína p24 TBSV Hojas de tabaco 0,4 0,05 Proteína p2490 TMV Hojas de tabaco 2,5 mg/25 g de hojas — Rinovirus tipo 14 Péptido de la proteína VP1 CMV Hojas de caupí — — Virus respiratorio sincitial Péptidos de la proteína G AMV Hojas de tabaco — 0,006 CMV Hojas de caupí — 0,005 Staphylococcus aureus Péptido D2 de la proteína de unión a fibronectina FnBP PVX Hojas de tabaco — 0,0003 CMV Hojas de caupí — 0,005 TMV Hojas de tabaco — — VIH tipo 1 Péptido de la proteína transmembrana gp41 Pseudomonas aeruginosa Péptido de la proteína F Plasmodium falciparum Péptidos de la proteína del Circumsporozoito TMV Hojas de tabaco — 0,003 Virus del papiloma humano tipo 16 Oncoproteína E7 PVX Hojas de tabaco — 0,0004 Linfoma de la célula B Fragmento Fv de la inmunoglobulina TMV Hojas de tabaco — 0,003 Tabla 8. Antígenos de enfermedades humanas expresados mediante vectores virales91. 89 Wagner, B.; Hufnagl, K.; Radauer, C.; Wagner, S.; Baier, K.; Scheiner, O.; Wiedermann, U.; Breiteneder, H. (2004). Expression of the B subunit of the heat-labile enterotoxin of Escherichia coli in tobacco mosaic virus-infected Nicotiana benthamiana plants and its characterization as mucosal immunogen and adjuvant. Journal of Immunological Methods, 287, 203-215. 90 Perez-Filgueira, D. M.; Brayfield, B. P.; Phiri, S.; Borca, M. V.; Wood, C.; Morris, T. J. (2004). Preserved antigenicity of HIV-1 p24 produced and purified in high yields from plants inoculated with a tobacco mosaic virus (TMV)-derived vector. Journal of Virological Methods, 121, 201-208. 91 Streatfield, S. J.; Howard, J. A. (2003). Plant-based vaccines. International Journal for Parasitology, 33, 479-493. 46 PLANTAS BIOFACTORÍA ANTÍGENOS PARA ELABORAR VACUNAS CONTRA ENFERMEDADES ANIMALES EXPRESADOS MEDIANTE VECTORES VIRALES Enfermedades animales Nivel de expresión Agente patógeno Antígeno Virus** Planta Virus de la rabia(*) Péptidos de la glicoproteína y nucleoproteína TMV y AMV Proteína estructural VP1 Proteína soluble total (%) Peso fresco (g) Hojas de tabaco y espinaca - 0,0005 TMV Hojas de tabaco - 0,02 Péptido de la proteína estructural VP1 CMV Hojas de caupí - - Virus de la enteritis del visón (visones, gatos y perros) Péptido de la proteína de la cápsida VP2 CMV Hojas de caupí - 0,002 Enfermedad hemorrágica de los conejos Proteína estructural VP60 PPP Hojas de tabaco - - PPP Hojas de tabaco - - Parvovirus canino (perros) Péptido de la proteína de la cápsida VP2 CMV Hojas de caupí - 0,002 Fiebre aftosa Virus de la hepatitis del ratón Péptido de la glicoproteína S TMV Hojas de tabaco - - Herpesvirus bovino tipo I92 Glicoproteína D TMV Hojas de tabaco - - Virus de la diarrea epidémica porcina93 Epítopo neutralizador TMV Hojas de tabaco 5 - Tabla 9. Antígenos de enfermedades animales expresados mediante vectores virales94. (*) Enfermedad humana y animal. ** AMV: Virus del mosaico de la alfalfa. CMV: Virus del mosaico del caupí. PPP: Potyvirus de la viruela del ciruelo. PVX: Virus X de la patata. TBSV: Virus del enanismo ramificado del tomate. TMV: Virus del mosaico del tabaco. 92 Pérez-Filgueira, D.M.; Zamorano, P.I.; Domınguez, M.G.; Taboga, O.A.; del Médico Zajac, M.P.; Puntel, M.; Romera, S.A.; Morris, T.J.; Borca, M.V.; Sadir, A.M.; (2003). Bovine Herpes Virus gD protein produced in plants using a recombinant tobacco mosaic virus (TMV) vector possesses authentic antigenicity. Vaccine, 21, 4201–4209. 93 Kang, T-J.; Kang, K-H.; Kim, J-A.; Kwon, T-H.; Jang, Y-S.; Yang, M-S. (2004). High-level expression of the neutralizing epitope of porcine epidemic diarrhea virus by a tobacco mosaic virus-based vector. Protein Expression and Purification, 38, 129–135. 94 Streatfield, S. J.; Howard, J. A. (2003). Plant-based vaccines. International Journal for Parasitology, 33, 479-493. 47 Además de la expresión de antígenos para la elaboración de vacunas contra patógenos bacterianos y virales, es posible expresar antígenos para elaborar vacunas contra otro tipo de afecciones como enfermedades autoinmunes y contra tumores humanos95. VACUNAS CONTRA ENFERMEDADES AUTOINMUNES Las enfermedades autoinmunes son aquellas en las que el sistema inmune reconoce como extrañas algunas estructuras propias y reacciona contra ellas produciendo lo que se conoce como autoanticuerpos. Algunos ejemplos son la artritis, la esclerosis múltiple, la miastenia gravis o la diabetes tipo I. Como se ha indicado, la administración por vía oral de antígenos puede dar lugar a fenómenos de tolerancia. En el caso de las enfermedades autoinmunes, el fenómeno de tolerancia oral provocado por la administración de autoantígenos por vía oral podría conducir a una disminución de la respuesta inmune alterada, lo cual podría mejorar los síntomas. Existen trabajos pioneros en la producción de autoantígenos en plantas, principalmente contra la diabetes tipo I, como la expresión de la enzima ácido glutámico decarboxilasa (GAD, en sus siglas en inglés) y la IL-4, que se expresan mediante fusión con la subunidad B de la toxina colérica96. También se ha producido la expresión en plantas de alérgenos, que podrían aplicarse para el desarrollo de vacunas para el tratamiento de las alergias tipo I, mediante la inducción de tolerancia por vía oral. Algunos ejemplos son la expresión mediante un vector viral de alérgenos del abedul (la proteína Bet v 1), del látex (las proteínas Hev b 3 y Hev b 1), y de la manzana (la proteína Mal d 2), en N.benthamiana97. VACUNAS ANTITUMORALES En la superficie de algunos tumores, como melanoma y cáncer de mama, aparecen determinadas proteínas denominadas antígenos tumorales contra los que algunas personas pueden desarrollar anticuerpos. En la actualidad se está investigando sobre la posibilidad de usar estos antígenos para la elaboración de vacunas y sobre su producción mediante distintos sistemas. Un ejemplo de un antígeno de este tipo es el antígeno GA733-2, producido en plantas de tabaco mediante la utilización del virus del mosaico del tabaco como vector viral98. 95 Sala, F.; Rigano, M.M.; Barbante, A.; Basso, B.; Walmsley, A.M.; Castiglione, S.(2003). Vaccine antigen production in transgenic plants: strategies, gene constructs and perspectives. Vaccine, 21, 803-808. 96 Ma, S.; Huang, Y.; Yin, Z.; Menassa, R.; Brandle, J. E.; Jevnikar, A. M. (2004). Induction of oral tolerance to prevent diabetes with transgenic plants requires glutamic acid decarboxylase (GAD) and IL-4, human GAD65. PNAS, 101, 5680-5685. 97 Wagner, B.; Fuchs, H.; Adhami, F.; Ma, Y.; Scheiner, O.; Breiteneder, H. (2004). Plant virus expression systems for transient production of recombinant allergens in Nicotiana benthamiana. Methods, 32, 227-234. 98 Verch, T,, Hooper, D. C.; Kiyatkin, A.; Steplewski, Z.; Koprowski, H. (2004). Immunization with a plant-produced colorectal cancer antigen. Cancer Immunology, Immunotherapy, 53, 92-99. 48 PLANTAS BIOFACTORÍA 4.1.1.2. Anticuerpos99 Los anticuerpos son glicoproteínas producidas por el sistema inmune de los vertebrados superiores, capaces de reconocer y unir antígenos diana de manera altamente específica. Esta capacidad de reconocer y unir de manera específica distintas moléculas hace que los anticuerpos puedan utilizarse para gran cantidad de aplicaciones que incluyen el diagnóstico, tratamiento y prevención de distintas enfermedades infecciosas, autoinmunes y otro tipo de trastornos100. Son moléculas complejas formadas por distintas cadenas polipeptídicas que se encuentran plegadas y ensambladas. Es fundamental que el plegamiento y ensamblaje sean correctos, ya que de lo contrario el reconocimiento del antígeno no se producirá de manera adecuada. La estructura típica de un anticuerpo es la de las inmunoglobulinas (Igs) séricas. Consisten en tetrámeros formados por dos cadenas pesadas 99 100 idénticas y dos cadenas ligeras idénticas, unidas mediante puentes disulfuro. Cada tipo de cadena presenta una serie de dominios constantes y otros dominios variables, que son los responsables del reconocimiento y unión del antígeno. Las cadenas pesadas presentan cuatro dominios, dos de los cuales forman una bisagra denominada región Fc, que permite que el anticuerpo adopte una estructura típica en forma de Y. En la región Fc se encuentra un residuo de asparagina conservado que es el lugar en el que se produce la glicosilación. Además de este tipo de Igs existen otras moléculas derivadas con capacidad de unir el antígeno. Dentro de estas moléculas derivadas se incluyen moléculas de menor tamaño (fragmentos de anticuerpos), así como otras de mayor tamaño como la IgA secretora que es un dímero de las Igs típicas. En la figura 9 se incluyen algunos tipos de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos expresados en plantas. Fischer, R.; Twyman, R. M.; Schillberg, S. (2003). Production of antibodies in plants and their use for global health. Vaccine 21, 820–825. Ma, J. K.; Drake, P.M.; Christou, P. (2003). The Production of Recombinant Pharmaceultical Proteins in Plants. Nature, 4, 794-805. 49 Fragmento Fab Fragmento Fab’ Dominio variable sencillo scFv unido al péptido líder Fragmentos de anticuerpo de tipo camélido Cadena larga sencilla IgG scFv scFv biespecífico Minibody scFv de fusión scFv unido a los péptidos líder y KDEL IgA. Dímero de IgG unidas por los extremos constantes mediante dos cadenas polipeptídicas denominadas componente secretor y cadena J. Diabody IgA Región constante de la cadena pesada Cadena J Fragmentos de anticuerpos tipo camélido. Igs características de los camélidos, formadas exclusivamente por dos cadenas pesadas que carecen de uno de los dominios. Región variable de la cadena pesada Componente secretor Fragmentos Fab y F(ab’). Extremos N terminal de las dos cadenas pesadas y de las dos cadenas ligeras. Región constante de la cadena ligera Punto de glicosilación Minibodis y diabodis. Dímeros que se forman de manera espontánea. Fragmentos Fv de cadena sencilla (scFv). Contienen regiones variables de las cadenas ligera y pesada unidas por una cadena peptídica flexible. Existen también scFv biespecíficos y de fusión con proteínas como enzimas o toxinas. Región variable de la cadena ligera Proteína de fusión Bisagra Péptido líder Puente disulfuro Péptido KDEL Figura 9. Anticuerpos y fragmentos de anticuerpos producidos en plantas. 50 scAbs PLANTAS BIOFACTORÍA Los fragmentos de anticuerpos en ocasiones son más efectivos como fármacos que los anticuerpos completos, ya que penetran mejor en los tejidos que los anticuerpos completos y se eliminan de los tejidos de manera más rápida. Las cadenas ligeras, pesadas y el componente secretor y la cadena de ensamblaje de los anticuerpos secretores están codificadas por distintos genes, de modo que para conseguir que una planta exprese este tipo de moléculas es necesario introducir todos los genes en la planta que se desea usar como biofactoría. Existen dos estrategias para conseguirlo. La primera consiste en introducir los genes que codifican para las cadenas en distintas plantas y luego realizar cruzamientos entre las plantas, seleccionando aquellas que posean todos los transgenes que se desea. Otra estrategia es utilizar métodos que permitan introducir todos los transgenes necesarios, como por ejemplo la coinfección de la planta con distintos vectores virales. La síntesis de este tipo de inmunoglobulinas mediante células de mamíferos requiere de dos tipos celulares distintos. La acumulación de anticuerpos en el citosol de la célula no es posible, debido a que en este ambiente no se produce un ensamblado correcto o 101 completo de las cadenas ligeras y pesadas que forman el anticuerpo, lo que lleva a su degradación. Tan solo se ha conseguido una acumulación de anticuerpos recombinantes en el citosol en el caso de cadenas polipeptídicas sencillas o scFvs. Para que se produzca un plegado y ensamblaje correcto de las cadenas polipeptídicas es necesario dirigirlas hacia el retículo endoplásmico tal y como se ha indicado en el apartado de tecnologías, mediante la adición de secuencias diseñadas a este efecto en el extremo amino terminal de la proteína. La glicosilación es especialmente importante en los anticuerpos y, como se ha indicado en el apartado de tecnologías, el direccionamiento hacia el retículo endoplásmico permite que se realice una glicosilación adecuada. Se han utilizado distintas plantas para expresar anticuerpos y se han llevado a cabo numerosas comparaciones para determinar los parámetros óptimos para la expresión. Existen varios tipos de anticuerpos recombinantes producidos en plantas que han pasado la fase preclínica de ensayos y se encuentran en fases de ensayo clínico, algunos en fase II101. A continuación se incluye una tabla con los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que se han obtenido utilizando plantas como biofactorías. Ma, J. K.; Drake, P.M.; Christou, P. (2003). The Production of Recombinant Pharmaceultical Proteins in Plants. Nature, 4, 794-805. 51 ANTICUERPOS Y FRAGMENTOS DE ANTICUERPOS OBTENIDOS UTILIZANDO PLANTAS BIOFACTORÍA Nombre o tipo de anticuerpo Aplicación Antígeno Tratamiento contra la caries dental Antígeno estreptocócico superficial I/ II Guy 13 (IgAS) Diagnóstico glóbulos rojos de donantes y receptores IgG anti-humano C5-1 (IgG) Planta Órgano Nicotiana tabacum Hojas 500 µg/g IgG 1 1,1% en PST Alfalfa — 1% PST Hojas 900 ng/g Semillas 1,5 µg/g Trigo Tratamiento del cáncer Antígeno carcinoembriónico (CEA) Nivel de expresión máximo scFvT84.66 (scFv) T84.66 (IgG) 102 T84.66/GS8 29,0 µg/g Hojas Arroz 27,0 µg/g Semillas 32 µg/g Guisante Semillas 9 µg/g Nicotiana tabacum agroinfiltrado con Agrobacterium Hojas 1,0 µg/g Hojas — Tratamiento del linfoma de célula B Vacuna idiotípica 38C13 (scFv) Nicotiana benthamiana Hojas 30,2 µg/g Tratamiento del cáncer de colon Antígeno de superficie CO17-1A (IgG) Nicotiana benthamiana — — Vacuna contra el linfoma no-Hodgkins103 — scFv Tabaco infectado con el TMV — 100 µg/ml en fluido intersticial Virus del herpes simplex 2 Proteína HSV-2 Anti-HSV-2 (IgG) Soja — — scFv Nicotiana tabacum Hojas 0,01% PST Nicotiana tabacum Hojas 0,044% PST Arabidopsis thaliana Hojas 0,2-0,4% PST MAK33 Fab Arabidopsis thaliana — 6,53% PST MAK33 scFv N. tabacum — 6-25 µg/mg PST Arabidopsis thaliana — 1,3% PST N. tabacum — 0,044% PST Afecciones cardiacas, miastenia, polimiosistis, enfermedad de McArdle, miopatías inflamatorias y desórdenes mitocondriales, distrofia muscular MAK33 IgG1 Creatina kinasa humana Fab — Sustancia P (neuropéptido) dAb Nicotiana benthamiana Hojas 1% PST Actividad antirrábica Virus de la rabia Anticuerpo monoclonal mAb S057 Nicotiana benthamiana Hojas 0,07% PST Inmunización pasiva de los animales Zealerona scFv Arabidopsis thaliana — — Vacunas inmunocontraceptivas para herbívoros Epítopo ZP3 ZP3 Tabaco infectado con el TMV* — — Tabla 10. Anticuerpos y fragmentos de anticuerpos expresados en plantas104, 105, 106. 102 103 Vaquero, C.; Sack, M. Schuster, F.; Finnern, R.; Drossard, J.; Schumann, D.; Reimann, A.; Fischer, R. (2002). A carcinoembryonic antigen-specific diabody produced in tobacco. FASEB J., 16, 408-410. McCormic, A. A.; Reinl, S. J.; Cameron, T. I.; Vojdani, F.; Fronefield, M.; Levy, R.; Tusé, D. (2003). Individualized human scFv vaccines produced in plants: humoral anti-idiotype responses in vaccinated mice confirm relevance to the tumor Ig. Journal of Immunological Methods, 278, 95-104. (Ver notas 104, 105 y 106 en página siguiente) 52 *TMV: Virus del mosaico del tabaco. PLANTAS BIOFACTORÍA 4.1.1.3. Biofármacos La utilización de la biotecnología permitió obtener estos productos de forma más segura, a través del Además de anticuerpos y vacunas existen otras cultivo en biorreactores de células de proteínas con interés biosanitario que pueden microorganismos o de mamíferos modificados expresarse en plantas como productos genéticamente, pero aún así estos sistemas sanguíneos, hormonas, reguladores del presentan riesgos de contaminación con toxinas o crecimiento y enzimas con potencial terapéutico virus peligrosos para la salud de las personas y los para tratar distintas enfermedades. animales. Además, según algunas previsiones, se estima que para 2010 este tipo de fármacos Según la Sociedad Española de Biotecnología en el ocupará un 35% del mercado farmacéutico. Este año 2000 el número de proteínas y péptidos aumento de la demanda posiblemente no pueda terapéuticos fabricados mediante técnicas de ser cubierto por los actuales sistemas de ingeniería genética en el mercado eran obtención. aproximadamente 50, con unas ventas anuales del orden de decenas de miles de millones de dólares. Las plantas debido a sus características En la mayor parte de los casos no se trata de de seguridad, capacidad de producción fármacos nuevos, sino que son proteínas humanas, y coste, podrían ser muy adecuadas para la que hasta la década de los 80 se obtenían en producción de este tipo de productos. muchos casos a partir de sangre de donantes o de A continuación en la tabla 11 se indican las órganos humanos, o a partir de animales, con el proteínas de interés biosanitario que se han consiguiente riesgo de contaminación. expresado en plantas modificadas. 104 105 106 Daniell, H.; Streatfield, S. J.; Wycoff, K. (2001). Medical molecular farming: production of antibodies, biopharmaceuticals and edible vaccines in plants. Trends in Plant Science, 6, 219-226. Gomord, V.; Sourrouielle, C.; Fitchette, A-C.; Bardor, M.; Pagny, S.; Lerouge, P.; Faye, L. (2004). Production and glycosilation of plant-made pharmaceuticals: the antibodies as a challenge. Plant Biotechnology Journal, 2, 83-100. Schillberg, S.; Fischer, R.; Emans, N. (2003). “Molecular farming” of antibodies in plants. Naturwissenschaften, 90, 145-155. 53 PROTEÍNAS BIOFARMACÉUTICAS EXPRESADAS EN PLANTAS Proteína Aplicación Planta Nivel de expresión Proteína C humana Anticoagulante Tabaco <0,1%PST Hirudina humana Inhibidor de la trombina Cánola 0,3% proteína de la semilla Tabaco 7% PST Somatotropina humana Hormona de crecimiento Cloroplastos de tabaco107,108 8% PST Factor estimulante de las colonias de granulocitos macrófagos Tratamiento de la neutropenia Tabaco — Factor de necrosis tumoral α Tratamiento contra tumores y enfermedades infecciosas Patata109 15 µg/g Eritropoyetina humana Anemia Tabaco <0,01% PST Encefalinas humanas Analgésicos opiáceos Arabidopsis 0,1% de la proteína de la semilla Factor de crecimiento epidérmico humano Reparación de heridas y control de proliferación celular Tabaco <0,01% PST Arroz, cánola — Tabaco <0,01% PF Tabaco 0,02% PST Interferón α Interferón β Albúmina sérica humana Tratamiento de la hepatitis CyB Cirrosis hepática, quemaduras, cirugía 110 Tabaco 11% PST Hemoglobina α y β humanas Sustituto sanguíneo Tabaco 0,05% PS Colágeno homotrimérico humano Colágeno Tabaco <0,01% PF Antitripsina α-1 humana Fibrosis quística, enfermedades hepáticas y hemorragias Arroz — Aprotinina humana Inhibidor de la tripsina para cirugía de transplantes Maíz — Antimicrobiano Fortificación de fórmulas infantiles Patata 0,1% PST Lactoferrina humana Arroz111 0,5% arroz descascarillado Enzima conversora de la angiotensina Hipertensión Tabaco, tomate — Tricosantina Terapia VIH Nicotiana bethamiana 2% PST Glucocerebrosidasa Enfermedad de Gaucher Tabaco 1-10% PST Lipasa gástrica de perro112 Insuficiencia pancreática ligada a fibrosis quística Tabaco 0,5-1 mg PF Tabla 11. Proteínas de interés biofarmacéutico expresadas en plantas113. 107 108 109 110 111 112 113 54 Twyman, R. M.; Stoger, E.; Schillberg, S.; Christou, P.; Fischer, R. (2003). Molecular farming in plants: host systems and expression technology. Trends in Biotechnology, 21, 570-578. Staub, J. M.; Garcia, B.; Graves J.; Hajdukiewicz, P.; Hunter, P.; Nehra, N.; Paradkar, V.; Schlittler, M.; Carroll, J. A.; Spatola, L.; Ward, D.; Ye, G.; Russell, D. A. (2000). High-yield production of a human therapeutic protein in tobacco chloroplasts. Nature Biotechnology, 18, 333-338. Ohya, K.; Itchoda, N.; Ohashi, K.; Onuma, M.; Sugimoto, C.; Matsumura, T. (2002). Expression of biologically active human tumor necrosis factor-alpha in transgenic potato plant. Journal of Interferon and Cytokine Research. 22, 371-378. Fernández-San Millán, A.; Mingo-Castel, A.; Miller, M, Daniell, H. (2003). 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Proteínas de interés industrial Las enzimas se utilizan en muchos procesos industriales, siendo de gran importancia en industrias como las del papel y la madera, Existen distintas proteínas que pueden industria textil, industria química, elaboración de obtenerse mediante la utilización detergentes y producción de alimentos y piensos de plantas con aplicaciones en la industria. En para animales114. En estas industrias las enzimas este tipo de proteínas se incluyen enzimas de se necesitan en cantidades elevadas, lo que hace interés industrial, péptidos capaces de formar necesario que su coste sea bajo115. polímeros y otras proteínas que pueden utilizarse como suplementos para alimentación animal y En la tabla 12 se incluyen ejemplos de enzimas de humana como por ejemplo las proteínas de la interés industrial producidas en plantas, así como leche. sus aplicaciones. ENZIMAS DE INTERÉS INDUSTRIAL EXPRESADAS EN PLANTAS Enzima Aplicación industrial Planta Cantidad Lacasa Industria textil (decoloración de fibras), clarificación de zumos y “bioglue” para madera Maíz 10 g/kg grano Tabaco 0,3% PST Nicotiana benthamiana 5,0% PST Vicia narbonensis 5 U/kg semillas Tabaco 0,3% PST Cebada — Arabidopsis 26% PST α-amilasa Glucanasa Procesado del almidón, clarificación de vinos y zumos, industria de detergentes Producción de etanol, industria textil, de papel y pulpa y producción de piensos para animales 4,1% PST Tabaco Xilanasa Bioconversión de paredes celulares, eliminación de lignina residual en producción de papel y mejora de la digestibilidad de las plantas para piensos animales Xilanasa termoestable Fitasa Elaboración de piensos para animales. Liberación del fósforo de los fitatos — 3-6% Colza 2 kU/kg semilla Guisante 8 kU/kg semilla Cloroplastos de tabaco 6% PST Tabaco 14,4% Soja — Quimosina Elaboración de queso Tabaco Patata 1-0,5% Transglutaminasa116 Procesado de alimentos Arroz — Tabla 12. Enzimas de interés industrial expresadas en plantas117. 114 115 116 117 Giddings, G. (2001). Transgenic plants as protein factories. Current Opinion in Biotechnology, 12, 450–454. Horn, M. E.; Woodard, S. L.; Howard, J. A. (2004). Plant molecular farming: systems and products. Plant Cell Rep.; 22, 711-720. Capell, T.; Claparols, I.; Del Duca, S.; Bassie, L.; Miro, B.; Rodriguez-Montesinos, J.; Christou, P.; Serafini-Fracassini, D. (2004) Producing transglutaminases by molecular farming in plants. Amino Acids, 26, 419-423. Biesgen, C.; Hillebrand, H.; Herbers, K. (2002). Technical enzymes produced in transgenic plants. Phytochemistry Reviews 1, 79–85. 55 Entre los polímeros basados en proteínas 4.2. Ingeniería metabólica recombinantes se encuentran la elastina, el colágeno y las proteínas de la seda de la araña. La ingeniería metabólica de plantas consiste en la modificación de las rutas enzimáticas de la El colágeno es una proteína estructural muy utilizada planta con el fin de modificar el contenido de en las industrias cosmética, farmacéutica y médica, determinados compuestos. Las modificaciones para la elaboración de implantes, piel y cartílago que pueden realizarse incluyen el aumento del artificial, injertos de huesos, etc. Un producto contenido de productos deseables, la relacionado muy utilizado es la gelatina, que tiene disminución del contenido de productos aplicaciones como estabilizante de vacunas y indeseables o la producción de nuevos fármacos, para elaborar cápsulas, etc. En la compuestos que la planta no sintetizaba actualidad su obtención es a partir de fuentes anteriormente. Para ello, puede actuarse sobre animales lo cual lleva asociado riesgos de transmisión las rutas existentes en la planta o introducir de enfermedades y de rechazos en el caso de los implantes debido a que pueden desencadenar una rutas metabólicas completas que den lugar a la producción de compuestos nuevos. respuesta inmune en las personas. El colágeno está formado por tres cadenas que se asocian formando una triple hélice. Mediante la introducción de los genes de las cadenas que 4.2.1. Modificación de rutas enzimáticas existentes119, 120 forman la molécula se ha conseguido expresar en plantas de tabaco las cadenas, que de manera Aunque el término “ingeniería metabólica” da idea espontánea se ensamblan adquiriendo la de un conocimiento preciso de los sistemas que se conformación en triple hélice de colágeno. En la están modificando, esto no siempre es así. Las actualidad hay varias empresas interesadas en plantas pueden producir una gran cantidad de llevar al mercado esta molécula118 (ProdiGene, compuestos de cuyas rutas de síntesis se conoce Medicago, Meristem Therapeutics). muy poco. Existe una regulación muy estricta para conseguir que en la planta exista un equilibrio Otras proteínas con interés para la elaboración de entre los distintos compuestos y el conocimiento polímeros son las espidroinas, proteínas que forman de estos mecanismos de regulación es muy la seda de la tela de las arañas. La seda de la araña limitado. Muchas de las rutas se encuentran se considera que es la fibra natural más fuerte que relacionadas de manera que los productos de unas existe, es insoluble en la mayor parte de los son los sustratos de otras y, en ocasiones, varias disolventes, incluyendo ácidos y bases diluidas, y rutas distintas conducen a la obtención del mismo resistente a gran cantidad de enzimas proteolíticas, producto. En este caso, la actuación sobre una por lo que tiene un gran interés industrial. Su ruta podría provocar que se active otra para obtención en cantidades elevadas a partir de arañas compensar el cambio. Por estos motivos en la no es posible, por lo que su producción mediante mayor parte de los casos las modificaciones se plantas sería muy importante. De momento se han hacen por “ensayo y error”. conseguido expresar dos tipos de espidroinas en tabaco y patata acumulando más del 2% de la Las estrategias que pueden usarse para modificar proteína soluble total, aunque no se ha logrado el metabolismo de las plantas dependen del tipo formar fibras a partir de ellas. de modificación que se desee hacer. 118 119 120 56 Ma, J. K.; Drake, P. M.; Christou, P. (2003). The Production of Recombinant Pharmaceultical Proteins in Plants. Nature, 4, 794-805. Capell, T.; Christou, P. (2004). Progress in plant metabolic engineering. Current Opinion in Biotechnology, 15,148–154. Trethewey, R. N. (2004). Metabolite profiling as an aid to metabolic engineering in plants. Current Opinion in Plant Biology, 7, 196–201. PLANTAS BIOFACTORÍA Estrategias para disminuir la cantidad de un compuesto no deseado. • Bloqueo de la síntesis de una de las enzimas de la ruta enzimática. Puede hacerse reduciendo el nivel de ARN mensajero mediante antisentidos, cosupresión o tecnologías de interferencia de ARN. • Bloqueo de algunas de las enzimas de la ruta mediante expresión de anticuerpos dirigidos contra ella. • Diversificación del flujo hacia una ruta competitiva. síntesis de compuestos para poder realizar modificaciones. Pueden modificarse las rutas de síntesis de componentes esenciales para la supervivencia de la célula vegetal (metabolismo primario) o las rutas de síntesis de otros componentes que no son imprescindibles para la supervivencia de la célula, pero sí para la supervivencia de la planta completa (metabolismo secundario). Los componentes del metabolismo primario cuya modificación mediante ingeniería genética despierta mayor interés son los hidratos de carbono y los lípidos debido a sus aplicaciones alimentarias e industriales. • Incremento de la degradación del compuesto que se desea eliminar. Hidratos de carbono Estrategias para aumentar la producción de compuestos normalmente producidos por la planta. Es lo más frecuente. • Transferencia de una ruta o parte de una ruta metabólica de otro organismo. • Superación de pasos limitantes de la ruta mediante el bloqueo de rutas competitivas y disminución de la degradación del compuesto de interés mediante modificaciones de la expresión de uno o varios genes. • Modificación de la expresión de los genes reguladores que controlan los genes de biosíntesis de las distintas enzimas de la ruta. La regulación de los flujos metabólicos no está sólo limitada por la expresión de los genes de las enzimas. Existen otros factores que influyen de manera muy importante como son la regulación El hidrato de carbono de reserva más abundante en las plantas es el almidón y se encuentra en distintos órganos como semillas, frutas, tubérculos y raíces. Se utiliza en la industria alimentaria y en la elaboración de adhesivos, plásticos y polímeros, y como sustrato fermentable para la obtención de etanol y otro tipo de compuestos químicos. El almidón es un polímero de glucosa formado por dos tipos de moléculas denominadas amilosa y amilopectina. La diferencia entre estas moléculas es que la amilosa es una cadena lineal de glucosa, mientras que la amilopectina presenta ramificaciones. Debido a esta diferencia, cada tipo de molécula tiene distintas propiedades físicoquímicas y el contenido relativo de cada una de ellas determinará las propiedades físico-químicas del almidón121. En su forma nativa el almidón tiene un número de aplicaciones limitadas. Para conseguir que tenga propiedades adecuadas para otro tipo de aplicaciones debe someterse a distintos tratamientos y en ocasiones es necesario realizar modificaciones químicas. de la actividad enzimática y la compartimentación y transporte, tanto de las enzimas como de los precursores para la síntesis de los productos finales (puede ocurrir que se exprese una enzima en un lugar de la célula en el que no tenga acceso a los sustratos adecuados). Por este motivo, es necesario un mayor conocimiento de las rutas de 121 Mediante la ingeniería metabólica es posible modificar la composición del contenido de amilosa y amilopectina del almidón, consiguiendo almidones que poseen propiedades funcionales mejoradas sin necesidad de realizar modificaciones químicas. Jobling, S. (2004). Improving starch for food and industrial applications. Current Opinion in Plant Biology, 7, 210-218. 57 En maíz y trigo existen mutantes naturales que Los objetivos de la ingeniería metabólica de lípidos producen almidón que contiene exclusivamente se refieren al contenido y composición de ácidos amilopectina. Esto se debe a que presentan daños grasos, y a la modificación de otros lípidos en los genes que codifican para una enzima minoritarios. Se busca incrementar el contenido involucrada específicamente en la síntesis de de determinados ácidos grasos y aumentar el amilosa y, como consecuencia, sólo pueden contenido en aceite de las semillas. sintetizar amilopectina. Mediante la inhibición de los genes que codifican para esta enzima se ha Los componentes principales de los aceites conseguido obtener variedades de patata que no vegetales son los ácidos grasos. Existen más de contienen amilosa. 200 tipos de ácidos grasos, que se diferencian en la longitud de la cadena y la presencia de dobles Otro ejemplo es la obtención de tubérculos de enlaces o grupos químicos como hidroxilos, epoxi, patata con mayor contenido en amilosa mediante acetilenos, ciclopropenos, furanos, etc., algunas el bloqueo de la síntesis de las enzimas de cuyas rutas de síntesis se han conseguido ramificantes responsables de la síntesis de identificar. Dentro de estos ácidos grasos sólo amilopectina. Estos almidones con alto contenido unos pocos se producen en cantidades elevadas en amilosa se utilizan por ejemplo para la (esteárico, linoleico, palmítico, laúrico y oleíco), elaboración de cartón corrugado y papel y para la mientras que el resto son muy raros. elaboración de caramelos. En el caso de la industria alimentaria interesa aumentar el nivel de determinados ácidos grasos El Dr. Pozueta (CSIC y Universidad Pública de Navarra) es uno de los líderes a nivel mundial en ingeniería metabólica en almidón. Su grupo ha descubierto las rutas enzimáticas precursoras de la producción de almidón en plantas, habiendo conseguido plantas transgénicas con un alto contenido en almidón y alto balance amilosa/amilopectina. saludables, entre los que se incluyen los ácidos grasos poliinsaturados, y mejorar la estabilidad de los aceites para reducir la necesidad de hidrogenación. En cuanto a los ácidos grasos con propiedades saludables se han modificado plantas del género Brassica y tabaco para que produzcan ácido γ-linoleico. Para las aplicaciones industriales el interés se centra en aumentar la expresión de ácidos grasos poco frecuentes con propiedades funcionales atractivas e incrementar el contenido de aceite en Otro hidrato de carbono con importancia es la las semillas para reducir los costes de producción. inulina, que es un compuesto de reserva que se utiliza como sustituto de grasas en la elaboración Algunos ejemplos de cultivos de oleaginosas con de alimentos bajos en calorías. Este hidrato de contenido en ácidos grasos modificado son cánola carbono sólo se puede obtener de manera con alto contenido en ácido laúrico para elaborar comercial de la achicoria. Mediante ingeniería detergentes, con alto contenido en ácido esteárico metabólica se han introducido los genes que para elaboración de grasas, y con alto contenido codifican para las enzimas de la ruta de síntesis de en oleato para usos en alimentación y como aceite la inulina en otras plantas como patata o hidráulico. remolacha. Por último, señalar la introducción de dos genes Lípidos implicados en la síntesis de ceras en jojoba, que es la única planta capaz de acumular este tipo de compuestos, en Arabidopsis, consiguiéndose en esta Los lípidos tienen gran importancia para su planta una acumulación de hasta un 70% de ceras utilización, no solo en la industria alimentaria, sino en las semillas maduras. La transferencia de estos también para la elaboración de productos que se genes a otros cultivos comerciales permitiría la utilizan en otras industrias como detergentes y obtención de estos compuestos para distintas jabones, recubrimientos, pinturas, lubricantes, aplicaciones entre las que se encuentran la plásticos, derivados químicos, etc. elaboración de lubricantes industriales y cosméticos. 58 PLANTAS BIOFACTORÍA o producir suplementos dietéticos122. Las rutas Productos del metabolismo secundario mejor conocidas son las de la formación de En el metabolismo secundario se incluyen aquellas rutas de síntesis de moléculas que no son flavonoides y antocianinas y las de los alcaloides, debido a que existen sustancias de interés farmacéutico que pertenecen a estos grupos de importantes para la supervivencia de la célula, compuestos. pero sí para la supervivencia de la planta completa, como pigmentos de flores y frutos, aromas, sabores, componentes tóxicos, etc. A continuación, en la tabla 13 se indican algunas de Muchas de estas sustancias se utilizan para la las modificaciones que se han realizado en plantas producción de medicinas, colorantes, insecticidas, mediante ingeniería metabólica para acumular aromas y fragancias, y para enriquecer alimentos compuestos del metabolismo secundario. EXPRESIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS Compuesto Enzima Planta Fitoeno sintasa de Erwinia uredovora Tomate S-adenosil metionina descarboxilasa Tomate Licopeno γ-tocoferol metil transferasa Vitamina E (tocoferol) Arabidopsis Maíz Vitamina A (β-caroteno) Fitoeno sintasa de narciso y fitoeno desaturasa de Erwinia uredovora Licopeno-β-ciclasa de narciso Arroz Astaxantina β-Caroteno cetolasa de algas Tabaco Flavonol Chalcona isomerasa de petunia Tomate Arabidopsis Isoflavonas Isoflavona sintasa Tabaco Maíz Caempferol Genes reguladores Lc y C1 de maíz Tomate Quercetina Genes CH1 de petunia Tomate Tabla 13. Ingeniería metabólica de plantas para la expresión de metabolitos secundarios123, 124. Lignina compuestos químicos contaminantes, por lo que existe interés en eliminar o reducir su contenido. Un ejemplo de la utilización de la ingeniería Se han caracterizado varias enzimas de su ruta metabólica para disminuir el contenido de un de síntesis y se ha conseguido reducir el compuesto en una planta es la reducción de contenido de la lignina mediante la regulación de lignina. La lignina es un polímero complejo que las enzimas 4-coumarata-CoA ligasa (4CL) o la impregna la pared celular de muchas células cinnamil alcohol deshidrogenasa (CAD). Existen vegetales confiriéndoles resistencia mecánica, ensayos de campo con álamo temblón con siendo responsable de la dureza de la madera. contenido en lignina modificado. Otras especies Para la producción de pulpa y papel a partir de la que se están barajando para realizar madera es necesario extraer este compuesto, lo modificaciones de este tipo son chopos, cual resulta costoso y da lugar a la formación de eucaliptos y pinos125, 126, 127. 122 123 124 125 126 127 Verpoorte, S. R.; Memelink, J. (2002). 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Esto se debe a que, generalmente, la planta no dispone de métodos de regulación endógena sobre rutas que no posee de manera natural. Por tanto, para conseguir una producción adecuada es necesario asegurar que la actividad enzimática que se ha introducido es suficiente y que existen sustratos disponibles. Además es necesario prevenir la degradación del producto por las enzimas endógenas de la planta. Existen distintos ejemplos de rutas completas que se han introducido en plantas que permiten que sean utilizadas como biofactorías de compuestos de interés, como la producción de bioplásticos en distintas especies, la producción de vitamina A en arroz y la alteración de la composición de los ácidos grasos. Bioplásticos129 Un ejemplo de introducción de una ruta biosintética completa es la producción de polímeros de polihidroxialcanoatos (PHAs) en plantas transgénicas. Los PHAs son macromoléculas sintetizadas por bacterias que se acumulan en el citoplasma formando gránulos y pueden alcanzar hasta un 90% del peso seco celular. Estas moléculas muestran propiedades parecidas a algunos plásticos como el polipropileno, por lo que han despertado gran interés, debido a que son biodegradables y reciclables. El PHA mejor estudiado es el poli(3-hidroxibutirato) (PHB). En la síntesis de este compuesto están implicadas tres enzimas, que son la 3-cetotiolasa, la 128 129 130 131 60 acetacetil-CoA reductasa y la PHA sintasa. Mediante la introducción de los tres genes bacterianos que codifican para las enzimas implicadas en su síntesis en plastos de Arabidopsis, se ha conseguido la acumulación de este polímero en una cantidad superior al 40% en peso seco. La acumulación de este polímero en Arabidopsis no da lugar a problemas de fertilidad o crecimiento, pero en las plantas que presentan altos contenidos se observan fenómenos de clorosis. Este polímero se ha conseguido expresar en otras plantas como alfalfa, mediante transformación cloroplástica de hoja, pero no se han logrado producciones tan elevadas como en Arabidopsis. Otras especies que se han considerado interesantes para la producción de este compuesto son las oleaginosas, ya que el PHB deriva del mismo precursor que los aceites. Recientemente se ha realizado la introducción de los genes de la síntesis del PHB en plantas de lino oleaginoso (Linum usitatissimum). El lino oleaginoso es una planta que se utiliza para producir fibras de estopa. La producción en una misma planta de fibras de estopa y PHB es muy interesante ya que se obtienen materiales formados por una matriz del polímero reforzada con las fibras del lino, que según los resultados parece que mejoran las propiedades extensibles de estas fibras130. El inconveniente que presenta el PHB es que es un polímero frágil con pocos usos potenciales. Existe otro copolímero denominado poli(3-hidroxibutiratoco-3-hidroxilvalerato) conocido con el nombre de Biopol, con propiedades más adecuadas que el PHB, que se ha producido en Arabidopsis y colza. Algunas de las compañías interesadas en la producción de PHAs son Monsanto, que está trabajando en soja y colza, Zeneca Seeds, que trabaja con colza131 y la empresa Metabolix, que se encuentra trabajando con mijo perenne, tabaco y alfalfa. Trethewey, R. N. (2004). Metabolite profiling as an aid to metabolic engineering in plants. Current Opinion in Plant Biology, 7, 196–201. Capell, T.; Christou, P. (2004). Progress in plant metabolic engineering. Current Opinion in Biotechnology, 15, 148–154. Wróbel, M.; Zebrowski, J.; Szopa, J. (2004). Polyhydroxybutyrate synthesis in transgenic flax. Journal of Biotechnology, 107, 41-54. Reddy, C. S. K.; Rashmi, R. G.; Kalia, V. C. (2003). Polyhydroxyalkanoates: an overview. Bioresource Technology, 87, 137-146. PLANTAS BIOFACTORÍA 5. Legislación Para asegurar que la aplicación de las técnicas de En este Reglamento se contemplan los aspectos modificación genética para obtener organismos necesarios para la aplicación de la Ley. Incluye las modificados genéticamente se hace en condiciones normas sobre información, vigilancia y control de en las que los riesgos para la salud o para el medio las actividades de utilización confinada, liberación ambiente sean mínimos, se ha adoptado una serie voluntaria y comercialización de OMGs, las de medidas de garantía y control de las actividades responsabilidades, infracciones y sanciones, así en las que se produzcan o empleen OMG. como la composición y competencias del Consejo Interministerial de Organismos Modificados La regulación en el ámbito de la Unión Europea se Genéticamente y de la Comisión Nacional de realiza a través de dos Directivas básicas, que han Bioseguridad. sido modificadas posteriormente debido a desarrollos y adaptaciones al progreso técnico: Este Reglamento define la utilización confinada como “cualquier actividad por la que se modifique • Directiva 90/219/CEE modificada por la el material genético de un organismo o por la que Directiva 98/81/CE relativa a la utilización éste, así modificado, se cultive, almacene, confinada de microorganismos modificados emplee, transporte, destruya o elimine, siempre genéticamente. que en la realización de tales actividades se utilicen medidas de confinamiento, con el fin de • Directiva 2001/18/CE sobre la liberación intencional en el medio ambiente de organismos limitar su contacto con la población y el medio ambiente”. modificados genéticamente por la que se deroga la Directiva 90/220/CEE. Es el principal instrumento legislativo en virtud del cual los ensayos experimentales y el comercio de OMG y de productos que contengan OMG son autorizados en la Comunidad Europea. Las actividades de utilización confinada se clasifican en cuatro tipos en función del riesgo para la salud humana y el medio ambiente. A cada uno de estos tipos se le asigna el grado de confinamiento suficiente para proteger la salud Estas Directivas han sido incorporadas a la legislación española a través de la Ley 9/2003, y el Real Decreto 178/2004. La Ley 9/2003 establece el régimen jurídico de la utilización confinada, liberación voluntaria y comercialización de organismos modificados genéticamente y el humana y el medio ambiente. El Reglamento incluye los requisitos habituales mínimos y las medidas necesarias para cada grado de confinamiento para las actividades de laboratorio, las actividades en invernaderos y semilleros y para actividades distintas de las de laboratorio. Real Decreto 178/2004 incorpora las Directivas y Decisiones de la Comisión de desarrollo y A continuación se incluye una tabla con las adaptación posteriores y aprueba el Reglamento notificaciones de utilizaciones confinadas llevadas a General para el Desarrollo y Ejecución de la Ley cabo en España relacionadas con la agricultura 9/2003. molecular. 61 NOTIFICACIONES DE UTILIZACIONES CONFINADAS LLEVADAS A CABO EN ESPAÑA RELACIONADAS CON LA AGRICULTURA MOLECULAR Nº de notificación Fecha recepción Empresa Lugar OMG Objeto de modificación Tipo OMG* A/ES/02/04 (a, b, c, d) 10-02-02 Dpto. Mejora Genética y Biotecnología (INIA) Madrid Diversos Diversos 1y2 A/ES/02/06 27-06-02 Universidad Pública de Navarra Navarra Nicotiana tabacum Producción de proteínas humanas 1 A C Navarra Madrid E. coli Arabidopsis thaliana Producción inóculo de vector viral TuMV Evaluación infectividad de plásmidos 1 A C Madrid Agrenvec Tarragona Potyvirus del mosaico del nabo Inoculación del potyvirus MG en plantas del género Brassica 1 A C Cataluña 01-12-03 Instituto de Biología Molecular de Barcelona Barcelona Arroz y tabaco Producción de proteínas de interés terapéutico 1 A/ES/02/12 29-11-02 A/ES/03/15 A/ES/03/17 20-11-03 Agrenvec Comunicación o autorización Tabla 14. Notificaciones de utilizaciones confinadas llevadas a cabo en España relacionadas con la agricultura molecular. * Tipo Tipo Tipo Tipo 1: 2: 3: 4: riesgo nulo o insignificante. bajo riesgo. riesgo moderado. alto riesgo. En este Reglamento se define la liberación autorización expresa previa a la liberación y un voluntaria como “la introducción deliberada en el plan de seguimiento con vistas a detectar los medio ambiente de un organismo o combinación efectos de los OMGs sobre la salud humana o el de OMGs, sin que hayan sido adoptadas medidas medio ambiente equivalentes, al menos, a los específicas de confinamiento para limitar su previstos en la Ley 9/2003 y en este Reglamento. contacto con la población y el medio ambiente y Además, deben prever los requisitos oportunos del proporcionar a éstos un elevado nivel de tratamiento de nuevos datos, información al seguridad”. público, datos sobre resultados de la liberación e intercambios de información. No será de aplicación a las sustancias y compuestos medicinales de uso humano que En este caso, el órgano competente para su consistan en OMGs o en combinaciones de éstos, autorización solicitará al Consejo Interministerial o que contengan dichos organismos, siempre que de OMGs un informe sobre la evaluación del riesgo su liberación voluntaria sea distinta a su para la salud humana y el medio ambiente. comercialización y esté autorizada por otras normas comunitarias o por la legislación española A continuación, en la tabla 15 se incluyen las dictada para su cumplimiento. Estas normas notificaciones de liberaciones voluntarias llevadas deben prever una evaluación del riesgo para la a cabo en España relacionadas con la agricultura salud humana y el medio ambiente, una molecular. 62 PLANTAS BIOFACTORÍA NOTIFICACIONES DE LIBERACIONES VOLUNTARIAS LLEVADAS A CABO EN ESPAÑA RELACIONADAS CON LA AGRICULTURA MOLECULAR Superficie de liberación Nº de notificación Empresa OMG Comunidad Autónoma Objeto de modificación Período de liberación B/ES/97/24 TEZIER IBERICA Tabaco Valencia Expresión lipasa gástrica de perro Abril-octubre 1997 B/ES/97/32 CLAUSE Ibérica/ BIOCEM Tabaco Andalucía Resistencia a kanamicina Producción de colágeno Mayooctubre 1997 2.000 m2 7/31/1997 B/ES/97/33 CLAUSE Ibérica/ BIOCEM Tabaco Andalucía Expresión lipasa gástrica de perro Abril-octubre 1997 60.000 m2 7/31/1997 B/ES/99/15 Univ. Pública de Navarra Patata Navarra Cambio de metabolismo de carbohidratos Mayo-agosto 1999 300 m2 Nav: 23/06/99 Cataluña Producción de proteínas a partir de la inoculación del virus modificado en plantas del género Brassica 15 de junio15 de septiembre 2003 30.000 m2 Cat: 19/03/04 B/ES/03/40 Agrenvec, S. L. Potyvirus del mosaico del nabo (TuMV) Fecha aprobación Sustituida B/ES/97/33 Tabla 15. Notificaciones de liberaciones voluntarias llevadas a cabo en España relacionadas con la agricultura molecular. Según el artículo 3 de la Ley 9/2003, la autorización de comercialización de OMGs o productos que los contengan, la autorización de los ensayos de campo relacionados con el examen técnico para la inscripción en el Registro de Variedades Comerciales y la vigilancia, control y sanción, son competencias de la Administración General del Estado (AGE). También corresponde a la Administración General del Estado la concesión de autorizaciones de utilización confinada y de liberación voluntaria de OMGs en los siguientes casos: • Incorporación a medicamentos de uso humano o veterinario, a productos y artículos sanitarios y a aquellos que por afectar al ser humano pueden suponer un riesgo para la salud de las personas. • Supuestos derivados de la Ley 13/1986 de Fomento y Coordinación de la Investigación Científica y Técnica cuando los programas de investigación sean ejecutados por las instituciones, entes u órganos del propio Estado. Estas autorizaciones son otorgadas por el Consejo Interministerial de Organismos Modificados Genéticamente, adscrito al Ministerio de Medio Ambiente. Dicho Consejo está compuesto por representantes de los Ministerios de Medio Ambiente; Agricultura, Pesca y Alimentación; Sanidad y Consumo; Economía y Hacienda; Industria, Turismo y Comercio; Educación y Ciencia e Interior, todos ellos con rango de Director General. El Consejo funciona en coordinación con la Comisión Nacional de Bioseguridad, y es responsable de la coordinación e intercambio de información con las Comunidades Autónomas y con la Comisión Europea. Las Comunidades Autónomas son competentes en la concesión de autorizaciones, (salvo los casos que corresponden a la Administración General del Estado) de utilización confinada y de liberación voluntaria de OMGs con fines de investigación y desarrollo y cualquier otro distinto de la comercialización; y en la vigilancia, el control, y la imposición de sanciones de estas actividades, con excepción de las que son de competencia estatal, según lo que se ha indicado anteriormente. Las actividades de evaluación de riesgo de los organismos modificados genéticamente están adscritas al Ministerio de Medio Ambiente, 63 conforme a lo establecido en el Real Decreto 1477/2004 por el que se desarrolla la estructura orgánica básica del Ministerio de Medio Ambiente. La Comisión Nacional de Bioseguridad es un órgano colegiado de carácter consultivo cuya función es informar sobre las solicitudes de autorización correspondientes a organismos modificados genéticamente. Está adscrita al Ministerio de Medio Ambiente y compuesta por representantes de los diferentes Ministerios implicados y por representantes de las Comunidades Autónomas, así como de personas e instituciones expertas en la materia. Además de esta normativa encaminada a garantizar que los riesgos para la salud o el medio ambiente derivados de las actividades en las que se produzcan o empleen OMGs sean mínimos, es necesaria la regulación de la coexistencia de los cultivos de OMGs y otros tipos de cultivos incluidos los convencionales y los ecológicos. No existe una normativa que regule este aspecto, pero sí se ha elaborado una Recomendación de la Comisión (2003/556/CE), sobre las Directrices para la elaboración de estrategias y mejores prácticas nacionales a fin de garantizar la coexistencia de los cultivos modificados genéticamente con la agricultura convencional y la agricultura ecológica. Debido a las condiciones específicas de cada país miembro, la Comisión no es partidaria de la elaboración de una normativa comunitaria, sino que deja libertad a cada estado miembro para elaborar su propia normativa nacional. Esta Recomendación ofrece una serie de principios y factores que deben tenerse en cuenta para la elaboración de estrategias de coexistencia. En España aún no se ha aprobado una normativa sobre coexistencia aunque existe un borrador muy avanzado del Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación. A continuación se incluyen tres cuadros en los que se indican los procedimientos administrativos de autorización de las actividades de utilización confinada, liberación voluntaria y comercialización de organismos modificados genéticamente. 64 PLANTAS BIOFACTORÍA UTILIZACIÓN CONFINADA DE ORGANISMOS MODIFICADOS GENÉTICAMENTE - RD 178/2004 SOLICITANTE CC.AA. Evaluación del riesgo de la actividad para la salud humana y el medio ambiente Comisión Regional de Bioseguridad Comunicación a la Administración de la utilización de instalaciones específicas TIPO 1 TIPO 2 TIPOS 3 y 4 AGE* Comprobación documental Director General de Calidad y Evaluación Ambiental Art. 3 Ley 9/2003 Secretario del Consejo Interministerial de OGMs Comisión Nacional de Bioseguridad Mínimo 45 días € Mínimo 90 días Recibo tasas Mínimo 45 días Informe de conformidad RESOLUCIÓN DE AUTORIZACIÓN Emisión resolución * Administración General del Estado. Comunicación de primera utilización de instalaciones. Comunicación de utilizaciones confinadas sucesivas. Inicio de la actividad en primera utilización. Inicio de actividad en utilizaciones sucesivas. Autorización expresa para primera utilización. Autorización expresa para sucesivas utilizaciones. TIPO DE ACTIVIDADES: TIPO TIPO TIPO TIPO 1: 2: 3: 4: RIESGO NULO O INSIGNIFICANTE BAJO RIESGO RIESGO MODERADO ALTO RIESGO Fuente: AGRENVEC. LIBERACIÓN VOLUNTARIA EN EL MEDIO AMBIENTE DE OGMs CON FINES DISTINTOS A LA COMERCIALIZACIÓN - RD 178/2004 SOLICITANTE CC.AA. Comisión Regional de Bioseguridad Estudio técnico Evaluación del riesgo Resumen en inglés Comprobación documental Solicitud de autorización RESOLUCIÓN DE AUTORIZACIÓN Director General de Calidad y Evaluación Ambiental COMISIÓN EUROPEA 30 días Información pública Art. 3 Ley 9/2003 Secretario del Consejo Interministerial de OGMs Recibo tasas Comisión Nacional de Bioseguridad € Mínimo 90 días AGE Emisión resolución Informe de conformidad Informe de resultados Solicitud de autorización de liberación voluntaria en el medio ambiente. Autorización expresa con condiciones particulares. Inicio de la liberación voluntaria. Fuente: AGRENVEC. 65 66 Notificador o ecib de r e s Acu Envío de la notificación Fuente: Ministerio de Medio Ambiente **ERMA: Evaluación de riesgos medioambientales Comunidades Autónomas Envío de la notificación Consejo Interministerial de OGMs Toma de decisión final Comisión Europea Información adicional Solicitud de informe Informe de evaluación de España Consejo Europeo Informe ERMA** Observaciones Envío informe de evaluación Formulación de observaciones ¿? Solicitud de información adicional Envío inmediato del SNIF Informe de evaluación (90 días) Contestación a observaciones, objeciones y envío de información adicional Estados miembros Formulación de observaciones y/u objeciones, petición de información adicional (60 días) Envío inmediato del SNIF* PROCEDIMIENTO DE COMERCIALIZACIÓN DE OMGs Informe de evaluación + Notificación completa (30 días) *SNIF: Formato resumen de la notificación Formulación de observaciones y/u objeciones, petición de información adicional (60 días) Comisión Nacional de Bioseguridad (Informe Preceptivo) Consulta pública (Página web JRC, 30 días) PLANTAS BIOFACTORÍA 6. Aspectos de mercado 132 Descripción del sector No obstante, las primeras moléculas procedentes de plantas como biofactorías que se han comercializado La agricultura molecular puede considerarse un no han sido biofármacos, sino las enzimas subsector dentro de la biotecnología formado producidas por Prodigene y comercializadas por principalmente por grupos de investigación de Sigma Aldrich. Esto se debe a que a la producción centros públicos y de universidades y por de moléculas de interés industrial se le aplica una empresas, en su mayoría de pequeño tamaño, normativa menos estricta que la que se aplica a aunque existen algunas con un tamaño mayor y moléculas biofarmacéuticas. un número de empleados en torno a 50 personas. La relación entre los centros de investigación y las empresas es muy estrecha, y en muchos casos los Empresas centros de investigación proporcionan a las empresas distintos servicios o los componentes La base del sector la constituyen las denominadas técnicos de la plataforma de producción, “empresas plataforma”, que son aquellas incluyendo herramientas de transformación, capaces de llevar a cabo la mayor parte de los expresión, etc. procesos necesarios para la obtención de proteínas recombinantes en plantas (incluyendo Como se ha indicado, el principal interés las tecnologías básicas de transformación y los de la utilización de plantas como biofactorías sistemas que permiten optimizar la producción y es la obtención de proteínas recombinantes de purificación). Para poder operar con libertad interés biosanitario, debido a la creciente necesitan tener el control sobre la propiedad demanda de este tipo de productos y a la industrial, lo cual puede hacerse a través del dificultad que entraña su obtención, y es en este desarrollo de tecnología o bien licenciando la que sentido en el que se orientan la mayor parte de otros han patentado. Dentro de las empresas las empresas. plataforma se diferencian dos grupos: • Empresas con experiencia, con productos en fase de ensayo clínico o cercanos a esta fase. Se formaron a finales de los años 90, son de tamaño mediano y contienen en sus plantillas científicos cualificados, expertos en normativa y empresarios. Operan como plataformas de producción completas y son capaces de producir moléculas a pequeña escala. Muchas de estas empresas han tenido problemas financieros y la mayor parte dependen de inversores privados. A medida que los productos avancen en los ensayos clínicos el valor de estas empresas irá aumentando, aunque es posible que algunas desaparezcan, como ha ocurrido con CropTech. Algunos ejemplos son Large Scale Biology, Meristem Therapeutics, Planet Biotechnology, Prodigene, Sembiosys Genetics, Icon Genetics, Medicago, Plantechno y SunGene. • Empresas de reciente creación, de pequeño tamaño, con menos de 10 empleados. Son principalmente “spin-off” de centros de investigación de universidades o centros públicos. Dentro de este grupo se incluyen desde empresas que desarrollan tecnologías hasta empresas que desarrollan productos. Su financiación es mediante inversores semilla y subvenciones de gobiernos locales. Es posible que aquellas empresas que desarrollan tecnologías en un futuro sean capaces de desarrollar plataformas de producción completas o bien que se integren en empresas de mayor tamaño dedicadas a la agricultura molecular. Dentro de este grupo se encuentran las empresas españolas que en la actualidad se dedican a agricultura molecular como Agrenvec, Era Plantech y Plant Bioproducts. 132 Arcand, F.; Arnison, P. (2004). Development of Novel Protein-Production Systems and Economic Opportunities & Regulatory Challenges for Canada. www.plantpharma.org/documents/NPPS_040412.pdf. 67 Existe otro tipo de empresas dedicadas al desarrollo de productos, creadas específicamente para este fin como “spin-out” o filiales a partir de otras empresas del sector farmacéutico o de la biotecnología en general. No poseen una plataforma completa de producción y su objetivo es el desarrollo de nuevos sistemas de producción o de nuevos productos de su propiedad. Es posible que el número de empresas de este tipo aumente debido a alianzas y acuerdos de licencia de patentes en el caso de que continúe la tendencia al desarrollo de este tipo de productos. Algunos ejemplos son Agracetus o Calgene. Propiedad Industrial Como se ha indicado para la obtención de una planta que pueda usarse como una biofactoría de moléculas de interés es necesaria la utilización de distintas tecnologías. Por una parte se encuentran las tecnologías de transformación, más generales y menos dominantes; y por otra, tecnologías relacionadas con la optimización de la producción y la mejora de la purificación y el confinamiento, que son más específicas para cada combinación de planta/plataforma. La libertad de operación puede conseguirse mediante el desarrollo de actividades investigadoras que conduzcan a la obtención de patentes. En caso de que la tecnología que se necesite pertenezca a otra organización también puede lograrse estableciendo acuerdos o alianzas, o a través del pago de licencias. Es necesario evaluar el coste que implica el desarrollo de tecnologías originales patentables, frente al coste que supone licenciar tecnologías ya existentes. Es posible que el establecimiento de acuerdos con los propietarios de la tecnología o incluso la licencia de la patente, sean más beneficiosos que la inversión que supone el desarrollo de la tecnología. Sin embargo, la obtención de patentes de tecnologías originales permite a la empresa elegir entre varias posibilidades: • Una estrategia monopolista para evitar que otros exploten su tecnología. • Una estrategia de licencias que les proporcione ingresos procedentes de las ventas de otras empresas. • El establecimiento de colaboraciones que les permitan acceder a la tecnología de otras empresas. 68 La estrategia más adecuada para empresas pequeñas y centros de investigación parece ser el desarrollo de la mayor cantidad posible de patentes en las áreas donde existan menos. Esto permitiría establecer acuerdos de co-licencia con los dueños de patentes dominantes, situándose en una posición defensiva más fuerte en tecnologías que facilitan la aprobación del producto, la seguridad y eficacia y la producción de biomasa. Evolución del sector Como se ha indicado a lo largo del informe, el principal interés del sector se centra en el desarrollo de moléculas de interés biosanitario. Existen ya algunos productos que han superado las etapas preclínicas y en la actualidad están en fase de ensayo clínico, por lo que es posible que en los próximos años algunos de ellos alcancen el mercado. El tiempo empleado en el desarrollo de este tipo de productos implica la inmovilización del capital durante periodos relativamente largos. A medida que se avanza en las investigaciones es necesario realizar nuevos aportes de capital. Por este motivo es posible que algunas empresas pasen a desarrollar productos no farmacéuticos con un tiempo de aprobación menor y una entrada en el mercado más rápida, que generará beneficios de manera más temprana. Teniendo en cuenta estos puntos es previsible que la evolución del sector se oriente hacia: • La continuación en el desarrollo de productos farmacéuticos, solos o en sociedad con compañías biofarmacéuticas. Pueden establecerse relaciones entre empresas, incluyendo la subcontratación de empresas de agricultura molecular por farmacéuticas para el desarrollo de productos concretos y, en algunos casos, la compra de estas empresas de modo que pasen a ser unidades integradas dentro de las biofarmacéuticas. Excepcionalmente, algunas empresas dedicadas al desarrollo de plantas como biofactorías de moléculas de interés terapéutico, crecerán para convertirse en empresas farmacéuticas integradas. • El desarrollo de productos no farmacéuticos. En este tipo de productos se incluyen productos de interés industrial, productos dedicados al cuidado personal y reactivos de laboratorio. Son productos que requieren un tiempo de aprobación menor que los farmacéuticos, de modo que podrán entrar antes en el mercado y generar ingresos. PLANTAS BIOFACTORÍA • El desarrollo de productos en tejidos comestibles para la elaboración de productos farmacéuticos o no completado la fase I de ensayo clínico), contra papilomavirus y contra parvovirus. farmacéuticos cuya administración pueda realizarse sin necesidad de purificación, bien por vía oral o por Colaboraciones: vía dérmica. Este tipo de productos, como se ha indicado, presentan ventajas económicas porque evitan la etapa de purificación, pero existen algunos retos técnicos y obstáculos legislativos. • Colaboración con ProdiGene Inc., para el desarrollo de anticuerpos terapéuticos. Prodigene desarrollará las construcciones genéticas para la transformación y Large A continuación se indican algunos ejemplos de Scale Biology Corp. usará sus tecnologías de empresas que poseen productos en fase de bioprocesamiento y extracción para purificar ensayo clínico, relativamente cercanos a la los anticuerpos de manera eficiente y comercialización. económica. • Colaboración con el US Naval Medical Research LARGE SCALE BIOLOGY CORP. Center, en el estudio de nuevas proteínas California, Estados Unidos capaces de estimular el crecimento de las células www.lsbc.com de la médula ósea y células madre. Es una empresa estadounidense de tamaño Su estrategia de protección de su propiedad medio, con 130 profesionales, fundada en 1987. industrial está encaminada a asegurarse libertad Se dedica a la investigación, análisis, de operación en todas sus áreas de negocio. En el manufactura y comercialización de proteínas. campo de GENEWARE® poseen 17 patentes estadounidenses y 47 en otros países, cuyas Mantiene colaboraciones con distintos centros y duraciones están entre 2011 y 2018. Poseen otras empresas entre los que se encuentran algunas patentes relacionadas con proteómica, genómica y relacionadas con la agricultura molecular como biomanufactura. Dow AgroSciences LLC, Prodigene Inc. o Plant Bioscience Ltd. MERISTEM THERAPEUTICS Poseen una tecnología basada en la utilización de vectores virales denominada GENEWARE®. Ésta permite testar la función de nuevos genes, Clermont-Ferrand, Francia (subsidiaria en Massachusetts, Estados Unidos) www.meristem-therapeutics.com las proteínas codificadas por ellos, la producción en masa y purificación de proteínas Es una empresa de tamaño medio con alrededor recombinantes en plantas de tabaco y la de 60 trabajadores, de los cuales 40 son evaluación de la expresión transitoria de genes científicos. Fundada en 1997 para desarrollar un foráneos. Usan el virus del mosaico del tabaco y programa de investigación denominado Molecular tienen autorización de APHIS (Animal and Plant Pharming®, que se inició en 1992 por el Grupo Health Inspection Service) para realizar ensayos Limagrain y cuyo objetivo se centraba en la de campo con este virus. producción de proteínas terapéuticas recombinantes derivadas de plantas. El Grupo Poseen varios productos en distintas fases de Limagrain contribuyó con su propiedad industrial, desarrollo y colaboraciones para el desarrollo de resultados científicos, material y know-how. En la otros productos nuevos: actualidad es líder en la producción de proteínas terapéuticas recombinantes en plantas para la Desarrollo de productos: • α-galactosidasa A para el tratamiento de la enfermedad de Fabry (en fase de ensayo clínico), lipasa ácida lisosomal (LAL en sus siglas en inglés), para terapia cardiovascular y una nueva generación de compuestos biológicos como aprotinina e interferón. • Vacunas personalizadas contra el linfoma no-Hodgkins (en la actualidad se ha industria farmacéutica. Mantiene colaboraciones con distintas empresas como Stallergenes, para evaluar la viabilidad industrial y producción de dos alérgenos de ácaros en plantas; con Mitsubishi Pharma Corp y Eli Lilly Co., para la producción de proteínas recombinantes en plantas, y con el Grupo Limagrain, que les proporciona infraestructuras agrícolas y su banco de germoplasma. 69 Posee una plataforma denominada Molecular plantas (incluyendo lipasa, lactoferrina, Pharming® Platform Technology, que incluye hemoglobina y colágeno) y herramientas de la desde la tecnología de transformación biología molecular (promotores y vectores (agroinfiltración y transformación estable de para aumentar la expresión de proteínas tabaco y maíz) hasta la fase final de purificación. recombinantes en plantas dicotiledóneas y monocotiledóneas). Poseen varios productos en distintas fases de desarrollo: • Lipasa gástrica para el tratamiento de la • Patentes relacionadas con la extracción y purificación. • Patentes relacionadas con la producción de insuficiencia exocrina pancreática en pacientes plantas (aumento de la producción e inhibición afectados por fibrosis quística o patologías de la germinación). pancreáticas, expresada en maíz. Se han realizado los ensayos clínicos en fase I siendo Además han firmado acuerdos de licencia satisfactorios, por lo que en la actualidad se exclusivos y no exclusivos de patentes con otras encuentra en fase II en Alemania y Francia y empresas como Von Schawen, Japan se espera que esté en el mercado en Europa Tobacco, Pangene, Calgene y Mogen entre 2007-2008. Han obtenido el “orphan Licensing y con la fundación Cornell Research drug status” en Europa. Foundation. • Albúmina sérica humana. Han conseguido producir cantidades de miligramos en tabaco, con un correcto patrón de plegado. Colaboran PLANET BIOTECHNOLOGY INC. con la empresa Pangene, para el desarrollo de California, Estados Unidos una técnica que permita su expresión en maíz. www.planetbiotechnology.com • Lactoferrina en fase I de ensayos clínicos, para tratamiento de infecciones gastrointestinales y síndrome del ojo seco en maíz. • Alérgenos recombinantes de los ácaros del polvo. Es una empresa estadounidense dedicada a la investigación, desarrollo y comercialización de nuevos productos terapéuticos y preventivos basados en anticuerpos monoclonales obtenidos de plantas genéticamente modificadas. • Producción de colágeno humano en plantas. Han conseguido producir cantidades de gramos en tabaco. Producen dos tipos de colágeno, una forma hidroxilada, que forma fibras y es estable a temperaturas con relevancia biológica y un tipo no hidroxilado que podría usarse como pegamento biológico. Poseen una tecnología para la producción de inmunoglobulina A (Protected-SIgA™) en plantas transgénicas. Es la primera empresa en el mundo que ha conseguido producir y testar clínicamente de manera exitosa un anticuerpo en plantas de tabaco. • Se encuentran investigando la producción de otras proteínas recombinantes complejas Se han centrado en el desarrollo de drogas como la hemoglobina humana en tabaco y preventivas y terapéuticas en tres mercados anticuerpos monoclonales, de los que han médicos amplios no referidos a enfermedades conseguido obtener cantidades de miligramos mortales. Poseen tres productos en desarrollo: de anticuerpos monoclonales completos y conformados en tabaco. • CaroRx™. Anticuerpo para prevenir la caries dental. Están en ensayos en fase II para Poseen una autorización de APHIS para realizar desarrollar IgGs. ensayos de campo con maíz. • RhinoRx™. Anticuerpo para tratar los En cuanto a su estrategia en el ámbito de la propiedad industrial, poseen patentes pertenecientes a distintas familias, entre las que se incluyen: catarros debidos a rinovirus. Ensayos en fase I. Anti-ICAM-1 SIgA tópico para rinovirus en tabaco. • DoxoRx™. Anticuerpo para el tratamiento de • Patentes que cubren la producción y aislamiento de distintas clases de proteínas en 70 la alopecia inducida por el tratamiento quimioterapéutico. PLANTAS BIOFACTORÍA – Lacasa. Es una enzima redox que se usa PRODIGENE INC como blanqueante en distintas industrias. Texas, Estados Unidos www.prodigene.com Su propiedad industrial les permite tener una posición fuerte frente a empresas competidoras. Es una empresa estadounidense pionera en el Combinan el desarrollo y comercialización de los uso de plantas transgénicas para producir productos de los que son propietarios de proteínas recombinantes con uso en el campo manera independiente, con colaboraciones y farmacéutico, industrial y de la salud animal. Es alianzas con otras compañías para la fabricación la primera empresa que ha desarrollado y de proteínas de interés terapéutico e industrial. comercializado este tipo de productos. Han colaborado con empresas farmacéuticas y Existen otras empresas que han desarrollado dedicadas a la agricultura molecular como tecnologías específicas para mejorar alguno de los Genencor Inc, Pharmaceutical Inc., Large puntos para optimizar la producción de proteínas Scale Biology Corp., Avant recombinantes en plantas. A continuación se Immunotherapeutics Inc., Eli Lilly & Co. y indican algunas de ellas: Stauffer Biotech. Son propietarios de una plataforma tecnológica para la expresión de proteínas recombinantes en maíz. Su sistema de producción abarca desde el SEMBIOSYS GENETICS INC. Alberta, Canadá www.sembiosys.ca aislamiento del gen de interés hasta la purificación de la proteína producida por este gen. Es una empresa canadiense cuya actividad se centra en el desarrollo, comercialización y Poseen una gran cantidad de productos en desarrollo: • Vacunas. Han desarrollado vacunas contra la hepatitis B y contra la gastroenteritis bacteriana (gastroenteritis del “viajero”) que producción de proteínas de interés farmacéutico y no farmacéutico en plantas mediante la utilización de herramientas de la ingeniería genética y su plataforma tecnológica denominada cuerpo lipídico-oleosina. se encuentran en fase I de ensayo clínico. La plataforma cuerpo lipídico-oleosina está Están desarrollando otras vacunas contra el dirigida a la producción y purificación de virus de la gastroenteritis transmisible porcina proteínas recombinantes en cártamo, que es y se encuentran colaborando en proyectos una planta oleaginosa. Esta plataforma permite para el desarrollo de otras vacunas animales una purificación eficiente y económica de las que son confidenciales. proteínas recombinantes mediante el anclaje de • Productos terapéuticos humanos. Han las mismas a los cuerpos lipídicos lo que permite comercializado una proteína terapéutica que una recuperación y purificación simultánea, se utiliza en cirugía para prevenir las pérdidas junto con una producción a gran escala. de sangre denominada aprotinina bajo el nombre de AproliZean™. • Anticuerpos. • Productos para usos no clínicos: Poseen colaboraciones con Dow Agrosciences y en 2003 firmaron un acuerdo con Syngenta Participation AG, que le permite a Syngenta usar su tecnología para la producción de sus compuestos biológicos. – TrypZean™ (tripsina). Es una enzima proteasa que se utiliza como intermediario Han desarrollado varios productos y sistemas de en la industria farmacéutica en el proceso de desarrollo de productos basados en esta fabricación de determinados productos. plataforma: – AproliZean™ (aprotinina). Es un inhibidor de proteasas que se usa como reactivo en cultivos celulares. – Avidina. Es una molécula utilizada como • Stratosome™ Biologics System y Affinity Capture System. Esta tecnología permite la producción y purificación de proteínas recombinantes dirigiendo las mismas hacia los reactivo de diagnóstico y posee aplicaciones cuerpos lipídicos y purificando éstos en la purificación de proteínas. posteriormente. 71 • StratoCapture™ Purification System. Sistema basado en la unión de la proteína A a las oleosinas que permite la purificación sencilla de anticuerpos producidos en plantas. Además pretenden utilizar su plataforma para optimizar la producción de las siguientes proteínas: • Insulina. Se encuentra en fase de investigación, y creen que podría estar en el mercado a partir de 2008-2009. • Apolipoproteína A-I y A-IMIlano para reducir y estabilizar la formación de placas de ateroma que se asocian con enfermedades cardiovasculares. Estos productos se encuentran en fase de investigación y se espera que puedan estar en el mercado en 2011. Poseen una cartera de patentes que les permite la comercialización en exclusiva de su plataforma de producción. CHLOROGEN Missouri, Estados Unidos El científico principal y creador de la empresa, Henry Daniell, patentó por primera vez la expresión de genes en cloroplastos en 1988. Desde entonces, ha patentado distintas tecnologías relacionadas con la transformación de cloroplastos y secuencias reguladoras de la expresión de los genes introducidos exclusivamente en estos orgánulos. Por tanto, las patentes más antiguas y dominantes en este campo son de su propiedad. Sus estrategias de mercado se centran en el desarrollo de proteínas de interés farmacéutico, bien mediante la licencia de su tecnología para co-desarrollar estos productos o bien proporcionando la tecnología a empresas del sector farmacéutico para el desarrollo y fabricación de proteínas de interés sin licenciar su tecnología. Otra posibilidad que barajan es la asociación con otras empresas pertenecientes a mercados distintos del farmacéutico, como el desarrollo de alimentos o piensos, y productos industriales, con posibilidad de licenciar su tecnología de transformación de cloroplastos. Por último, mencionaremos tres empresas españolas dedicadas a la agricultura molecular: www.chlorogen.com Empresa estadounidense fundada en 2002 que AGRENVEC Madrid, España se dedica a la transformación de cloroplastos www.agrenvec.es para el desarrollo de fármacos y otros productos. Ha conseguido expresar distintos tipos de proteínas con interés terapéutico e industrial en cloroplastos de tabaco, entre los que se encuentran: • Medicamentos y vacunas: albúmina sérica humana para usos terapéuticos y no terapéuticos, interferón para enfermedades hepáticas, factor de crecimiento tipo insulina Nace en 2001 como una spin-off, a partir de la licencia de una patente del INIA (Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria) y con la participación de la empresa de capital riesgo NAJETI España. La iniciativa de Agrenvec ha sido respaldada por el CDTI (Centro para el Desarrollo Tecnológico Industrial), del Ministerio de Ciencia y Tecnología, a través de la concesión de un proyecto NEOTEC, para la creación de nuevas empresas de base tecnológica. (insulin-like growth factor) para tratamiento de diabetes, y vacunas contra cólera, antrax y peste. • Biopolímeros: han expresado en tabaco proteínas que producen polímeros para usos Poseen una plataforma tecnológica basada en la utilización de vectores virales para la utilización de plantas como biofactorías. Utilizan el vector viral p35Tunos-vec01 derivado del virus del mosaico del nabo (virus TuMV). industriales, como la elastina y el 4HB, que es un componente de un polímero de cristal líquido denominado zenita. Poseen una autorización de APHIS para el cultivo de tabaco. 72 Las moléculas producidas en plantas biofactoría de interés para esta empresa son principalmente enzimas con aplicaciones en los campos industrial, agrícola, terapéutico y medioambiental. PLANTAS BIOFACTORÍA Ha establecido colaboraciones con centros públicos de investigación y con empresas privadas de PLANT BIOPRODUCTS, S.L. biotecnología, lo que le permite el uso de Madrid, España tecnologías complementarias y el desarrollo de www.plantbioproducts.com nuevos productos no disponibles en el mercado. Es una empresa creada en marzo de 2003 a partir de una idea empresarial de Ignacio ERA PLANTECH Moreno Echanove. Barcelona, España www.eraplantech.com En junio de 2004 firmaron un convenio de colaboración con el departamento de Es una empresa ubicada en la Bioincubadora del Biotecnología del Instituto Nacional de Parque Científico de Barcelona, que produce Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria péptidos y proteínas recombinantes de interés (INIA) que permite la incubación de su proyecto terapéutico o industrial en plantas. de I+D en dicho centro. La firma de este convenio fue auspiciada por la Fundación Sus principales socios son Advancell —gestión Genoma España, que además le presta apoyo y desarrollo de negocio— y BCN Emprèn, que financiero y oferta de servicios. Posteriormente es una empresa de capital riesgo. se han sumado a este proyecto el Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias de Posee una plataforma tecnológica denominada Argentina (INTA) y un profesor titular de la ZERA™, que permite la acumulación de Universidad Pública de Navarra. proteínas y péptidos en las plantas. Utiliza dominios de almacenamiento en el retículo El proyecto consiste en el desarrollo de una endoplásmico, consiguiendo una acumulación plataforma tecnológica basada en la elevada de la proteína recombinante. La modificación genética de cloroplastos de plantas plataforma incluye todas las etapas del proceso superiores para producción de aplicaciones de obtención de proteínas recombinantes en comerciales en las que se utilizará el material plantas, incluyendo la transformación mediante vegetal en bruto. Algunos ejemplos de estas Agrobacterium, la purificación y la validación de aplicaciones son la utilización de celulasas para las proteínas diana. Ha conseguido producir con la conversión de biomasa celulásica en éxito calcitonina en plantas de tabaco. bioalcohol o la producción de antígenos vacunales de administración oral. En la actualidad se encuentra optimizando la tecnología ZERA™ para asegurar su viabilidad y competitividad, para lo cual se le ha concedido un proyecto NEOTEC. Está investigando en nuevos sistemas de expresión constitutiva, expresión específica en semillas y la elaboración de una cartera de productos propios. Sus científicos fundadores son Dolors Ludevid y Margarita Torrent, y cuenta con los En la actualidad se encuentra trabajando en varios productos con el fin de validar sus logros tecnológicos, a la vez que desarrolla sus primeras aplicaciones industriales. Estos productos son un antígeno que protege frente a la enfermedad hemorrágica del conejo y un antígeno inmunocompetente para el control de la fiebre aftosa bovina. investigadores Blanca Llompart y Miriam Bastida. En Biospain 2004 se realizó la Se encuentra interesada en colaborar con presentación del nuevo Director General de la empresas e instituciones que dispongan de empresa, François Arcand. productos y/o aplicaciones de su propiedad compatibles con la expresión genética en Posee una solicitud de patente para la cloroplastos y que deseen utilizar una producción de péptidos y proteínas por plataforma sencilla de producción para validar acumulación de las mismas en cuerpos proteicos sus aplicaciones. derivados del retículo endoplásmico, mediante la utilización de dominios de la proteína γ-zeina, Sus colaboradores científicos son José Ángel capaz de dirigir y retener la proteína hacia el Martínez Escribano (investigador del Dpto. de retículo endoplásmico. (US 20040005660: Biotecnología del INIA), Daniel Mariano Pérez Production of peptides and proteins by Filgueira (investigador asociado del INIA) y Jon accumulation in plant endoplasmic reticulum- Veramendi Charola (profesor titular de la derived protein bodies). Universidad Pública de Navarra). 73 7. Aspectos socioeconómicos La utilización de plantas como biofactorías tiene múltiples ventajas sobre otros tipos de sistemas de producción, pero presenta una serie de factores críticos que deben ser tenidos en cuenta. Entre ellos se encuentran los riesgos para el medio ambiente y para la salud que puedan producirse como consecuencia del cultivo de este tipo de plantas al aire libre. Otros derivan de la posibilidad de pasar a la cadena alimentaria 133. El abordaje de algunos de estos factores críticos puede llevarse a cabo mediante el desarrollo de estrategias tecnológicas. En otros casos, será necesario el establecimiento de técnicas de cultivo especiales como el cultivo con medidas de confinamiento, como invernaderos con barreras contra polen y animales, túneles de plástico e incluso minas y cuevas. En cualquier caso, la adopción de estas medidas lleva asociada un coste económico. En 2002 la empresa Prodigene se vio implicada en dos casos de contaminación de cultivos de soja con maíz modificado genéticamente que se había cultivado anteriormente en esos campos. La empresa realizó ensayos de campo con un maíz modificado para producir un antígeno para elaborar una vacuna contra el virus de la gastroenteritis transmisible porcina. Tras la recolección de este maíz se realizó una nueva siembra, que en este caso fue de soja, pero no se llevó a cabo una limpieza correcta de dos de los campos, de modo que quedaron restos de maíz transgénico, que creció junto con la soja contaminando este cultivo. Inspectores del APHIS que realizaban controles de campo, detectaron la contaminación e indicaron la necesidad de destruir las semillas y plantas dentro de un radio de 1.320 pies del lugar donde se había realizado el ensayo. En uno de los campos se llevó a cabo esta destrucción, bajo la supervisión de inspectores del APHIS, pero en el otro se llegó a recolectar la soja. Esta soja contaminada con el maíz transgénico fue enviada a un elevador de grano, donde se mezcló con 500.000 celemines de soja procedente de otros campos, por lo que fue necesario que el USDA destruyese toda la soja que había en el elevador. Como consecuencia de estos incidentes, la empresa Prodigene fue condenada a pagar una multa de 250.000 dólares y ha debido reembolsar al USDA el coste que tuvo la adquisición y destrucción de la soja contaminada en los elevadores de grano 134. En el incidente que ocurrió con la empresa todavía no presentaban semillas por lo que la Prodigene la cantidad de maíz que contaminó el cantidad de proteína que se encontraba en esos elevador de grano fue muy pequeña, ya que en el 650 gramos de tejido era realmente muy campo de cultivo se contabilizaron menos de 10 pequeña, y en 500.000 celemines de soja era una plantas. Se estima que al elevador de grano debió cantidad casi inapreciable. Posteriormente la FDA llegar aproximadamente el equivalente a 650 admitió en una nota de prensa que aunque el gramos de tejido de maíz, ya que durante la material procedente del maíz nunca debió haber recolección de la soja se separan las hojas de las contaminado la soja, no había existido riesgo para legumbres, que son las que se llevan al silo, de la salud humana ya que éste se hubiese derivado modo que la mayor parte de las plantas de maíz de una ingesta elevada del producto que podría se debieron eliminar durante el cosechado. haber provocado reacciones alérgicas 135. Además, la proteína transgénica que producían estas plantas llevaba un promotor específico de Este incidente ha marcado un hito importante. semilla, por lo que era en este tejido en el que se Para algunos grupos demuestra el gran riesgo que acumulaba. Las plantas de maíz en el momento de supone el cultivo de plantas como biofactorías de la recolección no habían alcanzado la madurez y productos farmacéuticos, frente a otros para los 133 134 135 74 Huot, M. F (2003). Plant Molecular Farming: Issues and Challenges for Canadian Regulators. Option Consommateurs. www.aphis.usda.gov/brs/compliance9.html U.S. Food and Drug Administration. FDA Action on Corn Bioengineered to Produce Pharmaceutical Material. November 19, 2002. www.fda.gov/bbs/topics/ANSWERS/2002/ANS01174.html PLANTAS BIOFACTORÍA que se demuestra la eficacia de las medidas de una adaptación de las infraestructuras y desarrollar control de las autoridades. En cualquier caso, nuevos procedimientos de cultivo y recolección, que parece que este incidente se derivó de unas malas cambiarían el concepto que se tiene actualmente de prácticas agrícolas, más que de otro tipo de la agricultura. En el caso de plantas biofactoría, la factores críticos. empresa propietaria es dueña no sólo de las semillas, sino de todo lo que se produzca a partir El grupo de trabajo de la Biotechnology Industry de ellas. El cultivo de estas plantas debe realizarse Organization (BIO en sus siglas en inglés) ha tal y como la empresa indique. desarrollado guías de prácticas genéricas de confinamiento, que contienen una serie de medidas de control de la exposición complementarias que incluyen: Las relaciones que se establecen entre las empresas propietarias de las plantas y los agricultores pueden ser de varios tipos. Una posibilidad es que el agricultor propietario de la • Aplicación de sistemas de Análisis de Contención y Puntos de Control Crítico (CACCP en sus siglas en inglés) para el diseño de prácticas de cultivo que aseguren un alto grado de seguridad, adaptados a cada combinación de planta, plataforma y producto. tierra realice el cultivo de las plantas transgénicas siguiendo las normas marcadas por la empresa, que debe encargarse de su entrenamiento. Otra opción es que la empresa se encargue de todo el proceso de cultivo de las plantas mediante la contratación y entrenamiento de personal y pague un precio al agricultor por el uso de sus tierras. • Medidas de confinamiento agronómico. Son procedimientos estándar de operación específicos para cada combinación de planta y plataforma de producción, que se pueden considerar el equivalente a las Buenas Prácticas de Fabricación y por analogía se llaman Buenas Prácticas Agronómicas. Su diseño debe hacerse Para analizar la rentabilidad de la agricultura molecular para el agricultor, en el caso de que sea éste el que se encargue de cultivar las plantas transgénicas, es necesario tener en cuenta distintos factores:136 en función de la naturaleza y riesgo del producto que se desea producir. • Cantidad de terreno dedicado. • Viabilidad del sistema de producción. • Medidas de bioconfinamiento. Son propiedades de la biofactoría que previenen algunos riesgos de escape, como la transformación de cloroplastos, la utilización de promotores inducibles tras la recolección o la esterilidad • Inversiones del productor en tiempo y dinero que requiera el cultivo. • Responsabilidad del agricultor en caso de contaminación. masculina, que se utiliza para evitar el flujo de polen. • Seguros. • Implicación en la distribución. Estas medidas han sido adoptadas por la gran mayoría de las empresas pertenecientes a esta • Pérdida de independencia. organización dedicadas a la agricultura molecular • Efectos potenciales de la agricultura molecular y es probable que se conviertan en estándares en la salud del agricultor. industriales y que sean adoptadas por otras empresas no pertenecientes a esta organización y por centros de investigación públicos. • Infraestructura administrativa, científica y reglamentación. Como se ha indicado, unas malas prácticas Aunque existen empresas propietarias de agrícolas pueden dar lugar a problemas muy biofactorías que han optado por este tipo de serios que pueden llegar a hundir a una pequeña relación con grupos de agricultores especializados, empresa. Es muy importante aplicar todas las parece que la tendencia se dirige hacia el alquiler medidas necesarias para evitar posibles de las tierras al agricultor y contratación de contaminaciones. Para ello, es necesario realizar personal especializado para las labores de cultivo. 136 Huot, M. F. (2003). Plant Molecular Farming: Issues and Challenges for Canadian Regulators. Option Consommateurs. 75 Otro de los factores críticos que se indicaban es el riesgo de contaminación de la cadena alimentaria. Esto hace que, a la hora de evaluar la aceptación de las plantas como biofactorías, sea necesario tener en cuenta a otros agentes muy importantes que son aquellos implicados en la producción de alimentos. La US National Food Processing Association 137 (NFPA en sus siglas en inglés), ha • Certificación de las fuentes de la cadena alimentaria. • Monitorización y control rigurosos con programas de auditoría que permitan verificar que las medidas de contención y confinamiento son efectivas. • Mejora de las actividades de inspección. manifestado su opinión con respecto a la Sugieren que las inspecciones deben llevarse a utilización de plantas para producir compuestos de cabo al menos en las fases críticas de la interés farmacéutico e industrial. En esta producción, incluyendo etapas como el cultivo, asociación, aunque entienden los beneficios de la polinización y cosechado de las plantas, así producción de dichos compuestos en plantas, como en el procesado y eliminación de los creen que el principal objetivo del gobierno debe residuos. ser mantener un suministro de alimentos seguro y sano. Opinan que la presencia accidental de este • Establecimiento de un sistema de análisis de tipo de productos en la cadena alimentaria, debido peligros y puntos de control crítico semejante al a los riesgos para la salud que presentan, podría que se utiliza en la industria alimentaria para desencadenar nuevas crisis alimentarias como las realizar un análisis sistemático que permita que han sucedido en los últimos años detectar los peligros potenciales y las medidas (encefalopatía espongiforme bovina, dioxinas en de prevención relevantes. pollos, etc). Por este motivo, demandan una tolerancia cero a la presencia de estos compuestos Como se ha indicado, algunas de estas medidas en los alimentos. Para conseguir esto exigen que como la monitorización, la redundancia en los se asegure una protección contra la contaminación sistemas de confinamiento, la segregación del 100%, mediante el empleo de plantas no geográfica de cosechas en el caso del maíz y la comestibles para la expresión de proteínas aplicación de sistemas de Análisis de Contención y recombinantes. Sólo en el caso de que esto no Puntos de Control Crítico, están siendo llevadas a fuese posible aceptarían la utilización de especies cabo por las empresas pertenecientes a la comestibles, pero con unas medidas de control Biotechnology Industry Organization 139. muy estrictas entre las que incluyen138: Por último, es necesario tener en cuenta cuál es la • Sistemas de contención redundantes en función opinión de los consumidores sobre este tipo de del riesgo, que deben incluir tanto el riesgo plantas. La percepción social de los OMGs es muy debido a la especificidad biológica de la planta diferente en función de cuál sea su uso. Según el (exposición) como el riesgo debido a la proteína Comité Asesor de Ética en la Investigación que se está produciendo. Científica y Técnica de la Fundación Española para • Segregación geográfica de cultivos. la Ciencia y la Tecnología (FECYT), en el caso de las plantas modificadas genéticamente para la • Fenotipos diferenciales que permitan distinguir a producción de alimentos existe una percepción simple vista las biofactorías de la planta no negativa y un cierto rechazo que en algunos casos transformada. se deben a cierta subjetividad, desinformación e • Desarrollo de normativas de obligado cumplimiento en lugar de guías de recomendaciones. • Seguros de responsabilidades. 137 138 139 76 incluso manipulación. En este tipo de plantas las modificaciones genéticas realizadas le proporcionan a la planta ventajas para el desarrollo y supervivencia de los cultivos, como tolerancia a herbicidas o resistencia frente a Asociación estadounidense representante de una gran parte de la industria de transformación de alimentos en temas de política científica y pública, relacionados con la seguridad alimentaria, la nutrición y otros aspectos relacionados con el consumidor. www.nfpa-food.org/content/regulatory/comments_view.asp?id=43 Arcand, F.; Arnison, P. (2004). Development of Novel Protein-Production Systems and Economic Opportunities & Regulatory Challenges for Canada. www.plantpharma.org/documents/NPPS_040412.pdf. PLANTAS BIOFACTORÍA plagas, que los consumidores no consideran como un beneficio directo. En muchos casos, únicamente perciben los riesgos medioambientales y sanitarios, debidos a la posibilidad de que se produzcan alergias u otras reacciones adversas por el consumo de estos organismos. También creen que sólo se benefician las grandes compañías propietarias de las semillas. Sin embargo, en el caso de los OMGs para uso farmacéutico no existe esta percepción negativa y el consumidor considera que hay beneficios directos y se posiciona favorablemente frente a este tipo de productos140. En el caso de la utilización de plantas como biofactorías para producir compuestos de interés farmacéutico es difícil saber en qué sentido se decantará la opinión pública. Por una parte, cabría esperar la aceptación de los productos finales y por otra, es posible que la liberación al medio ambiente de este tipo de plantas genere cierto rechazo debido a los efectos que podrían tener sobre el medio ambiente y al riesgo que existe de pasar a la cadena alimentaria. 140 Comité Asesor de Ética en la Investigación Científica y Técnica (2004) Informe sobre OMGs en la agricultura y la alimentación. Fundación Española para la Ciencia y la Tecnología. 77 8. Ejemplos de grupos de investigación españoles CASO PRÁCTICO 1 Nombre de la institución o empresa: Universidad Pública de Navarra, Dpto. Producción Agraria, Área de Producción Vegetal. Dirección web: www.unavarra.es/produccionagraria GRUPO DE INVESTIGACIÓN: Agrobiotecnología Vegetal. Personal: 1 Catedrático, 1 Titular, 1 Ayudante, 1 Asociado y 5 Becarios Colaboración externa: 1 Ayudante 1 Técnico Investigador principal: Ángel Mingo Castel Área de experiencia: Común a todo el personal: Transformación genética nuclear y plastidial Biotecnología vegetal Formación: 2 Biólogos 7 Ingenieros Agrónomos Inmunología Agronomía Biólogo Ingeniero Agrónomo PRINCIPALES LÍNEAS DE INVESTIGACIÓN DEL GRUPO – Producción de proteínas de interés farmacéutico mediante transformación plastidial en tabaco. – Producción de vacunas en plantas mediante transformación cloroplástica en tabaco. – Transformación plastidial de maíz. PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN FINANCIADOS Y COSTE Proyecto de investigación: – Producción de antígenos vacunales en plantas mediante transformación cloroplástica (2003-05). – Producción de cardiotrofina-1 en plantas de tabaco mediante transformación plastidial (2004-05). – Producción de albúmina humana, factor insulínico (IGF-I) e interferón (IFN alfa 2b) en plantas transplastómicas de tabaco (2005-2006). Organismo Coste CICYT 69.920 € Gobierno de Navarra 29.345 € Gobierno de Navarra 50.000 € OFERTA DE SERVICIOS A EMPRESAS Transformación plastidial de plantas en las que el “riesgo ambiental” es despreciable y los rendimientos obtenidos son “record”. BARRERAS Y LIMITACIONES EN LA INVESTIGACIÓN – Falta de “masa crítica mínima necesaria” en investigadores postdoctorales para competir a nivel internacional y que permita suplir áreas de conocimiento colaterales deficitarias, pero necesarias para entrar en la fase de “desarrollo del producto”, tales como la de ingeniería químico-farmacéutica. – Falta de financiación suficiente. – Dificultad en la transformación plastidial de especies distintas del tabaco. – Vacunación con plantas por vía oral: baja inducción de respuesta inmune con respecto a la vía parenteral. DIFICULTADES PARA EL DESARROLLO E IMPLANTACIÓN DE LA AGRICULTURA MOLECULAR – No existe legislación europea específica para la producción de biofármacos en plantas. Un aspecto clave es si se va a permitir el empleo de platas comestibles o sólo plantas que no entran en la cadena alimentaria. Este aspecto supedita la investigación desde su inicio. Esta legislación es demasiado restrictiva y no está justificada por datos científicos, lo que constituye una pesada e innecesaria carga para el progreso. – Bajos niveles de expresión de la proteína recombinante. – Alto coste de los sistemas de purificación. HITOS Y PLAZOS EN LA IMPLANTACIÓN DE LA AGRICULTURA MOLECULAR Si se eliminan las barreras legislativas actuales: – Primeras explotaciones comerciales: 3 años. – Primeros fármacos en el mercado: 5 años. 78 PLANTAS BIOFACTORÍA CASO PRÁCTICO 2 Nombre de la institución o empresa: Instituto de Agrobiotecnología y Recursos Naturales. Universidad Pública de Navarra. Dirección web: www.unavarra.es/invest/biotec.htm GRUPO DE INVESTIGACIÓN: Metabolismo. Personal: 1 Investigador Científico 2 “Ramón y Cajal” y 2 pre-docs Investigador principal: Javier Pozueta Romero* Área de experiencia: Ingeniería metabólica (biología molecular, bioquímica y metabolismo), en plantas y bacterias: metabolismo glucídico. Formación: Biólogos PRINCIPALES LÍNEAS DE INVESTIGACIÓN DEL GRUPO Metabolismo del almidón y glucógeno en plantas y bacterias, respectivamente. PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN FINANCIADOS Y COSTE Proyecto de investigación: Nudix hidrolasas: nuevas herramientas moleculares para el control de los niveles intracelulares de azúcares-nucleótidos y del metabolismo glucídico en plantas transgénicas. Organismo Comisión Interministerial de Ciencia y Tecnología (CICYT). Empresas privadas (farmacéuticas y agroalimentarias). Coste 140.000 euros (2005-2007) 40.000 euros/año PATENTES O SOLICITUDES DE PATENTES Número PCT/ES01/00021 PCT/ES02/00174 PCT/JP03/03189 PCT/ES03/00363 ES200400257 Título Plant ADPglucose pyrophosphatase, method for the production thereof, its use in the production of assay devices and for obtaining transgenic plants. Bacterial ADPglucose pyrophosphatase, method of production, use in the manufacture of testing devices and in the production of transgenic plants and bacteria. Production of UDPglucose pyrophosphatase. Azúcar-nucleótido pirofosfatasa/fosfodiesterasa vegetal, procedimiento de obtención, uso en la fabricación de dispositivos de ensayo y en la obtención de plantas transgénicas. Procedimiento de producción de sacarosa sintasa recombinante a partir de Escherichia coli y su uso en la fabricación de kits de determinación de sacarosa, producción de azúcares-nucleótidos y obtención de plantas transgénicas con alto contenido en almidón y alto balance amilosa/amilopectina. Año 2000 2001 2001 2004 OFERTA DE SERVICIOS A EMPRESAS Nuestro equipo no presta servicios a empresas. Sin embargo, hemos firmado 2 contratos de colaboración con sendas empresas cuyo objeto es identificar y expresar genes que codifican para enzimas reguladoras del metabolismo glucídico en plantas y en mamíferos. LÍNEAS FUTURAS DE INTERÉS – Aunque no se trata de una línea de investigación, creemos que la metabolómica es una herramienta futura cuya utilización englobará a un prometedor y amplio conjunto de líneas de investigación. – La creación de nanobiosensores y dispositivos dependientes de reacciones enzimáticas para la medida de metabolitos resulta atractiva y muy vinculada al tipo de investigación llevada a cabo en nuestro laboratorio. En colaboración con un equipo de ingenieros de la Universidad Pública de Navarra, acabamos de solicitar un proyecto de investigación correspondiente a la Acción Estratégica de Nanociencia y Nanotecnología en el marco del Plan Nacional de Investigación Científica, Desarrollo e Innovación Tecnológica (2004-2007). – Obtención de plantas transgénicas productoras de almidones con cantidades y calidades alteradas. Nos gustaría desarrollar en múltiples especies la tecnología ya disponible en nuestro laboratorio. Garantizando la productividad actual, tal tecnología permitiría reducir la superficie de cultivo del planeta a una superficie equivalente a la península Ibérica. BARRERAS Y LIMITACIONES EN LA INVESTIGACIÓN – Ausencia de planes estratégicos sólidos y definidos en centros tecnológicos que orienten sus investigaciones hacia problemas concretos. Esto dificulta la creación de grupos y líneas de investigación cohesionados, con capacidad de generar alianzas y actividades complementarias, debidamente apoyados por personal técnico y con especializaciones definidas. – Dificultad en transmisión del conocimiento a la sociedad. Los centros tecnológicos no están debidamente dotados de personal adecuado para esta actividad. Ello limita en gran medida la interacción entre los centros tecnológicos. – Ausencia de estímulos para la figura del “investigador emprendedor”. La mayor parte de los investigadores españoles llevan a cabo su investigación dentro del ámbito de lo público. La legislación actual impide en gran medida que el investigador “público” pueda desarrollar sus ideas e invenciones en el ámbito privado. Por tanto, investigadores pertenecientes a los Centros Tecnológicos Públicos (acaparadores de una gran cantidad del conocimiento) se ven impedidos para generar más investigación fuera del ámbito público. Finalmente la investigación llevada a cabo en España está delimitada por la inversión del estado. DIFICULTADES PARA EL DESARROLLO E IMPLANTACIÓN DE LA AGRICULTURA MOLECULAR Rechazo social a “lo molecular”, “lo manipulable” y “lo intangible”. Es preciso educar, informar y hacer ver la necesidad de la implantación de la agricultura molecular. Los programas de enseñanza y los medios de comunicación serán fundamentales. HITOS Y PLAZOS EN LA IMPLANTACIÓN DE LA AGRICULTURA MOLECULAR – Comunicación y educación: – Legislación: – Primeras explotaciones comerciales: 5 años. 10 años. 15 años. * Este grupo de investigación colabora con PLANT BIOPRODUCTS, S.L. 79 CASO PRÁCTICO 3 Nombre de la institución o empresa: Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA), Dpto. Biotecnología. Dirección web: www.inia.es GRUPO DE INVESTIGACIÓN: Grupo de Vacunas. Personal: 1 Investigador A2 3 Posdoctorales 1 Predoctoral 1 Técnico de laboratorio Investigador principal: José Ángel Martínez Escribano Área de experiencia: Virología Biofactorías Diagnóstico Vacunas Formación: Biólogos Veterinarios Otros PRINCIPALES LÍNEAS DE INVESTIGACIÓN DEL GRUPO Vacunas de nueva generación. Interacción virus-célula y Biofactorías. PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN FINANCIADOS Y COSTE Proyecto de investigación: – Producción de reactivos para el control y profilaxis del síndrome respiratorio y reproductivo del ganado porcino (PRRS) en un sistema libre de cultivos celulares. Años 2003-2004. – Desarrollos biotecnológicos para la utilización rentable de plantas como biofactorías. Años 2004-2008. – Desarrollo de vacunas recombinantes mejoradas. Años 2002-2004. – Caracterización de los mecanismos inmunológicos relevantes en protección frente al virus de la Peste porcina africana: desarrollo de nuevas estrategias vacunales. Años 2004-2007. – Development of African swine fever virus vaccines. Referencia: 75813. Años 2005-2009. Organismo Coste Proyecto PETRI 95-0624-OP. 115.000 € Proyecto del plan estratégico del INIA CPE03-022-C5. 160.000 € Proyecto Sectorial de Recursos y Tecnologías Agrarias RTA01-057 125.000 € Proyecto CICYT. AGL 2004 07857-C03-02/GAN. 130.000 € Wellcome Trust Foundation. 309.000 € PATENTES O SOLICITUDES DE PATENTES Número 200302845 200302958 200302634 Título Sistema para producir péptidos y proteínas multiméricos y sus aplicaciones. Proteína de fusión con direccionamiento de antígenos vacunales a células presentadoras de antígeno y sus aplicaciones. Dispositivo para cría de larvas. Año 2003 2003 2003 TENDENCIAS EN LA INVESTIGACIÓN EN AGRICULTURA MOLECULAR – Producción de vacunas. – Producción de moléculas terapéuticas. – Producción de enzimas industriales. OFERTA DE SERVICIOS A EMPRESAS – – – – Moléculas de fusión que mejoran eficacia inmunológica. Estrategias para acumular establemente proteínas expresadas en plantas. Transformación nuclear y cloroplástica. Vector derivado del virus del mosaico del tabaco como sistema de expresión transitoria en plantas. LÍNEAS FUTURAS DE INTERÉS – Desarrollo de tecnología de transformación cloroplástica propia para producción de vacunas y enzimas industriales. BARRERAS Y LIMITACIONES EN LA INVESTIGACIÓN – Personal. – Instalaciones adecuadas fundamentalmente para el escalado semiproductivo. – Falta de interés por parte de empresas farmacéuticas e industriales de diverso tipo para la financiación de proyectos de desarrollo con esta tecnología. DIFICULTADES PARA EL DESARROLLO E IMPLANTACIÓN DE LA AGRICULTURA MOLECULAR – Percepción social negativa con repercusión en la legislación. – Inmovilismo dentro del sector agrícola para cambiar procesos productivos. HITOS Y PLAZOS EN LA IMPLANTACIÓN DE LA AGRICULTURA MOLECULAR – Legislación: – Primeras explotaciones comerciales: – Primeros fármacos o productos industriales en el mercado: 80 5 años 7 años 10 años PLANTAS BIOFACTORÍA CASO PRÁCTICO 4 Nombre de la institución o empresa: AGRENVEC S.L. Dirección web: www.agrenvec.es Investigador principal: Alicia Romero Lorca Personal: 2 Doctores 2 Ingenieros 2 Técnicos Laboratorio Área de experiencia: Biotecnología vegetal Virología vegetal Agronomía Formación: Biólogos Ingenieros Agrónomos PRINCIPALES LÍNEAS DE INVESTIGACIÓN DEL GRUPO Expresión de proteínas recombinantes en plantas mediante vectores virales. PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN FINANCIADOS Y COSTE Proyecto de investigación: – Generación de un nuevo vector viral basado en MVCV. – Utilización de plantas como biofactorías para la producción de enzimas industriales. Organismo IMADE MIN-PROFIT Coste 26.188 € 53.156 € PATENTES O SOLICITUDES DE PATENTES Número ES2125842 Título Clones y vectores infectivos de plantas derivados del Virus del Mosaico del Nabo (TuMV) (explotación de la licencia INIA). Año 1997 TENDENCIAS EN LA INVESTIGACIÓN EN AGRICULTURA MOLECULAR – Incremento en el rendimiento: aumento del nivel de expresión y de la estabilidad de la proteína recombinante. – Generación de nuevos vectores virales. – Duplicación de las características de bioseguridad de la tecnología. OFERTA DE SERVICIOS A EMPRESAS – Expresión de proteínas recombinantes en plantas, de manera muy rápida y económica, sin limitación en la cantidad de producto. – Realización de proyectos de I+D cooperativa bajo contrato. LÍNEAS FUTURAS DE INTERÉS – Expresión de proteínas terapéuticas y anticuerpos. – Biorremediación. BARRERAS Y LIMITACIONES EN LA INVESTIGACIÓN – Infracapitalización: falta de acceso a financiación. Capital riesgo poco desarrollado y business angels poco familiarizados con el sector y con la tecnología. Falta de adecuación de las convocatorias de ayudas públicas a las características y posibilidades de las empresas de base tecnológica. Demasiada orientación hacia empresas de estructura “tradicional”. Burocratización excesiva de los procedimientos administrativos en la gestión de ayudas. – El procedimiento administrativo en la obtención de permisos para trabajar con organismos recombinantes puede generar retrasos de años en los planes de I+D, imposibles de soportar por empresas de reciente creación, ya lastradas con los problemas añadidos en el punto anterior. De nada sirve financiar parcialmente proyectos de I+D si no se pueden ejecutar por la falta de permisos. – Falta de adaptación de las condiciones marcadas en los permisos a los ciclos de cultivo de las distintas especies vegetales. – Falta de coordinación entre los distintos programas e iniciativas nacionales y regionales. – Falta de instalaciones de apoyo (Parques científicos, clusters, etc). – Atomización del sector. DIFICULTADES PARA EL DESARROLLO E IMPLANTACIÓN DE LA AGRICULTURA MOLECULAR – Legislación restrictiva y procedimientos esclerotizados, tanto en la evaluación previa del riesgo como en los protocolos de control y seguimiento. Alto riesgo de deslocalización hacia países que apuestan decididamente por la biotecnología y con costes menores. – Falta de interés REAL de las Administraciones y del sector Agrario por reconvertir una parte de la agricultura convencional, dependiente de ayudas europeas, hacia una agricultura dirigida a la obtención de moléculas de alto valor añadido para los mercados farmacéutico, químico, industrial, etc. – Desconocimiento tecnológico por parte de los agentes que participarían en ese proceso de implantación: cooperativas, agricultores, Administraciones, Industria, etc. HITOS Y PLAZOS EN LA IMPLANTACIÓN DE LA AGRICULTURA MOLECULAR – Legislación: – Primeras explotaciones comerciales: – Primeros fármacos en el mercado: 3 años 1 año 5 años 81 CASO PRÁCTICO 5 Nombre de la institución o empresa: PLANT BIOPRODUCTS, S.L. Dirección web: www.plantbioproducts.com Investigador principal: Ignacio Moreno Echanove Personal: 1 investigador Área de experiencia: Transformación genética Biotecnología vegetal Virología Formación: Biólogos Ingenieros Agrónomos PRINCIPALES LÍNEAS DE INVESTIGACIÓN DEL GRUPO Desarrollo de sistemas de expresión mediante transformación genética de cloroplastos. Extracción y ensayo de enzimas y antígenos vacunales expresados en cloroplastos de tabaco. PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN FINANCIADOS Y COSTE Proyecto de investigación – Expresión de enzimas en cloroplastos de tabaco. Organismo Genoma España Coste 110.000 € TENDENCIAS EN LA INVESTIGACIÓN EN AGRICULTURA MOLECULAR – Utilización de extractos de producción agraria en bruto con fines industriales. – Utilización de extractos de producción agraria en bruto para sanidad animal. OFERTA DE SERVICIOS A EMPRESAS – Extractos de plantas enriquecidos en actividades enzimáticas de interés industrial. – Servicio de expresión genética en cloroplastos utilizando nuestros vectores de transformación. LÍNEAS FUTURAS DE INTERÉS – Obtención de otras enzimas de interés industrial. – Producción de vacunas y otros productos para sanidad humana. BARRERAS Y LIMITACIONES EN LA INVESTIGACIÓN – Falta de financiación, especialmente para la contratación de personal cualificado para I+D y suficientemente motivado económicamente. – Costes y tiempo necesario para registrar productos, autorizaciones para cultivo y comercialización de productos derivados de OMGs. DIFICULTADES PARA EL DESARROLLO E IMPLANTACIÓN DE LA AGRICULTURA MOLECULAR – Desarrollo de sistemas industriales de producción vegetal en condiciones de confinamiento (ingeniería): necesidades financieras para la construcción de plantas piloto para cultivo continuo en condiciones de confinamiento. – Novedad de la Legislación e inseguridad en la forma de aplicación de ésta. HITOS Y PLAZOS EN LA IMPLANTACIÓN DE LA AGRICULTURA MOLECULAR – Desarrollo de producción industrial (escala piloto): 2-3 años – Desarrollo de producción industrial (escala comercial): 3-5 años 82 PLANTAS BIOFACTORÍA CASO PRÁCTICO 6 Nombre de la institución o empresa: Instituto Vasco de Investigación y Desarrollo Agrario-Neiker. Dirección web: www.neiker.net Área: Transformación Genética del Dpto. Biotecnología. Personal: 1 Jefe de Departamento 3 Investigadores Doctores 4 Becarios pre-doctorales Investigador principal: Enrique Ritter Azpitarte Área de experiencia: Biotecnología vegetal Transformación genética Biología Molecular Genómica Funcional Microbiología Formación: Biólogos Bioquímicos Ingenieros agrónomos PRINCIPALES LÍNEAS DE INVESTIGACIÓN DEL GRUPO – – – – Producción de proteínas con actividad farmacológica en sistemas vegetales y bacterianos. Producción de enzimas industriales de interés agronómico en sistemas heterólogos. Aislamiento de nuevos genes de resistencia frente a estrés biótico y abiótico. Estudio de las MLPs de diferentes plantas lactíferas y desarrollo de un sistema de producción de proteínas heterólogas basado en estos genes. – Desarrollo de herramientas genómicas y post-genómicas en hongos patógenos, análisis del transcriptoma mediante microarrays, biofilms fúngicos, proteomics en hongos patógenos, dimorfismo en hongos patógenos, expresión heteróloga en levaduras de interés industrial, mecanismos de resistencia al cobre en Yarrowia lipolytica. PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN FINANCIADOS Y COSTE Proyecto de investigación – Identificación y Producción de proteínas de interés farmacéutico o agroalimentario, utilizando técnicas recombinantes. 2005-2007. – Desarrollo de prototipos de “biofactorias” para “molecular farming” basado en plantas lactíferas y análisis de su potencial como nuevas fuentes de péptidos antimicrobianos. 2005-2007. – Nuevas tecnologías para la elaboración de medicamentos de última generación y compuestos biotecnológicos. CIC-BIOGUNE 2003-2004. – Producción de enzimas para aplicaciones en el sector agroalimentario mediante técnicas recombinantes. CIC-BIOGUNE 2003-2004. – Resistant wild potatoes as source for novel genes mediating resistance against fungal, viral and nematode diseases. INCO-Project PL ICA4-1999-30052. 2000-2003. – Novel approaches for the control of fungal disease. QLK2-2000-2003. – Molecular analysis of biofilm formation in the human pathogenic fungi Candida albicans and Candida glabrata. IP-DCPTR50. 2001-2004. – Negative regulation of hyphal development in Candida albicans. 1999-2001. – New targets for antifungal therapy- molecular biology of dimorphism in the human pathogen Candida albicans. BIOMED N. BMH4-CT96-0310. 1996-1999. Organismo Departamento Industria del Gobierno Vasco. Coste 427.182 € Departamento Industria del Gobierno Vasco. 509.450 € Comisión Europea 150.000 € Comisión Europea 40.000 € Instituto Pasteur (París) 219.195 € Wellcome Trust 1.000.000 € Unión Europea 100.000 € Unión Europea Departamento de Agricultura y Pesca del Gobierno Vasco. — — PATENTES O SOLICITUDES DE PATENTES Número ES 2094 088 P9701346 P9900731 WO 00/61767 SD-07 Título Identificación, clonación y utilización de una región de DNA amplificada en cepas de Penicillium chrysogenum superproductoras de penicilina. Un procedimiento para incrementar la producción de penicilina en Penicillium chrysogenum mediante la inactivación del gen Lys2”. Una proteasa extracelular de Acremonium chrysogenum con actividad CPC-acetilhidrolasa y su utilización para la síntesis de derivados desacetilados de cefalosporina C e inactivación del gen para aumentar la producción de cefalosporina. Extracellular protease from Acremonium chrysogenum with CPC-acetyl hydrolase activity and its utilization in the synthesis of deacetylated derivatives of cephalosporin C and inactivation of the gene for increasing production of cephalosporin. Génes impliqués dans la formation de biofilms par la levure pathogène Candida albicans. Año 1994 1997 1999 2000 2003 TENDENCIAS EN LA INVESTIGACIÓN EN AGRICULTURA MOLECULAR – Desarrollo de sistemas de transformación de plantas para la producción de proteínas y sustancias de interés farmacológico o agroalimentario. – Cribado de genotecas de origen vegetal mediante Phage display para la obtención de péptidos antimicrobianos: Nuevas aproximaciones para el control de las enfermedades fúngicas humanas. OFERTA DE SERVICIOS A EMPRESAS Detección de transgenes en alimentos comercializados. (Continúa en página siguiente) 83 CASO PRÁCTICO 6 (continuación) LÍNEAS FUTURAS DE INTERÉS – Utilización de plantas como “biofactorías” para la producción de diferentes sustancias de interés, principalmente proteínas y péptidos de interés alimenticio y/o farmacológico. – Establecimiento de cultivos in vitro de plantas lactíferas y sistemas de transformación específicos. – Exploración y explotación de genomas vegetales mediante aproximaciones “genome-wide” para búsqueda de proteínas antibióticas y nuevos productos de interés farmacológico. BARRERAS Y LIMITACIONES EN LA INVESTIGACIÓN – Falta de financiación. – Voluntad política negativa ante el cultivo de plantas transgénicas en el campo. – Limitación de ensayos en sistemas confinados. – Falta de tradición en el empleo de la biología molecular como herramienta para investigaciones agronómicas. DIFICULTADES PARA EL DESARROLLO E IMPLANTACIÓN DE LA AGRICULTURA MOLECULAR – Ausencia de legislación que regule el cultivo de transgénicos. Aparición y desaparición de moratorias no válidas ante la ausencia de legislación. – Percepción negativa de la manipulación molecular entre los propios agentes encargados de su implantación. – Falta de información o información sesgada hacia la opinión pública. – Percepción negativa por parte de los agricultores ante el cultivo de transgénicos. – Percepción negativa por parte de los consumidores ante los alimentos transgénicos. HITOS Y PLAZOS EN LA IMPLANTACIÓN DE LA AGRICULTURA MOLECULAR – Decreto Ley que regule la convivencia entre alimentos transgénicos y no transgénicos: – Legislación que regule el cultivo de plantas transgénicas: – Primeras explotaciones comerciales de plantas transgénicas productoras de proteínas de interés para uso humano: – Primeros productos purificados para uso humano en el mercado: 84 1 año 3 años 10 años 15 años PLANTAS BIOFACTORÍA CASO PRÁCTICO 7 Nombre de la institución o empresa: Centro Nacional de Biotecnología (CNB) – CSIC, Dpto. Genética Molecular de Plantas. Dirección web: www.cnb.uam.es Investigador principal: Juan Antonio García Álvarez Personal: 1 Profesor de Investigación CSIC 1 Contratada Ramón y Cajal 3 Investigadores post-doctorales 4 becarios pre-doctorales 1 Ayudante titulada CSIC Área de experiencia: Biotecnología vegetal Virología Formación: Biólogos Bioquímicos Ingenieros Agrónomos PRINCIPALES LÍNEAS DE INVESTIGACIÓN DEL GRUPO – – – – Silenciamiento de RNA y otros mecanismos de defensa de las plantas frente a virus. Mecanismo de infección de virus de plantas. Determinantes de patogenicidad virales. Vectores de expresión en plantas basados en virus. PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN FINANCIADOS Y COSTE Proyecto de investigación – El virus de la sharka como agente patógeno y como vector de expresión: factores implicados en su interacción con las plantas. – Virus-induced gene silencing: unravelling the basis of a mechanism and its exploitation for the analysis of a multitude of individual gene functions in plants. – Targeting immunostimulating-structure production in plants. – Development of intervention strategies against SARS in a European-Chinese taskforce. Organismo Coste Plan Nacional de I+D+I 260.100 € Unión Europea 285.305 € Unión Europea 243.549 € Unión Europea 260.052 € PATENTES O SOLICITUDES DE PATENTES Número P9800623 P9900698 PCT/EP 01/10026 Título Sistema de presentación de antígenos basado en el virus de la sharka. DNA recombinante derivado del virus de la sharka y vector de expresión de proteínas heterólogas basado en dicho DNA recombinante. Producción del antígeno VP60, o de un fragmento del mismo, del virus de la enfermedad hemorrágica de los conejos en plantas y vacuna contra la enfermedad hemorrágica vírica de los conejos que comprende dicho antígeno. Año 1998 1999 2001 TENDENCIAS EN LA INVESTIGACIÓN EN AGRICULTURA MOLECULAR – Mejoras agronómicas de las plantas. – Mejora de la calidad de los productos de las plantas. – Las plantas como biofactorías de nuevos productos. OFERTA DE SERVICIOS A EMPRESAS – Desarrollo de vectores de expresión en plantas. – Desarrollo de estrategias para interferir con enfermedades virales de plantas. BARRERAS Y LIMITACIONES EN LA INVESTIGACIÓN – Falta de estabilidad en las fuentes de financiación. – Falta de plazas estables para el personal científico. DIFICULTADES PARA EL DESARROLLO E IMPLANTACIÓN DE LA AGRICULTURA MOLECULAR Aceptación social. 85 CASO PRÁCTICO 8 Nombre de la institución o empresa: Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA), Dpto. Biotecnología. Dirección web: www.inia.es Grupo: Biotecnología de Virus Vegetales. Personal: 2 investigadores, 1 técnico grado medio 2 investigadores postdoctorales 1 becario predoctoral (sólo 1,5 personas dedicadas a Agricultura Molecular) Investigador principal: Fernando Ponz Ascaso Área de experiencia: Biotecnología de virus vegetales Formación: 2 químicos 3 biólogos 1 ing. técnico agrícola PRINCIPALES LÍNEAS DE INVESTIGACIÓN DEL GRUPO Plantas como biofactorías empleando vectores virales. PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN FINANCIADOS Y COSTE Proyecto de investigación Desarrollos biotecnológicos para la utilización rentable de plantas como biofactorías (CPE03-022-C5-5). Organismo Coste INIA 74.100 € PATENTES O SOLICITUDES DE PATENTES Número 9701522 Título Clones y vectores infectivos de plantas derivados del virus del mosaico del nabo. Año — TENDENCIAS EN LA INVESTIGACIÓN EN AGRICULTURA MOLECULAR – Mejoras de la capacidad de expresión de proteínas foráneas en plantas empleando los vectores derivados del virus del mosaico del nabo. – Expresión de proteínas de distintos orígenes con utilidades diversas. OFERTA DE SERVICIOS A EMPRESAS Los vectores están licenciados por el INIA a la empresa AGRENVEC. BARRERAS Y LIMITACIONES EN LA INVESTIGACIÓN La principal barrera que nosotros experimentamos en esta área es la falta de financiación específica. Al tratarse de proyectos fundamentalmente de desarrollo tecnológico, al no haber fuentes específicas de financiación para ellos, profundizar en ellos con las fuentes normales de financiación del Plan Nacional nos obligaría a renunciar (problema de los EJCs) a trabajar en los proyectos de investigación de naturaleza más básica, cosa que no deseamos hacer. La sensación en el grupo es que, pese a que éste es un caso claro de un desarrollo tecnológico derivado de un esfuerzo de investigación básica, no está previsto en un grupo de un OPI público como el nuestro que se pueda continuar en la profundización de la D, si no es renunciando a hacer más I, lo cual encontramos bastante paradójico, puesto que no podríamos haber hecho esta D concreta si no hubiéramos estado muy implicados en la I. DIFICULTADES PARA EL DESARROLLO E IMPLANTACIÓN DE LA AGRICULTURA MOLECULAR En el ámbito de los grupos de investigación, lo expresado en el cuadro anterior. En el campo de las aplicaciones prácticas, el principal obstáculo es la deficiente estructura empresarial del sector de la producción agraria (fragmentación y pequeño tamaño de las empresas, falta de capitalización, ausencia de mentalidad innovadora, etc.). La producción agraria española está diseñada de una manera no sostenible, muy subvencionada y sin un buen entorno de implementación de nuevas ideas tecnológicas. En resumen, el ambiente productor es muy adecuado para la agricultura molecular. HITOS Y PLAZOS EN LA IMPLANTACIÓN DE LA AGRICULTURA MOLECULAR Sin un cambio casi drástico de escenario empresarial agrario, lo más probable es que la implantación no se produzca. Si se produjese (muy improbable) un cambio efectivo de actitud por parte de los poderes públicos de tal forma que se pudiera crear un entorno favorable a la inversión en agricultura molecular, quizá se podrían apreciar mejoras en unos 3-5 años. La legislación y otras cuestiones relacionadas pueden mejorar, pero no son en estos momentos el principal obstáculo. La estructura empresarial de la producción agraria española es poco compatible con el desarrollo biotecnológico propio. Cultivar plantas transgénicas de compañías multinacionales no exige demasiado cambio en las estructuras productivas, pero implementar desarrollos propios es otra historia. 86 PLANTAS BIOFACTORÍA CASO PRÁCTICO 9 Nombre de la institución o empresa: Instituto de Biología Molecular de Barcelona (IBMB)-CSIC, Dpto. de Genética Molecular. Dirección web: www.ibmb.csic.es Grupo: Transporte subcelular de proteínas vegetales. Personal: 2 investigadores 4 becarios pre-post Investigador principal: Dolores Ludevid Múgica Área de experiencia: Transformación genética Biotecnología vegetal Biología celular vegetal Expresión proteínas heterólogas en plantas Formación: Bioquímicos Biólogos Ingenieros agrónomos PRINCIPALES LÍNEAS DE INVESTIGACIÓN DEL GRUPO Señales de transporte subcelular de proteínas vegetales. Expresión de proteínas terapéuticas en plantas. Biología celular vegetal. Proteómica. PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN FINANCIADOS Y COSTE Proyecto de investigación Molecular Farming: Producción de proteínas de interés terapéutico en plantas (BIO-2004-03202). Producción de proteínas de interés terapéutico en plantas de arroz y tabaco. Organismo Coste CYCIT(2004-7) 158.000 € Empresa ERA PLANTECH S.L (2004-6) 71.000 € PATENTES O SOLICITUDES DE PATENTES Número WO2004 003207 US2004 005660 WO97 28247 Título Production of peptides and proteins by accumulation in plant endoplasmic reticulum-derived protein bodies. — Año 2002 — TENDENCIAS EN LA INVESTIGACIÓN EN AGRICULTURA MOLECULAR Las tendencias generales se focalizan fundamentalmente en los siguientes objetivos: 1) Resistencia a patógenos 2) Mejora productiva/nutritiva de plantas comestibles (food/feed) 3) Resistencia a sequedad y suelos salinos 4) Producción de proteínas terapéuticas. Nuestro grupo trabaja en esta última. Herramientas que se utilizan: – Genómica: secuenciación de genomas vegetales de interés agroalimentario. Nodulación. – Genómica funcional: genes implicados en resistencia a patógenos, sequedad, salinidad, fotosíntesis. – Proteómica. – Metabolómica: regulación de rutas metabólicas y metabolitos secundarios. – Genética/Desarrollo vegetal/floración. OFERTA DE SERVICIOS A EMPRESAS – – – – – – – – Secuencias reguladoras: Promotores (FTO). Nuevas tecnologías de transformación vegetal. (FTO). Diversidad vegetal: identificación y cultivo de nuevas especies vegetales con rasgos de interés comercial. Tecnologías de producción de proteínas terapéuticas de alto valor añadido a costes bajos/ vacunas comestibles/productos industriales/nutritivos. Marcadores genéticos para cultivares de interés agroalimentario. Mejora genética. Interés en la maduración de frutos. Know-how relativos al down-processing de biomasa vegetal: sistemas de homogenización, tratamiento de sólidos, bioquímica (purificación de extractos proteicos, lípidos, azúcares y metabolitos secundarios). Interés en algas (biomasa). Por ejemplo: empresas de cosmética, alimentación animal. LÍNEAS FUTURAS DE INTERÉS – – – – – Plantas GM de cultivos extensivos para la producción de productos industriales (biopolímeros, enzimas industriales,…). Plantas GM para la producción de proteínas terapéuticas (vacunas, anticuerpos, citoquinas, hormonas). Plantas GM productoras de complementos alimentarios para alimentación humana y animal. Agricultura sostenible. Aprovechamiento de biomasa-energía. Plantas GM para cultivo extensivo de plantas resistentes a desecación. BARRERAS Y LIMITACIONES EN LA INVESTIGACIÓN – Escasa dotación presupuestaria por parte de la administración en proyectos de investigación de agricultura molecular. Este aspecto es especialmente grave en un país con una climatología idónea para cultivos sostenibles. – Falta de flexibilidad y dinero para la contratación de personal cualificado. – Falta de contacto con la realidad: interacción agricultor/empresa-investigador. – Crear puestos de trabajo especializados y multidisciplinares (abogado/científico) que detecten y gestionen posibles transferencias de tecnología (para la propia institución pública o para empresas interesadas). (Continúa en página siguiente) 87 CASO PRÁCTICO 9 (continuación) DIFICULTADES PARA EL DESARROLLO E IMPLANTACIÓN DE LA AGRICULTURA MOLECULAR – Legislación compleja y poco clara. – Falta de mecanismos de control sanitario y medioambiental. Mecanismos de control científicamente rigurosos y reconocidos socialmente. Acompañados además por un seguimiento en campo/ invernadero, durante el procesamiento del vegetal y del producto final (controles moleculares específicos, analítica concreta….). – Falta de información al consumidor. – Desarrollo de Sistemas seguros de confinamiento. HITOS Y PLAZOS EN LA IMPLANTACIÓN DE LA AGRICULTURA MOLECULAR – Legislación: 3 años – Primeras explotaciones comerciales: 5 años – Primeros fármacos en el mercado: 10 años 88 PLANTAS BIOFACTORÍA CASO PRÁCTICO 10 Nombre de la institución o empresa: FORT DODGE VETERINARIA, S.A. Investigador principal: Juan Plana Durán (Departamento de I+D) Personal: 15 investigadores Área de experiencia: Transformación genética Biotecnología vegetal Virología Formación: Biólogos Ingenieros agrónomos Veterinarios Bioquímicos PRINCIPALES LÍNEAS DE INVESTIGACIÓN DEL GRUPO Vacunas: – Convencionales. – DNA Recombinantes. PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN FINANCIADOS Y COSTE Proyecto de investigación: Biosafe coronavirus vaccine vector for the prevention of human infections of the enteric and respiratory tract. Referencia: QLRT-2000-00874. 1999-2002. 2000-2003. Biosafe coronavirus vector-based vaccine for prevention of foot-and-mouth disease. Referencia: QLRT-2001-00825. 2001-2004. Trageting immunocomplex production in plants. Referencia:QLRT-2001-01050. 2001-2004. Epidemiology and control of classical swine fever (CSF) in wild boar and potential use of a newly developed live marker vaccine. Referencia: SSPE-CT-2003-501599. 2004-2008. Development of intervention strategies against SARS in a European-Chinese taskforce. Referencia: FP6-2003-SSP-SARS. 2004-2007. Organismo Coste European Commission Framework Program — European Commission Framework Program European Commission Framework Program — European Commission Framework Program — European Commission Framework Program — — PATENTES O SOLICITUDES DE PATENTES Número P 9301973 P 9401493 Título Vaccine for preventing the porcine reproductive and respiratory syndrome. Recombinant rabbit haemorrhagic disease virus (RHDV) capsids and proteins, diagnostic kits and vaccines containing said recombinant products. P 9502370 Recombinant adenoviruses which express antigens of the porcine transmissible gastroenteritis PCT/ES96/00185 virus (TGEV) and their use in the formulation of vaccines. 9600620 Vectors based on recombinant defective viral genomes and their use in the formulation of vaccines. P9902673 Clones y vectores infectivos derivados de coronavirus y sus aplicaciones. P200002161 Producción del antígeno VP60, o de un fragmento del mismo, del virus de la enfermedad hemorrágica de los conejos en plantas y vacuna contra la enfermedad hemorrágica vírica de los conejos que comprende dicho antígeno. Año 1994 1995 1995 1996 1999 2000 TENDENCIAS EN LA INVESTIGACIÓN EN AGRICULTURA MOLECULAR Expresión de proteínas y anticuerpos en plantas. LÍNEAS FUTURAS DE INTERÉS Desarrollo de “edible vaccines” (vacunas comestibles). BARRERAS Y LIMITACIONES EN LA INVESTIGACIÓN Ninguna dificultad en nuestra empresa. DIFICULTADES PARA EL DESARROLLO E IMPLANTACIÓN DE LA AGRICULTURA MOLECULAR Dificultad para registro. HITOS Y PLAZOS EN LA IMPLANTACIÓN DE LA AGRICULTURA MOLECULAR – Primeras explotaciones comerciales: 5 años 89 CASO PRÁCTICO 11 Nombre de la institución o empresa: Centro Nacional de Biotecnología (CNB). CSIC, Dpto. Biología Molecular y Celular. Dirección web: www.cnb.uam.es Investigador principal: Luis Enjuanes Sánchez Personal: 1 profesores titulares 6 investigadores 5 becarios pre-post Área de experiencia: Virología Formación: Biólogos PRINCIPALES LÍNEAS DE INVESTIGACIÓN DEL GRUPO Biología de coronavirus, incluyendo mecanismos de replicación, transcripción, encapsidación, desarrollo de vectores para vacunas. PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN FINANCIADOS Y COSTE Proyecto de investigación Diseño de vacunas para la protección del ganado porcino frente a infecciones entéricas y respiratorias. 1999-2000. Desarrollo de un vector vacunal para la especie porcina basado en genomas de coronavirus. Referencia: CAM 07B/0020/99. 2000. Generic coronavirus vaccine vectors for protection of farm animals against mucosal infections. Referencia: QLRT-1999-00002. 2000-2002. Immunotherapy of enteric infections by rotaviruses and coronaviruses using plantibodies. Referencia: QLRT-1999-30739. 2000-2002. Biosafe coronavirus vaccine vector for the prevention of human infections of the enteric and respiratory tracts. Referencia: QLRT-2000-00874. 2001-2004. Ingeniería de genomas de coronavirus para el diseño de vectores bioseguros. Referencia: BIO2001-1699. 2001-2004 Biosafe coronavirus vector-based vaccine for prevention of foot-and-mouth disease. Referencia: QLRT-2001-00825. 2002-2005. Targeting immunocomplex production in plants. Referencia: QLRT-2001-01050. 2002-2005. Development of intervention strategies against SARS in a European-Chinese taskforce. Referencia: FP6-2003-SSP-2.2-SARS. 2004-2007. Organismo Coste — — CAM 28.940 € UE 238.000 € UE 246.730 € UE 263.860 € CICYT 252.570 € UE 256.742 € UE 248.105 € UE 380.000 € PATENTES O SOLICITUDES DE PATENTES: Número Título PCT/EP 00/12063 Infectious clone. (P 55171) 200200158 Secuencia de ácido nucleico que comprende la señal de encapsidación del RNA de un coronavirus del grupo 1 y sus aplicaciones. Año 2000 2002 TENDENCIAS EN LA INVESTIGACIÓN EN AGRICULTURA MOLECULAR Diseño de vacunas para salud animal, caracterización del genoma de las especies de interés en alimentación, mejora y transferencia de embriones, proteómica, genómica. OFERTA DE SERVICIOS A EMPRESAS Diseño de vacunas recombinantes seguras. LÍNEAS FUTURAS DE INTERÉS Estudios básicos sobre la biología de coronavirus (incluyendo coronavirus porcinos y humanos). BARRERAS Y LIMITACIONES EN LA INVESTIGACIÓN – Falta de instalaciones de seguridad biológica. – Dificultad en las autorizaciones para el trabajo con patógenos. DIFICULTADES PARA EL DESARROLLO E IMPLANTACIÓN DE LA AGRICULTURA MOLECULAR Mejora del sistema de patentes europeo en comparación con el americano. HITOS Y PLAZOS EN LA IMPLANTACIÓN DE LA AGRICULTURA MOLECULAR – Legislación: – Primeras explotaciones comerciales: – Primeros fármacos en el mercado: 90 1 año 3 años 5 años PLANTAS BIOFACTORÍA CASO PRÁCTICO 12 Nombre de la institución o empresa: Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA), Dpto. Biotecnología. Dirección web: www.inia.es Investigador principal: Covadonga Alonso Martí Personal: 1 Contratado posdoctoral 1 becario predoctoral Área de experiencia: Virología molecular Biología Molecular Formación: Biólogos PRINCIPALES LÍNEAS DE INVESTIGACIÓN DEL GRUPO Identificación de dianas terapeúticas para estrategias de interferencia antiviral mediante: – Estudios proteómicos de las interacciones virus-hospedador. – Caracterización de los mecanismos de apoptosis. – Función de las proteínas motoras microtubulares en el transporte intracelular de los virus. PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN FINANCIADOS Y COSTE Proyecto de investigación Estudio de las interacciones patógeno- hospedador del virus de la Peste porcina africana mediante técnicas de proteómica y microscopía confocal IO2004-00690. Año 2005. Desarrollos biotecnológicos para la utilización rentable de plantas como biofactorías. Años 2004-2008. Estudio de la interacción virus-célula mediante análisis proteómico de la infección por el virus de la Peste porcina africana. AGL2002-00668. Development of African swine fever virus vaccines. Referencia: 75813. Años 2005-2009. Producción de reactivos para el control y profilaxis del síndrome respiratorio y reproductivo del ganado porcino (PRRS) en un sistema libre de cultivos celulares. Años 2003-2004. 95-0624-OP. Organismo Coste Proyecto CICYT Proyecto del plan estratégico del INIA CPE03-022-C5 46.000 € 160.000 € Proyecto CICYT 133.500 € Wellcome Trust Foundation 309.000 € Proyecto PETRI 115.000 € TENDENCIAS EN LA INVESTIGACIÓN EN AGRICULTURA MOLECULAR – Vacunas. – Biofactorías en la producción de moléculas de interés diagnóstico o terapéutico. OFERTA DE SERVICIOS A EMPRESAS Identificación de moléculas diana de interés diagnóstico o terapéutico mediante estudios proteómicos. LÍNEAS FUTURAS DE INTERÉS Desarrollo de moléculas antivirales. BARRERAS Y LIMITACIONES EN LA INVESTIGACIÓN – Falta de financiación. – Falta de personal. DIFICULTADES PARA EL DESARROLLO E IMPLANTACIÓN DE LA AGRICULTURA MOLECULAR – Legislación más permisiva. – Falta de implantación de la innovación en el sector agrícola. HITOS Y PLAZOS EN LA IMPLANTACIÓN DE LA AGRICULTURA MOLECULAR – Legislación: – Primeras explotaciones comerciales: – Primeros fármacos en el mercado: 5 años 5 años 10 años 91 9. Conclusiones La ingeniería genética ha permitido convertir en tecnológicas que permiten eliminar algunos biofactorías de productos como enzimas, riesgos ambientales, como la expresión transitoria antibióticos, vacunas, anticuerpos u hormonas, a de las proteínas recombinantes, su confinamiento distintos organismos entre los que se incluyen en orgánulos como cloroplastos, que no se bacterias o levaduras, o a cultivos celulares de transmiten por polen o la utilización de animales como insectos o mamíferos. promotores que sólo se activan ante determinados Desde hace años se investiga la posibilidad de utilizar plantas completas para la producción de estímulos físicos o químicos, limitando su producción a momentos determinados. estos compuestos de interés, debido a que De estos desarrollos tecnológicos, la expresión de presentan múltiples ventajas económicas, técnicas proteínas foráneas en cloroplastos de tabaco aparece y de seguridad, que hacen que puedan como uno de los más ventajosos. Los cloroplastos son considerarse como una alternativa a otros orgánulos que no se transmiten a través del polen, ya sistemas de producción más costosos o con que su herencia es materna, de modo que el riesgo de riesgos de contaminación por agentes patógenos: contaminación de otros cultivos es muy pequeño. La • Ventajas técnicas. Las plantas son sistemas sencillos de transformar genéticamente, y existen protocolos de transformación y regeneración para múltiples especies. Se conocen secuencias específicas que permiten la acumulación de proteínas en tejidos y órganos transformación de cloroplastos permite niveles de expresión elevados, ya que cada célula vegetal contiene gran cantidad de estos orgánulos. Además, la proteína recombinante se encuentra protegida de la degradación y su acumulación dentro del cloroplasto no afecta al desarrollo normal de la planta. fáciles de recolectar, almacenar y procesar, o en El tabaco se utiliza como modelo de experimentación orgánulos donde las proteínas se encuentran debido a que es fácilmente transformable y existe protegidas de la degradación, lo cual aumenta una tecnología muy avanzada para la transferencia y su rendimiento de producción. expresión de genes. Por otra parte se trata de una • Ventajas económicas. El cultivo de plantas es económico y sencillo, ya que existen planta no comestible, claramente diferenciada de las que lo son, por lo que el riesgo de contaminación de infraestructuras y maquinaria específica para su la cadena alimentaria es muy bajo. Además, produce cultivo, recolección y procesado. un elevado rendimiento de biomasa y se dispone de infraestructuras para su cultivo y procesado a gran • Ventajas referentes a la seguridad del producto. escala. Se trata de organismos eucariotas, más cercanos a los seres humanos que bacterias y Por otra parte, la transformación de otros tipos de levaduras, que no presentan patógenos que plastos de frutas despierta un gran interés para la puedan afectar al hombre o los animales, como obtención de vacunas comestibles. es el caso de las toxinas bacterianas, virus, priones o secuencias oncogénicas. El número de empresas dedicadas al desarrollo de plataformas biotecnológicas de producción de Sin embargo, existen una serie de retos que pueden proteínas recombinantes en plantas se encuentra tener una incidencia en el desarrollo de plantas liderado por Estados Unidos y Canadá, donde se biofactoría. Estos retos derivan, por una parte, de sitúan aproximadamente el 60%. En Europa, aspectos relacionados con la seguridad, tanto aunque existen empresas que están realizando medioambiental como sanitaria (salud humana y investigaciones, y algunas ya tienen productos en animal). En segundo lugar existen una serie de retos fase de ensayo clínico, la situación es de retraso relacionados con el proceso productivo, referentes a frente a estos países. rendimiento de la producción y purificación de los productos de interés. El principal motivo de este retraso es la moratoria que hasta hace unos meses impedía la aprobación Se han desarrollado distintas tecnologías que de nuevos transgénicos en Europa, lo cual ha permiten aumentar la expresión de proteínas y condicionado profundamente el sector mejorar la purificación, situando el rendimiento biotecnológico en los países miembros. Esta del conjunto del proceso en niveles competitivos moratoria ha tenido una influencia notable en con los sistemas tradicionales de producción. retrasar el desarrollo de la agricultura molecular en Asimismo se han desarrollado estrategias Europa, dado que las plantas biofactoría se 92 PLANTAS BIOFACTORÍA encuentran en una fase más temprana de como lo son los biorreactores en los que se desarrollo que otros OGMs (Organismos cultivan microorganismos o células animales. Modificados Genéticamente). La incidencia de la moratoria se ha visto reflejada en tres ejes clave: la Por otra parte se encuentra la gran barrera que planificación de la política científica, la inversión supone la ausencia de una legislación específica privada y la masa crítica del sector. para uso no alimentario. Algunos investigadores consideran que la normativa actual que regula las Por una parte ha afectado a la planificación de la actividades en las que se produzcan o empleen política científica, tanto europea, a través de sus OMGs es demasiado restrictiva y no está Programas Marco, como a las políticas científicas justificada por datos científicos. Esta normativa de los estados miembros. Así, el apoyo a la condiciona extraordinariamente la investigación, lo investigación en plantas transgénicas ha quedado cual unido a la falta de financiación ha llevado a relegado a la investigación con fines básicos y los algunos grupos a abandonar sus líneas de proyectos con fines aplicados como el desarrollo investigación en este campo. de plantas biofactoría se han visto excluidos de las áreas prioritarias de I+D+i. No obstante, parece que en Europa se están produciendo ciertos cambios que podrían auspiciar En segundo lugar, la combinación de la moratoria un mejor futuro. La moratoria finalizó el 19 de con las barreras administrativas ha provocado que mayo del pasado año, con la autorización por la las industrias farmacéuticas y agroalimentarias no Comisión Europea de la importación y procesado apuesten por la utilización de estos sistemas para de maíz dulce modificado genéticamente de la la obtención de productos, con la consiguiente línea Bt11 de Syngenta, aunque todavía no se ha desinversión privada en la I+D de este sector. De concedido la autorización para su cultivo. hecho, algunas de las empresas europeas de mayor tamaño han decidido trasladarse a Estados Por otra parte, existe un proyecto europeo Unidos y Canadá, donde tienen más facilidades denominado Consorcio Pharma-Planta, fundado por para llevar a cabo sus investigaciones y desarrollar la Comisión Europea como parte del Sexto Programa sus productos. Marco en el área denominada “Plant Platforms for Immunotherapeutic Biomolecule Production”. Este Por último, y como resultado de este ambiente de proyecto cuenta con 12 millones de euros y en él incertidumbre y de la falta de financiación tanto participan 39 equipos de investigación de 11 países pública como privada en Europa, se ha producido europeos (ninguno español) y Sudáfrica. Su objetivo un abandono paulatino por parte de algunos es el desarrollo de estrategias eficientes y seguras grupos de las líneas de investigación relacionadas para la producción de proteínas terapéuticas en con la agricultura molecular, lo que ha conducido a plantas para la obtención de tratamientos para una pérdida de masa crítica, imprescindible para enfermedades humanas como SIDA, diabetes, rabia asegurar la competitividad del sector. o tuberculosis. Los investigadores españoles consultados acerca Por último, es imprescindible disponer de un de las plantas biofactoría coinciden al señalar que entorno legal y administrativo claramente definido la falta de financiación pública o procedente de y estable que permita la participación de los empresas farmacéuticas, junto con la dificultad distintos agentes del sector (empresas, grupos de para la autorización de usos confinados y investigación, inversores privados) desde el liberaciones voluntarias, son las principales perfecto conocimiento de las reglas del juego. Esto barreras y limitaciones con las que se encuentran permitirá la correcta valoración de las en la investigación. oportunidades de futuro y ayudará a definir y afianzar sus posicionamientos. Otro punto de coincidencia es el rechazo por parte de la opinión pública de este tipo de plantas. A efectos de aprobación y coexistencia será Cuando se habla de plantas modificadas necesario considerar cada plataforma de manera genéticamente se genera un cierto temor o independiente, entendiendo una plataforma como la rechazo en la opinión pública, debido a que la combinación de planta, tecnología y producto, ya que aplicación principal de las plantas es la obtención es esta combinación la que determina los riesgos de alimentos. El riesgo de que estos productos para la salud y el medio ambiente. Por otro lado, puedan contaminar la cadena alimentaria hace resulta altamente conveniente la definición de que productores de alimentos y consumidores se estrategias específicas de apoyo al desarrollo de opongan a su uso. Sin embargo, las plantas estas tecnologías por parte de las Administraciones biofactoría no están destinadas a la producción de Públicas, así como el establecimiento de programas alimentos, sino que se trata de biofactorías, tal y de información pública. 93 10. Anexos ANEXO I. Proyecto Pharma-Planta www.pharma-planta.org El Proyecto Pharma-Planta es un consorcio de 39 equipos de investigación académicos y de empresas, de 11 países europeos y Sudáfrica. El proyecto ha sido fundado por la Comisión Europea como parte del Sexto Programa Marco en el área denominada “Plant platforms for immunotherapeutic biomolecule production” y cuenta con 12 millones de Euros para la investigación del uso de plantas modificadas genéticamente para el desarrollo de tratamientos para enfermedades humanas como SIDA, diabetes, rabia y tuberculosis. Sus objetivos son el desarrollo de estrategias eficientes y seguras para la producción de proteínas terapéuticas en plantas, así como la definición de los procedimientos y métodos que permitan la producción de estas proteínas de acuerdo con la normativa, de modo que finalmente puedan obtenerse productos con una pureza y calidad suficiente para poder realizar ensayos clínicos. El proyecto se encuentra coordinado por el St Georges Hospital en Londres y por el Instituto Fraunhofer en Alemania y en él participan expertos en las áreas de biología molecular, biología de plantas, inmunología, tecnologías de expresión de proteínas recombinantes, biotecnología de plantas, vacunas, evaluación de riesgos y gestión de la propiedad industrial. A continuación se incluye una tabla con los participantes en este proyecto. 94 PLANTAS BIOFACTORÍA CENTROS DE INVESTIGACIÓN DEL CONSORCIO PHARMA-PLANTA País Alemania Austria Bélgica Francia Grecia Institución Página web Fraunhofer Institute of Molecular Biology and Applied Ecology www.ime.fraunhofer.de Institute of Molecular Biotechnology, RWTH - University of Aachen www.biotec.rwth-aachen.de University of Heidelberg www.uni-heidelberg.de University of Münster www.uni-muenster.de Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research (IPK) www.ipk-gatersleben.de University of Natural Resources and Applied Life Sciences www.boku.ac.at Flanders Interuniversity Institute for Biotechnology www.vib.be Université Catholique de Louvain www.ucl.ac.be Centre de Coopération Internationale en Recherche Agronomique pour le Développment (CIRAD) www.cirad.fr Université Blaise Pascal Clermont-Ferrand II www2.univ-bpclermont.fr Institut National de la Recherche Agronomique (INRA) www.inra.fr Agricultural University of Athens www.aua.gr National University of Ireland www.nui.ie Trinity College www.tcd.ie Universita Degli Studi di Verona www.univr.it Ente per le Nuove Tecnologie, l'Energia e l'Ambiente www.enea.it Consiglio Nazionale Delle Ricerche www.cnr.it John Innes Centre www.jic.bbsrc.ac.uk Centre for the Management of Intellectual Property in Health Research and Development (MIHR) www.mihr.org St George's Hospital Medical School www.sghms.ac.uk Oxford Brookes University www.brookes.ac.uk University of Warwick www.warwick.ac.uk University of Cambridge www.cam.ac.uk University of Glasgow www.gla.ac.uk University of Leeds www.leeds.ac.uk Université de Neuchâtel www.unine.ch Irlanda Italia Reino Unido Suiza 95 96 Reino Unido The Chancellor, Masters and Scholars of the University of Cambridge Jonh Innes Centre The Royal Veterinary and Agricultural University University of Leeds Mechanisms of transgene integration and expression in crop plant plastids: underpinning a technology for improving human health. Targeting immunocomplex production in plants. Plant center: molecular plant physiology research and training. Manipulation of transport of soluble proteins to vacuolar compartments. Reino Unido Dinamarca Reino Unido Reino Unido University of Leeds Biochemical and genetic approaches to study bio-molecular interactions in plants. Alemania País FraunhoferGesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung e.V. Coordinador Recombinant pharmaceuticals from plants for human health. Proyecto ANEXO II. Proyectos financiados por la Unión Europea Israel Weizmann Institute of Science — — Fort dodge veterinaria/ Laboratorios sobrino CSIC-CNB Holanda Wageningen University — — España España — Suecia Uppsala University — Suiza Reino Unido The Chancellor, Masters and Scholars of the University of Cambridge Universite de Neuchatel Italia — País National Research Council Of Italy — Colaboradores 2001-2003 2001-2004 2002-2005 2002-2005 2002-2005 2004-2009 Duración QLK3-CT-200052080 QLK3-CT-200060078 QLK2-CT-200201050 HPRN-CT-200200262 HPRN-CT-200200262 LSHB-CT-2003503565 Referencia Fondazione Telethon CSIC-CNB DANISCO A/S Immunotherapy of enteric infections by rotaviruses and coronaviruses using plantibodies. Upgrading of sugar beet pectins by enzymatic modification and molecular farming. Coordinador EUREXpress, a European Consortium for large-scale gene expression analysis by RNA in situ hybridization. Proyecto Dinamarca España Italia País Reino Unido Unilever Uk Central Resources Ltd Reino Unido University Of Stirling Holanda Italia University Of Rome “La Sapienza” Wageningen University Reino Unido University Of Leeds Holanda Dinamarca The Royal Veterinary and Agricultural University University Of Groningen Francia Alemania España Italia Institut National de la Recherche Agronomique Aachen University of Technology Fort Dodge Veterinaria SA International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology Reino Unido Alemania Max-Planck-Gesellschaft Zur Foerderung Der Wissenschaften E.V. John Innes Centre Reino Unido Medical Research Council España España Universidad Miguel Hernandez de Elche Universidad de Murcia Francia Reino Unido País Universite de Paris V 'Rene Descartes Univ. Of Newcastle Upon Tyne Colaboradores 2000-2003 2000-2003 2000-2003 Duración QLK3-CT-199900089 QLK2-CT-200000739 QLG2-CT-199900793 Referencia PLANTAS BIOFACTORÍA 97 98 Holanda Alemania Dienst Landbouwkundig Onderzoek Instituut voor Dierhouderij en Dierengezondheid Rhein.-Westf. Technische Hochschule Aachen Biopharmaceuticals produced in plants: proteins involved in the regulation of fertility in animals. Production of diagnostic and therapeutic antibodies in plants by molecular farming. Reino Unido Scottish Crop Research Institute (SCRI) Standardization of the Immunodiagnosis and Qualification of Plant Viruses by Development of Synthetic Antigens. Reino Unido País Scottish Crop Research Institute (SCRI) Coordinador Standardization of the Immunodiagnosis and Qualification of Plant Viruses by Development of Synthetic Antigens. Proyecto United Medical and Dental Schools of Guy's and St.Thomas's Hospital Centre National de la Recherche Scientifique (C.N.R.S) Reino Unido Francia Reino Unido Austria VITROPLANT Pflanzenbiotechnologie GmbH BBSRC John Innes Centre Austria University Of Agricultural Sciences-Vienna Francia Institut National de la Recherche Agronomique (INRA) Reino Unido Adgen Ltd. Holanda Italia Agritest Srl Dienst Landbouwkundig Onderzoek. Centrum voor Plantenveredelings Grecia Holanda Nederlandse Algemene Keuringsdienst voor Zaaizaad en Pootgoed van Landbouwgewassen Benaki Phytopathological Institute Alemania Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen (RWTH) Italia Portugal Universidade do Porto Univ. Degli Studi di Bari Holanda País Wageningen University Colaboradores 1997-2001 1998-2001 1998-2002 1998-2002 Duración FAIR973110 BIO4980255 SMT4982246 SMT4982246 Referencia Reino Unido Bélgica Alemania United Medical and Dental Schools of Guy's and St.Thomas's Hospital Vrije Universiteit Brussel Instituut Moleculaire Biologie Rhein.-Westf. Technische Hochschule Aachen Jonh Innes Centre Unilever UK Central Resources Ltd The development of a vaccine against mucosal infection with SIV/HIV in nonhuman and human primates. Engineering high quality crops by optimizing lysine, methionine and cystine content. Molecular farming of therapeutic antibodies in plants. Expression of animal virus antigens in plants using viral vectors. Processing technology for recovery of recombinant antibody produced in crop plants. Reino Unido Reino Unido País Coordinador Proyecto Holanda Dienst Landbouwkundig Onderzoek Austria Holanda España España Holanda Alemania University of Agricultural Sciences-Vienna Wageningen Universit Fort dodge veterinaria S.A. CSIC-CNB Institute for Animal Science and Health Research Technischen Hochschule Aachen — Israel Weizmann Institute of Science — Suiza Reino Unido Universität Bern University Of Bristol Alemania Holanda Cooperative Verkoop-en Produktievereniging van Aarappelmeel en Derivaten 'AVEBE' BA Max-Planck-Gesellschaft Zur Foerderung der Wissenschaften E.V Francia Biocem SA. Laboratoire de Biologie Cellulaire et Moléculaire Alemania Holanda Biomedical Primate Research Centre Freie Universitaet Berlin Suecia Francia País University of Göteborg Université de Rouen - Haute Normandie Colaboradores 1996-1999 1996-1999 1997 1997-2000 1997-2001 Duración FAIR961039 BIO4960304 FAIR965860 BIO4972182 BMH4972345 Referencia PLANTAS BIOFACTORÍA 99 100 Francia Centre National de la Recherche Scientifique (C.N.R.S) Axis Genetics plc University of Edinburgh Rhein.-Westf. Technische Hochschule Aachen Tree improvement based on lignin engineering. The plant as a factory for the production of oral vaccines and diagnostics. Structure, function and industrial applications of plant laccases and peroxidases. Molecular farming of therapeutic antibodies in plants. Alemania Reino Unido Reino Unido País Coordinador Proyecto — Université de Rouen - Haute Normandie — Francia Italia Dinamarca University Of Copenhagen Università degli Studi di Catania Francia Universite Paul Sabatier de Toulouse III Suiza Dinamarca Novo Norddisk Universite De Geneve Bélgica Eurogenetics Nv Bélgica España Immunologia y Genetica Aplicada S.A. Rijksuniversiteit Gent Holanda Dinamarca Danish Veterinary Institute for Virus Research Institute for Animal Science and Health Research Reino Unido Zeneca Group Plc España Francia I.N.R.A. - Centre de Versailles Empresa Nacional de Celulosas S.A.- Centro de Investigacion de Ence - CIE Grecia País Center for Renewable Energy Sources Colaboradores 1997 1994-1998 1995-1998 1995-1999 Duración FAIR965860 FAIR21661 FAIR950720 FAIR950424 Referencia Francia Holanda Wageningen University A flexible approach to endow plants with new properties. País GREENTECH SA Coordinador Novel approaches for a mass production of plant extension which is a bovine collagen and gelatin substitute by overexpression in transgenic plants or in fermentation process. Proyecto Holanda Italia Centre for Plant Breeding Res. Ente per le Nuove Tecnologie l'Energia e l'Ambiente (ENEA) Bélgica Alemania University Of Hamburg Universiteit Gent Alemania Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen (RWTH) Francia Alemania Bundesanstalt für Züchtungsforschung an Kulturpflanze Institut National de la Recherche Agronomique (INRA) Alemania País Gesellschaft für Biotechnologische Entwicklung und Consulting GmbH Colaboradores 1993-1995 1997 Duración BIO2920239 BIO4979054 Referencia PLANTAS BIOFACTORÍA 101 102 Expresión de un antígeno vírico en plantas de patata: optimización de una vacuna contra la enfermedad hemorrágica del conejo Universidad de Oviedo Dpto. Bioquímica y Biología Molecular * En estos proyectos colabora Fort Dodge Veterinaria, S.A. Producción de antígenos vacunales en plantas mediante transformación cloroplástica BIOPHAR – Production of enzymes for applications in food industries using recombinant techniques 1999-2000 2002 2003-2004 MEDIBIO: New technologies for producing pharmaceuticals using plant systems 1998-2000 Desarrollo de vacunas comestibles contra el virus de la fiebre hemorrágica del conejo usando un vector viral para plantas basado en el potyvirus del mosaico del nabo 2000 1998-2000 Aplicaciones biotecnológicas de los virus vegetales: expresión heteróloga de biomoléculas de interés industrial en plantas Expresión de péptidos vacunales del virus del sarampión en plantas transgénicas 2001-2003 1998-2001 Producción y mejora de la acumulación de proteínas de interés agronómico y metabólico en plantas Utilización de plantas como biofactorías. Desarrollo de sistemas de sobreproducción de xenoproteínas de interés vacunal 2001-2004 Producción de proteínas de interés terapéutico en plantas 1996-1999 Expression of animal virus antigens in plants using viral vectors 2002-2005 Targeting immunocomplex production in plants 1997-1999 1996-1999 Expression of animal virus antigens in plants using viral vectors Diseño de un vector de expresión basado en el virus de la sharka y su empleo para producir en plantas antígenos de agentes patógenos para la preparación de vacunas 2000-2003 2002-2005 Duración Immunotherapy of enteric infections by rotaviruses and coronaviruses using plantibodies* Targeting immunocomplex production in plants* Proyecto Universidad Pública de Navarra Dpto. Producción Agraria (grupo de agrobiotecnología vegetal) Instituto Vasco de Investigación y Desarrollo Agrario (NEIKER) Departamento de Biotecnología Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA) Dpto: Biotecnología (grupo de apoptosis) Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA) Dpto: Biotecnología (grupo de biotecnología de virus vegetales) Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA) Dpto: Biotecnología (grupo de vacunas) Instituto de Biología Molecular de Barcelona. Dpto. Genética molecular de plantas (grupo de transporte subcelular de proteínas vegetales) Centro Nacional de Biotecnología (CNB-CSIC) Dpto: Genética Molecular de Plantas Centro Nacional de Biotecnología (CNB-CSIC) Dpto. Biología Molecular y Celular Centro ANEXO III. Centros públicos de investigación y proyectos PLANTAS BIOFACTORÍA ANEXO IV. Empresas PAÍS SISTEMA DE EXPRESIÓN USA Maíz y algodón España Virus TuMV Bayer Cropscience www.bayercropscience.com Alemania Cánola, algodón y arroz Basf Plant Science GmbH www.basf.de/en Alemania Cánola EMPRESA Agracetus www.agracetus.com Agrenvec www.agrenvec.es MOLÉCULAS Proteínas terapéuticas Enzimas industriales — Biopolímeros Vitaminas Lactoferrina humana Biocem S.A./Biogemma S.A. Francia Maíz y tabaco Lipasa gástrica Vacuna contra la rabia Anticuerpos del VIH Biolex (Epicyte) www.biolex.com USA Maíz Anticuerpos del Herpes Simplex Microbicidas Bioplanta Gmbh www.bioplanta-leipzig.de Biosecure Crops www.growmax.biz Calgene Inc Cellectis S.A. www.cellectis.com Ceres Inc www.ceresbiotechnology.com Alemania Tabaco Anticuerpos Canadá Patata Anticuerpos monoclonales USA Cloroplasto Xilanasas Francia Plantas Fármacos USA — — Albúmina sérica humana Interferones Chlorogen www.chlorogen.com USA Tabaco Factores de crecimiento Biopolímeros (elastina) Vacunas contra antrax, peste y cólera Chromatin Inc www.chromatininc.com USA Cobento Biotech Aps www.cobento.com Dinamarca CropDesign www.cropdesign.com Fármacos Factor intrínseco humano Arabidopsis Transcobalamina humana Bélgica Arroz — Vacunas de uso veterinario Dow Agrosciences www.dowagro.com USA Maíz Anticuerpos de uso veterinario 103 PAÍS SISTEMA DE EXPRESIÓN USA Cártamo España Tabaco Australia Tabaco, banana, caña de azúcar y leguminosas Biopolímeros y proteínas de interés terapéutico e industrial USA Tabaco y cebada Colágeno y gelatina recombinantes España Potyvirus de la viruela del ciruelo USA — Enzimas industriales Corea del Sur Tomates y tabaco Vacunas animales y humanas comestibles Greenovation Biotech GmbH www.greenovation.com Alemania Maíz Greentec GmbH Alemania — Canadá Melón coreano, tabaco, cánola y mostaza EMPRESA Emlay And Associates Era Plantech www.eraplantech.com Farmacule Bioindustries Pty Ltd www.farmacule.com Fibrogen Inc www.fibrogen.com Fort Dodge Veterianaria Genecor International www.genencor.com Genomine Inc www.genomine.com MOLÉCULAS Fármacos Calcitonina Proteína VP60 de la fiebre hemorrágica del conejo Factor IX Colágeno y gelatina bovina Fármacos Guardian Biotechnologies www.guardianbio.com Vacunas Hormonas Enzimas de restricción Interferón α y β Somatotropina Anticuerpos de cadena sencilla Anticuerpos monoclonales Icon Genetics Ag www.icongenetics.com Antígenos Alemania/USA Tabaco Glucocerebrosidasa Taumatina Álbumina ADNasa Inhibidor de ARNasa Insulina Ingenasa www.ingenasa.es KWS Saat AG. www.kws.de 104 España — Alemania Maíz, trigo, cebada, caña de azúcar y patata — Inulina PLANTAS BIOFACTORÍA PAÍS SISTEMA DE EXPRESIÓN Kosan Bioscience Inc. www.kosan.com USA Tabaco Large Scale Biology www.lsbc.com USA Tabaco EMPRESA Limagrain Group www.limagrain.com MOLÉCULAS Enzimas (poliquétido sintasas) Vacuna contra el cáncer α-Galactosidasa Francia Maíz — Lactoferrina Maltagen Forschung GmbH www.maltagen.de Lisozima Alemania Cebada Albúmina sérica humana Vacuna contra hepatitis Maxigen Inc www.maxygen.com USA — — Proteínas plasmáticas Nutracéuticos Medicago www.medicago.com Canadá Alfalfa Enzimas industriales Colágeno Anticuerpos monoclonales Mendel Biotechnology www.mendelbio.com USA — — Lipasa gástrica Meristem Therapeutics www.meristem-therapeutics.com Francia Tabaco y maíz HSA como excipiente para vacunas Lactoferrina Metabolix www.metabolix.com USA Tabaco, alfalfa y mijo Biopolímeros (PHAs) Alemania Patata y cánola Anticuerpos y fragmentos de anticuerpos Monsanto Protein Technology www.mpt.monsanto.com USA Maíz Neorx Corporation www.neorx.com USA — MPB Cologne GmbH Avicidina (MAbs) Proteínas terapéuticas contra el cáncer. Avidicina Vacunas comestibles de uso veterinario Nexgen Biotechnologies, Inc www.nexgenbiotech.com Hormonas (diagnóstico del hipo e hipertiroidismo) Corea del Sur Melón coreano Proteínas para el diagnóstico de HFRS EGF Novartis www.novartis.com Multinacional Plantas Enzimas 105 EMPRESA Novoplant GmbH www.novoplant.com PAÍS SISTEMA DE EXPRESIÓN Alemania Guisante, patata y soja MOLÉCULAS Anticuerpos recombinantes de cadena sencilla de uso veterinario Interleukina-3 Interferón β Orf Genetics www.orfgenetics.com Islandia Lechuga y cebada Eritropoyetina Stem cell factor (SCF) Factor estimulante de las colonias de granulocitos macrófagos Phylogix www.phylogix.com USA — Phytomedics www.phytomedics.com USA Tabaco y tomate Multinacional Cánola Pioneer Hi-Bred International Inc www.pioneer.com Planet Biotechnology www.planetbiotechnology.com Plant Bioproducts, S. L. www.plantbioproducts.com Proteínas terapéuticas Biopolímeros Enzimas USA Tabaco España Cloroplastos IgGs contra la caries y resfriado común Antígenos de la enfermedad hemorrágica del conejo y fiebre aftosa bovina Enzimas con aplicaciones industriales Plantechno Srl www.plantechno.com Italia Plantgenix www.plantgenix.com USA Plantigen Inc www.lhsc.on.ca/plantigen — Arroz y trigo Proteínas humanas terapéuticas y de diagnóstico Canadá — Tabaco — GAD & citoquininas contra diabetes tipo I IL-10 Planton GmbH www.planton.de Alemania Patata Péptidos antimicrobianos Canadá Tabaco Glicoproteína B de hCMV Prodigene www.prodigene.com USA Maíz Progenco Co www.progenco.com Reino Unido Girasol, maíz y tabaco Sembiosys Genetics Inc. www.sembiosys.ca Canadá Cártamo Serological Corporation www.serologicals.com USA Prairie Plant Systems Inc www.prairieplant.com 106 Vacunas contra Hepatitis B Aprotinina Proteínas terapéuticas Fármacos Cuerpos lipídicos — — PLANTAS BIOFACTORÍA EMPRESA PAÍS SISTEMA DE EXPRESIÓN USA Maíz MOLÉCULAS Avidina Stauffer Biotech β-Glucuronidasa Subterra* www.subterrallc.com USA Tabaco Alemania Tomate, patatas, tabaco, cánola y Arabidopsis Glicoproteína B de hCMV Tocoferoles Sungene GmbH & Co. www.sungene.de Vitamina K Enzimas industriales Syngene Biotek Syngenta Biopharma www.syngenta.com/en/biopharma Toxin Alert www.toxinalert.com Unicrop www.unicrop.fi Ventria Bioscience www.ventriabio.com Yissum Research Development Co www.yissum.co.il Péptidos antimicrobianos Canadá Tabaco y patatas Suiza Cártamo Anticuerpos Canadá Tabaco y patata Anticuerpos Finlandia Cebada Anticuerpos monoclonales Proteínas de interés terapéuticos USA Arroz Israel Tabaco y tomate Alternativos a antibióticos de uso veterinario: lactoferrina y lisozima Clorofilasa recombinante terapéutica * Joint venture con Prairie Plant Systems Inc. 107 108 SemBioSys Genetics Inc. SemBioSys Genetics Inc. SemBioSys Genetics Inc. Icon Genetics BASF Plant Science Medicago London Health Sciences Noda Institute for Scientific Research SemBioSys Genetics Inc. Meristem Therapeutics Pioneer Hi-Breed Intl. MPB Cologne Penn State Research Foundation National Science Council Applied Phytologics Boyce Thompson Inst. Products for topical applications comprising oil bodies Products for topical applications comprising oil bodies Oil bodies and associated proteins as affinity matrices Processes and vectors for amplification or expression of nucleic acid sequences of interest in plants Method for expression of biosynthetic genes in plant seeds using novel multiple expression constructs Method for regulating transcription of foreign genes Methods and products for controlling the immune response of a mammal to glutamic acid decarboxylase Method for producing foreign polypeptide in plant intercellular fluid Products for topical applications comprising oil bodies Method for producing human haemoglobin proteins using plant cells Methods of increasing polypeptide accumulation in plants Method for carrying out the controlled post-harvest production of proteins in host organisms Quantitative transient protein expression in plant tissue culture Application of alpha amylase gene promoter and a signal sequence in the production of recombinant proteins in transgenic plants and transgenic plant seeds Plant selectable marker and plant transformation method Banana DNA associated with fruit development US6599513 US6582710 US6509453 WO02088369 WO02057464 US6420548 US6388850 US6388068 US6372234 US6344600 WO0138508 WO0120974 US6288302 US6284956 US6284946 US2002108149 Icon Genetics Commercial use of Arabidopsis for the production of human and animal therapeutic and diagnostic proteins WO03012035 Solicitante Título de patente Nº de patente Métodos de transformación nuclear Métodos de transformación nuclear ANEXO V. Patentes 2001 2001 2001 2001 2001 2002 2002 2002 2002 2002 2002 2002 2002 2003 2003 2003 2003 Año 109 Applied Phytologics Washington State Univ. Research Foundation Medicago Univ. of California Mogen Intl.141 Univ. of California SemBioSys Genetics Inc. Iowa State Univ. Medicago Univ. of California Univ. of California SemBioSys Genetics Inc. SemBioSys Genetics Inc. SemBioSys Genetics Inc. Novartis SemBioSys Genetics Inc. Mogen Intl. Mogen Intl. Mogen Intl. Production of mature proteins in plants Production of secreted foreign polypeptides in plant cell culture Promoter for regulating expression of foreign genes Production of proteins in plant seeds Recombinant DNA: transformed microorganisms, plant cells and plants: a process for introducing an inducible property in plants, and a process for producing a polypeptide or protein by means of plants or plant cells Process for protein production in plants Preparation of heterologous proteins on oil bodies Plant secretory signal peptides and nectarins Protein production in transgenic alfalfa plants Process for protein production in plants Process for protein production in plants Oil bodies and associated proteins as affinity matrices Oil bodies as topical delivery vehicles for active agents Oil body based personal care products Recombinant production of proteins using 7B2 protein Oil-body protein cis-elements as regulatory signals Production of heterologous proteins in plants and plant cells Production of heterologous proteins in plants and plant cells Production of enzymes in seeds and their use US6066781 US6020169 CA2385348 WO9916890 EP337532 US5994628 US5948682 US5939288 US5990385 US5889189 US5888789 US5856452 CA2353071 CA2290278 US5804417 US5792922 US5763748 US5716802 US5714474 Actualmente pertenece a Syngenta. 2000 SemBioSys Genetics Inc. Uses of oil bodies US6146645 141 2000 MPB Cologne Fibrous proteins and their production WO0008142 1998 1998 1998 1998 1998 1999 1999 1999 1999 1999 1999 1999 1999 1999 1999 1999 2000 2000 2000 2001 SemBioSys Genetics Inc. Oil body based personal care products US6183762 2001 Año SemBioSys Genetics Inc. Solicitante Uses of oil bodies Título de patente US6210742 Nº de patente Métodos de transformación nuclear PLANTAS BIOFACTORÍA 110 1997 1996 1996 1995 Univ. of California Virginia Tech Intellectual Properties Washington Univ. Virginia Tech Intellectual Properties SemBioSys Genetics Inc. Mogen Intl. The Rubber Research Inst of Malaysia/ Univ. of Hertfordshire Mogen Intl. Plant Genetic Systems Inc. The Rubber Research Inst of Malaysia/ Univ. of Hertfordshire National Science Council of ROC Krebbers et al. Process for protein production in plants HMG2 promoter expression system Producing commercially valuable polypeptides with genetically transformed endosperm tissue HMG2 promoter expression system and post-harvest production of gene products in plants and plant cell cultures Oil-body proteins as carriers of high-value peptides in plants Production of heterologous proteins in plants and plant cells Method for the production of proteins in plant fluids Production of enzymes in seeds and their use Process for the production of biologically active peptide via the expression of modified storage seed protein genes in transgenic plants Method for the production of proteins in plant fluids Gene expression system comprising the promoter region of the alpha amylase genes Process for the production of biologically active peptide via the expression of modified storage seed protein genes in transgenic plants US5693506 US5689056 US5677474 US5670349 US5650554 US5650307 US5580768 US5543576 US5487991 EP598589 US5460952 CA1337048 1995 1995 1996 1997 1997 1997 1997 1997 1998 SemBioSys Genetics Inc. Method for cleavage of fusion proteins CA2286861 1998 Año Univ. of California Solicitante Rice beta-glucanase enzymes and genes Título de patente CA2296008 Nº de patente Métodos de transformación nuclear 2002 2002 2002 2002 2002 2002 2002 2001 2001 2001 2001 2001 2001 2000 2000 2000 Icon Genetics Icon Genetics Greenovation Biotech GmbH Calgene Rutgers Univ. Syngenta Rutgers Univ. Auburn Univ. Calgene Icon Genetics Calgene Calgene Rutgers Univ. Monsanto Novartis Rutgers Univ. Calgene Processes and vectors for plastid transformation of higher plants Processes and vectors for plastid transformation Plastid transformation of Lycopersicon plants Expression of herbicide tolerance genes in plant plastids Nuclear-encoded transcriptional system in plastids of higher plants ClpP plastid promoter sequence DNA constructs and methods for stably transforming plastids of multicellular plants and expressing recombinant proteins therein Marker free transgenic plants engineering the chloroplast genome without the use of antibiotic selection Methods and vectors for site-specific recombination in plant cell plastids Methods for transforming plant plastids and making transplastomic plants Enhancer elements for increased translation in plant plastids Enhanced expression of proteins Editing-based selectable plastid marker genes Bacterial expression system based on plastid or mitochondrial promoter combinations Therapeutically active proteins in plants Translation control elements for high-level protein expression in the plastids of higher plants and ethods of use thereof Expression of eukaryotic peptides in plant plastids WO02057466 WO02055651 EP01245149 US6492578 US6472586 US6362398 US6338168 WO0129241 WO0170939 WO0121782 WO0104331 US6297054 US6218145 WO020612 WO007431 WO0003012 US6013860 Calgene 2003 Calgene Expression of eukaryotic peptides in plant plastids US6512162 Expression of enzymes involved in cellulose modification 2003 Calgene Plastid transformation of Brassica US6515206 US20020137214 2003 Auburn Univ. Genetic engineering of plant chloroplasts US6642053 2000 2002 2003 Año Icon Genetics Solicitante Gene expression in plastids based on replicating vectors Título de patente WO03004658 Nº de patente Métodos de transformación de cloroplastos e ingeniería de cloroplastos Métodos de transformación de cloroplastos e ingeniería de cloroplastos PLANTAS BIOFACTORÍA 111 112 1999 1999 1999 1999 1999 1998 1998 1997 1997 1996 1996 1996 1995 Auburn Univ. Auburn Univ. Calgene Rutgers Univ. Calgene Rutgers Univ. Novartis Rutgers Univ. Auburn Univ. Calgene Calgene Calgene Rutgers Univ. Universal chloroplast integration and expression vectors, transformed plants and products thereof Genetic engineering of plant chloroplasts Controlled expression of transgenic constructs in plant plastids DNA constructs and methods for stably transforming plastids of multicellular plants and expressing recombinant proteins therein Enhanced expression in a plant plastid Plastid promoters for transgene expression in the plastids of higher plants Transgenic plants expressing cellulolytic enzymes Plastid transformation in Arabidopsis thaliana Genetic engineering of plant chloroplasts Controlled expression of transgenic constructs in plant plastids Expression of Bacillus thuringiensis cry protein in plant plastids Enhanced expression in a plant plastid Method for stably transforming plastids of multicellular plants US5932479 US5925806 US5877402 US586642 WO985559 WO9811235 WO9732977 US5693507 US5576198 US5545818 US5545817 US5451513 Año WO199910513 Solicitante Título de patente Nº de patente Métodos de transformación de cloroplastos e ingeniería de cloroplastos 2003 2003 2002 2002 2002 2001 2001 2001 2001 1998 1996 Prodigene Inc. Icon Genetics MPB Cologne Large Scale Biology Meristem Therapeutics Prodigene Inc. /Genencor Prodigene Inc. Large Scale Biology Prodigene Inc. Univ. of Texas Methods of commercial production and extraction of protein from seed Using viruses to detect or purify proteins Method for extracting proteins from plants in pure form Method for recovering proteins from the interstitial fluid of plant tissues Method for isolating and purifying and resulting protein Method of increasing recovery of heterologous active enzymes produced in plants Methods of producing recombinant proteins Method for recovering proteins from the interstitial fluid of plant tissues Methods of commercial production and extraction of protein from seed Method of isolation and purification of fusion polypeptides US6504085 WO02068927 WO0205922 US6441147 WO0198473 WO0196543 WO0121270 US6284875 WO9839461 US5532142 Año Large Scale Biology Corp. Solicitante Method for recovering proteins from the interstitial fluid of plant tissues Título de patente US6617435 Nº de patente Métodos purificación de productos Métodos de purificación de productos PLANTAS BIOFACTORÍA 113 114 2002 2002 2002 2002 2002 2002 2002 Medicago Inst. of Molecular Agrobiology Icon Genetics Icon Genetics Fujiyama et al. Dow AgroSciences Inc. Atabekov et al. Rutgers Univ. /Phytomedics Method of selecting plant promoters to control transgene expression Reduction of transmission of transgenes in plants Processes and vectors for producing transgenic plants Amplification vectors based on trans-splicing Method for secretory production of glycoprotein having human-type sugar chain using plant cell Regulatory sequences useful for gene expression in plant embryo tissue Methods for coexpression of more than one gene using at least one internal ribosome entry site Materials and methods for amplifying and enhancing transcribing of polynucleotides in plants and portions thereof WO0236786 WO0216624 WO0210160 WO02097080 WO02057468 US6410828 US6376745 US6355860 2001 2001 2001 2001 2001 2001 2001 2001 2000 1999 1999 Prodigene Inc. Applied Phytologics MPB Cologne Queensland Univ. of Technology MPB Cologne SemBioSys Genetics Inc. Dow AgroSciences MPB Cologne Rutgers Univ. /Phytomedics Applied Phytologics Dow AgroSciences Novel plant promoter sequences and methods of use for same Plant transcription factors and enhanced gene expression Expression vectors for concentrating a recombinantly produced protein in different cell compartments A construct capable of release in closed circular form from a larger nucleotide sequence permitting site specific expression and/or developmentally regulated expression of selected genetic sequences Inhibition of carbohydrate-modified enzymes in host organisms Flax seed specific promoters Methods and genetic compositions to limit -outcrossing and gene flow in crop plants Expression system for anaerobic gene expression in higher plants Materials and methods for amplifying polynucleotides in plants Plant selectable marker and plant transformation method Methods and genetic compositions to limit outcrossing and undesired gene flow in crop plants WO0183792 WO0173085 WO0172996 WO0155434 WO0116340 EP1141350 US6194201 US6100092 WO9967406 CA2354195 2002 WO0194394 Methods and compositions to reduce or eliminate transmission of a transgene 2002 Icon Genetics Process of producing environmentally safe transgenic organisms WO02096192 US20020144305 2003 Rutgers Univ. Phosphorus-controllable recombinant expression of polypeptides in plants US6544789 2002 2003 Año Atabekov et al. Solicitante Recombinant construct for enhancement of gene expression in plants Título de patente US6573427 Nº de patente Otras tecnologías: promotores, marcadores, confinamiento, direccionamiento, etc. Otras tecnologías 2001 2001 2001 Veterinary Infectious Disease Organization (VIDO) Large Scale Biology Loma Linda Univ. Henry M. Jackson Foundation Recombinant subunit proteins from porcine parovirus produced in plants Self antigen vaccines for treating B cell lymphomas and other cancers Transgenic plant-based vaccines Method of stimulating an immune response by administration of host organisms that express intimin alone or as a fusion protein with one or more other antigens WO0194392 WO0168682 WO0155169 US6261561 142 115 1996 Edible Vaccines Inc. Prodigene Inc. Vaccines produced and administered through edible plants Vaccines expressed in plants US5484719 WO9420135 Actualmente pertenece a Prodigene. 1997 Edible Vaccines Inc.142 Anti-viral vaccines expressed in plants US5612487 1994 1997 1997 Washington Univ. Washington Univ. Oral immunization by transgenic plants US5686079 Washington Univ. 1997 Biocem Transgenic plants expressing rabies glycoprotein G, and glycoproteins thus obtained WO9743428 Oral immunization by transgenic plants 1997 Agriculture and Agri-Food Canada (AAFC) Porcine reproductive and respiratory syndrome oral vaccine production in plants CA2221843 Oral immunization by transgenic plants 1998 Agriculture and Agri-Food Canada (AAFC) Porcine reproductive and respiratory syndrome oral vaccine production in plants CA2319141 US5679880 1999 Loma Linda Univ. US5654184 1999 1999 Univ. of Guelph. Porcine reproductive and respiratory syndrome oral vaccine production in plants Expression of cholera toxin B subunit in transgenic plants and efficacy thereof in oral vaccines 2000 Thomas Jefferson Univ. Polypeptides fused with alfalfa mosiac virus or ilarvirus capsid US6042832 WO9937784 2000 Novartis Therapeutically active proteins in plants WO0020612 WO9918225 2001 2001 Texas A & M Univ. Chinese Inst of Microbiology Oral immunization with transgenic plants Cholera vaccine prepared from transgenic carrot and its preparing process US6194560 CN1286120 2001 2002 2001 Prodigene Inc. US2002058312 SemBioSys Genetics Inc. Plants and plant cells expressing histidine tagged intimin US6406885 Expression cassettes and methods for delivery of animal vaccines 2002 Henry M. Jackson Foundation Polypeptides fused with alfalfa mosiac virus or ilarvirus capsid US6448070 The use of plant oil-bodies in vaccine delivery systems 2002 Thomas Jefferson Univ. Recombinant vaccines against IBDV WO0195934 2003 2003 Boyce Thompson Inst. Meristem Therapeutics Expression of immunogenic hepatitis B surface antigens in transgenic plants Año Solicitante US6551820 Título de patente US6528063 Nº de patente Producción de vacunas Producción de vacunas PLANTAS BIOFACTORÍA 116 143 1999 1999 1999 1998 1997 1997 1997 1997 1996 1996 Epicyte Pharmaceutical Inc. Scripts Research Inst. Scripts Research Inst. Epicyte Pharmaceutical Inc. Scripts Research Inst. Institute für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung (IPK) Scripps Research Inst. Scripts Research Inst. Planet Biotechnology United Medical and Dental Schools of Guy's/St. Thomas's hospitals Scripps Research Inst. J-chain and analogues as epithelial cell targeting conjugates Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies Novel epithelial tissue targeting agent Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies Cassettes for the expression of storable proteins in plants Compositions containing glycopolypeptide multimers and methods of making same in plants Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies Method for producing immunoglobulins containing protection proteins in plants and their use Methods for producing immunoglobulins containing protection proteins in plants and their use Compositions containing plant-produced glycopolypeptide multimers, multimeric proteins and method of their use WO9920310 EP946717 US5959177 WO9830592 WO9742313 WO972900 US5639947 CA2252454 WO9621012 CA2208783 US5202422 Actualmente pertenece a Biolex. 2000 1993 2000 Planet Biotechnology Epicyte Pharmaceuticals Method for producing immunoglobulins containing protection proteins in plants and their use J chain polypeptide targeting molecule linked to an imaging agent US6045774 2000 Monsanto Method for producing antibodies in plant cells US6080560 US6046037 2001 2000 Method for producing immunoglobulins containing protection proteins in plants and their use US6303341 Monsanto 2001 Planet Biotechnology J chain polypeptide targeting molecule linked to an imaging agent US6391280 Epicyte Pharmaceuticals Inc. 2002 Epicyte Pharmaceuticals143 Cassettes for the expression of storable proteins in plants US6403371 Epithelial cell targeting agents 2002 Institute für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung (IPK) Method for producing antibodies and protein toxins in plant cells 2002 Scripps Research Inst. Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies US6417429 US6251392 2002 Icon Genetics Production of proteins in plants WO02101006 US6140075 2002 Año SemBioSys Genetics Solicitante Methods for the production of multimeric proteins and related compositions Título de patente WO0250289 Nº de patente Producción de anticuerpos Producción de anticuerpos 1999 1999 Groupe Limagrain Holding Wisconsin Alumni Research Foundation Method for producing, by plant cells, “-1-antitrypsin and its alleles, and products containing the resulting “-1-antitrypsin Transgenic plants as an alternative source of lignocellulosic-degrading enzymes EP1051503 US5981835 1999 1999 Prodigene Optimized nucleotide sequence encoding organophosphorus hydrolase and methods of use for same WO9953037 Agriculture and Agri-Food Canada (AAFC) 2000 Univ. of California Value-added traits in grain and seed transformed with thioredoxin CA2368744 Xylanase obtained from an anaerobic fungus 2000 US5948667 2000 Academia Sinica Univ. of California Protein production in transgenic plant seeds Barley gene for thioredoxin and NADP-thioredoxin reductase Mogen Intl. Expression of phytase in plants US6022846 CA2309342 2000 Prodigene Inc. CA2368854 2000 2000 Applied Phytologics Production of alpha 1-antitrypsin in plants Commercial production of proteases in plants US6127145 US6087558 2000 Agriculture and Agri-Food Canada (AAFC) Xylanase obtained from an anaerobic fungus US6288304 US6137032 2001 SemBioSys Genetics Inc. Expression of somatotropin in plant seeds US6303766 2001 2001 Virginia Tech Soybean phytase and nucleic acid encoding the same WO0114571 2000 2001 SemBioSys Genetics Inc. Commercial production of chymosin in plants WO0177422 D. Exp Ind. Des Tabacs et Allum 2001 Meristem Therapeutics Method for the manufacture of recombinant unhydroxylated collagen polypeptide fibres obtained thereby WO0194393 CropTech 2001 Institute für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung (IPK) Synthetic spider silk proteins and the expression thereof in transgenic plants US20020162140 Production of recombinant allergens in plants 2002 Univ. of Arizona Expression of recombinant human acetylcholinesterase in transgenic plants US6380372 Production of urokinase in plant-based expression systems 2002 2002 Battelle Memorial Inst. Univ. of California Controlled environment agriculture bioreactor for heterologous protein production Barley gene for thioredoxin and NADP-thioredoxin reductase WO0208382 FR2809413 2003 Korea Inst of Science and Technology Tobacco for producing human insulin protein and its production JP5041990 WO0000624 2003 Meristem Therapeutics Año Solicitante Recombinant lactoferrin, methods of production from plants and uses Título de patente US6569831 Nº de patente Producción de proteínas Producción de proteínas PLANTAS BIOFACTORÍA 117 118 1999 1998 1998 1998 1998 Loike et al. Biocem Meristem Therapeutics Biocem Prodigene Inc. Mammalian alcohol dehydrogenase and aldehyde dehydrogenase production in plants Recombinant lactoferrin, methods of production from plants and uses Recombinant collagen and derived proteins produced by plants, methods for obtaining them and uses Pancreatic lipases and/or recombinant colipases and derived polypeptides produced by plants, methods for obtaining them and use thereof Commercial production of avidin in plants US5855881 WO9850543 WO9827202 WO9817807 1996 1996 1993 1992 Meristem Therapeutics Korea Inst of Science and technology Korea Inst of Science and Technology DNA Plant Technology Corp. Human interlukin-6 producing tobacco Plant for producing IL-2 Ice crystal growth suppression polypeptides and method of making WO9633277 KR9607190 KR9309562 US5118792 1997 Prodigene Inc. Commercial production of aprotinin in plants Mogen Intl. Expression of phytase in plants US5593963 Recombinant preduodenal lipases and polypeptide derivatives produced by plants, processes for obtaining them and their uses 1997 Prodigene Inc. CA2233538 1997 1997 Prodigene Inc. Commercial production of beta-glucuronidase in plants Commercial production of aprotinin in plants 1997 Prodigene Inc Commercial production of avidin in plants WO9717455 WO9717454 1998 Mogen Intl. Expression of phytase in plants US5770413 WO9717453 1998 1998 Prodigene Inc. Prodigene Inc. Commercial production of aprotinin in plants Commercial production of B-glucuronidase in plants EP859852 US5804694 EP862641 1999 Genencor Cleaning compositions containing plant cell wall degrading enzymes and their use in cleaning methods US5872091 1999 Año CropTech Solicitante Production of lysosomal enzymes in plant-based expression systems Título de patente US5929304 Nº de patente Producción de proteínas 2001 2001 2001 2000 2000 2000 2000 2000 2000 2000 2000 1999 1999 1998 1998 Metabolix Metabolix Kosan Biosciences Inc. Metabolix Metabolix Pioneer Hi-Breed Intl. Pioneer Hi-Breed Intl. Univ. of Minnesota Monsanto Pioneer Hi-Breed Intl. Metabolix Monsanto Metabolix Metabolix Monsanto Massachusetts Institute of Technology (MIT) Polyhydroxyalkanoate production from polyols Polyhydroxyalkanoate biopolymer compositions Production of polyketides in plants Methods for purifying polyhydroxyalkanoates Transgenic systems for the manufacture of poly(3-hydroxy-butyrate-co-3-hydroxyhexanoate Plant cells and plants transformed with Streptococcus mutans gene encoding glucosyltransferase C enzyme Plant cells and plants transformed with Streptococcus mutans gene encoding glucosyltransferase D enzymes Polyhydroxyalkanoate synthesis in plants Polyhydroxyalkanoates of narrow molecular weight distribution prepared in transgenic plants Plant cells and plants transformed with Streptococcus mutans gene encoding glucosyltransferase B enzymes Methods for isolating polyhydroxyalkanoates from plants Polyhydroxyalkanoates of narrow molecular weight distribution prepared in transgenic plants Modification of fatty acid metabolism in plants Biological systems for manufacture of polyhydroxyalkanoate polymers containing 4-hydroxyacids Methods of optimizing substrate pools and biosynthesis of poly-B-hydroxybutyrate-co-poly-Bhydroxyvalerate in bacteria and plants Method for producing polyester biopolymers US6329183 US6323010 US6262340 WO0068409 WO0043523 US6127603 US6127602 US6103956 US6091002 US6087559 US6083729 US6228623 WO9945122 WO9914313 WO9800557 EP482077 2002 Monsanto DNA sequence useful for the production of polyhydroxyalkanoates USRE37543 2000 2002 2002 Univ. Laval /AAFC Pioneer Hi-Breed Intl. Method for producing polyhydroxyalkanoates in recombinant organisms Polyhydroxyalkanoate synthase genes 2002 Metabolix Production of medium chain length polyhydroxyalkanoates from fatty acid biosynthetic pathways WO0240690 US6475734 2003 Metabolix Modification of fatty acid metabolism in plants US6586658 US6492134 2003 Año Riken Solicitante Methods for transformation of plants, transformed plants and processes for preparation of polyesters Título de patente US6620601 Nº de patente Ingeniería metabólica: producción de bioplásticos Ingeniería metabólica: producción de bioplásticos PLANTAS BIOFACTORÍA 119 120 1998 1998 1997 1997 1996 1996 1996 1995 1995 1993 1993 1993 1993 1992 Monsanto Massachusetts Institute of Technology (MIT) Massachusetts Institute of Technology (MIT) Massachusetts Institute of Technology (MIT) Massachusetts Institute of Technology (MIT) Massachusetts Institute of Technology (MIT) Michigan State Univ. Massachusetts Institute of Technology (MIT) Michigan State Univ. Massachusetts Institute of Technology (MIT) Massachusetts Institute of Technology (MIT) Massachusetts Institute of Technology (MIT) Zeneca DNA sequence useful for the production of polyhydroxyalkanoates Method for producing polyester biopolymers Gene encoding bacterial beta-ketothiolase Polyhydroxybutyrate polymerase Gene encoding bacterial acetoacetyl-CoA reductase Overproduction and purification of soluable PHA synthase Processes for producing polyhydroxybutyrate and related polyhydroxyalkanoates in the plastids of higher plants Polysaccharide based biodegradable thermoplastic materials Transgenic plants producing polyhydroxyalkanoates Polyhydroxyalkanoate polymerase Method for producing novel polyester biopolymers Method for producing novel polyester biopolymers Production of polyhydroxy alkanoate in plants US5750848 US5663063 US5661026 US5534432 US5512669 US5480794 WO9505472 US5459258 WO9302187 US5250430 US5245023 US5229279 WO9219747 Año Massachusetts Institute of Technology (MIT) Solicitante Gene encoding bacterial acetoacetyl-CoA reductase Título de patente US5798235 Nº de patente Ingeniería metabólica: producción de bioplásticos 145 144 2001 2001 2001 2000 2000 2000 1999 1999 1999 1998 Institute für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung (IPK) Washington State Univ. KWS Saat AG. Hindustan Lever Ltd Stichting Scheikundig Onerzoek Washington State Univ. Washington State Univ. Tiense Suikerraffinderrij Hindustan Lever Ltd Washington State Univ. Pioneer Hi-Breed Intl. Amoco Corp Amoco Corp Production of non-cariogenic sugars in transgenic plants Transacylases of the paclitaxel biosynthetic pathway Process for producing inulin-generating plants Methods and composition for modulating flavonoid content Production of oligosaccharides in transgenic plants Compositions and methods for taxol biosynthesis Nucleic acids encoding Taxus geranylgeranyl disphosphate synthase, and methods of use Transgenic plants presenting a modified inulin producing profile Methods and composition for modulating flavonoid content Compositions and methods for taxol biosynthesis Cellulose synthesis in the storage tissue of transgenic plants Method and composition for increasing sterol accumulation in higher plants Method and composition for increasing sterol accumulation in higher plants WO0159136 US6287835 US6255562 WO004175 US6147280 US6114160 US6043072 WO9954480 WO9937794 US5994114 US5723764 US5365017 US5306862 Adquirida por Unilever. Adquirida por BP. 2002 Univ of Calif./ Washington State Univ. Germacrene C synthase gene of Lycopersicon esculentum US6342380 145 2002 Washington State Univ. Monoterpene synthases from grand fir (Abies grandis) US6429014 1994 1994 2000 2002 Washington State Univ. Sesquiterpene synthases from grand fir (Abies grandis), and methods of use US6451576 144 2003 Año Calgene Solicitante Glycogen biosynthetic enzymes in plants Título de patente US6538181 Nº de patente Ingeniería metabólica: otras rutas metabólicas Ingeniería metabólica: otras rutas metabólicas PLANTAS BIOFACTORÍA 121 11. Referencias • Arcand, F.; Arnison, P. (2004). Development of • Elbers, I. J.W.; Stoopen, G.M.; Bakker, H.; Novel Protein-Production Systems and Economic Stevens, L.H.; Bardor, M.; Molthoff, J.W.; Opportunities & Regulatory Challenges for Canada. Jordi, W.J.R.M.; Bosch, D.; Lommen, A. 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OMG Organismo modificado genéticamente. PHA Polihidroxilalcanoato. PHB Poli (3-hidroxibutirato). PPP Potyvirus de la viruela del ciruelo. PST Proteína soluble total. PVX Virus X de la patata. RE Retículo endoplásmico. TBSV Virus del enanismo ramificado del tomate. TMV Virus del mosaico del tabaco. TuMV Potyvirus del mosaico del nabo. USDA United States Department of Agriculture. PLANTAS BIOFACTORÍA 13. Glosario • Agrobacterium tumefaciens: Bacteria patógena de plantas capaz de insertar en éstas una parte de su material genético a través de heridas. Esta capacidad se aprovecha para introducir genes en plantas, sustituyendo algunos de los genes que contiene la bacteria por los genes de interés. • Alérgeno: Sustancia capaz de desencadenar una respuesta inmune en determinados organismos. • Anticuerpo: Proteína sintetizada por el sistema inmunológico como respuesta a la presencia de una sustancia extraña, a la que se une de manera selectiva. • Antígeno: Sustancia capaz de desencadenar la producción de anticuerpos por el sistema inmunológico. • Aparato de Golgi: Compartimento celular implicado en la glicosilación y direccionamiento de proteínas, formado por un conjunto de vesículas y sacos aplanados limitados por membranas. • Apoplasto: Espacio que existe entre la pared celular y la membrana plasmática en la célula vegetal. • Ácido ribonucleico mensajero (mRNA): Molécula de ARN transcrita a partir de una molécula de ADN, que puede ser traducida a una cadena polipéptidica cuya secuencia de aminoácidos viene codificada en su secuencia. • Cultivo hidropónico: Sistema de cultivo de plantas en el que el suministro de los nutrientes se realiza a través de una disolución embebida en un sustrato inerte. • Efectos de posición: Variaciones en los niveles de expresión de un transgén debidos al lugar de inserción del mismo en el genoma de la planta. • Efectos epigenéticos: Modificaciones no mutacionales, generalmente no heredables y de carácter no permanente. • Electroporación: Aplicación de pulsos eléctricos de elevado voltaje que inducen la formación de poros reversibles en la membrana de protoplastos u otras células, a través de los cuales puede introducirse material genético en la célula. • Epítopo: Cualquier estructura o secuencia que es reconocida por un anticuerpo. También denominado determinante antigénico. • Expresión transitoria: Expresión de genes foráneos sin necesidad de que se produzca integración de estos genes en el genoma de la célula transformada. • Glicosilación: Adición covalente de moléculas de azúcares denominadas glicanos a determinados aminoácidos de cadenas polipeptídicas. • Hirudina: Anticoagulante natural obtenido a partir de la sanguijuela. • Autenticidad estructural: Característica de la proteína recombinante por la que su estructura es idéntica a la de la proteína nativa, conservando su función biológica. • Intrón: Fragmento de ADN de los genes de eucariotas que se transcribe a ARN y es eliminado durante la maduración del mRNA, por lo que no se traduce a proteínas. • Citosol: Porción fluida del citoplasma. • Lignina: Molécula orgánica compleja que imparte rigidez y fortaleza a las paredes secundarias de la célula vegetal. • Cloroplasto: Orgánulo subcelular característico de las células vegetales en cuyo interior se realiza la fotosíntesis, que contiene su propio material genético. • Confinamiento: Se refiere a las medidas de tipo agronómico o biológico que se utilizan con el fin de limitar el contacto de un organismo cuyo material genético ha sido modificado con la población y el medio ambiente. • Lipofílico: Que presenta afinidad por las grasas. • Micotoxina: Sustancia tóxica producida por hongos que tiene efectos negativos agudos y/o crónicos sobre la salud de los animales y de los seres humanos. Varias de ellas están clasificadas como carcinógenos o posibles carcinógenos para los seres humanos. 127 • Micropropagación: Multiplicación in vitro y/o regeneración de materiales vegetales en condiciones asépticas en medios de cultivo que contienen los nutrientes esenciales para el crecimiento. • Modificaciones postraduccionales: Conjunto de modificaciones que pueden producirse en las proteínas una vez sintetizadas, encaminadas a que adquieran una configuración adecuada. • Neutropenia: Déficit anormal de células neutrófilas en la sangre como consecuencia del cual las personas afectadas son más susceptibles a infecciones. • Oleosinas: Proteínas lipofílicas implicadas en la formación de estructuras de almacén de lípidos. • Oligosacárido: Hidrato de carbono formado por la unión de entre dos y diez monosacáridos. • Operón policistrónico: Conjunto de genes controlados por un único promotor que se transcriben en un único mRNA. • Péptido señal: Secuencia de 15 a 30 aminoácidos situada en el extremo amino terminal de una proteína que contiene información acerca del destino final de la proteína en la célula. • Plantas transplastómicas: Plantas transgénicas en las que el gen foráneo se ha insertado en el material genético de los cloroplastos en lugar de en el núcleo celular. • Plásmido Ti: Molécula de ADN circular de la bacteria Agrobacterium tumefaciens que contiene los genes responsables de la inducción de tumores en plantas. Se utiliza como vector para introducir ADN foráneo en plantas. • Plastoma: Material genético de los cloroplastos. • Prión: Agente infeccioso responsable de varias enfermedades neurodegenerativas en los mamíferos entre las que se encuentra la encefalopatía espongiforme bovina o “mal de las vacas locas”. • Promotor: Secuencia de ADN adyacente al gen necesaria para que éste sea transcrito a ARN. También denominado secuencia promotora. • Proteína recombinante: Proteína cuya secuencia de aminoácidos está codificada por un gen clonado. 128 • Proteína foránea: Proteína procedente de otro organismo. • Protoplasto: Célula a la que se ha eliminado la pared celular mediante procesos químicos o enzimáticos. En suspensión son capaces de incorporar de manera natural fragmentos de ADN que se encuentren en el medio. • Recombinación homóloga: Proceso por el cual se pueden intercambiar fragmentos entre dos moléculas de ADN a través de secuencias idénticas de nucleótidos. • Retículo endoplásmico: Sistema membranoso formado por una red de sáculos o cisternas aplanados y vesículas que se encuentra en el citoplasma celular. Interviene en la síntesis y el transporte de proteínas. • Secuencia líder: Secuencia que aparece en el mRNA en el extremo 5’ que no es traducida a proteínas. • Secuencias oncogénicas: Secuencias que codifican genes que estimulan la reproducción celular provocando crecimientos incontrolados que causan la formación de tumores. • Silenciamiento: Conjunto de fenómenos que pueden inhibir la expresión de los transgenes insertados en una planta. • Somatotropina: Hormona secretada por mamíferos que estimula la síntesis de proteínas y el crecimiento de los huesos largos en piernas y brazos. También denominada hormona de crecimiento. • Traducción: Proceso mediante el cual se produce la síntesis de polipéptidos a partir de un mRNA que codifica la secuencia de aminoácidos de los mismos. • Transcripción: Proceso mediante el cual se forma una molécula de mRNA a partir de un molde de ADN. • Transgén: Gen procedente de un organismo que se ha incorporado en el genoma de otro. • Vacuna: Preparación de un organismo patógeno muerto o atenuado, o de determinantes antigénicos derivados, capaz de inducir una respuesta inmune duradera y protectora contra ese patógeno. • Vacuna atenuada: Vacuna producida a partir de un organismo patógeno vivo que ha sido PLANTAS BIOFACTORÍA modificado para obtener una forma menos virulenta. • Vacuna de subunidades: Vacuna elaborada a partir de proteínas u otras moléculas procedentes de un organismo patógeno, capaces de inducir una respuesta inmune. Estas moléculas pueden obtenerse mediante purificación a partir del organismo patógeno o pueden sintetizarse artificialmente. • Vacuna inactivada: Vacuna elaborada a partir de organismos patógenos completos tratados para eliminar su capacidad infectiva. • Vacuola: Estructura muy abundante en células vegetales, que consiste en una cavidad rodeada de una membrana en la que se acumulan distintos productos. • Variación somaclonal: Cambios genéticos o epigenéticos que aparecen de forma espontánea en el cultivo in vitro de tejidos. • Vector: Vehículo de transferencia de un gen foráneo a un organismo hospedador, que contiene todos los elementos necesarios para su expresión. Suelen ser virus o plásmidos modificados por ingeniería genética. 129 Orense, 69, planta 2ª - 28020 Madrid Teléfono: 91 449 12 50 • Fax: 91 571 54 89 www.gen-es.org