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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Modulación de células dendríticas de la piel en la inducción de distintos tipos de respuesta inmune efectora. TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE DOCTORADO EN CIENCIAS EN INMUNOLOGÍA PRESENTA M. en C. DAVID EDUARDO MEZA SANCHEZ Directora: Dra. Laura Cecilia Bonifaz Alfonzo Director interno: Dr. Francisco Javier Sánchez García ii iii iv INDICE GENERAL INDICE DE FIGURAS vi ABREVIATURAS vii RESUMEN viii ABSTRACT ix ANTECEDENTES x Estructura de la piel 1 Subtipos de células dendríticas 3 Maduración de células dendríticas 4 Importancia de los Adyuvantes en la Respuesta Inmune 7 Inmunobiología de células dendríticas de la piel 8 Células dendríticas en epidermis 9 Células dendríticas en dermis 11 Inmunización en piel 12 JUSTIFICACIÓN 14 HIPOTESIS 15 OBJETIVO 16 MATERIALES Y METODOS 17 Ratones 17 Reactivos Enriquecimiento de linfocitos T CD4 17 + 18 Marcaje y transferencia de linfocitos T CD4+ 18 Inmunización 19 Co-cultivo 19 Determinación de citocinas Citocinas en secreción 20 Tinción intracelular 20 Inmunofluorescencia 21 v RESULTADOS A. Proliferación de linfocitos T CD4 22 B. Efecto adyuvante en la proliferación de linfocitos T CD4+ antígeno específico. 24 C. Expresión de MHC-II, CD86 y CD40 en células de Langerhans de ratones B10BR transferidos. 25 D. Expresión de citocinas Th1/Th2/Th17 en linfocitos T CD4 + de ratones B10BR transferidos. E. Determinación de citocinas Th1/Th2/Th17 en ratones Balb/c. 30 32 F. Expresión de citocinas después de la inmunización por diferentes vías de inoculación. G. Efecto adyuvante de Subunidad B de TC. 35 38 H. Importancia de las células dendríticas de la piel en la inducción de la Respuesta inmune efectora después de inmunización en piel. 41 DISCUSIÓN 44 CONCLUSIONES 51 BIBLIOGRAFÍA 52 vi INDICE DE FIGURAS Figura 1. Anatomía de la piel y de células efectoras. Figura 2. Fenotipo y localización de subtipos de células dendríticas. Figura 3. Modelo de interacción entre subtipos de DC y linfocitos T durante la infección. Figura 4. Interacción de DC con células del sistema inmune. Figura 5. Proliferación de linfocitos T CD4+ Vβ 8.2+ con diferentes dosis de antígeno vía intradérmica en oreja. Figura 6. Proliferación de linfocitos T CD4+ Vβ 8.2+ en diferentes ganglios ganglios linfáticos. Figura 7. Proliferación de linfocitos T CD4+ en ganglios linfáticos cuando se administran diferentes adyuvantes. Figura 8. Expresión y distribución de MHC-II en células de Langerhans de ratones B10BR transferidos con linfocitos T CD4+. Figura 9. Expresión y distribución de MHC-II y CD40 en células de Langerhans de ratones B10BR transferidos con linfocitos T CD4+. Figura 10. Expresión y distribución de MHC-II y CD86 en células de Langerhans de ratones B10BR transferidos con linfocitos T CD4+. Figura 11. Expresión de citocinas Th1/Th2/Th17 en linfocitos T CD4+ de ratones B10BR transferidos. Figura 12. Expresión de citocinas Th1/Th2/Th17 en linfocitos T CD4+ de ratones Balb/c transferidos. Figura 13. Proliferación de linfocitos T CD4+ cuando se administra el antígeno en diferentes vías de inoculación. Figura 14. Proliferación de linfocitos T CD4+ con 1 μg de LG en diferentes vías de inoculación. Figura 15. Expresión de citocinas cuando se administra el antígeno en diferentes vías de inoculación. Figura 16. Cinética de distribución de MHC-II y CD86 en TC y CTB. Figura 17. Importancia de CTB en la inducción de respuesta inmune. Figura 18. Las CD de la piel no son responsables de la proliferación de Linfocitos T CD4+. Figura 19. Importancia de las células dendríticas de la piel en la inducción de respuesta inmune efectora. Figura 20. Citocinas intracelulares en linfocitos T después de quitar el sitio de Inoculación. vii ABREVIATURAS Ag Antígeno BTC Subunidad B de toxina de cólera BSA Albúmina sérica bovina CD Célula Dendrítica CD40 Proteína coestimuladora en células presentadoras de antígeno CD86 Proteína activadora de la familia B7 CL Células de Langerhans CPA Célula presentadora de antígeno FACS Fluorescent activated cell sorter GLd Ganglio linfático de drenaje IFN Interferon gamma IL Interleucina kDa KiloDalton LG Lisozima de Gallina M Molaridad MHC Complejo principal de histocompatibilidad OVA Ovoalbúmina PBS Solución amortiguadora de fosfatos PE Ficoeritrina RI Respuesta Inmune SFB Suero Fetal bovino Stv Estreptavidina TC Toxina de cólera TCR Receptor T de linfocitos T TLR Receptores tipo Toll TNF Factor de necrosis tumoral viii RESUMEN La respuesta inmune dada por la inmunización cutánea y el papel de las células dendríticas en el inicio de esta respuesta permanece controversial hasta nuestros días, Aquí nosotros evaluamos el linfocitos T CD4+ después de la inmunización en la oreja con bajas dosis de un antígeno modelo en combinación con toxina de cólera (TC). Nosotros encontramos presentación de antígeno local en ganglios linfáticos de drenaje (GLd) que se traduce en producción de IFN-γ e IL-17 por linfocitos T CD4+, aunque las células productoras de IFN-γ fueron más frecuentes que las células productoras de IL17 e IFN-γ/IL-17. la subunidad B de TC (BTC) indujo activación de CD de la piel y diferenciación de linfocitos T de manera similar a la toxina completa. células La presentación de antígeno pudo haber sido lograda por presentadoras notablemente de antígeno en el GLd, sin embargo y la producción de IFN-γ/IL-17 por linfocitos CD4+ fue dependiente de la presencia de células migrantes de la piel, que llegan al GLd dentro de las primeras 24 horas después de la inmunización. Estos resultados indican que en el contacto inicial después de la inmunización, la respuesta de IFN-γ es dominante sobre IL-17, IL-4 e IL-5 sugiriendo que la expansión clonal de linfocitos T CD4+ puede ser atribuida a CD presentadoras en GLd, una segunda oleada de presentación de antígeno por CD migrantes de la piel es necesaria para una eficiente diferenciación de células T CD4+ productoras de IFN-γ/IL-17 ix ABSTRACT The immune response elicited by cutaneous immunization and the role of migrating dendritic cells (DCs) in shaping this response remains controversial. Here we evaluated the initial priming of CD4+ T cells after ear immunization with low doses of model antigens in combination with cholera toxin (CT). We found local antigen presentation in draining cutaneous lymph nodes (dCLN) that translates into the production of IFN-γ and IL-17 by CD4+ T cells, although IFNγ-producing cells were more frequent than IL-17 and IFN-γ/IL-17 cells. The β subunit of CT (CTB) induced skin DC activation and T cell differentiation similarly to the complete toxin. Antigen presentation could be achieved by presenting cells in the dCLNs, however and remarkably, IFN-γ/IL-17 production by CD4+ T cells was dependent on the presence of migrating skin cells that arrive at the LN during the first 24 hr after immunization. These results indicate that in the initial priming after ear immunization, IFN-γ responses are dominant over IL-17, IL-4 and IL-5 and suggest that even when clonal expansion of CD4+ T cells can be achieved by DCs present in dCLNs, a second wave of antigen presentation by migrating DCs is necessary for efficient IFN-γ/IL-17 CD4+ T cell differentiation. x ANTECEDENTES Estructura de la piel La piel, es la interfase primaria entre el cuerpo y el ambiente, provee la primera línea de defensa contra patógenos microbianos y agresores físicos y químicos. La inmunovigilancia de un organo tan extenso y expuesto, presenta un desafío único para las células dendríticas (CD) y otras células del sistema inmune que lo constituyen. De tal forma que, si una respuesta inmune es inadecuada, podrian desarrollarse infecciones y tumores y si, una respuesta inmune es excesiva, entonces inflamación crónica y autoinmunidad pueden ser desarrolladas. Por lo tanto, los mecanismos de defensa activos como las rutas tolerogénicas contribuyen a la homeostasis inmune, asegurando que la respuesta inmune en la piel sea la adecuada para el desafío antigenico. (Nestle O. F., 2009). Debido a su accesibilidad, la piel es un sistema ideal en el que podemos estudiar tanto el tejido como todo el organismo ante daños locales y sistémcos. La piel, tiene dos compartimentos principales: la epidermis y la dermis. La epidermis es el compartimento exterior y contiene cuatro estratos. El estrato basal es la capa inferior de la epidermis y es la responsable de la renovación constante de las celulas de la piel. Esta capa contiene solamente una hilera de células no diferenciadas conocidas como queratinocitos basales, que se dividen frecuentemente. Estos se diferencian y mueven a la siguiente capa, conocida como estrato espinoso, en donde comienza un proceso de maduración pero también de división para la lamina basal. Las células que se mueven del estrato espinoso cambian su forma de columna, a poligonales y comienzan a sintetizar queratina. Los queratinicitos en el estrato granuloso está caracterizado por marcas oscuras de material citoplasmático y estas células producen activamente proteínas queratínicas y lípidos. Finalmente el estrato corneo como último producto de maduración de los queratinocitos es el estrato más expuesto de los cuatro y es el principalmente responsable de la 1 función de barrera de la piel, excluyendo agentes tóxicos y previniendo la deshidratación. Células especializadas, como melanocitos (encargados de la pigmentación de la piel) y células de Langerhans (CL), que son las principales células del sistema inmune residentes en la piel, así como linfocitos T, principalmente CD8+ pueden ser encontrados en los estratos basales y espinosos. La dermis es anatómicamente un tejido más complicado, con una gran diversidad celular, ya que contiene células del sistema inmune especializadas, como CD, linfocitos T CD4+ y linfocitos T γδ y células NKT, sin embargo, macrófagos, células cebadas, fibroblastos y células del sistema nervioso también están presentes. La dermis es drenada por conductos linfáticos y vasculares a través del cual, las células migrantes se pueden trasladar (Proksch E., 2008) Figura 1. Anatomía de la piel y de células efectoras (Frank O. Nestle, Nature review Immunology, 2009) 2 Las CD a pesar de no ser tan abundantes, son células que se encuentran ampliamente distribuidas en el organismo y que están especializadas para la captura, procesamiento y presentación de antígenos a linfocitos T. Subtipos de células dendríticas Existen dos posibles rutas de ontogenia de células dendríticas, a partir de células progenitoras hematopoyéticas, una ruta genera células dendríticas mieloides CDm y otra que genera DCp (Grouard G.,1997) El ligando de Flt3 aparece como el factor principal que dirige la homeostasis de las CD en reposo In vivo, las CDm se encuentran en al menos tres compartimentos: CD residentes de tejido periférico, CD residentes de órganos linfoides y CD en circulación sanguínea. Las CD convencionales pueden ser clasificadas en tres subtipos en bazo, esto de acuerdo con la expresión de CD4 y CD8α (Vremec D., 2000). No ha sido determinado si la mayoría de células CD4- CD8- son distintas del subtipo CD4+, pero varios reportes han mostrado diferencias (Proietto A, 2004; Lundie RJ, 2008) La complejidad de los subtipos de CD se hace más evidente cuando analizamos el ganglio linfático, ya que además de estar conformado por las CD que normalmente se encuentran en el bazo, también lo conforman CD migrantes de la piel que son las CL, CD dermales (CD der) y CD CD103+, llamadas CD dermales Langerina+. En la piel, estos tres tipos distintos de CDm migrantes, se encuentran en dos áreas diferentes. Las células de Langerhans (CL) residen en la epidermis y las CDder están presentes en la dermis64 al igual que las CD Langerina+ (Bursh LS, 2007; Poulin L.F., 2007; Ginhoux F., 2007). 3 Figura 2. Fenotipo y localización de subtipos de DC. (Heath W. and Carbone F. Nature Immunology, 2009) Maduración de CD Las células dendríticas inician la respuesta inmune adaptativa, a través de la captura de antígeno en la periferia, el procesamiento y presentación del antígeno endocitado en forma de péptidos unidos a proteinas del MHC en la superficie, y por movilización a ganglios linfáticos de drenaje donde establecen contacto con los linfocitos T especificos. Aquí las células dendríticas derivadas de la dermis migran lentamente, explorando el sitio, desplegando activamente las dendritas mientras realizan frecuentes contactos transitorios con linfocitos T altamente móviles (Millar MJ, 2004, PNAS; Millar MJ 2004 JEM). Durante la inmunización activa, las interacciones de CD con linfocitos T son más estables, iniciando la proliferación de linfocitos T y la consecuente producción de citocinas (Millar MJ, 2004; Bousso P 2003;,Mempel TR, 2004) 4 Figura 3. Modelo de interacción entre subtipos de DC y linfocitos T durante la infección (Heath W. and Carbone F. Nature Immunology, 2009) La respuesta inmune mediada por linfocitos T se caracteriza por la producción de citocinas específicas por células activadas, acompañadas por la diversificación funcional de los linfocitos T. Generalmente, las CD responden a microorganismos intracelulares induciendo linfocitos T CD4+ hacia una respuesta tipo Th1, caracterizada por producción de IFN-γ. 5 Por otro lado, la infección por patógenos extracelulares lleva a la polarización de linfocitos T hacia una respuesta inmune tipo Th2, caracterizada por la producción de IL-4 (Agrawal S., 2003). Estas funciones de especialización de linfocitos T CD4+ activados, dependen de varios factores. De manera general, el destino de las células T naive, es determinado por tres señales provistas por las CD, en contacto con patógenos 1) La señal 1, resulta de la ligación del receptor de células T (TCR) con péptidos derivados de patógenos, presentados por moléculas MHC-II en la superficie de las CD (complejo MHC-IIPéptido), y por la unión de CD40 con su ligando CD154; estas señales determinan la especificidad del antígeno. 2) La señal 2, es una señal coestimuladora, y es principalmente mediada por la activación de CD28 a través de moléculas CD80 y CD86 expresadas en CD después de su activación (Cunningham A.J., 1977). 3) La señal 3 es una señal polarizante, esto es, se refiere a señales derivadas de células presentadoras de antígeno (APC) hacia células T, determinando la diferenciación de una célula T efectora (células T helper (TH1), células TH2, TH3, TH17, Treg o linfocitos T citotóxicos Kalinski P., 1999; Curtsinger J.M, 2003). La señal 3, depende del estímulo de maduración recibido, así como las condiciones impuestas por el microambiente. Estas tres senales, en conjunto, determinan la funcion que desarrollaran los linfocitos T. 6 Importancia de los adyuvantes en la Respuesta Inmune Varios adyuvantes han sido utilizados en vacunas para incrementar la respuesta inmune humoral y celular, teniendo un papel crítico en la determinación de la polarización de linfocitos T (Agrawal S, 2003; Pulendran B, 2006) adyuvantes tales como LPS u oligonucletidos CpG no metilados (CpG), activan células dendríticas vía receptores tipo Toll, TLR4 y TLR9 respectivamente, estímulos que promueven una respuesta inmune tipo Th1 (Pulendran B, 2006). Recientemente ha sido mostrado que la polarización hacia el tipo Th2 puede ser inducida por cistein-proteasas, como la papaína o por toxinas derivadas de bacterias, como E. coli o Vibrio cholerae. La toxina producida por Vibrio cholerae, es una enterotoxina termolábil con peso molecular de 10,000 a 90,000 Daltons (Besson P., 1977). Está conformada por dos subunidades (A y B). La subunidad “A” está compuesta a su vez por dos moléculas; la molécula que corresponde a la fracción tóxica, la cual transforma el ATP en AMPc, y la molécula A2 que esta encargada de unir la unidad “A” con la subunidad “B”, mediante puentes disulfuro. La subunidad “B” es un homopentámero, encargado de unir la toxina a un receptor denominado gangliosido GM1 (monosialogangliosido), el cual está presente en todas las células nucleadas de los mamíferos (Holmgren J. 1981). La toxina de cólera (TC) administrada por vía oral, induce una rápida movilización de células dendríticas inmaduras en la pared intestinal que es seguida por la expansión de una gran cantidad de CD maduras en los nódulos linfáticos mesentéricos (NLM) de drenaje, con aumento en la expresión de CD80 CD86 y CD40 (D). La TC, es uno de los más potentes adyuvantes utilizados en mucosas, ya que no únicamente abroga la tolerancia, sino que también potencia predominantemente una respuesta de linfocitos T y B (Elson C, 1984; Holmgren J, 1993; Lycke N, 1986; Xu-Amano J, 1993). 7 Algunos estudios han propuesto que la TC induce una fuerte respuesta tipo Th2 co-administrada con antígenos modelo, basados en la producción de IL-4, IL-5 e IL-10, pero bajas cantidades de IFN-γ (Yamamoto S, 1997; XuAmano J, 1993; Simecka JW, 2000; Marinaro M, 1995). Además, se ha demostrado que TC y la enterotoxina de E. coli pueden suprimir la producción de IL-12 e IFN-γ (Ryan EJ, 2000; Braun MC, 1999). Sin embargo, otros estudios han reportado una mezcla de respuestas Th1/Th2, con producción simultanea de IFN-γ e IL-4 después de la inmunización con TC por las vías oral e intranasal (Yanagita M, 1999, Schaffeler MP, 1997) y Lavelle et al, demostró que la TC también promueve la generación de células T reguladoras contra antígenos modelo. (Lavelle EC, 2003) En un estudio reciente, Lee y colaboradores demostraron la capacidad que tiene TC de inducir una respuesta tipo Th17, con una alta producción de IL17 e IL-6, siendo precisamente esta última, clave para desarrollar este tipo de respuesta (Lee JB, 2009). Inmunobiología de CD de la piel Con la ayuda del microscopio de dos fotones, el cual permite visualizar el sistema inmune in vivo en tiempo real y por medio de tinción intravital, Debasish S. y colaboradores revelaron las secuencias de movilidad e interacción dinámica que tiene las células dendríticas de la piel en la dermis y epidermis, cuando están en presencia de adyuvantes y como esto puede contribuir a la polarización de linfocitos T (Debasish S, 2010). En este estudio, determinaron que: i)En la oreja, las CL están presentes dentro de los primeros 40 μm de la superficie y las CD dermales se localizan más profundamente, entre 40 y 100 μm. Dentro del cojinete plantar, las CL se localizaron dentro de los 60 μm de profundidad, pero importantemente, no se detectaron CD dermales a más de 350 μm. ii) Las CD dérmicas y CL son diferencialmente movilizadas durante la sensibilización por contacto y por 8 adyuvantes, tales como CpG y LPS que inducen una respuesta tipo Th1 o Papaína que se ha demostrado que induce una respuesta tipo Th2. iii) La sensibilización en la oreja por LPS, CpG y Papaína, inducen movilización de CD dermales en tres distintas fases: a) Incremento de la movilidad y sondeo de CD, la cual ocurre dentro de los primeros 10 a 20 minutos después de aplicado el estímulo, b) migración dirigida que se da entre los 20 y 90 minutos subsecuentes y c) la entrada a vasos linfáticos que ocurre después de los 90 minutos aproximadamente. iiii) Durante este mismo tratamiento, las CL de la oreja permanecen inmóviles por más de 48 horas, iiiii) La polarización Th1 de linfocitos T CD4+, fue independiente del sitio de inmunización, mientras que la inmunización en la oreja, favoreció la respuesta Th2. Con este estudio concluyen que la movilización de CL incrementa una respuesta Th1, pero no Th2, mientras que la movilización de CD dermales es suficiente para inducir proliferación de células T y polarización inicial de linfocitos T hacia una respuesta Th2 (Sen D, 2010), CD en epidermis En la actualidad, las evidencias sobre el papel de las células de Langerhans en el organismo en condiciones de salud y enfermedad son contradictorias, Algunos reportes indican que al aplicar un antígeno directamente en la epidermis por administración epicutánea, después de remover el estrato corneo, se induce una respuesta tipo Th2 en ausencia de adyuvantes (Strid, J., 2004) Otros trabajos describen que, a diferencia de lo descrito para CD en reposo, las CD de la piel, migran constantemente al ganglio linfático, en donde las CL inducen una eficiente respuesta inmune con secreción de IFN-γ. Mayerova, D., 2004), sugiriendo que la función de estas células, incluso en reposo, es la inducción de respuesta inmune. 9 Algunos resultados muestran que después de infectar ratones con el virus de herpes simple exclusivamente en la epidermis, las células de Langerhans no son las que presentan e inducen respuesta inmune contra el virus (Allan, R.S, 2003). Estos resultados sugieren que las CL sólo transportan el antígeno de la epidermis y que las CD CD8+ residentes del ganglio son las que transpresentan el antígeno a los linfocitos T (Bosnjak L, 2005). También se ha reportado recientemente que CL aisladas de la epidermis o migrantes de explantes de la piel, realizan presentación cruzada de proteínas solubles o antígenos acoplados a células en moléculas de MHC-clase I a células T CD8+. A demás, estas células T CD8+ activadas, ejercen funciones efectoras tal como producción de citocinas y actividad citotóxica (Stoitzner P, 2006). Recientemente, se han desarrollado modelos murinos en los que las CL pueden ser depletadas por inoculación de toxina diftérica (TD) o aisladas por una molécula de EGFP+ unidas a la molécula de Langerina (LanherinaDTREGFP), (Bennett C, 2005; Kissenpfennig A, 2005). Estos modelos serán un impulso importante para el desarrollo de experimentos in vivo que permitan entender la función de las CL. En otros modelos murinos experimentales,las CL nunca se desarrollaron y estos ratones carecen constitutivamente de esta células (ratones Langerina-DTA) (Kaplan D, 2005). Los resultados obtenidos en el modelo experimental de depleción por TD han sido contradictorios, ya que cuando cantidades bajas de antígeno son aplicadas en la piel las CL son determinantes en la respuesta inmune. Sin embargo, cuando grandes cantidades de alergenos son aplicados, las CD pueden substituir la carencia de CL y mediar la hipersensibilidad por contacto (Noordegraaf M, 2010). Estos resultados, contrastan con los modelos de ratón en los que las CL están ausentes desde el nacimiento, ya que en estos últimos se ha demostrado que, sin importar la cantidad de sensibilizante utilizado, las CL incrementan las reacciones de hipersensibilidad por contacto. Esta discrepancia no ha sido explicada. 10 CD en dermis En el caso de la dermis, los recientes descubrimientos de nuevos subtipos de CD dermales que expresan Langerina+, han complicado la historia aun más ( Poulin L, 2007; Ginhoux F, 2007), Bursch LS, 2007) El subtipo de células CD dermales Langerina+ constituye del 30-60% de todas las CD Langerina+ en los nodos linfáticos de drenaje de la piel, aunque dicha población es escasa en la dermis. Estas células representan un subtipo de células dendríticas distintas ya que al parecer cumplen muchas de las funciones que habían sido atribuidas hasta ese momento a las CL (Kaplan, 2008). Varios reportes indican que estas CD dermales Langerina+, son mediadores de la respuesta inmune en la piel, como hipersensibilidad por contacto (Wang L, 2008), y presentación cruzada de antígenos expresados en los keratinocitos de la epidermis, así como antígenos virales (Bedoui S, 2009). Figura 4. Interacción de DC con células inmune (Nestle O.F., Nature Reviews Immunology, 2009 11 Inmunización en piel El diseño de nuevas propuestas de vacunación a través de la piel es muy atractiva por su simplicidad y facilidad, pero principalmente por la respuesta inmunológica que pueden inducir las CD, es por eso que las CD son prometedoras candidatas para inmunoterapia contra cancer. Actualmente, la inmunoterapia convencional de CD, consiste , en la diferenciación in vitro de monocitos de sangre periférica o de células precursoras CD34+ de pacientes, a CD, posteriormente estas células son cargadas con el antígeno tumoral y transferidas de regreso a los pacientes con cancer (Stoizner 2008). Algunos pacientes con cancer con tumoraciones sólidas malignas tal como son el cancer renal y el melanoma, han mostrado mejoría clínica e incluso la completa remisión del tumor (Schuler G, 2003; Shuler Thurner, 2002). Las desventajas que presenta este tratamiento, es el elevado costo, además de lo incomodo que resulta para el paciente todo el proceso. Es por eso que se han buscado nuevas estrategias de inmunoterapia en piel que resuelvan estos problemas. Una de las estrategias que se han seguido, es cargar las células Langerhans in situ con proteínas antigénicas, a través de inmunización epicutánea en la piel, que consiste en retirar el estrato corneo mediante el contacto repetitivo con cinta adhesiva. El uso de esta inmunoterapia ha demostrado que no solo las LC, si no también las CD dermales, presentan el antígeno a los linfocitos T en el ganglio drenante, y además, inducen células T CD8+ de memoria de larga duración, capaces de inhibir el crecimiento del melanoma trasplantado en un modelo murino (Stoitzner P, 2008). Otra aplicación importante es el tratamiento de prevención de infecciones. Glenn et al, comenzaron a desarrollar vacunación con toxinas, como toxina de cólera y toxoide tetánico, con las cuales lograron proteger a ratones, de subsecuentes desafíos con estas toxinas (Glenn G, 1998). 12 En un estudio, donde se comparó la eficiencia de la vía epicutánea, quitando el estrato corneo, contra la vía intramuscular, se administró Agripal, que es una vacuna contra influenza, disponible comercialmente. Ambas rutas de vacunación indujeron producción de IFN-γ en células T CD4+ activadas, sin embargo, la respuesta de células T CD8+ fue únicamente detectada solo en la administración en piel y no en el músculo (Vogt A, 2008) Una característica importante que tiene la piel, es que las vacunaciones que se realizan en ella, puede generar respuestas inmune diferentes, como se ha demostrado por la inducción de tolerancia, inhibiendo la encefalomielitis autoinmune experimental (Bynoe M, 2003). Por lo anterior, las células dendríticas de la piel son las mejores candidatas para evaluar tanto los procesos de maduración de las CD in vivo, como para estudiar la capacidad de respuesta de las CD inmaduras a distintos estímulos. En conclusión, la inmunización en piel, representa una nueva opción para el tratamiento y prevención de una multitud de afectaciones que aquejan al ser humano. 13 JUSTIFICACIÓN Las células dendríticas de la piel parecen jugar un papel clave en la inducción de la respuesta inmune y hasta el momento se desconoce si las CD de la piel pueden controlar y dirigir el tipo de repuesta. Es importante, por lo tanto, determinar las consecuencias de la inmunización en piel, en el inicio de una respuesta inmune celular. 14 HIPOTESIS La calidad de la respuesta inmune inducida por inmunización en piel, será distinta a la generada por otras vías de inoculación y esto será dependiente, de la presencia o ausencia de células dendríticas de la piel. Las células dendríticas de la piel juegan un papel clave en la inducción y tipo de respuesta inmune celular inducida por la inmunización en piel. 15 OBJETIVOS GENERAL Determinar la participación de las células dendríticas de la piel en la inducción y tipo de respuesta inmune inducida por la inmunización en la piel. PARTICULARES Inocular bajas cantidades de antígeno por vía intradérmica en oreja del ratón y evaluar la proliferación de linfocitos T antígeno específicos en los ganglios linfáticos drenantes al sitio de inoculación. Determinar la activación de células dendríticas de la piel (CL) después de la administración local de diferentes adyuvantes mediante la expresión de moléculas MHC clase II y moléculas coestimuladoras. Evaluar el patrón de citocinas que expresan los linfocitos T antígeno específicos, después de inocular bajas dosis de antígeno en la piel (oreja) en presencia de distintos adyuvantes y en comparación con otras vías de inoculación. Determinar el tipo de respuesta inmune inducido por la coadministración de bajas cantidades de antígeno en la piel en combinación con la subunidad B de TC. Determinar si la respuesta inmune inducida en piel, depende de las migración de las CD de la piel al ganglio linfático drenantes. 16 MATERIALES Y METODOS Ratones Se utilizaron ratones 3A9 (I-Ak) TCR transgénicos, cuyos TCR, en linfocitos T CD4+, son especificos para el péptido 46-61 de lisozima (HEL). Se realizaron cruzas heterocigotas con ratones B10BR (I-Ak) y se seleccionaron con I-Ad y Vβ 8.2 por citometría de flujo a partir de linfocitos en sangre periferica. También se utilizaron ratones DO11.10 (I-Ad) transgénicos, que expresan en linfocitos T CD4+ el receptor Tαβ específico para Ovoalbúmina de Gallina (OVA), estos ratones fueron donados amablemente por el Dr. Ignacio Terrazas (ENEP Iztacala). Además, ratones Balb/c (I-Ad) y ratones C57/BL6 (IAb) que fueron proporcionados por el Bioterio de la Unidad de Medicina Experimental de la Facultad de Medicina de la UNAM, ubicado dentro de las instalaciones del Hospital General de México. Todos los ratones utilizados en los experimentos, fueron de 8-10 semanas de edad y usados de acuerdo a los lineamientos del Comité de Ética Institucional para el cuidado de animales de experimentación Reactivos Los anticuerpos anti CD4 PE, anti CD4 APC, anti CD11c APC, anti CD11c PE, anti I-Ab PE, anti IL-17 PE, anti IFN-γ PE, anti CD86 PE, anti B7-H1 PE, anti CD40 PE, STV-APC, así como el kit de CBAs para citocinas Th1/Th2 de ratón y el Flex set IL-17 e IL-10 de ratón, son de origen comercial Pharmingen-BD Biosciences®. Los sobrenadantes de anticuerpos anti CD8 (TIB105), anti B220 (RA3-6B2), Anti F4/80 (F4/80), anti I-Ab (TIB-120), fueron producidos en el laboratorio a partir de hibridomas obtenidos de ATCC. Anticuerpos anti I-Ak (H116.32) Biotina, anti TCR Vβ8.2 (F23.1) Biotina, anti MHC-II (NIM-R4) Alexa 488, anti DEC-205 biotina (NLDC-45), anti CD40 (IC10), fueron producidos, purificados y marcados en el laboratorio. 17 Lisozima y la subunidad B de toxina de cólera fueron de Sigma- Aldrich®, toxina de cólera de Chalbiochem ®, Poli I:C de Amersham Biosciences ®, Brefeldin-A de Roche ®, MACS anti CD11c de ratón de Miltenyi Bistec ® y CFSE de Fluka®, anti IgG rata. Enriquecimiento de linfocitos T CD4+ De ratones 3A9 y DO11, se extrajo bazo y ganglios, los cuales fueron macerados hasta obtener una suspensión celular uniforme. Estas células se incubaron con una mezcla de anticuerpos que contenían: anti CD8, anti B220, anti F4/80, anti MHC-II y anti CD11c y CD11b, en una cantidad de 2x107 células/ml durante 30 minutos a 4 °C. Posteriormente se colectaron las células y después de los lavados correspondientes, se colocaron en placas p100 cubiertas con anti IgG en una proporción de 4x107 células/placa, resuspendidas en 5 ml de medio RPMI suplementado durante 30 minutos a 37°C. Pasado este tiempo, se recuperaron las células no adheridas, se cuantificaron y se determinó su pureza. Marcaje y transferencia de linfocitos T CD4+ Para determinar proliferación, los linfocitos T CD4+ enriquecidos se marcaron añadiendo 1 μL de CFSE 5 mM por cada 107 células y se incubó durante 10 minutos a 37 °C. Concluido este tiempo, se añadió suero fetal bovino en igual volumen al que estaban las células resuspendidas. Después de los lavados correspondientes, las células se resuspendieron en PBS en un volumen final de 5x107 células/ml. 5x106 linfocitos CD4+ purificados de ratones 3A9 o DO11 fueron transferidos en un volumen de 100μl vía i.v., a ratones B10BR y Balb/c respectivamente. 18 Inmunización Después de 24 horas, los ratones B10BR y Balb/c transferidos, fueron inmunizados vía intradérmica en la oreja del ratón, de acuerdo a las condiciones experimentales establecidas, utilizando: Lisozima (LG) 0.3, 1, 3 y 10 μg, Ovoalbúmina (OVA) 1 μg, toxina de cólera (TC) 1μg, subunidad de toxina de cólera (BTC) 1 μg, Poli I:C 1 μg, anti CD40 2μg y LPS 1μg. Después de 72 horas de administrado el antígeno solo o en combinación con alguno de los adyuvantes, se obtuvieron los ganglios drenantes a la oreja del ratón, y así los ganglios distales al mismo. Estos ganglios se trabajaron individualmente, obteniendo una suspensión celular, enriqueciendo linfocitos CD4+ mediante la panning y colocando en cocultivo. Alternativamente a la vía de inoculación intradérmica en la oreja del ratón, se utilizó la vía subcutánea en cojinete plantar y la vía intraperitoneal cuando el experimento así lo requirió. Co-cultivo Un día antes de obtener los ganglios, se extrajo bazo, ganglios cervicales, axilares, braquiales, inguinales y poplíteos de ratones B10BR o Balb/c en medio Hanks con Ca+ y Mg+, y se añadió colagenasa D, perfundiendo los órganos en un principio y posteriormente disgregando el tejido durante 30 minutos a 37 °C. Después de la lisis y cuantificado el número de células totales, éstas se incubaron por 30 minutos con perlas magnéticas CD11c+ a 4 °C, obteniendo por selección positiva células dendríticas, las cuales se fueron resuspendidas en 1x106 células/ml de medio RPMI suplementado y colocando 100μl en placas de 96 pozos y 1 ml en placas de 12 pozos. La mitad de estos pozos fueron marcados como re-estímulación y se agrego lisozima en una cantidad de 10 μg/ml. 19 Pasadas 18 horas, las células totales y CD4+ de los ratones transferidos e inmunizados, se colocaron en cocultivo con las CD CD11c+ con y sin LG u OVA según fuera el caso, en una proporción de 3:1. Después de 12 horas de incubación a 37 °C en 5% de CO2 se colectaron los sobrenadantes de cada condición y se congelaron a -20 °C para la determinación de citocinas. Determinación de citocinas Citocinas en secreción Para determinar las citocinas secretadas en los sobrenadantes del cocultivo, se utilizó el kit de CBAs Th1/Th2 y el Flex set para IL-10 e IL-17 de acuerdo al procedimiento establecido por BD para el tratamiento de las muestras y analizadas mediante FACS Calibur BD y Flow Jo. Tinción intracelular Para determinar los marcadores externos celulares, se bloqueó inespecíficamente a las células, incubando por 20 minutos con suero de caballo al 2% a 4 °C, posteriormente se administró αCD4 y Vβ 8.2, incubando nuevamente por 20 minutos a 4 °C, y lavando 3 veces más con FACS buffer. Para determinar las citocinas intracelulares, en el último lavado se añadió perm/wash resuspendiendo y lavando inmediatamente las células, posteriormente se añadió citofix/citoperm, dejando incubar durante 20 minutos a 4°C. Finalmente se añadió αIFN-γ APC e αIL-17 e incubamos bajo las condiciones indicadas con anterioridad. El analisis se realizó en FACS CAlibur BD y el Flor Jo. 20 Inmunofluorescencia Ratones B10BR transferidos con linfocitos T CD4+ fueron inoculados con PBS, HEL, o una mezcla de HEL+CT y HEL+CTB, HEL+ Poli I:C, HEL+ αCD40 y HEL+Poli I:C/αCD40 vía i.d. en la oreja del ratón, después de 6, 12, 18, 24, 48 y 72 horas, los ratones fueron sacrificados y las orejas depiladas antes de su escisión. Las orejas se colocaron en placas con EDTA 0.5M durante 2 horas a 37 °C, continuando con 2 horas más en PBS bajo condiciones similares. Concluida la incubación, la epidermis se separó de la dermis mecánicamente y se fijo y permeabilizó en acetona a -20 °C por 20 minutos. Posteriormente las láminas epidérmicas fueron reconstituidas en PBS y bloquedas por 2 horas con suero de caballo al 2%. Después de los lavados, se añadieron los anticuerpos αMHC-II Alexa 488, αCD86 PE, αCD40 PE a los pozos correspondientes y se dejó incubando toda la noche a 4 °C. Las láminas fueron lavadas con PBS minuciosamente y montadas en vectashild para su observación en el microscopio confocal Carl Zeiss. 21 RESULTADOS A. Proliferación de linfocitos T CD4+ El primer objetivo fue determinar la dosis de LG adecuada, para inducir presentación de antígeno y proliferación de linfocitos T antígeno específicos en el modelo murino de inoculación en piel. Para esto se enriquecieron linfocitos T CD4+ específicos para LG de ratones 3A9 transgénicos (I-Ak) y se marcaron con CFSE para transferirlos a ratones B10BR (I-Ak), con la finalidad de que un porcentaje importante de linfocitos T CD4+ correspondieran al TCR transgénico, lo que permitiría su seguimiento, pero al mismo tiempo, tener un repertorio diverso de linfocitos T. Primeramente, enriquecimos linfocitos T CD4+ de ratones 3A9, mediante panning, obteniendo una pureza del 95%. Estas células fueron marcadas con CFSE y transferidas a ratones B10BR vía i.v. en una volumen de 100 μl, 5x106 células/ratón. Al día siguiente, se administró vía intradérmica en la oreja del ratón, PBS y LG, esta última en dosis de 0.3, 1, 3 y 10 μg y después de 72 horas se obtuvieron los ganglios linfáticos de drenaje (GLd), cervicales y distales para determinar por citometría de flujo, la dilución de la CFSE que correlaciona con la división de los linfocitos T. Vβ a) 8.2 PBS 11 % 0.3 μg 76 % 1 μg 3 μg 91% 93 % 10 μg 97 % CFSE Figura 5. Proliferación de linfocitos T CD4+ Vβ 8.2+ con diferentes dosis de antígeno vía intradérmica en oreja. Se transfirieron 5x106 linfocitos T CD4+ de ratones 3A9 marcados con CFSE a B10BR vía i.v. 24 horas después se inoculó por vía intradérmica en la oreja 0.3,1, 3 y 10 μg/ml de LG. Células CD4+ CFSE+ Vβ 8.2+ en el nódulo linfático de drenaje 3 días después de inmunizado el ratón. Los diagramas de puntos e histogramas son representativos de al menos 2 experimentos independientes. 22 En la figura 5, se puede observar que a partir de la administración de dosis muy bajas de antígeno (0.3μg), se logra inducir una tasa de proliferación de linfocitos T CD4+ Vβ+ 8.2. La administración de PBS induce un basal de proliferación, pero sin hacerse evidentes los ciclos del mismo. En cambio, desde la administración de 0.3 μg y hasta 10 μg dichos ciclos de proliferación son detectados, y el número de células en las últimas rondas de proliferación, aumenta de manera proporcional a la dosis administrada. De tal forma que la administración de 0.3 μg de LG, indujo una proliferación del 76% de las células CFSE+ Vβ8.2 que al menos se dividieron una vez. Para 1μg de LG, la proliferación resultante fue del 91%, donde observamos células con un mayor número de divisiones. Después de la administración de 3 y 10 μg de LG se observan un 93 y 97% de células en división respectivamente. Con 10μg de antígeno (LG) se obtiene prácticamente el máximo de proliferación. 0.3 μg 1 μg 3 μg 10μ g Distal Cervical Drenante PBS CFSE Figura 6. Proliferación de linfocitos T CD4+ Vβ 8.2+ en diferentes ganglios linfáticos. Se transfirieron 5x106 linfocitos T CD4+ de ratones 3A9 marcados con CFSE a B10BR vía i.v. 24 horas después se inoculó por vía i.d. 0.3, 1, 3 y 10 μg/ml de LG. Proliferación de linfocitos T CD4+ CFSE+ Vβ 8.2+ en diferentes ganglios linfáticos, cuando se administran dosis crecientes de LG. Los diagramas de puntos e histogramas son representativos de al menos 2 experimentos independientes. 23 Cuando se analizo la proliferación de los linfocitos T LG específicos en los GLd al sitio de inoculación en comparación con el resto de los ganglios (figura 6), observamos que en los primeros, la proliferación es mayor en todas las dosis administradas y que las células se encuentran principalmente en los últimos ciclos de proliferación, a diferencia los otros ganglios, en donde la mayoría de células se encuentran en los primeros ciclos de proliferación. De manera importante, las células que proliferan son escasas en el resto de los ganglios cuando se administran bajas dosis de antígeno comparado con lo observado en los GLd. Estos resultados indican que la vía de inoculación i.d. de bajas dosis de LG en la oreja del ratón, es eficiente para inducir proliferación de linfocitos T antígeno específicos y esta parece estar restringida a los ganglios que drenan el sitio de inoculación. B. Efecto adyuvante en la proliferación de linfocitos T CD4+ antígeno específicos. Una vez determinada la dosis de LG adecuada para la presentación de antígeno y proliferación de los linfocitos T antígeno específicos, decidimos evaluar el efecto que podría inducir la administración de distintos adyuvantes en conjunto con el antígeno, en la proliferación de linfocitos T CD4+. Para determinar este efecto, se enriquecieron nuevamente linfocitos T CD4+, y se marcaron con CFSE. Se transfirieron 5x106 células a ratones B10BR. Después de 18 horas, se administro PBS, LG, LG+LPS y LG+CT vía intradérmica en la oreja del ratón y 72 horas después, se obtuvieron los ganglios drenantes y distales para determinar la dilución de CFSE por citometría de flujo (figura 7). 24 TC LPS LG PBS Figura 7. Proliferación de linfocitos T CD4+ en ganglios linfáticos cuando se administran diferentes adyuvantes. Transferimos 5x106 linfocitos T CD4+ de ratones 3A9 marcados con CFSE a B10BR vía i.v. y 24 horas después, fueron inmunizados vía intradérmica con 1μg de LG, LG+LPS o LG+TC. 72 horas después se colecta el ganglio drenante y distal y se determina la proliferación de células CD4+ CFSE+, Vβ 8.2+. Los histogramas son representativos de al menos 2 experimentos independientes. Cuando administramos LG mezclada con los distintos adyuvantes ya sea LPS o TC por vía i.d en la oreja, observamos que la mayoría de las células CD4+ CFSE+ Vβ8.2 obtenidas de el GLd, se encuentran en los últimos ciclos de proliferación comparado con la administración de LG sola. Este no es el caso para las células que se encuentran en los ganglios distales, ya que LG sola mostró más células proliferantes que LPS y TC. De manera importante este último se observan prácticamente la mayoría de células CFSE+ sin proliferar. Estos resultados indican que la co-administración de LG y un adjuvante impacta en la proliferación de los linfocitos T específicos y esto se observa solamente en los GLd al sitio de inoculación. C. Expresión de MHC-II, CD86 y CD40 en células de Langerhans de ratones B10BR transferidos. Una vez que determinamos incremento de proliferación por el efecto adyuvante en el GLd, se determinó in situ en la piel del ratón, las diferencias que existen en CL, cuando administramos el antígeno solo o en conjunto con distintos adyuvantes. 25 Una vez transferidos linfocitos T CD4+ CFSE+ de ratones 3A9 a ratones B10BR en mismo número que en experimentos anteriores. Se administró 18 horas después PBS, LG, y LGL en combinación con TC, Poli I:C, αCD40 y una mezcla de Poli I:C/αCD40. Después de 24 horas, se obtuvieron las orejas de los ratones inoculados, las cuales fueron tratadas con EDTA 0.5M. Posteriormente se aislaron las láminas epidérmicas y se determino la expresión y distribución de MHC-II (3a) CD40 (3b) y CD86 (3c) por inmunofluorescencia. PBS Poly I:C LG TC αCD40 Poli I:C/ αCD40 Figura 8. Expresión y distribución de MHC-II en células de Langerhans de ratones B10BR transferidos con linfocitos T CD4+. Linfocitos T CD4+ de ratones 3A9 son enriquecidos y transferidos a ratones B10BR en una cantidad de 5x106 células/ratón, Después de 24 horas son inmunizados vía i.d. en la oreja del ratón con PBS, HEL 1μg, CT 1μg, Poli I:C 1 μg αCD40 2μg y una mezcla de Poli I:C/αCD40 1μg/2μg respectivamente. Al día siguiente son aisladas las orejas tratadas con EDTA 0.5M por 2 horas y después con PBS el mismo tiempo. Después de separar la epidermis mecánicamente, es fijada con Acetona -20 °C. La tinción se realiza con MHC-II Alexa 488, para determinar la distribución de esta molécula. La observación se realiza a 40X. A) y C) 100X, en un microscopio confocal Carls Zeiss. Las imágenes que se muestran son representativas de al menos 3 experimentos independientes. 26 En la figura 8, podemos observar imágenes de CL en la epidermis de ratones inoculados con diferentes adyuvantes. La administración de PBS y LG muestran una expresión de MHC-II muy semejante entre sí, con una distribución uniforme en las células. De manera importante, cuando se administra TC la distribución de MHC II se localiza principalmente en el centro de la célula y prácticamente, no se observan las dendritas. Después de la administración de Poli I:C, se observa expresión de MHC-II en toda la célula, tanto en cuerpo como en dendritas, pero con mayor abundancia en el primero. Tanto en los ratones administrados con αCD40, como la mezcla de éste con Poli I:C, mostraron una distribución distinta a la TC, ya que la molécula de MHC-II se expresa en toda la célula, pero principalmente en las dendritas, que se perciben de mayor tamaño. Además de los cambios observados en la distribución de MHC-II de cada condición, se determinó la expresión de CD86 y CD40 en las láminas epidérmicas. En la figura 9, se observa que en los casos donde administramos PBS y LG, no se expresa la molécula CD40 a diferencia de cuando se administra TC, en donde se observa CD40 colocalizando con MHC-II en el centro de la célula. La expresión de CD40, también se pudo observar con la administración conjunta de Poli I:C/αCD40 colocalizando con MHC-II en áreas centrales de las células. Cuando se evaluó la expresión de CD86 (figura 10), no se observó expresión de esta molécula al administrar PBS o LG. En el caso de TC, la molécula de CD86, co-localiza nuevamente en el centro de la célula con MHCII. Poli I:C/αCD40, induce la expresión de CD86 en toda la célula, aunque en menor intensidad que la TC. 27 MHC-II CD40 COMBINACIÓN PBS LG TC Poli I:C /αCD40 8. Expresión y distribución de MHC-II y CD40 en células de Langerhans de ratones B10BR transferidos con linfocitos T CD4+. Linfocitos T CD4+ de ratones 3A9 son enriquecidos y transferidos a ratones B10BR en una cantidad de 5x106 células/ratón, Después de 24 horas son inmunizados vía i.d. en la oreja del ratón con PBS, LG 1μg, TC 1μg y una mezcla de Poli I:C/αCD40 1μg/2μg respectivamente. Al día siguiente son aisladas las orejas tratadas con EDTA 0.5M por 2 horas y después con PBS el mismo tiempo. Después de separar la epidermis mecánicamente, es fijada con Acetona -20 °C. La tinción se realiza con MHC-II Alexa 488 y CD86. La observación se realiza a 40X, en un microscopio confocal Carl Zeiss. Las imágenes que se muestran son representativas de al menos 3 experimentos independientes. 28 MHC-II CD86 COMBINACIÓN PBS LG TC Poly I:C/ CD40 Figura 10. Expresión y distribución de MHC-II y CD86 en células de Langerhans de ratones B10BR transferidos con linfocitos T CD4+. Linfocitos T CD4+ de ratones 3A9 son enriquecidos y transferidos a ratones B10BR en una cantidad de 5x106 células/ratón, Después spués de 24 horas son inmunizados vía i.d. en la oreja del ratón con PBS, LG 1μg, TC 1μg y una mezcla de Poli I:C/αCD40 1μg/2μg respectivamente. Al día siguiente son aisladas las orejas tratadas con EDTA 0.5M por 2 horas y después con PBS el mismo tiempo. Después de separar la epidermis mecánicamente, es fijada con Acetona -20 °C. La tinción se realiza con MHC-II Alexa 488 y CD86 PE. La observación se realiza a 100X, en un microscopio confocal Carl Zeiss. Las imágenes que se muestran son representativas de al menos 3 experimentos independientes. 29 Estos resultados indican que la administración de LG en combinación con los distintos adyuvantes y en particular con la TC induce activación de las células dendríticas de la piel a diferencia de la LG sola en la que no se perturba el fenotipo basal de las células dendríticas de la piel. D. Expresión de citocinas Th1/Th2/Th17 en linfocitos T CD4 + de ratones B10BR transferidos. Posteriormente, se evaluó si el impacto en la proliferación de las células T LG específicas y la activación de las CL observada de acuerdo al adyuvante utilizado, podían ser determinantes, en el tipo de respuesta inmune inducida. Utilizando el modelo descrito, se enriquecieron y se transfirieron linfocitos T CD4+ de ratones 3A9 específicos para LG a ratones B10BR. Después de 24 horas se administró por vía i.d. en la oreja PBS, LG, LG+TC, LG+Poli I:C y LG+Poli I:C/αCD40. Después de 72 horas, se obtuvieron los GLd y se purificaron linfocitos T CD4+ por panning, colocándolos en co-cultivo con CD de ratones B10BR previamente incubadas con LG 18 horas antes. Después de 12 horas de cultivo se colectó el sobrenadante y se determinaron las citocinas en los sobrenadantes de cultivo por CBAs. En la figura 11, podemos observar en barras blancas, que en los sobrenadantes de los co-cultivos de linfocitos T CD4+ con células dendríticas CD11c+ sin LG, prácticamente no se observa ninguna de las citocinas evaluadas ya que los valores son inferiores a 20 pg/ml (límite de detección del ensayo), a excepción de TNF-α para el que se detectaron valores de 50 a 100 pg en las distintas condiciones, y particularmente en el caso de la inmunización del antígeno con la mezcla Poli I:C/αCD40, se observaron valores de 300 pg/ml cuando los linfocitos T fueron re-estimulados in vitro con CD en ausencia de antígeno. 30 a) b) IL-2 4000 500 *** 400 *** 300 200 ** *** *** 3000 pg/mL pg/mL Sin re-estímulo Re-estimulado IFN-γ 2000 *** 1000 100 PB S H EL aC D Po C 40 l T /P y I ol :C y I:C aC D Po CT 40 ly /P I : ol C y I:C PB S H EL aC D Po CT 40 ly /P I : ol C y I:C PB S H EL IL-17 f) c) 150 PB S H EL aC D Po C 40 l T /P y I ol :C y I:C 0 0 TNF-α 500 400 pg/mL *** 50 pg/mL *** 100 *** 300 200 100 0 8 6 6 S EL aC D Po C 40 l T /P y I ol :C y I:C 0 PB 0 PB 2 PB S H EL aC D Po C 40 l T /P y I ol :C y I:C 2 S EL D Po C 40 l T /P y I ol :C y I:C 4 H pg/mL 8 4 PB S H EL aC D Po C 40 l T /P y I ol :C y I:C IL-5 10 PB S H EL aC D Po C 40 l T /P y I ol :C y I:C pg/mL PB S H EL aC D Po C 40 l T /P y I ol :C y I:C e) IL-4 10 aC d) H D Po CT 40 ly /P I: ol C y I:C PB S H EL aC aC PB S H EL D Po CT 4 0 ly / P I: ol C y I: C 0 + Figura 11. Expresión de citocinas Th1/Th2/Th17 en linfocitos T CD4 de ratones B10BR + transferidos. Linfocitos T CD4 de ratones 3A9 son enriquecidos mediante panning y transferidos a ratones B10BR en 5x106 células/ratón. Después de 24 horas se administró a diferentes grupos: PBS, LG 1 μg sola o mezclada con TC 1μg, Poli I:C 1μg o Poli I.C/αCD40 1μg/2μg respectivamente. 72 horas después, se obtienen los linfocitos T CD4+ de los ganglios drenantes y se cocultivan con células dendríticas CD11c+ solas o cargadas con LG 1μg en los pozos, en proporción 3:1. Después de 12 horas de estimulación se colecta el sobrenadante y se determina la expresión de citocinas por CBAs. La media y desviación estandar se calcularon a partir de 3 experimentos independientes n=3. 31 Las barras negras, muestran las citocinas producidas en el co-cultivo de linfocitos T CD4+ provenientes de ratones inoculados con diferentes condiciones experimentales y co-cultivados con CD CD11c+ en presencia de LG. Se puede observar que la producción de distintas citocinas es nula cuando los linfocitos T provienen de ratones inoculados con PBS o LG. En contraste cuando los ratones fueron inmunizados con LG en combinación con TC o con una mezcla de Poli I:C/aCD40 se obtiene una expresión significativa tanto de IL-2 como de TNF-γ. La citocina que se expresó en mayor cantidad en los ratones inmunizados con LG en combinación con TC fue IFN-γ. Se observó también una expresión significativa de esta citocina en ratones inmunizados con TC y la mezcla de Poli I:C/αCD40. La expresión de IFN-γ fue mayor es las condiciones mencionadas comparada con la expresión por la inoculación de LG y Poli I:C. Tomando en cuenta que la TC es un adjuvante que predominantemente induce repuesta celular tipo Th2 en mucosas, se evaluaron los sobrenadantes de cultivo para determinar citocinas del tipo Th2. Como se puede observar en la figura 11D y 11F no se detectaron valores por encima del nivel de detección del ensayo para IL-4 e IL-5. De manera importante en los sobrenadante de cocultivo de linfocitos T CD4+ y CD incubadas con LG se observó expresión de IL-17 con valores de100 pg/mL en el caso de los ratones inmunizados con TC y Poli I:C/aCD40. Estos datos indican que la administración de LG por vía i.d. en la oreja, induce proliferación de linfocitos T CD4+ específicos para LG pero no es suficiente para inducir secreción de citocinas en los ratones B10BR transferidos. En contraste, la administración de LG con TC induce la expresión de citocinas Th1/Th17. El mismo resultado se obtuvo al utilizar como adjuvante la mezcla de Poli I:C/aCD40 sugiriendo que la inoculación i.d en oreja se traduce en la inducción de una respuesta con citocinas tipo Th1/Th7 sobre Th2. 32 E. Determinación de citocinas Th1/Th2/Th17 en ratones Balb/c. De acuerdo al perfil de citocinas obtenido en ratones B10BR transferidos e immunizados con LG en combinación con TC, decidimos determinar las citocinas secretadas en ratones Balb/c bajo el mismo esquema de immunización, ya que este fondo genético ha sido reportado para establecer perfiles Th1/Th2. Al igual que el modelo murino de 3A9-B10BR, Los ratones Balb/c fueron transferidos vía i.v. con 5x106 linfocitos T CD4+ de ratones DO11.10 TCR específicos para OVA. La pureza de los linfocitos T CD4+ fue del 95%. Al día siguiente, se administraron vía i.d., PBS, OVA y OVA+TC y 72 horas después, obtuvimos las células del ganglio drenante. Estas células se co-cultivaron con CD de ratones Balb/c incubadas con OVA 18 horas antes. Después de 12 horas, se colectaron los sobrenadantes y se determinaron las citocinas en los sobrenadantes de cultivo por CBAs. Los linfocitos T de los ratones Balb/c transferidos con linfocitos T CD4+ específicos para ovoalbúmina, no secretan IL-2 e IFN-γ cuando se administra PBS u OVA. En contraste y similar a lo obtenido con los ratones B10.BR los ratones Balb/c transferidos e inmunizados con OVA en combinación con TC expresan cantidades significativas de IL-2 e interesantemente de IFN-γ, (figura 12 b). Se obtuvo expresión de TNF-α en todas las condiciones evaluadas siendo significativamente mayor en los linfocitos T CD4+ de los ratones inmunizados con OVA y TC. Sorprendentemente aunque se obtuvieron diferencias significativas en la producción de IL-4 e IL-5 en los ratones inmunizados con OVA y TC, los valores son inferiores a los niveles detectados por el ensayo. AL igual que en los ratones B10.BR transferidos, se obtuvo una expresión importante de IL-17 en los ratones Balb/c transferidos inmunizados con OVA y TC (Figura 12f). 33 b) IL-2 2000 400 pg/mL O C T PB C T O VA PB S O VA PB S C T d) TNF-α VA 0 S 0 O 500 PB 100 C T 1000 S pg/mL 200 *** 1500 *** 300 c) Sin reestimular Re-estimulado IFN-γ VA a) IL-4 10 1500 8 *** pg/mL pg/mL 1000 6 ** 4 500 2 f) IL-5 C T O VA PB S IL-17 250 *** 200 T PB S O VA T C O VA C PB S 0 T 0 O VA 50 PB S 2 T 100 C *** VA 4 150 O 6 PB S pg/mL 8 C 10 pg/mL C T PB S C T VA O PB S C T VA O PB S e) O VA 0 0 Figura 12. Expresión de citocinas Th1/Th2/Th17 en linfocitos T CD4+ de ratones Balb/c transferidos. Linfocitos T CD4+ de ratones DO11 específicos para Ovoalbúmina, son enriquecidos mediante panning y transferidos a ratones Balb/c en 5x106 células/ratón. Después de 24 horas se administra a diferentes grupos:PBS, LG 1 μg sola o mezclada con TC 1μg y 72 horas después se obtienen los linfocitos T CD4+ de los ganglios drenantes, los cuales se cocultivan con células dendríticas CD11c+ de ratones Balb/c que fueron cargadas o no con OVA 1μg en los pozos correspondientes, con una proporción de 3:1. Después de 12 horas de estimulación se colecta el sobrenadante y se determina la expresión de citocinas por CBAs. . La media y desviación estandar se calcularon a partir de 3 experimentos independientes n=3. 34 Con estos resultados, es posible establecer que la inmunización i.d. en la oreja, de dos diferentes antígenos, en dos diferentes fondos genéticos en combinación con TC, induce expresión de citocinas con un perfil Th1/Th17. F. Expresión de citocinas después de la inmunización por diferentes vías de inoculación. Una vez establecido el perfil de citocinas expresado por los linfocitos T CD4+ específicos provenientes de ratones inmunizados con LG u OVA en combinación con TC y otros adyuvantes, fue importante determinar si la respuesta inducida por la inmunización en piel (oreja) era similar a la inducida por otras vías de inoculación. Para esto, nuevamente se transfirieron linfocitos T CD4+ de ratones 3A9 y 24 horas después, se administró PBS, LG y LG+TC por 3 vías de inoculación: vía intradérmica en la oreja del ratón, vía subcutánea en cojinete plantar y vía intraperitoneal. La administración de LG se hizo inicialmente con 0.3μg de LG con y sin TC (figura 13). Posteriormente se utilizó 1μg de LG (figura 14 y 15), tres días después de la inoculación se obtuvieron los GLd al sitio de inocuación y se purificaron linfocitos T CD4+, que fueron co-cultivados con CD previamente incubadas con LG. Como se puede observar en la figura 13, la sola administración de 0.3 μg de LG por vía intradérmica, es suficiente para inducir proliferación del 55% de los lifocitos T específicos. No ocurre así, cuando el antígeno es inoculado por vía subcutánea o intraperitoneal, en los que se obtienen porcentajes de linfocitos T en proliferación de 18% y 16% respectivamente. A pesar de que la inoculación de 0.3μg de antígeno con TC, incrementa la proliferación en todas las vías, solo se observan las últimas rondas de proliferación cuando se inocula por vía intradérmica. La administración de 3 μg de LG, induce una proliferación similar en todas las vías de incolulación. 35 0 3 μg + TC 0.3 μg a) 3 μg 16% 43% 94% 18% 39% 93% 55% 86% 94% 3% 3% 3% i.p. s.c. i.d. PBS CFSE Figura 13. Proliferación de linfocitos T CD4+ cuando se administra el antígeno en diferentes vías de inoculación. Linfocitos T CD4+ de ratones 3A9 son enriquecidos mediante panning y transferidos a ratones B10BR en 5x106 células/ratón. Después de 24 horas se administra a diferentes grupos: PBS, LG 1 μg sola o mezclada con TC 1μg en 3 diferentes vías. Intradérmica en la oreja del ratón, subcutánea en cojinete plantar e intraperitoneal. 72 horas después se obtienen linfocitos T CD4+ para determinar proliferación por citometría de flujo con CD4+ Vβ8.2+. Los datos mostrados, son representativos de al menos 3 experimentos independientes. De acuerdo con lo anterior, decidimos administrar 1 μg de LG en las distintas vías de inoculación en combinación con TC para determinar si hay diferencias en la secreción de citocinas. LG TC i.p. s.c. i.d. PBS Figura 14. Proliferación de linfocitos T CD4+ con 1 μg de LG en diferentes vías de inoculación. Linfocitos T CD4+ de ratones 3A9 son enriquecidos mediante panning y transferidos a ratones B10BR en 5x106 células/ratón. Después de 24 horas se administra a diferentes grupos: PBS, LG 1 μg sola o mezclada con TC 1μg en 3 diferentes vías. Intradérmica en la oreja del ratón, subcutánea en cojinete plantar e intraperitoneal. 72 horas después se obtienen linfocitos T CD4+ de GLd y se determina proliferación mediante dilución de CFSE. Los datos mostrados, son representativos de al menos 3 experimentos independientes. 36 En la figura 14, se puede observar la proliferación cuando se administra 1 μg de antígeno solo o mezclado con TC la cual es similar para la inmunización i.d. en oreja e i.p. y ligeramente menor en el caso de la inoculación subcutanea. El adyuvante incrementó en todos los casos el porcentaje de células en los últimos ciclos de división. Interesantemente, cuando determinamos, que citocinas se expresaban, estas solamente fueron detectadas por la inoculación vía i.d. en la oreja, no así, en vía subcutánea e intraperitoneal a pesar de la proliferación celular observada. IL-2 IFN 200 600 400 pg/mL 100 200 50 C T i.p . EL C T H i.p . s. c. EL H C T s. c. i.d . H EL i.p .C T s. c. C T i.p .H EL s. c. H EL 0 i.d .C T i.d .H EL 0 i.d . pg/mL 150 TNF 400 pg/mL 300 200 100 i.p .C T s. c. C T i.p .H EL s. c. H EL i.d .C T i.d .H EL 0 Figura 15. Expresión de citocinas cuando se administra el antígeno en diferentes vías de inoculación. Linfocitos T CD4+ de ratones 3A9 son enriquecidos mediante panning y transferidos a ratones B10BR en 5x106 células/ratón. Después de 24 horas se administra a diferentes grupos: PBS, LG 1 μg sola o mezclada con TC 1μg en 3 diferentes vías. Intradérmica en la oreja del ratón, subcutánea en cojinete plantar e intraperitoneal. 72 horas después se obtienen linfocitos T CD4+ de los GLd y se co-cultivan con células dendríticas CD11c+ que fueron cargadas con LG 1μg, en una proporción de 3:1. Después de 12 horas de estimulación se colecta el sobrenadante y se determina la expresión de citocinas por CBAs. . La media y desviación estándar se calcularon a partir de 3 experimentos independientes n=3. 37 La expresión de IL-2 e IFN-γ, fueron detectadas después de la inmunización con LG+TC. Para el caso de TNF-a, encontramos nuevamente concentraciones altas en todas las vías administradas aunque la mayor expresión se determino después de la inoculación i.d. en la oreja. Lo anterior sugiere, que la inoculación por vía intradérmica en la oreja del ratón, es más eficiente para inducir respuesta inmune con bajas dosis de antígeno, comparada con otras vías de inoculación. G. Efecto adyuvante de Subunidad B de TC. Debido a que la administración de TC induce una fuerte inflamación en la oreja del ratón cuando se administra vía i.d., decidimos determinar si la subunidad B de toxina de cólera (BTC) -que es la fracción no tóxica- produce los mismos efectos adjuvantes que la toxina completa. Para esta determinación se utilizo el modelo B10BR-3A9, transfiriendo 5x106 células/ratón. Después de 24 horas, se administro LG+TC y LG+ BTC al grupo de ratones correspondientes, pasadas 6, 12 y 18 horas, se sacrificaron los ratones y se obtuvieron las láminas epidérmicas de los sitios inoculados para análisis de MHC-II y CD86 en células de Langerhans, mediante inmunofluorescencia (figura 16). Pasadas 72 horas obtuvimos linfocitos T CD4+ del ganglio drenante y se colocaron en co-cultivo con CD previamente incubadas con LG 18 horas antes. Después de 12 horas de re-estimulación se tomaron los sobrenadantes para determinar citocinas por CBAs (figura 17). 38 TC A) BTC 6h 12h 18h Figura 16. Cinética de distribución de MHC-II y CD86 en TC y BTC. Se transfieren 5 x106 linfocitos T CD4+ de ratones 3A9, a ratones B10BR células/ratón. Después de 24 horas se administra a diferentes grupos: PBS, LG 1 μg sola o mezclada con TC 1μg, o con BTC 1μg. Después de 6 12 y 18 horas se obtienen las láminas epidérmicas y se determina la expresión y distribución de MHC-II y CD86 por inmunofluorescencia. Los datos mostrados son representativos de al menos 3 experimentos independientes. En la figura 16, podemos observar las diferencias en inflamación del sitio de inoculación en la oreja cuando se administra TC comparado con la BTC. Cuando se evaluaron las células de Langerhans en las láminas epidérmicas se observó a las 6 horas después de la inoculación, que no existían diferencias importantes en la distribución de MHC-II en los ratones administrados TC o BTC. La expresión de CD86 es baja. A las 12 horas la distribución de MHC-II permanece sin cambios evidentes, pero la expresión de CD86 aumenta en TC. A las 18 horas de administrado el estímulo, la 39 distribución de MHC-II se incrementa con TC, localizándose particularmente en el centro de las células y de manera importante no hay expresión de esta molécula en las dendrítas, dando un aspecto esférico. Para BTC no hay variaciones en la distribución de MHC-II, incluso a tiempos mayores. La expresión de CD86 se incrementa ligeramente a 18 horas en ambas condiciones. Interesantemente, la inoculación del antígeno en combinación con BTC induce tanto la proliferación de los linfocitos T específicos para LG, como la expresión de citocinas. La producción de TNF-α e IFN-γ fue similar comparada con la inmunización de LG y la TC completa. Importantemente, en el caso de IL-17 se detectaron concentraciones mayores para BTC de 400 pg/ml, a diferencia de la toxina completa que dio valores de 150 pg/ml. IL-2 TNF-α 600 400 *** Sin re- estímulo *** Re estimulado *** 300 *** pg/mL pg/mL 400 200 200 100 C T C TB PB S H EL PB S H EL C T C TB PB S H EL PB S H EL C T C TB IL-17 IFN-γ 800 PB S H EL C T C TB 0 PB S H EL 0 C T C TB 200 PB S H EL 1000 C T C TB 400 PB S H EL pg/mL 2000 * 600 *** *** 3000 C T C TB 4000 pg/mL C T C TB 0 0 Figura 17. Importancia de BTC en la inducción de respuesta inmune. Se transfieren 5 x106 linfocitos T CD4+ de ratones 3A9, a ratones B10BR células/ratón. Después de 24 horas se administra a diferentes grupos: PBS, LG 1 μg sola o mezclada con TC 1μg, o con BTC 1μg. Después de 72 horas se obtienen los linfocitos T CD4+ de los ganglios drenantes y se co-cultivan con células dendríticas CD11c+ cargadas o no, con LG 1μg en una proporción de 3:1. Pasadas 12 horas, se colecta el sobrenadante y se determina la expresión de citocinas por CBAs. . La media y desviación estándar se calcularon a partir de 3 experimentos independientes n=3. 40 Estos resultados, sugieren que la BTC es capaz de inducir un efecto adjuvante similar a la de la toxina completa al ser co-administrada con LG por via i.d. en la oreja sin causar daño e inflamación al tejido. H. Importancia de las células dendríticas de la piel en la inducción de la respuesta inmune efectora después de la inmunización en piel. Una vez determinado que la vía de inmunización i.d en la oreja del ratón es más eficiente que el resto de las vías utilizadas, quisimos saber, la importancia de las células dendríticas de la piel en la inducción de la respuesta inmune efectora de tipo Th1/Th17. Para esto, se enriquecieron linfocitos T CD4+ de ratones 3A9, marcados con CFSE y se transfirieron 5x106 células/ratón. Después de 24 horas, se administro por vía i.d en la oreja del ratón PBS, LG, LG+TC y HEL+BTC, 2 horas después quitamos la oreja, y pasados 3 días obtuvimos los linfocitos T CD4+ del GLd y se determinó en un principio proliferación, y después del cocultivo, producción de citocinas por CBAs y tinción intracelular. Dejando el sitio Quitando el sitio 91% 94 % 96 % 85 % 2.5 % BTC TC LG 93% 61% 2.5 % PBS Figura 18. Las CD de la piel no son responsables de la proliferación de linfocitos T CD4+. Linfocitos T CD4+ de ratones 3A9 son enriquecidos mediante panning y transferidos a ratones B10BR en una cantidad de 5x106 células/ratón. Después de 24 horas se administra PBS, LG 1 μg sola o mezclada con TC 1μg o BTC 1μg. 90 minutos después de administrado el estímulo, se realiza anestesia local de la oreja y se quita, cauteriza la herida. 72 horas después se obtienen los linfocitos T CD4+ de los ganglios drenantes y se determina proliferación mediante CD4+ y Vβ 8.2+. Los datos mostrados son representativos de al menos 3 experimentos independientes. 41 En la figura 18 se puede observar, que la proliferación no se afectó al quitar la oreja 2 horas después de administrado el antígeno con el adyuvante. Ya que cuando se administro BTC o TC, el porcentaje de células en proliferación se mantuvo equivalente, 94% con el sitio de inoculación y 91% sin el sitio para BTC y de 96% a 93% para TC. En el caso de LG, la proliferación se afectó considerablemente, ya que disminuyó de 85% a 61%, por lo que no existen diferencias significativas. . Interesantemente, cuando determinamos las citocinas expresadas mediante CBAs y tinción intracelular el resultado fue inesperado, ya que todas las citocinas se abaten casi por completo cuando se quita el sitio de inoculación. a) 250 pg/mL 100 Site intact 0 d) Site excised IL-17 *** *** 400 60 pg/mL pg/mL Site intact 80 500 *** 200 40 *** 20 100 0 1000 Site excised TNF-α 300 *** 500 50 c) CTB CT HEL PBS *** 1500 150 0 IFN-γ 2000 *** *** 200 pg/mL b) IL-2 0 Site intact Site excised Site intact Site excised Figura 19. Importancia de las células dendríticas de la piel en la inducción de respuesta inmune efectora. Linfocitos T CD4+ de ratones 3A9 son enriquecidos mediante panning y transferidos a ratones B10BR en una cantidad de 5x106 células/ratón. Después de 24 horas se administra PBS, LG 1 μg sola o mezclada con TC 1μg o BTC 1μg. 90 minutos después de administrado el estímulo, se realiza anestesia local de la oreja y se quita, cauterizando la herida. 72 horas después se obtienen los linfocitos T CD4+ de los GLd y se cocultivan con células dendríticas CD11c+ cargadas con LG 1μg en una proporción de 3:1. Después de 12 horas de estimulación se colecta el sobrenadante y se determina la expresión de citocinas por CBAs. . La media y desviación estándar se calcularon a partir de 3 experimentos independientes n=3. 42 Para IL-2, las concentraciones disminuyeron significativamente de 200 a menos de 50 pg/ml para TC y BTC. Importantemente IFN-γ disminuyo dramáticamente de 1800 a menos de 50 pg/ml. TNF-α, también sigue el mismo comportamiento, disminuyendo en ambas condiciones, hasta valores menores a 20 pg/ml. Finalmente, IL-17 también se abate, pasando de 50 a menos de 10 pg/ml en TC y de 70 a 10 pg/ml en BTC. PBS a) CT CTB IFN-γ Site intact HEL Site exciced 90’ IL-17 D) Site intact Site excised 90’ Site excised 24 h CTB IL-17 Figura 20. Citocinas intracelulares en linfocitos T después de quitar el sitio de inoculación. Linfocitos T CD4+ de ratones 3A9 son enriquecidos mediante panning y transferidos a ratones B10BR en una cantidad de 5x106 células/ratón. Después de 24 horas se administra PBS, LG 1 μg sola o mezclada con TC 1μg o BTC 1μg. 90 minutos y 24 horas después de administrado el estímulo, se realiza anestesia local de la oreja y se escinde, cauterizando la herida. 72 horas después se obtienen los linfocitos T CD4+ de GLd y se co-cultivan con células dendríticas CD11c+ cargadas con HEL 1μg en una proporción de 3:1 con Brefeldin-A. Después de 12 horas de estimulación se colectan las células, y se determina la expresión de citocinas por tinción intracelular. Los datos mostrados son representativos de al menos 3 experimentos independientes. 43 En cuanto a la expresión de IFN-γ e IL-17 dentro de la propia célula, corroboramos los datos de obtenidos por CBAs, ya que las células productoras de IFN-γ pasan de 1.4% a 0.2% disminuyendo casi en su totalidad. Como puede observarse en la figura 20, los linfocitos T CD4+ a pesar de proliferar no son capaces de diferenciarse a células productoras de citocinas. Estos datos indican de manera importante, que las células dendríticas de la piel son indispensables en la inducción de respuesta inmune efectora después de la inoculación en piel. 44 Discusión Las DC tienen una función central en la respuesta inmune, ya que además de ser consideradas como células vinculantes entre el sistema inmune innato y el sistema inmune adaptativo, con base en la función de captura, procesamiento y presentación de antígeno que realizan; también se les ha considerado la capacidad de polarizar la respuesta de las células T hacia un fenotipo Th1, Th2 o Th17, de acuerdo a la producción de citocinas, como son IFN-γ y IL-12, IL-4 y 5 o IL-17 y IL-6 respectivamente (Demangel C, 2004, Geginat J, 2008). En esta década, además se le han reconocido otras funciones como la participación en el control de autoinmunidad y tolerancia, de acuerdo a su estado de maduración, en ausencia de expresión de moléculas coestimuladoras o por la expresión de moléculas co-inhibidoras en las CD como lo es B7-H1 o B7-DC que interactúan con la molécula PD-1 en linfocitos T (Turley S. 2002; Steinman. 2003). Finalmente, también se les ha catalogado como células con capacidades inmunorreguladoras, cuando se encuentran en presencia de IL-10 (Yang AS, 2003), o por secreción de TGF-β (Tada Y, 2004). Importante también es el número de subtipos de CD que se han determinado así como la distribución particular que tienen en el organismo. Su localización en la piel, así como ser una de las primeras barreras con las que se encuentran los patógenos, hace de las CD de la piel, candidatas importantes en el inicio de una respuesta inmune. Estas células y particularmente las CL desarrolladas in vitro, son las mejores en inducir proliferación de linfocitos T (Romani N,1989; Schuler G; 1985). Por estas razones, la inmunización en piel, representa una excelente opción para determinar las características de la respuesta inmune, que puedan ser clave en el tratamiento y prevención de una multitud de afectaciones que aquejan al ser humano asi como en el desarrollo de nuevas vacunas. 45 En este trabajo se utilizó el modelo de inoculación intradérmica en la oreja, en ratones B10BR transferidos con linfocitos T CD4+ específicos para HEL. El hecho de que en este modelo podamos determinar una proliferación de casi el 80% de células al tercer día de administrado el Ag, con solo 0.3 μg por vía i.d. es un resultado que hay que destacar, ya que corrobora primeramente la sensibilidad de la piel a la administración de antígenos, presumiblemente debido a las CD que la conforman, y la importancia que tienen en la presentación de antígeno y subsecuente proliferación de linfocitos T. La administración intradérmica que realizamos en este modelo, utiliza una cantidad de antígeno menor, comparada con la administración por vía epicutánea en donde se quita el estrato corneo, en donde se utilizan hasta 100 μg de proteína para inducir dicho estímulo (Strid J, 2004). Esto indica, que la vía i.d. en la oreja del ratón al parecer, evita la difusión del Ag, concentrándolo y haciendo más eficiente la captura por las CD de la piel para su posterior transporte a los glanglios que drenan al sitio de inoculación donde se llevara la presentación de antígeno, la proliferación de células T y el inicio de una respuesta inmunológica. Un dato interesante fue que al utilizar dosis altas de antígeno (1-10 μg) se observo proliferación sistémica en los diferentes ganglios analizados a diferencia de dosis bajas, en la que la proliferación es principalmente local. Este efecto se hace más evidente cuando administramos bajas dosis de antígeno en conjunto con TC en donde la proliferación se observa prácticamente solo en los ganglios drenantes al sitio de inyección. En nuestro estudio, utilizamos adyuvantes que actúan en inmunidad innata a través de la interacción con TLRs estimulando la producción de citocinas Th1 como lo es Poli I:C, también utilizamos adyuvantes que se han establecido como inductores de respuesta Th2 como toxina de cólera, y anticuerpos que simulan la interacción CD40-CD40L entre los linfocitos T activados y las CD, como lo es el αCD40 que se ha determinado rompe tolerancia inmunológica cuando es co-inyectado con el Ag acoplado a DEC205 (Bonifaz L, 2004). 46 Los datos de microscopía confocal nos muestra la distribución que tiene la molécula MHC clase II en láminas epidérmicas, después de administrado el antígeno vía i.d en la oreja con los distintos adyuvantes así como la expresión de CD86 y CD40. Los datos nos muestran que la sola administración de antígeno no activa las CL, ya que la expresión de MHC-II es equivalente a la administración de PBS, y la expresión de CD80 y CD40 es prácticamente nula en esta condición. De manera interesante, las CL modifican por completo el patrón de expresión de MHC-II, ubicándose solo en el cuerpo de la célula y no en las dendritas, lo que da un aspecto esférico, también hay expresión de CD86 y CD40 e importantemente estas dos moléculas colocalizan con MHC-II. Esta particular expresión de MHC-II con TC, podría ser debida al efecto tóxico que tiene esta toxina en las células por la trasformación de ATP a AMPc (Holmgren J. 1981). La mezcla poli I:C/αCD40, también activa las CL. Pero el patrón de expresión de MHC-II se observa de manera contraria a TC, localizándose en toda la célula, dando un aspecto de mayor dimensión a la célula. Al igual que la TC, la expresión de CD86 y CD40 se hacen evidentes, pero en menor intensidad, y colocalizan también con la molécula de MHC-II en ciertas regiones de la célula (Figura 2c) esta combinación de adyuvantes al parecer no es tóxica y estimula importantemente al sistema inmune. Cuando determinamos, si estas diferencias en la distribución de MHC clase II y en la expresión de CD80 y CD86 tenían alguna repercusión en la producción de citocinas por los linfocitos T previamente transferidos, encontramos que todos los adyuvantes administrados, inducen la expresión de citocinas con un perfil TH1, pero en diferentes concentraciones. Primeramente es importante observar que la producción de citocinas es detectada solamente cuando se aplica un re-estímulo antígeno específico a la célula, es decir, no existe un basal de estas citocinas en las células cuando se extraen del ganglio. 47 De los adyuvantes administrados, la TC y la mezcla Poli I:C/αCD40 inducen una mayor producción de citocinas, encontrándose IL-2 y TNF-α, IFNγ, este último, en mayor concentración. Tanto IL-4 e IL-5 se encontraron en valores por debajo del límite de detección. Interesantemente, también se observo la producción de IL-17, aunque a tiempos más tardíos (24hr) y en menor concentración que IFN-γ, este dato correlaciona con reportes publicados en los que se detecta producción de IL-17 con TC dependiente de IL-6 (Lee J, 2009). Sin embargo, también ha sido reportado que TGF-β es importante para la diferenciación a células T productoras de IL-17 (Mangan, P, 2006) Estos resultados son diferentes a lo establecido para TC por otras vías de administración, en donde se ha reportado que induce polarización Th2 o una mezcla Th1/Th2 (Yamamoto S, 1997; Xu-Amano J, 1993; Simecka JW, 2000; Marinaro M, 1995). Estos experimentos concuerdan con reportes en los que se establece respuesta Th1 después de la inmunización en piel. (King, I. 2007; Hervouet, C.2008). Aunque la mayoría de estudios que reportan una respuesta inmune Th2 cuando se administra TC por vía nasal u oral, han sido realizados en ratones Balb/c (I-Ad) (Yamamoto S, 1997; Xu-Amano J, 1993; Simecka JW, 2000; Marinaro M, 1995), la expresión de citocinas producidas en el modelo transgénico para OVA DO11-BAlb/c, son equivalentes al modelo 3A9-B10BR es decir, este tipo de RI tipo Th1 con TC y poli I:C/αCD40 es independiente del antígeno y del fondo genético utilizado. Interesantemente, cuando comparamos la vía de inoculación i.d. en la oreja con las vías subcutánea en cojinete plantar y la vía intraperitoneal, solo la administración de LG 0.3 μg por vía i.d. pudo inducir proliferación de linfocitos T en el ganglio de drenaje. A pesar de que la administración de 1 μg de LG + TC, logró inducir y equiparar las rondas de proliferación en todas las vías de inoculación, solo la vía intradérmica pudo producir la diferenciación de linfocitos T a producir citocinas después de la re-estimulación anatígeno específica. Este proceso puede deberse a la baja cantidad de antígeno administrado, el cual al inocularse en tejido adiposo o subcutáneo, es suficiente para inducir 48 proliferación, pero no la diferenciación de los linfocitos T. Otra explicación posible, es que en la oreja la captura del antígeno por las células dendríticas que migran al nodulo linfatico tiempo después pudo hacer posible una segunda oleada del antígeno en el ganglio drenante y esto ser determinante en la diferenciación y producción de citocinas por los linfocitos T. (Sen. D, 2010) Se ha reportado que existe diferencias en el tipo de respuesta immune inducida por TC, cuando se administra la subunidad B o A de toxina de cólera, en donde se afirma que la ATC dirige principalmente una respuesta Th2 a diferencia de BTC que induce una respuesta Th1(Anjuere F, 2003.) y que esta respuesta puede ser protectora. (Areas, A. P., 2005). Nuestros resultados muestran, tipos de respuesta equivalentes cuando se administra CT o la fracción BTC, en ambos casos se expresaron las citocinas IFN-γ e IL-17. De manera importante, los efectos de TC y BTC son diferentes. La administración de TC realiza redistribución de MHC-II que se hace evidente a partir de las 18 horas de aplicado el estímulo, hasta las 48 horas. En el caso de BTC esta distribución no es evidente en ningún tiempo, y la expresión de CD86, no varía de una a otra condición. Estos hallazgos son importantes ya que se podría en un futuro utilizar a BTC no toxica en la inducción de respuesta inmune en piel. Finalmente como se observa en la figura 8, la inducción de linfocitos T CD4+ productores de IFN-γ e IL-17, fue dependiente de las CD migrantes de la piel que llegan en los primeros 90 minutos después de la inmunización. No así, la proliferación, la cual no se afectó de manera importante. Esto sugiere, que aunque una parte del antígeno pudo difundir de manera libre a través de los vasos linfáticos hasta el ganglio drenante de manera independiente del transporte de las CD de la piel (Sixt M, 2005), esto no fue suficiente para la inducción de una respuesta inmune eficiente. La coadministración de TC y BTC, a pesar de incrementar las rondas de proliferación cuando se administraba con HEL hasta ciclos de diferenciación, no es suficiente para producir IL-2, TNF-α, IFN-γ e IL-17, las cuales se abaten prácticamente en su totalidad al quitar el sitio de inoculación a los 90 minutos. 49 Cuando el sitio es retirado 24 horas después de administrar el antígeno, las citocinas producidas son equivalentes a los ratones en los que no se quitó el sitio de inoculación, esto puede implicar, que las CD dermales las cuales migran en los primeros 90 minutos después del estímulo, al ganglio linfático sean las células encargadas de llevar el antígeno de la piel en una segunda oleada y que esto permita la diferenciación y subsecuente polarización de los linfocitos T CD4+ (Sen D PNAS 2010). Estos resultados sugieren que la eficiente respuesta de células T CD4+ después de la inmunización en piel, requiere la presentación inicial del antígeno por las CD del ganglio linfático de drenaje y posteriormente una segunda presentacióo de células que lleguen en la primera hora después de inmunización. 50 Conclusión La inmunización intradérmica en la oreja del ratón, es más eficiente que otras vías de inoculación. La subunidad B de TC es capaz de inducir una respuesta inmune eficiente, sin causar daño en el tejido que se administra y con efectos superiores a otros adyuvantes utilizados. La migración de las células dendríticas de la piel (dermales) es fundamental para llevar a cabo la diferenciación a células T productoras de citocinas y la consecuente respuesta inmune. 51 [1-49]BIBLIOGRAFIA 1 Agrawal, S., Agrawal, A., Doughty, B., Gerwitz, A., Blenis, J., Van Dyke, T. and Pulendran, B., Cutting edge: different Toll-like receptor agonists instruct dendritic cells to induce distinct Th responses via differential modulation of extracellular signal-regulated kinase-mitogenactivated protein kinase and c-Fos. J Immunol 2003. 171: 4984-4989. 2 Allan, R. S., Smith, C. M., Belz, G. T., van Lint, A. L., Wakim, L. M., Heath, W. R. and Carbone, F. R., Epidermal viral immunity induced by CD8alpha+ dendritic cells but not by Langerhans cells. Science 2003. 301: 1925-1928. 3 Bedoui, S., Whitney, P. G., Waithman, J., Eidsmo, L., Wakim, L., Caminschi, I., Allan, R. S., Wojtasiak, M., Shortman, K., Carbone, F. R., Brooks, A. G. and Heath, W. 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