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Respuesta inmune a la infección por
ETEC en ratones Balb/c inmunizados
con Peptido CFA/I
Yolanda López Vidal
[email protected]
Facultad de Medicina, UNAM
PRINCIPALES SINTOMAS CLINICOS
GRUPO
DIARREA
EIEC
1025
EPEC
605
ETEC
EHEC
%
DIARREA/VÓMITO %
DIARREA/SANGRE
%
95.8
45
4.2
0
0
96
24
3.8
1
0.2
5825
97.1
123
2.7
12
0.2
250
95.8
8
3
3
12
Escherichia coli enterotoxigénica
• Escherichia coli enterotoxigénica (ETEC) es una causa
importante de diarrea infantil aguda en todo el
mundo, especialmente en países en desarrollo y los
turistas que los visitan.
• La colonización del intestino delgado por ETEC es un
requisito indispensable para causar diarrea.
• La adherencia a la mucosa intestinal por ETEC está
mediada por factores de colonización o fimbrias
(CFAs) y son un factor importante de virulencia.
FACTORES DE VIRULENCIA EN ETEC
• Los factores de
colonización de ETEC están
clasificados en 4 familias
(CFA/I, II, III y IV).
• Los CFAs interactúan con
diversos componentes
celulares (sitios de unión)
en el intestino delgado.
• En la familia CFA/I existen
determinantes antigénicas
iguales como el epítopo
lineal común (CLE).
EPITOPOS DE CFA/I POTENCIALES PARA
LINFOCITOS T
5
10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130 135 140 145
CFA/I sequence
T-cell epitopes
(Cassels, 1997)
R
R
*
I-A Regions. Sette MHC
Motifs
T cell Motif-Rothbard-Taylor
AMPHI Regions-AMPHI
70
4
Intensity Plot-AMPHI
2.25
0
-1.01
Faucher PliskaHydrophobicity
5
0
Alpha-Helix Plot-AMPHI
5
0
310 Helix Plot-AMPHI
PEPTIDO POTENCIAL DE CFA/I PARA
LINFOCITOS T
33
> Y
40
S
P
A
S
K
T
F
45
E
S
Y
R
V
51
M
T
Q
V
H
T
C *
CFA/I. Peptide sequence
T cell epitope (Cassels, 1997)
R
R
2.25 *
I-A Regions-Sette MHC Motifs
T cell Motif- Rothbard-Taylor
AMPHI Regions AMPHI
70
-1.01
4
0
Intensity Plot- AMPHI
Fausher Pliska-Hydrophobicity
5
Alpha Helix Plot-AMPHI
0
5
310 Helix Plot-AMPHI
0
VACUNAS DE ETEC
• Aunque la enfermedad causada por ETEC tiene gran
relevancia existe una vacuna efectiva, basada en
bacterias completas.
• En intentos por crear una vacuna se administró CLE
por vía intranasal para protección contra la infección
por ETEC en ratón.
• La subunidad B de la toxina del cólera (CTB), Cry1Ac
se demostró que son potentes adyuvantes en
mucosas.
OBJETIVOS
• Evaluar la respuesta inmune inducida por CLE con
CTB ó Cry1A contra la infección por ETEC en un
modelo murino.
• Determinar la respuesta inmune humoral y
proliferación celular de linfocitos T en diferentes
tejidos (bazo, ganglios linfáticos cervicales e
inguinales y Placas de Peyer), y el perfil de citocinas.
• Determinar la configuracion CLE de ETEC en
condiciones fisiológicas.
Metodología experimental
Inmunizar
0, 7, y 28 días
vía intranasal
Control con PBS
Control con
CTB o Cry1A
Inmunizados
con péptido
Inmunizados con
péptido + CTB o
Cry 1Ac
Reto con ETEC
6 x 108 UFC/ml
Excreción de ETEC
Evaluación durante 7 días
posteriores al reto
Comportamiento de
los ratones
Presencia de diarrea
Hemaglutinación
Sacrificio y obtención de Bazo, ganglios
linfáticos cervicales, inguinales y placas de
Peyer
Ajuste de células y viabilidad
Proliferación celular
PHA
CLE
Determinación de IL-4,
IL-10, INF-γ por CF
CTB o
Cry1Ac
CLE + CTB o
Cry1Ac
Estudio de subpoblaciones
linfocitarias (CD4, CD8) por CF
Ultrastructura de CLE en CFA/I de
E. coli enterotoxigénica
Día
Grupo
Presencia de ETEC
en heces
0
Todos los grupos
-
0
1
Todos los grupos
+++
+++
++
++
+
0
1
1
1
0
0
1
0
0
Control
3
CLE
CTB
CLE + CTB
Control
4
CLE
CTB
CLE + CTB
-
Diarrea
Antiicuerpos contra el
peptido (Abs)
2
1
0
CTB
CTB + Cry
Cry
Adyuvantes
IgA
e IgG
sérica contra el ECL en CFA/I de ETEC de los
sueros de ratones inmunizados con el péptido (50g/ml), y los
adyuvantes CTB /or Cry.
2
1
0
1
5
25
50
Péptido (g/ml)
Respuesta proliferativa de las células NLC de ratón inmunizado
intranasal con Cry (50g/ml) y el péptido (50g/ml)
y
PBS.
44
3
2
1
0
NLP
NLC
Bazo
Respuesta proliferativa de NLC y células de bazo de ratones inmunizados
vía intranasal con Cry (50g/mL) and peptide (50g/ml). Las células fueron
estimuladas in vitro péptido (1g/mL), Cry (1g/mL) y and Con A (5g/mL)
2
1
0
1
5
10
25
50
CFA/I
Con A
Péptido (g/ml)
Respuesta proliferativa en células de placas de Peyer’s de ratón
infectado con ETEC expresa CFA/I
y ratones con (PBS)
.
Células cultivadas in vitro con varias concentraciones del péptido, CFA/I
(1 g/mL) y Con A (5g/mL).
8
6
4
2
0
1
5
25
CFA/I
Con A
Péptido (g/ml)
Respuesta proliferativa de células de bazo de ratones infectados con
ETEC expresa CFA/I
y ratones controles (PBS)
. Las células
cultivadas in vitro con varias concentraciones de péptido de CFA/I (1
g/mL) y Con A (5g/mL).
30
Control
CLE
CTB
CLE + CTB
% Response
20
10
0
Spleen
PP
CD4+
Spleen
PP
CD8+
T Lymphocytes
Control
CLE
CLN
Spleen
60
CTB
CLE + CTB
IL-4
IL-10
Cytokines
INF-g
PP
CLN
ILN
Spleen
PP
CLN
ILN
PP
0
ILN
20
Spleen
% Response
40
Elipticity per residue x 10-3
80
B eta sheet
60
40
20
0
-20
-40
190
210
230
wavelength (nm)
250
Conclusiones
• La vacuna contra la infección por ETEC compuesta por
CLE+CTB o Cry induce mayor proliferación de linfocitos T.
• Una importante respuesta de IL-4 e IL-10 se obtuvo en
todos los órganos estudiados en el grupo vacunado con
CLE+CTB, o Cry.
• La producción de citocinas Th2 en los ratones y la
presencia de títulos altos de IgA e IgG inmunizado con
CLE+CTB ó Cry, sugiere el desarrollo de una respuesta
humoral protectora.
• El péptido CLE tiene un estructura secundaria de hoja β.
• En condiciones fisiológicas (pH 7.4 y 37 C) el péptido CLE
se agrega formando estructuras triméricas.