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LOS PROBLEMAS A
SOLVENTAR PUEDEN SER....
“SENCILLOS”
UN PROBLEMA SENCILLO:
Desbalance de amino ácidos en semillas de
leguminosas: Soja tiene poca lisina
“COMPLEJOS”
Soluciones
Caracteres
controlados
por 1 o pocos
genes
Caracteres
controlados por
muchos genes o
QTLs
1) Modificar por mutagénesis dirigida
proteínas endógenas
2) Introducir nuevas proteínas de reserva
ricas en los aminoácidos deficitarios
Ejemplos de caracteres modificables
por Ingeniería Genética
O NO TAN SENCILLO...
Aspartato
AK
lysCM4 (E. Coli)
Aspartato-4-fosfato
DHDPS
Dap4 (Corynebacterium)
Aspartato-4-semialdehido
2,3 dihidropicolinato
1.
Micronutrientes: vitamina A, vit C, vit E...
2.
Mejora de la tolerancia a estrés ambiental
3.
Resistencia a herbicidas
4.
Control de la senescencia
5.
Resistencia a patógenos
6.
Calidad de la semilla
7.
Control de del tiempo de floración
8.
Androesterilidad
9.
Calidad de fruto
10.
.....
Lisina
100 veces más lisina!!!!!!
Aplicaciones de IGP
A.
B.
Mejora de cultivos
1.
Las caracter
caracteríísticas siguientes son potencialmente importantes de modificar por
IG: control de insecto
insecto,, manipulaci
manipulació
ón de color de pétalos
talos,, producci
producció
ón de
compuestos industriales importantes,
importantes , y crecimiento de plantas en condiciones
adversas
Caracteres modificados por IG: Los grandes seis caracteres:
caracteres :
1.
Resistencia a herbicida
a) Los herbicidas es una gran industria
industria,, cuadruplicandose de 1966 a 1991, por
lo tanto plantas que resisten estos productos quí
qu ímicos es una necesidad
creciente
b) La cr
críítica es que estas plantas modificadas har
hará
á que se incremente el uso
de má
m ás producto quí
qu ímico,
mico, y posible desarrollo de malas hierbas resistentes
a herbicidas
c)
Resistencia a glifosato
i. Comercializado con el nombre de Roundup, el glifosato
inhibe el enzima EPSPS, que genera aminoá
aminoácidos
aromá
aromáticos
ii. El gen que codifica EPSPS ha sido transferido de E. coli
que es resistente a glifosato a plantas,
plantas, permitiendo
plantas resistentes
d) Resitencia a glufosinato
i. Glufosinato (El ingrediente activo es fosfinotricina)
fosfinotricina) copia
la estructura del aminoá
aminoácido glutamato,
glutamato, que bloquea la
enzima glutamato sintasa
ii. Las plantas reciben el gen de la bacteria Streptomyces
que produce una proteí
proteína que inactiva el herbicida
1
Soja Roundup Ready
reduce gastos
Tipo Soja
e)
Coste de Herbicida
(por acre)
Convencional
$27.65
Roundup Ready
$15.90
f)
Resistencia a Bromoxinilo
i. Un que que codifica la enzima bromoximolina
nitrilasa (BXN) se transfiere de la bacteria
Klebsiella pneumoniae a plantas
ii. La intrilasa inactiva el Bromoxinilo antes que mate
la planta
Sulfonilurea
i. Mata las plantas para bloquear un enzima
necesario para la sí
síntesis de los aminoá
aminoácidos
valina,
valina, leucin,
leucin, e isoleucina
ii. Resistencia generada mutando un gen de tabaco,
tabaco,
y transferir el gen a otras plantas
Datos suministrado por Dr. Duane Burgland, NDSU.
2.
Resistencia a insectos
a) La toxina Bt se aisla de Bacillus thuringiensis usado en
plantas.
plantas. El gen se ha insertado en maí
maíz, algodó
algodón, y patata y
ha sido comercializado
b) Inhibidores de proteasas de plantas se han explorado desde
1990s:
i. Producidas de manera natural por plantas,
plantas, se procesan
en respuesta a dañ
daño mecá
mecánico
ii. Inhiben enzimas digestivas de insecto despué
después de su
ingesta
iii. Los resultados no han sido tan prometedores como con la
toxina Bt puesto que los insectos generan resistencia a
inhibidores de proteasas
Productos agrícolas en el mercado
Algodón resistente a insectos
 Toxina Bt mata al gusano del algodón
 Gen tóxico de una bacteria
Source: USDA
Maíz resistente a insecto
 Toxina Bt mata al taladro del maíz
 Gen de una bacteria
 Rootworm GM aprovada (2/26/03)
Normal
Transgenic
2
Taladro afecta
distintas partes de
la planta
Patatas protegidas contra coleópteros
(CPB) y lepidópteros (PTM y ECB)
Rubisco
Cry1Ba
Cry1Ia
Cry1Ba
(Tomado de Naimov et al., 2003, Plant Biotech. J. 1, 51-57)
Efecto económico de maíz Bt en China
 $200/acre incremento económico
 $750 millones de incremento a nivel nacional
Cosechas biotecnológicas pueden se ventajosas
para el medio ambiente (y en producción)
Rendimiento de algodón y resultados de inecticidas de un ensayo masivo
(157 sitios) en India durante 2001
Cotton type
Bt
Non-Bt
Yield (kg/ha)
1501*
833
Popular check
802
# Bollworm sprays
0.62*
3.68
3.63
# Sucking insect sprays
3.57
3.51
3.45
Kg/ha insecticide
1.74*
5.56
5.43
Toxic class I
0.64*
1.98
1.94
Toxic class II
1.07*
3.55
3.46
Toxic class III
0.03
0.03
0.03
*Means within a row are significantly different at the 5% level
From: Science (2003) 299:900
3
3. Resistencia a virus
a) Productos quí
químicos se usan para controlar los
insectos que transmiten los virus, pero la
enfermedad en sí
sí es difí
difícil de controlar
b) Se pueden generar plantas que tengan genes de
resistencia a virus, bacterias y hongos
c) Plantas resistentes a virus expresan la proteí
proteína de
la cápsida del virus, previniendo la reproducció
reproducció n
del virus en cé
células de plantas
d) Genes de la proteí
proteína de la cá
cápsida se usan en
enfermedades como el virus del mosaico del
pepino,
,
virus
X
de
la
patata
pepino
Virus del manchado de la Papaya
e)
Genes de resistencia a enfermedades de hongos y virus se
han aislado de plantas relacionadas y transferidas a plantas
de cosechas
f) Yellow Squash and Zucchini
i. Semillas disponibles que son resistentes a mottle virus
de la sandí
sandía, virus del rizado amarillo del calabazí
calabazín y
virus del mosaico del pepino
g) Patata
a) Monsanto ha desarrollado patatas resistentes a leaf roll
virus y virus X de la patata,
patata, que tambié
también contiene el gen
de la toxina Bt
b) No comercializado debido a presió
presión pú
pública
h) Papaya.
a) Se han desarrollado variedades resistentes al ring spot
virus
Virus del manchado de la Papaya
1992 primeros sí
síntomas...
ntomas...
1994 se abandonaron los cultivos…
cultivos…
Virus del manchado de la Papaya
• Clonar el gen que codifica PC
• Introducirlo en papaya
Experimentos de infeccíó
n con el virus
infeccíón
Ensayos de campo de infecció
infección del
virus de la papaya
Abril 1992
Diciembre 1992
planta
transgénica
planta
control
4
Resistencia en transgé
transgénicas
Junio 1996
no
transgenicas
Resistencia en transgé
transgénicas
Noviembre 1996
transgenicas
Resistencia en transgé
transgénicas
no
transgenicas
transgenicas
Virus del manchado de la Papaya
Marzo 1997
no
transgenicas
4.
5.
transgenicas
Contenido de aceite alterado
a) Se ha conseguido a travé
trav és de la modificaci
modificació
ón de un enzima
implicado en biosí
bios íntesis de ácidos grasos
b) Variedades de soja se han generado por ingenierí
ingenier ía gen
gené
ética para
producir aceites con mejores propiedades nutricionales y durante su
uso en la cocina
c) Plantas modificados por ingenierí
ingenier ía gen
gené
ética pueden producir aceites
usados en detergentes,
detergentes , jabones,
jabones , cosmé
cosm éticos,
ticos, libricantes,
libricantes , y pinturas
Restraso en la maduraci
maduració
ó n de frutos
a) Permites cosechas como los tomates tener mayor vida post-cosecha
post- cosecha
b) Los tomates maduran y se ablandan desde la recolecci
recolecció
ón a la venta
c) Los tomates son generalmente recogidos y tratados con la hormona
vegetal etileno para inducir maduració
maduraci ó n, aunque esto no siempre
mejora el sabor
Vista aé
aé rea
Se han generado Tomates para producir menos etileno de manera
que se pueden desarrollar má
más sabor antes de la maduració
maduración y
la venta al mercado
5
Etileno CH2=CH2
Etileno CH2=CH2
Germinació
Germinación de la semilla
O
Lfruto
Maduració
Maduración del
L
O
Senescencia R
deRla flor y la hoja
A
Abcisión
ES Abcisió
D
Iniciació
Iniciación de la raí
raíz
Molé
Molécula única:
Molé
Molécula pequeñ
pequeña
gaseosa
Aplicaciones/beneficios
Frutos climaté
climatéricos
Control
Etileno
etileno
Maduració
Maduración
Control
Maduració
Maduración
maduració
maduración
Senescencia
Frutos
• Mayor vida poscosecha
• Minimizar pé
pérdidas en el
transporte
• Aumentar el sabor
Ruta de biosí
biosíntesis de etileno
Flores y vegetales
• Aumentar vida
• Retrasar la
senescencia
Estrategias
1. Desviar ACC
ACC
desaminasa
Met
AdoMet
AdoMet
Sintetasa
ACC
ACC
sintasa
Etileno
ACC
oxidasa
Met
AdoMet
AdoMet
Sintetasa
ACC
ACC
sintasa
\\
Etileno
ACC
oxidasa
6
1. Desviar ACC
Estrategias
Estrategias
2. Blooquear la expresió
expresión de ACC sintasa con antisentido
Frutos control
Met
AdoMet
AdoMet
Sintetasa
\\
ACC
ACC
sintasa
Etileno
ACC
oxidasa
Frutos transgé
transgénicos
Inactivación “antisense”
Inactivación “antisense”
1.Clonar el gen de planta
Gen planta
Gen invertido
“sense” mRNA
“antisense” mRNA
Gen de planta
Promotor
Gen planta invertido
2.Invertir
3.Reintroducirlo en planta
Cromosoma de
planta
Cromosoma de
planta
no traducción
Estrategias
Estrategias
2. Bloquear la expresió
expresión de ACC sintasa con antisentido
3. Retardar el reblandecimiento (Poligalacturonasa,
(Poligalacturonasa, PG)
AdoMet
AdoMet
Sintetasa
ACC
ACC
sintasa
Etileno
ACC
oxidasa
\\
Met
7
Estrategias
Transgénicos en el supermercado
3. Retardar reblandecimiento (PG)
d)
e)
¿Qué
Qu é pasó
pas ó con el tomate Flavr Savr?
Savr ?
i. Producido por Calgene bloqueando el gen de la poligalacturonasa
(PG) que está
est á implicado en estropear su textura
textura.. PG est
está
á implicado
en la degradaci
degradació
ó n de las pectinas de las paredes celulares
ii. Las plantas se transformaron con un antisentido de PG, que es el
mRNA que produce la PG
iii. Los primeros organimos modificados gené
gen éticamente fueron
aprobados por la FDA en 1994
iv. Los tomates eran delicados,
delicados , no crecieron bien en Florida y
costaban m
má
ás que los tomates normales
v. Calgene se vendi
vendió
ó a Monsanto despu
despué
és que ésta les acus
acusó
ó de uso
de una patente de manera ilega y el tomate Flavr Savr se dejó
dej ó de
comercializar
6.
D.
C.
Revolució n biotecnoló
Revolució
biotecnol ógica:
gica: Incremento de tolerancia a frí
fr ío y sequ
sequíía
1. Frutales está
est án sometidos a da
dañ
ños por fr
fríí o as
asíí como p
pé
é rdida por sequí
sequ ía .
Se puede usar ingenier
ingenieríía gen
gené
é tica para mejorar esto
2. Para resistir el frí
fr ío, genes regulados por fr
fríío (COR) codifican proteí
prote ínas
que protegen las ccé
élulas vegetales del da
dañ
ño por fr
fríí o
3. Un factor de transcripci
transcripció
ón de un grupo de genes COR llamado CBF se
patentó
patent
ó como WeatherGard en 1997 por un grupo de Michigan State
University. Estos genes tambi
tambié
én proporcionan tolerancia a sequí
sequ ía y alta
sal
4. Todas las cosechas analizadas contienen genes CBF
5. Plants modificadas por ingenier
ingenieríía gen
gené
ética que sobreexpresan los
genes CBF sobreviven en rangos de temperaturas entre 4 to 50C
Control del polen
a) La obtenció
obtenci ó n de h
hííbridos se obtienen del cruzamiento de dos lílíneas
puras
b) El m
mé
étodo genera plantas con caracteres favorables,
favorables , como plantas
de soja que producen m
má
ás semillas y son má
m ás resistentes a
condiciones ambientales adversas
c) Para que tenga é xito
xito,, la auto polinizaci
polinizació
ón se debe controlar.
controlar . Esto se
hace a travé
trav és de emasculaci
emasculació
ón, es decir eliminiar la parte
masculina ((estambres
estambres)) antes de la liberaci
liberació
ón del polen
polen.. Plantas
esté
est
é riles se han generado por ingenierí
ingenier ía gen
gené
é tica usando un gen
de la bacteria Bacillus amyloliqueifaciens
Comidas modificadas por ingenierí
ingenier í a gené
gen ética
1. Má s del 60% de comidas en USA contiene ingredientes de organismos
modificados gené
gen éticamente
2. 12 plantas modificadas por ingenierí
ingenier ía gen
gené
ética se han aprobado en USA
3. Soja
a) La soja se puede modificar para ser resistente a una amplio
espectro de herbicidas
b) En 2003 se elimin
eliminó
ó un ant
antíígeno de soja llamado P34 que puede
causar una reacció
reacci ón al
alé
érgica severa
4. Ma
Maííz
a) Resistencia a insecto por Bt es el ma
maííz modificado m
má
ás com
comú
ún
aunque la resistencia a herbicida es un caracter tambié
tambi én deseado
8
b) Estos productos incluyen aceite de maí
maíz, sirope de maí
maíz ,
harina,
harina, y alcohol
c) En 2002 alrededor de un 32% del campo de maí
maíz era
modificado por ingenierí
ingeniería gené
genética
5. Canola.
a) Más del 60% de la cosecha 2002 era modificado
gené
genéticamente,
ticamente, usado en comidas procesadas y tambien en
aceite de cocinar
6. Algodó
Algodón
a) Más del 71% del algodó
algodón en 2002 era modificado
gené
genéticamente
b) Aceite de semilla de algodó
algodón se encuentran en pastas, y
mantequilla de cacahuete
7. Otras cosechas
a) Papaya, arroz,
arroz, tomate,
tomate, cañ
caña de azucar etc
E. Arroz dorado
1. Syngenta tiene los derechos.
derechos. Monsanto
proporciona licencia gratis para el tercer
mundo
El problema del arroz como alimento...
Beneficios en humanos de cosechas modificadas
1.
• Las plantas no producen vitA – aunque algunas producen ßcaroteno, un precursor de vitA
• En muchos países en desarrollo, la deficiencia de vitA es un
problema muy importante:
• xeroftalmia - ceguera
• Respuesta inmune
IPI
Isopentenyl pyrophosphate
Biosíntesis de beta caroteno
en plantas
C5
Dimethylallyl pyrophosphate
C20
Es deficiente en provitamina A
1.
Deficiencia de vitamina A provoca ceguera, diarrea, enfermedades
respiratorias y enfermedades infantiles
2.
_ millon de niños se quedan ciegos/año
3.
Afecta a 124 millones de niños
3.
No se puede incrementar la cantidad de provit A por métodos
tradicionales
4.
Necesidad de Ingeniería Genética
Dimethylallyl pyrophosphate
IPI
Isopentenyl pyrophosphate
Genes introducidos en
arroz
PSY
C40
Phytoene
Geranylgeranyl pyrophosphate
CH 2OPP
Fitoeno sintasa
C40
CH 2OPP
CH 2OPP
C20
Geranylgeranyl pyrophosphate
CH 2OPP
PSY
C5
CH 2OPP
CH 2OPP
El arroz es el principal alimento mundial
2.
• vitamin A = retinol – producida por animales en el hígado, y
presente en la leche y huevos
psy Narciso
Phytoene
PDS
(crtI)
Fitoeno desaturasa
PDS
(crtI)
ZDS
Zeta caroteno desaturasa
ZDS
ctr1 Erwinia uredovora
Lycopene
Lycopene
LCYB
LCYB
lcy Narciso
Licopeno beta ciclasa
LCYB
LCYB
ß -Carotene (Provitamina
A)
ß -Carotene
CRTR-b
CRTR-b
OH
OH
Zeaxanthin
Zeaxanthin
HO
HO
CRTO
CRTO
CRTO
Antheraxanthin + Violaxanthin
CRTO
Antheraxanthin + Violaxanthin
CCS
CCS
O
O
OH
OH
O
Capsanthin
Capsanthin
HO
Capsorubin
O
OH
+
OH
O
9
HO
O
OH
OH
OH
O
O
OH
Astaxanthin
Capsorubin
O
OH
+
OH
O
Astaxanthin
Contrucción con los 2 primeros genes:
Promotor Gt1p:péptido transición:fitoeno sintasa
Promotor 35S:péptido transición fit/zet car desaturasa
GGPP
Fitoeno
Licopeno
(color rojo)
C5
Dimethylallyl pyrophosphate
IPI
Isopentenyl pyrophosphate
Genes introducidos en
arroz
CH 2OPP
CH 2OPP
C20
1) Control sin
transformar
Geranylgeranyl pyrophosphate
CH 2OPP
PSY
C40
psy Narciso
Phytoene
2, 3, 4) Lineas
transgénicas
independientes
PDS
(crtI)
ctr1 Erwinia uredovora
ZDS
Lycopene
LCYB
Actividad lcy ya presente!!!
LCYB
ß -Carotene
CRTR-b
OH
Zeaxanthin
HO
CRTO
CRTO
Antheraxanthin + Violaxanthin
CCS
O
OH
OH
O
Contrucción con los 3 genes:
Capsanthin
HO
O
OH
Promotor Gt1p:péptido transición:fitoeno sintasa
Capsorubin
Promotor 35S:péptido transición fitoeno desaturasa
Promotor Gt1p:péptido transición licopeno ciclasa
O
+
OH
Astaxanthin
O
OH
10
MODIFICACIÓN DE VARIOS COMPUESTOS
1, 2, 3, 4) Lineas
transgénicas
independientes
COMPROBACIÓN DE LAS PLANTAS TRANSGÉNICAS
11
LAS PLANTAS TRANSGÉNICAS
1) SON MÁS TOLERANTES A ESTRÉS OXIDATIVO
2) ACUMULAN ZEAXANTINA
1. Identificación de genes con homología aldo-ceto
reductasas
2. 9 cDNAs que definen 2 contigs: AKR1 y AKR2
3. AKR1: homología con quinona oxidoreductasas
4. AKR2 con baja homología (posible D-galacturonico
reductasa?)
AKR2 tiene actividad D-galacturónico
reductasa NADPH dependiente
L-galactosa
ácido
D-glucurónico
sustrato
extracto
WT
2
8
0
28 ± 4
72 ± 6
0
0
0
µgAA/g peso fresco
ácido
D-galacturónico
El contenido de Ácido Ascórbico
aumenta durante la maduración del fruto
0
0
0
AA
AA
La actividad se expresa en U/mg de proteínas
Las líneas transgénicas 2 y 8 que
sobreexpresan GalUR tienen mayor
contenido de AA
NADPH+
L-galactónico
NADP +
H+
L-galactono
1-4 lactona
Wt
Acido
Ascórbico
2
17
5
18
4
7
15
1
8
nmolAA/g peso fresco
D-galacturónico
FaGalUR
12