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ACTIVIDAD VOLUNTARIA PARA MECANISMOS DINÁMICOS CELULARES:
DESCRIPCIÓN DE IMÁGENES.
TEMA 1: CICLO CELULAR.
- Imagen de microscopía de fluorescencia en la que se aprecian los cromosomas en la placa
metafásica (en azul) y el huso mitótico (en verde).
4n
M
G2
G1
4n
S
2n
- Diagrama de las fases del ciclo celular en la que se muestra la carga cromosómica que ha
de esperarse en cada una de ellas.
- En esta figura se observan dos círculos concéntricos. Una de ellos, el más externo y de
mayor tamaño es de color morado el cual está interrumpido en determinadas zonas, donde
nos encontramos con unas estructuras esféricas que representar a células en el interior de las
cuales podemos observar otro círculo de color azul y con unas estructuras enrolladas que
presentan el DNA de las células.
Dentro de este círculo externo nos encontramos otro círculo de color verde y que en
determinadas zonas está interrumpido por unas líneas perpendiculares negras de mayor
grosor. Entre una línea perpendicular y otra se extiende un área de círculo que son de
mayor o menor tamaño según el caso. Cada una de estas zonas del círculo reciben un
nombre, que son de mayor a menos tamaño respectivamente: G1, S, G2 y M. Estos nombres
hacen referencia a las distintas fases del ciclo celular.
Igualmente, el área del círculo que representa la fase M está marcada con un triángulo rojo
cuyo vértice más agudo se sitúa en el centro de ambos círculos concéntricos. Asimismo, en
el centro de toda la figura podemos leer la palabra interfase.
4n
M
G0
Estímulo
G2
G1
4n
S
2n
- Diagrama de las fases del ciclo celular, incluida la fase G0, a partir de la cual se
reanuda el ciclo tras un estímulo.
1. Asociacón con
ciclinas
Ciclina
3. Asociación
inhibidora con
CKIs
4. Fosforilación
inhibidora en Thr14 y
Tyr15
2. Fosfoforilación
activadora en
Thr160
CDK
Complejo CDK/ciclina
- Dibujo de la CDK (naranja) unida a ciclina (verde) y a CKI (amarillo), en la que muestran
los residuos fosforilables de la CDK.
ciclina
Quinasa activadora de CDK
Bucle T
CDK
1. INACTIVO
Fosfato acti vador
Sitio acti vo
2. PARCIALMENTE ACTIVO
3. ACTIVO
- Esquema de las fases de activación de la CDK: 1) CDK inactiva, 2) unión de ciclina y
exposición del buble T (CDK parcialmente activa) y 3) fosforilación del buble T por parte
de la quinasa activadora de CDK (CDK activa).
Concentración de
ciclinas mitóticas
Interfase
Mitosis
Interfase
Mitosis
Interfase
Mitosis
Generaciones
- Gráfica que muestra la variación en la concentración de ciclinas mitóticas en función de la
fase del ciclo celular.
- Arriba: Esquema que representa el proceso de ubiquitinación de CKI tras la acción de
SCF activo, para su degradación proteasómica y abajo: Esquema que representa el
proceso de ubiquitinación del complejo CDK-Ciclina M debida a la acción de APCCdc20, para la degradación proteasómica de ciclinas M.
STOP
OP
ST
M
ST
OP
G2
G1
S
OP
ST
- Diagrama de las fases del ciclo celular en el que se representa la localización en el
ciclo de los distintos puntos de control.
TRANSICIÓN G1
punto R
S
Mitógenos,
Factores de crecimiento…
P
P
p16
D
P
pRb
Cdk4/6
p21
E2F
E2F
R
TRANSCRIPCIÓN
pRb
E
Cdk2
ENTRADA EN S
- Esquema en el que se representan las principales interacciones moleculares implicadas en
la transición de G1 a S, en el que algunos complejos CDK-ciclina fosforilan a pRb, liberando
a E2F, factor de transcripción que constituye el punto R de control, en el que se empieza a
transcribir genes de la fase S.
Radi ación, agentes químicos…
ADN
Activación de protein-quinasas
y fosforilación de p53
P53 estable
y acti vo
Degradación de p53
en proteasomas
TRANSCRIPCIÓN
TRADUCCIÓN
CKI p21
CDK activa
CDK inhibida
Activación de p53 y bloqueo de la progresión
del Ciclo Celular
- Esquema de la acción de p53 en respuesta a un daño en el ADN en el que, tras ser
fosforilado el p53, se transcribe el gen del CKI p21, que detendrá el progreso del ciclo
celular.
PROGRESIÓN EN G1
G1-Cdk
activo
Retroalimentación positiva
Proteína Rb
Proteína E2F
activa
G1/S-Cdk
activo
Transcripción de
genes de fase S
Ciclina E
Ciclina A
S-Cdk
activo
SÍNTESIS
DE ADN
Proteína E2F
inactiva
Retroalimentación
positiva
punto R
- Esquema sobre la regulación que tiene lugar en el punto R de control: Se da una
retroalimentación positiva sobre la activación de E2F por parte del mismo E2F y de sus
transcritos, las ciclinas A y E.
ORC (complejo de reconoci miento de origen)
ADN
Sitio de uni ón de ORC
Comple jo
pre-replicativo
Acti vi dad S-Cdk,
comienzo de l a fase S
Degradación de Cdc6
dependiente de ubiquitina
Fosforilación de ORC
Horquilla
de replicación
FINALIZACIÓN
DE LA REPLICACIÓN
CONTROL DE INICIO DE REPLICACIÓN
Y DE REPLICACIÓN 1X CICLO
- Esquema sobre los mecanismos celulares para evitar una segunda replicación: al
fosforilarse por S-CDK el complejo pre-replicativo formado por Mcm, ORC y Cdc6, se
desprende el Cdc6 fosforilado y ORC fosforilado comienza la replicación.
fosfatasa
inactiva
fosfato
Inhibidor
Ciclina B
retroalimentación
positiva
Thr161
Cdk1
Cdk1/B
inactivo
Cdk1/B
Inactivo
Cdk1/B activo
Regulación del FPM (Cdk1/B)
- Esquema sobre la regulación de FPM (Cdk1/B): La unión de CDK1 con la ciclina B
produce un complejo inactivo, que presenta dos restos fosforilables. Sólo cuando Cdc25
activo fosforila uno de estos residuos se activa el FPM.
1
M-CDK
APC-Cdc20
P
2
- Diagrama en el que se explica la relación de realimentación negativa entre M-CDK y
APC-Cdc20: Mientras que M-CDK facilita la activación de APC-Cdc20, el APC-Cdc20
ubiquitiniza el M-CDK para su destrucción.
segurina
separasa
inactiva
ubiquitinización y degradación
de segurina
APC inactivo
APC activo
M-Cdk
complejo
cohesina
G2
separasa
activa
huso
mitótico
metafase
rotura y disociación del
complejo cohesina
anafase
Separación de cromátidas hermanas
inducida por el complejo APC
- Esquema en el que se observa como el APC activo (unido a Cdc20) degrada la segurina
para la liberación de la separasa. Este enzima destruirá el complejo cohesina que mantiene
unidas dos cromátidas hermanas.
Las flechas indican la detección
inmunocitoquímica de Mad2 en
cinetocoros libres, aquellos que aún no
están asociados a microtúbulos
cromosómicos del huso mitótico. El
cromosoma que permanece asociado a
Mad2 no está correctamente alineado en
la placa metafásica, cuando lo esté se
liberará Mad2 de los cinetocoros y podrá
comenzar la anafase.
Mad2
Célula en prometafase, los cromosomas
mitóticos aparecen en azul y los
microtúbulos del huso mitótico en verde.
- Imagen de microscopía de fluorescencia en la que se aprecian los cromosomas en la placa
metafásica (en azul) y el huso mitótico (en verde), indicándose con flechas aquellos
cinetocoros libres, detectados mediante inmunocitoq
Final fase M
Miosina
Cdk1/B
La inactividad de Cdk1/B
permite la formación del
anillo contráctil
Miosina
p
No puede asociarse a la actina,
no formándose el anillo contráctil
Restos de microtúbulos de la región
central del huso mitótico
Actina
Anillo contráctil de actina-miosina
en el surco de segmentación
Miosina
CITOCINESIS
Surco de segmentación
- Anillo contráctil y citocinesis: Esquema que muestra la disposición de actina y miosina en
el anillo contráctil sólo posible bajo inhibición de Cdk1/B (que fosforila la miosina
inactivándola); imágenes de microscopía de fluorescencia, donde se aprecia la disposición
de la actina (en rojo) y de la miosina (en verde); imágenes de microscopio electrónico de
barrido en las que se muestra en surco de segmentación en la citocinesis.
Cubierta
nuclear
Nucleolo
Preparación para
la mitosis
Nucleolo
Núcleo
Desorganización
nucleolar
Profase
Metafase
Anafase
Telofase
G1
G1/S
G2
Formación
nucleolar
Crecimiento celular,
preparación para
la replicación…
Replicación
Nucleolo y ciclo celular
- Diagrama de las fases del ciclo celular con sus formaciones nucleolares características,
acompañado de 3 micrografías de núcleos en distintas fases del ciclo.
- Duplicación centrosómica: Dibujo de la formación de un nuevo centrosoma a lo largo
del ciclo celular.
microtúbulos
G1
S,G2
M
- Imágenes de microscopía electrónica de centrosomas en distintas fases del ciclo.
- Diagrama de las fases del ciclo celular representando la duplicación cetrosómica y su
regulación.
- Visualización de células vivas en distintos estadios de la mitosis.
Se observan la localización / cambios en la concentración de ciclina B1 (determinados por la
fluorescencia/ intensidad de fluorescencia respectivamente) mediante un marcaje con GFP
(proteína verde fluorescente).
- Imágenes paralelas de las distintas fases del ciclo celular obtenidas mediante dos técnicas
distintas: en la primera columna se observa el cambio morfológico de la célula por
microscopía de contraste de interferencia diferencial y en la segunda apreciamos por
microscopía de fluorescencia el descenso de la cantidad de ciclina B1-GFP (en verde) a lo
largo del ciclo celular.
- Diagrama que muestra una visión global de las interacciones moleculares que se dan a lo
largo de las fases para mantener el control del ciclo celular.
TEMA 2: APOPTOSIS
- Imágen obtenida mediante microscopía electrónica. En ella podemos distinguir dos tipos
de células: una apoptótica y otra normal. La primera se diferencia de la segunda en que su
núcleo está fragmentado y cromatinizado.
- En la imagen aparecen dos células a MET, donde pretende dejar claramente visibles los
rasgos de una célula “normal” donde podemos observar su núcleo eucromatínico con algo
de heterocromatina perinuclear (células de la derecha). Por el contrario la célula de la
izquierda donde se observa claramente un núcleo heterocromatinizado y que se comienza a
desmembrar en vesículas, lo cual es una característica típica del proceso apoptótico.
- Papel de la apoptosis en el modelado de los órganos durante el desarrollo embrionario; En
esta imágen se observa cómo el tejido interdigital de la mano de un embrión es eliminado
mediante mediante apoptosis resultando así los dígitos.
- En la imagen se observan 2 fotografías donde se han marcado con fluorocromos verdes, en
la derecha las células que conforman los pliegues interdigitales de la manos, que mantenían
unidos a los dedos. Por el contrario en la imagen de la derecha se observa como quedó la
mano tras el proceso de apoptosis de esas células, que posibilitaron la eliminación de los
pliegues interdigitales.
- Esquema: Fase de activación apoptótica a partir de señales extracelulares: El TNF
reconoce a su receptor situado en la membrana de la célula haciéndo que se active. En la
región citoplasmática de este receptor activado se acoplan una serie de proteínas (proteína
TRADD y FADD) que presentan además dominios de unión a la procaspasa-8
citoplasmática. La unión de dos de estas procaspasas a las proteínas adaptadoras permite que
queden cercanas y puedan activarse mutuamente formando así la caspasa8. Ya por último la
caspasa8 facilita a su vez la unión de dos pro-caspasas3 para que se hidrolicen y formen así
la caspasa3 efectora y con ella la fase de ejecución de la apoptosis.
- En la imagen se observa un dibujo que representa el proceso de recepción de señales
externa a la célula, que inducirán la apoptosis. En primer lugar el factor de necrosis
tumoral o TNF se asociara a la receptores específicos para el; lo cuales tienen unos
dominios proteicos en su cara citoplasmática que ayudan a la asociación de pro-caspasas – 8
para dar dímeros que conformen caspasas -8, que junto a la activación de la caspasas -3;
serán las encargadas de llevar a cabo el proceso de apoptosis.
- Estas imágenes representan gráficamente como pasan las pro-caspasas a caspasas activas,
ya sea por hidrólisis del péptidos o por su asociación con otras pro-caspasas para
autoactivarse.
- Imágen obtenida mediante microscopía óptica de fluorescencia utilizando para ello
colorante de Hoechst (con apetencia por el ADN): Se aprecian varias células entre las cuales
destaca una que se diferencia de las demás en que ha perdido la forma celular redondeada
típica así como volumen celular. Además su ADN está más condensado puesto que la
intensidad de la fluorescencia es mayor, y fragmentado. Estas características son propias de
las células que han entrado en apoptosis.
- En la imagen de microscopia se observan una serie de células de morfología redondeada
teñidas con el colorante Hoechst, que las tiñe de una coloración azul-violácea. De las células
con un color algo mas brillante resalta determinadas zonas del citoplasma celular; pero
destaca de entre todas una célula en cuyo interior hay unos cuerpos que se han teñido con
gran intensidad, debido a la mayor condensación cromatínica de ese núcleo; y de la cual
destaca su menor tamaño. Esta célula estará en llevando a cabo un proceso de apoptosis
celular.
- En la imagen vemos una serie de células, como círculos azul claro. Se les ha realizado una
tinción con Hoechst, un colorante con afinidad por el DNA.
Debido a ello, podemos apreciar en todas ellas una región más clara correspondiente al
núcleo. Sin embargo, en el centro hay una célula donde se está produciendo apoptosis: su
tamaño es menor y el núcleo brilla con mucha nitidez, debido a que el material genético está
muy heterocromatinizado.
- Se observan células coloreadas. Una de ellas presenta el núcleo más iluminado. Es debido
a la condensación de la cromatina y característico de las células apoptóticas.
- En la presenta imágen (M.E.T.) encontramos una célula cuyo núcleo está totalmente
fragmentado. Estos fragmentos se encuentran dispersos en el citoplasma y ninguno de ellos
ha sido liberados al exterior.
- En la imagen se observan dos células observadas con MET, que nos permite observar la
superficie celular y su interior. De las fotografías destacan la diferencia que existe entre las
2 células, que pertenecen al mismo tipo celular. En la célula de la izquierda y en la de la
derecha se pueden observar grandes evaginaciones citoplasmáticas, que conforman las
vesículas características de la apoptosis, pero que en el caso de la célula de la izquierda
son de mayor tamaño lo cual quiere decir que el proceso apoptótico estará mas avanzado.
- Se observa una imagen tomada con SEM de células que están sufriendo un proceso de
apoptosis celular, como se deduce de la fragmentación de su núcleo totalmente
heterocromatinizado en pequeñas vesículas que se están disponiendo cercanas a la
superficie de la membrana plasmática para desprenderse y poder ser fácilmente fagocitadas
para su destrucción.
- Se observa un esquema donde se representa de forma esquemática los pasos mas
importantes que se pueden observar a microscopia del proceso de apoptosis: en primer lugar,
se observa como la periferia nuclear heterocromática comienza a
adquirir un mayor
tamaño, a lo cual de sigue una deformación de la célula para continuarse con la formación
de evaginaciones citoplasmáticas. Esas evaginaciones en un estadio mas avanzado formaran
los cuerpos apoptóticos que recogerán porciones de citoplasma y/o núcleo para
posteriormente se eliminados por acción de los macrófagos.
- Se observa un esquema que representa el modelo de organización de la cromatina para
formar la fibra de 10 nm, en a cual la cadena de ADN se enrolla sobre un octámero de
histonas, conformando un nucleosoma que aproximadamente tiene unos 200 pb. Por tanto, si
se somete este DNA a un tratamiento con endonucleasas, estas realizaran cortes de la fibra
de 10 nm por las zonas mas vulnerables a estas que lo conforma el DNA espaciador entre
los nucleosomas. Si a continuación se lleva a cabo la electroforesis en gel de agarosa de ese
DNA se observara un patrón de bandas en escalera que marcara los distintos fragmentos de
fibra de 10 nm múltiplos de 200 pb.
- En la imagen de microscopia se observa un grupo de células de distinta morfología y
tamaños a las que se les han practicado una tinción con DAPI y una inmunodetección, para
con ello resaltar de un color mas “brillante” las células de menor tamaño y que presentan
una mayor condensación de sus núcleos, que serán las células apoptóticos. Estas células se
observaran con un color azul-blanquecino debido a la intensidad de la tensión y de las
cuales resalta su menor tamaño si se compara con el tipo celular normal.
- Fotografías obtenidas tras el marcaje celular con Anexina V asociada a un fluorocromo
(color verde). La Anexina V tiene afinidad por la PS de la membrana plasmática, y debido a
que no es permeable a la misma sólo se une a aquellas PS expuestas en la cara externa de la
membrana (señal apoptótica): En la primera de las fotografías se observa un total de 10
célualas, ninguna de ellas marcadas en su superficie con fluorocromo verde, y todas con el
mismo volumen y forma celular. En la segunda fotografía una de las 10 células anteriores ha
perdido la forma celular característica, aunque no volumen celular, y presenta además su
superficie bastante marcada con fluorescencia verde.
- Detección inmunocitoquímica de células apoptóticas: Detección de células apoptóticas,
que expresan en su membrana fosfatidil serina, por acción de un fluorocromo.
Para asegurar que no es una célula necrótica, se emplean colorantes que no atraviesan la
membrana plasmática.
- Tres imágenes (a,b y c) obtenidas con M.E.T.: a. La membrana plasmática de esta célula
está totalmente desintegrada y parcialmente rota por aquellos puntos en los está salientdo el
contenido citoplasmático al exterior (celula necrótica); b. Célula con su núcleo fragmentado
y condensado, membrana íntegra y contenido citoplasmático sin expulsar al exterior (célual
apoptótica); c. Cuerpo apoptótico: contenido celular rodeado de membrana plasmática
íntegra, que es reconocido por los macrófagos y eficazmente eliminado.
- En esta imagen se pueden observar 3 imágenes de 3 células diferentes. En primer lugar,
la de la izquierda con respecto a las otras dos esta mostrando la morfología celular ante un
proceso de necrosis, en la cual se observa como una célula funcionalmente “normal” de
repente estalla, liberando su contenido citoplasmático al exterior celular sin incluirlo en
vesículas.
Por el contrario la célula la imagen central muestra a una célula donde el núcleo esta
totalmente fragmentado en vesículas completamente heterocromáticas que se acercan a la
membrana para su liberación como cuerpos apoptóticos.
Por ultimo, la ultima imagen muestra como uno de esos cuerpos apoptóticos rodeados de
membrana y en cuyo interior esta englobado parte del citoplasma células y del núcleo
heterocromático, ha sido englobado o fagocitado por el macrófago para su posterior
destrucción, conformando un fagolisosoma.
- Se observan 3 imágenes de microscopía electrónica de transmisión: la primera corresponde
a una célula en necrosis. Por ello, su membrana se ve claramente rota y el material celular
está saliendo al exterior. Es decir, la célula se está “vaciando” de su contenido.
Las dos imágenes siguientes son células en apoptosis. Por ello, su membrana está
perfectamente íntegra, pero debido a la actuación de enzimas se ha destruido el contenido
celular y en consecuencia el interior de la célula se ve homogéneo.
TEMA 3: SENESCENCIA CELULAR
- Se observa una célula en el lado izquierdo que presenta una pequeña protuberancia o yema.
Esa protuberancia/yema es una célula hija generada por gemación.
En el lado derecho se observa otra célula donde la célula hija es de mayor tamaño.
TEMA 4: RUTAS DE SEÑALIZACIÓN INTRACELULAR
- La unión de AMPc a PKA inactiva causa la separación de la subunidad reguladora (que
queda unida a AMPc) de la subunidad catalítica.
- El Ca+2, al unirse acetilcolina a receptores de membrana de las células endoteliales, penetra
en estas a través de canales de Ca+2 y causa la liberación de NO (al activar a NOS) que
difunde a través de la membrana a células musculares lisas donde se asocia con la Guanilato
ciclasa. Esto se traduce en la relajación de la célula muscular.
- La liberación de Acetil Colina (ACh) por las terminaciones nerviosas colinérgicas
determina, a nivel de las células endoteliales, la activación de canales iónicos para el calcio
que hacen aumentar los niveles citoplasmáticos de este ion. El aumento del calcio
citoplasmático activa a la oxido nítrico sintasa de la célula endotelial, que genera NO a partir
de Arginina. El NO difunde hasta las fibras de la musculatura lisa de los vasos, donde este
gas activa una Guanilato Ciclasa. El GMPc producido por la ciclasa disminuirá los niveles
de calcio en la fibra muscular, determinando su relajación.
- Las proteínas G inactivas (unidas a GDI y GDP) al liberarse de su unión a GDI y
posteriormente de GDP que es sustituido en su sitio de unión por GTP, pasan a estar activas.
La inactivación de proteínas G es debida a la defosforilación (perdida de Pi) de GTP por
intervención/acción de GAP.
- Receptor GPCR, constituido por un polipéptido que forma 7 alfa hélices transmembrana,
un extremo carboxi-terminal citoplasmático y otro amino terminal extracelular al cual se
une el ligando.
- La señalización celular comienza con la unión de un ligando a su receptor específico, a
nivel de la superficie celular (reconocimiento). Dicha unión determina cambios
conformacionales en el receptor que permiten el paso de la señal a través de la membrana
(transferencia). A continuación, la señal llega hasta las moléculas efectoras, asociadas en la
cara interna de la membrana plasmática y que desencadenaran la respuesta (transmisión).
Finalmente, la transmisión de la señal será inhibida a distintos niveles (cese).
- Los fosfolípidos de las membranas son sustrato de fosfolipasas, las cuales se clasifican en
función del lugar por el que rompen a estos lípidos. La PLA1 escinde el acido graso anclado
en el C1 del glicerol, mientras la PLA2 elimina el radical unido al C2. La PLC rompe el
enlace establecido entre el grupo fosfato y el glicerol, liberando un diacilglicérido y la
cabeza polar fosforilada. Finalmente, la PLD libera la cabeza polar dejando el fosfato unido
al C3 del glicerol.
- El fosfatidil inositol es fosforilado por la PI4K, dicha quinasa cede un fosfato al grupo
hidroxilo del carbono cuatro del inositol, para dar lugar al PIP. Este producto es sustrato,
ahora, de la PI5K, quien cede otro fosfato al inositol, en este caso a nivel del OH del
carbono 5, dando lugar al PIP2. Finalmente, la PI3K puede añadir un fosfato más a nivel del
OH en el C3 del inositol dando lugar al PIP3. Para la obtención de este ultimo fosfoinosítido,
a partir de PI, se han consumido 3 moléculas de ATP.
- Los Receptores Tirosín Quinasa inactivos aparecen en forma monomérica. La unión a su
ligando determina la dimerización de dos monómeros, permitiendo la fosforilación cruzada
de ambos, a través del dominio tirosín quinasa localizado a nivel citoplasmático. Los
dímeros fosforilados constituye la forma activa, siendo reconocidos por proteínas con
dominios SH2.