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Centro de Investigación en Materiales Avanzados, S. C.
DOCTORADO EN CIENCIA DE MATERIALES
TESIS:
“Síntesis enzimática y propiedades térmicas de
Poli(lactonas) y sus copolímeros obtenidos vía
polimerización por apertura de anillo”
Presenta:
M. en C. Wilberth Antonio Herrera Kao
Asesores:
Dra. Tania E. Lara Ceniceros (CIMAV-Monterrey)
Dr. Manuel Aguilar Vega (CICY)
Apodaca, Nuevo León, Noviembre del 2014.
Índice
Índice de tablas -------------------------------------------------------------------------------- vii
Índice de Figuras ----------------------------------------------------------------------------- viii
Resumen ----------------------------------------------------------------------------------------- 1
Abstract ------------------------------------------------------------------------------------------ 2
Introducción -------------------------------------------------------------------------------------- 3
Hipótesis ------------------------------------------------------------------------------------------ 7
Justificación -------------------------------------------------------------------------------------- 8
Objetivo general ------------------------------------------------------------------------------- 10
Objetivos específicos ----------------------------------------------------------------------- 10
Capítulo I
1.1.
Polímeros y biopolímeros ---------------------------------------------------------- 11
1.2.
Las enzimas --------------------------------------------------------------------------- 13
1.2.1. Especificidad y selectividad de la enzima -------------------------------------- 17
1.2.2. Especificidad y selectividad en el sustrato ------------------------------------ 18
1.2.3. Factores importantes que determinan la selectividad ---------------------- 19
1.2.4. Clasificación de las enzimas ------------------------------------------------------ 19
i
1.3.
Síntesis de poliésteres catalizados por enzimas ---------------------------- 22
1.4.
Polimerización enzimática por apertura de anillo ---------------------------- 22
1.4.1. Mecanismo de la polimerización por apertura de anillo catalizada por
enzimas -------------------------------------------------------------------------------- 24
1.4.2. Ventajas del la Polimerización por apertura de anillo ---------------------- 25
1.5.
Cándida antárctica, lipasa tipo B (CALB) -------------------------------------- 26
Capítulo II.
Materiales y métodos
2.1. Reactivos --------------------------------------------------------------------------------- 29
2.2. Síntesis de los polímeros y copolímeros ------------------------------------------ 30
2.2.1. Síntesis de las lactonas usando Lipasa Pancreática Porcina, LPP ----- 30
2.2.2 Síntesis de lactonas con lipasa tipo B de Cándida antárctica (CALB) --- 33
2.2.3. Síntesis de los copolímeros -CL/PDL con lipasa tipo B de Cándida
antárctica (CALB) ----------------------------------------------------------------------------- 35
2.2.4. Síntesis de los polímeros con grupo lateral con lipasa tipo B de Cándida
antártica (CALB) inmovilizada utilizando una síntesis en dos etapas ----------- 36
2.3. Caracterización por espectroscopia de Infrarrojo con transformada de
Fourier, FTIR ----------------------------------------------------------------------------------- 37
2.4. Determinación del peso molecular por GPC ------------------------------------- 38
2.4.1. Cinética de polimerización --------------------------------------------------------- 38
ii
2.5. Resonancia Magnética Nuclear, RMN -------------------------------------------- 38
2.6. Caracterización térmica --------------------------------------------------------------- 39
2.6.1. Determinación de la temperatura de descomposición, Td por análisis
termogravimétrico, TGA --------------------------------------------------------------------- 39
2.4.2. Determinación de la temperatura de transición vítrea, T g, y de fusión, Tm
por análisis de Calorimetría Diferencia de Barrido, DSC --------------------------- 39
Capítulo III.
Resultados y discusiones
3.1. Resultados de la Síntesis de las lactonas usando Lipasa Pancreática
Porcina, LPP ----------------------------------------------------------------------------------- 40
3.2 Resultados de la Síntesis de las lactonas usando Lipasa Cándida
antárctica (Novozyme 435, N435) -------------------------------------------------------- 41
3.2.1. Resultados de peso molecular y porcentaje de conversión de
Polilactonas ------------------------------------------------------------------------------------- 42
3.2.2. Conversión del polímero en función del tiempo ------------------------------- 44
3.2.3. Perfil cromatográfico del sistema de reacción de -CL -BTL------------- 45
3.2.4. Características físicas de Poli( -caprolactona), P -CL y
Poli(pentadecanólido), PPDL, obtenidos por síntesis enzimática ---------------- 49
3.3. Caracterización de los polímeros obtenidos ------------------------------------- 50
iii
3.3.1. Caracterización por espectroscopia de infrarrojo, FTIR de Poli( caprolactona), P -CL y Poli(pentadecanólido), PPDL ------------------------------- 50
3.3.2. Caracterización por Resonancia magnética nuclear, RMN de Poli( caprolactona), P -CL y Poli(pentadecanólido), PPDL ------------------------------- 52
3.3.3. Caracterización por espectroscopia de infrarrojo, FTIR, de poli(lactonas)
con grupo lateral ------------------------------------------------------------------------------ 54
3.4. Caracterización por análisis térmico de los polímeros obtenidos ---------- 56
3.4.1. Caracterización por calorimetría diferencial de barrido, DSC para Poli( caprolactona), P -CL y Poli(pentadecanólido), PPDL-------------------------------- 56
3.4.2. Caracterización por análisis termogravimétrico, TGA para Poli( caprolactona), P -CL y Poli(pentadecanólido), PPDL ------------------------------- 60
3.4.3. Caracterización por análisis termogravimétrico, TGA para Poli( butirolactona), PBTL, Poli(decanolactona), PDCL y Poli(5-dodecanólido)
P5DDCL ---------------------------------------------------------------------------------------- 62
3.5. Polimerización por apertura de anillo en dos pasos de lactonas con grupo
lateral --------------------------------------------------------------------------------------------- 63
3.5.1. Polimerización por apertura de anillo en dos pasos incrementando la
concentración de enzima en lactonas con grupo lateral ---------------------------- 64
3.6. Síntesis de copolímeros de -CL-co-PDL mediante un proceso de
polimerización por apertura de anillo ---------------------------------------------------- 66
iv
3.6.1. Caracterización por espectroscopia de infrarrojo, FTIR, de copolímeros
de
-CL-co-PDL ------------------------------------------------------------------------------ 68
3.6.2. Caracterización por Resonancia magnética nuclear, RMN de copolímeros
-CL-co-PDL ----------------------------------------------------------------------------------- 69
3.6.3. Caracterización por análisis térmico de los copolímeros obtenidos ----- 72
3.6.3.1. Caracterización por calorimetría diferencial de barrido, DSC para
copolímeros -CL-co-PDL ------------------------------------------------------------------ 72
3.6.3.2. Caracterización por análisis termogravimétrico, TGA, para copolímeros
-CL-co-PDL ----------------------------------------------------------------------------------- 74
3.7. Propiedades térmicas para mezclas físicas de -CL/ PDL 50:50 ---------- 75
3.7.1. Análisis de calorimetría diferencial de Barrido, DSC, para una mezcla
física de P -CL/ PPDL 50:50 --------------------------------------------------------------- 75
3.7.2. Análisis termogravimétrico, TGA, para una mezcla física de P -CL/
PPDL 50:50 ------------------------------------------------------------------------------------ 77
3.8. Síntesis de lactonas a dos diferentes temperaturas 70°C y 90ºC por
polimerización por apertura de anillo ---------------------------------------------------- 78
3.8.1. Caracterización por espectroscopia de infrarrojo, FTIR de
Poli(pentadecanólido), PPDL obtenido a 70°C y 90°C ------------------------------ 79
3.8.2. Caracterización por resonancia magnética nuclear, RMN de
Poli(pentadecanólido), PPDL obtenido a 70°C y 90°C ------------------------------ 81
v
3.8.3. Difracción de Rayos X para Poli(pentadecanólido), PPDL obtenido a
70°C y 90°C ------------------------------------------------------------------------------------ 83
3.8.4. Caracterización por análisis térmico para Poli(pentadecanólido), PPDL
obtenida a 70°C y 90°C --------------------------------------------------------------------- 84
3.8.4.1. Caracterización por calorimetría diferencial de barrido, DSC para
Poli(pentadecanólido), PPDL obtenida a 70°C y 90°C ------------------------------ 84
3.8.4.2. Caracterización por análisis termogravimétrico, TGA, para
Poli(pentadecanólido), PPDL obtenida a 70°C y 90°C ------------------------------ 88
Conclusiones ----------------------------------------------------------------------------------- 90
Referencias ------------------------------------------------------------------------------------ 93
vi
Índice de tablas
Tabla 2.1. Propiedades físicas de los monómeros………………………………30
Tabla 2.2. Concentraciones de reactivos en el sistema de reacción usada en la
Síntesis de las lactonas catalizada por Lipasa Pancreática Porcina, LPP……32
Tabla 3.1. Síntesis de varias lactonas por polimerización por apertura de anillo
a 75°C utilizando novozyme 435…………………………………………………...42
Tabla 3.2. Síntesis de copolímeros a partir de -CL y PDL por polimerización
por apertura de anillo a 75°C utilizando novozyme 435…………………………66
vii
Índice de Figuras
Figura 1.1. Representación esquemática de una lipasa visualizando la
estructura secundaria y la estructura terciaria que proporciona la conformación
general……………………………………………………………………………...... 13
Figura 1.2. Representación esquemática de una reacción enzimática
visualizando el corte de una enzima que parecería tener forma globular y
mostrando su sitio activo cuya forma permite la interacción con el sustrato que
debe ajustarse a la misma geometría……………………………………………...14
Figura 1.3. Gráfica de las energías de las diferentes fases de una reacción.
Los sustratos precisan mucha energía para alcanzar el estado de transición,
pero una vez alcanzado, se transforman en productos. La enzima estabiliza el
estado de transición, reduciendo la energía necesaria para formar los
productos……………………………………………………………………………...15
Figura 1.4. Mecanismo de polimerizacion por apertura de anillo propuesto
catalizado por Cándida antárctica; lipasa tipo B………………………………… 24
Figura 1.5. Ilustración de la enzima CALB……………………………..……….. 27
Figura 1.6. Mecanismo de reacción de Cándida antárctica; lipasa tipo B…… 28
Figura 2.1. Sistema de reacción de polimerización por apertura de anillo
catalizado por N435………………………………………………………………… 33
Figura 3.1. Conversión de monómero durante la polimerización enzimática en
un paso………………………………………………………………………………. 44
Figura 3.2. Perfil de GPC del producto de polimerización de
-Caprolactona
catalizado por N435 a diferentes tiempos………………………………………. 46
Figura 3.3. Perfil de GPC de la reacción de polimerización de -Butirolactona
catalizada por N435 a diferentes tiempos……………………………………… 47
Figura 3.4. Aspecto de los polímeros obtenidos por polimerización por apertura
de anillo catalizado por N435 a partir de lactonas sin grupo lateral…………. 50
Figura 3.5. Espectros de FTIR de polímeros obtenidos a partir de lactonas sin
grupo lateral mediante polimerización por apertura de anillo…………….….... 51
viii
Figura 3.6. Espectro 1H NMR de a) poli( -caprolactona), P -CL y b)
poli(pentadecanólido), PPDL, en CDCl3…………………………………..……… 52
Figura 3.7. Espectro de FTIR de productos obtenidos de lactonas con grupo
lateral mediante polimerización por apertura de anillo de un paso………….... 54
Figura 3.8a. Termogramas de DSC para P -CL obtenida de polimerización por
apertura de anillo de un paso; segunda, R2, y tercera, R3, prueba de
calentamiento……………………………………………………………………….. 56
Figura 3.8b. Termogramas de DSC del comportamiento de la cristalización
para P -CL obtenida de polimerización por apertura de anillo de un paso;
primera, R1, y segunda, R2 corrida de enfriamiento………………………..…… 57
Figura 3.9a. Termogramas de DSC para PPDL obtenida de polimerización por
apertura de anillo de un paso; segunda, R2, y tercera, R3, prueba de
calentamiento……………………………………………………………………….. 58
Figura 3.9b. Termogramas de DSC del comportamiento de la cristalización
para PPDL obtenida de polimerización por apertura de anillo de un paso;
primera, R1, y segunda, R2 corrida de enfriamiento…………………………….. 59
Figura 3.10. Termogramas de TGA de la degradación térmica de P -CL and
PPDL obtenidos por polimerización por apertura de anillo de un paso………. 61
Figura 3.11. Termogramas de TGA de la degradación térmica de productos
obtenidos de lactonas con grupo lateral, P -BTL, PDCL y P5DDCL, por
polimerización enzimática por apertura de anillo de un
paso…………………………………………………………………………..………. 62
Figura 3.12. Espectros de FTIR de poli( -butirolactona) con Novozime 435
mediante un proceso de síntesis de 2 etapas con 30, 40 y 60% de N435…… 64
Figura 3.13. Aspecto de los copolímeros obtenidos por polimerización por
apertura de anillo catalizado por N435 a partir de lactonas sin grupo
lateral…………………………………………………………………………………. 67
Figura 3.14. Resultados de FTIR de copolímeros con concentraciones de
75/25, 50/50 y 25/75 de -CL/PDL en mol %.................................................... 68
Figura 3.15. RMN de copoliésteres con concentraciones de 75/25, 50/50 y
25/75 de -CL/PDL en mol %............................................................................ 70
ix
Figura 3.16. Termogramas de DSC de copoliésteres con concentraciones de
75/25, 50/50 y 25/75 de -CL/PDL en mol % en el segundo calentamiento…. 73
Figura 3.17. Termogramas de TGA de copoliésteres con concentraciones de
75/25, 50/50 y 25/75 de -CL/PDL en mol % en el segundo calentamiento…. 74
Figura 3.20. Termogramas de DSC de una película obtenida por mezcla física
con una concentración de 50/50 % en peso de P CL/PPDL……………...………………………………………………………..….… 76
Figura 3.21. Termogramas de TGA de la degradación térmica para la película
de P -CL/PPDL en un concentración de 50/50 % en peso mezclando
físicamente los polímeros………..…………………………………………….…
77
Figura 3.22. Espectro de FTIR para poli(pentadecanólido), PPDL obtenida a
70°C y 90ºC…………………………………………..……….…………………….. 80
Figura 3.23. Espectro de RMN para poli(pentadecanólido), PPDL obtenida a
70ºC (abajo) y 90ºC (arriba)………………………………………………..……… 82
Figura 3.24. Difracción de rayos x de PPDL obtenido por polimerización por
apertura de anillo a 70ºC y
90°C)…………………………………………………………………………………. 84
Figura 3.25. Termogramas de DSC para PPDL obtenido por polimerización
enzimática a 70ºC y
90°C………………………………………………………………………………… 85
Figura 3.26. Termogramas de DSC del comportamiento de cristalización para
PPDL obtenido por polimerización enzimática a 70ºC y
90°C……………………………………………………………………………….…. 87
Figura 3.27. Termogramas de la pérdida de masa por TGA para PPDL
obtenido a dos diferentes temperaturas 70ºC y
90°C………………………………………………………………………...……...… 88
Figura 3.28. Termogramas de la primera derivada para PPDL obtenido a dos
diferentes temperaturas 70ºC y 90°C……………………..……………………… 89
x
Resumen
En este trabajo se sintetizaron dos diferentes polilactonas y sus copolímero a partir de
la -caprolactona, -CL, y el pentadecanolido, PDL utilizando como catalizador una
lipasa tipo B de Cándida antárctica (CALB) inmovilizada sobre una resina acrílica
macroporosa, y que tiene por nombre comercial (Novosyme 435), N435. Los
homopolímeros de P -CL y el PPDL alcanzaron un porcentaje de conversión de un
96% con pesos moleculares entre 26,076 g/mol con un índice de polidispersidad de
1.5 para la fracción soluble. La Tm obtenida por DSC para estos polímeros fue de 69°C
con un porcentaje de cristalinidad de 55% para la P -CL y 93°C con un porcentaje de
cristalinidad de 78% para la PPDL. En el caso de los copolímeros alcanzaron un
porcentaje de conversión de un 96% con pesos moleculares entre 40 y 41,000 g/mol
para 75 y 50% de -CL y 31, 000 g/mol para el 25% de -CL, con un índice de
polidispersidad de 1.2 para la parte soluble. Por otro lado, copolímeros con 75 y 25%
molar de
-CL muestran una sola Tm a 60 y 70°C respectivamente mientras que un
50% molar muestra dos Tm’s a 60 y 71°C y presentan una temperatura de degradación
por encima de 350°C para todos los copolímeros. Evidencias de FTIR mostraron la
correcta síntesis y obtención de los homopolímeros, pues muestran una absorción
muy intensa a 1725 cm-1 para la P -CL, 1733 cm-1 para el PPDL y 1733 cm-1 de los
copolímeros pertenecen a las vibraciones de estiramiento de –C=O del grupo
carbonilo del éster. Un incremento en la temperatura de reacción a 90°C propicia que
el PPDL presente un peso molecular y una cristalinidad menor que la PPDL preparada
a 70°C además, de que por FTIR se observo una fase amorfa producida por la
presencia de grupos OH terminales. La PPDL sintetizada a 90°C presenta múltiples
eventos de fusión y cristalización a bajas temperaturas que no se observan en la
PPDL obtenida a 70°C. Las diferencias en el comportamiento de cristalización se
pueden atribuir a la presencia de la fase amorfa de la PPDL sintetizada a 90°C debido
al incremento de los grupos OH terminales que rompen la estructura cristalina.
1
Abstract
Polymerization of several lactones was carried out by either one or two steps
polymerization methods employing novozyme 435 (N-435) as catalyst.
Polymerization of lactones without side groups reached conversions of 96% at
12 h with molecular weights above 26076 g/mol for the soluble fraction. Thermal
analysis
showed
that
these
polymers
have
a
Tm
of
69
for
the
poly(caprolactone), PCL, with a cristallinity of 55% and a T m at 93°C and 78%
crystallinity for Poly(pentadecanolide), PPDL. On the other hand, the data
obtained indicate that the lactone monomers bearing side groups produce only
oligomers regardless of the steps used in the polymerization which is attributed
to steric hindrance induced by the side groups of lactones. On the other hand,
copolymers of
-caprolactone,
-CL, and pentadecanolide, PDL with 75/25,
50/50 and 25/75 mol % concentrations were synthesized employing novozyme
435 (N-435) as catalyst. They showed have the same percent conversion that
the homopolymers at 24 h reaction; although the molecular weight of the
soluble phase was higher. Thermal analysis showed that these copolymers with
75 mol % and 25 mol % of -CL only show a single melting peak at 63 and 79°C
respectively while the copolymer with 50 mol % of -CL show two melting peaks
at 61 and 71°C. The poly(pentadecanolide), PPDL, synthesized by enzymatic
ring opening polymerization at 90ºC, presents lower molecular weight and
crystallinity than the one prepared at 70ºC. It was detected by FTIR that PPDL
synthesized at 90ºC presents a large amorphous phase with more terminal OH
groups. A difference in the melting and crystallization behavior was detected by
differential scanning calorimetry, DSC, where the melting of the PPDL
synthesized at 90ºC presents multiple melting and crystallization events at
lower temperature than those exhibit by PPDL synthesized at 70ºC which
presents a well defined single melting and crystallization event. The differences
in melting and crystallization behavior are attributed to the presence of a larger
amorphous phase in PPDL synthesized at 90ºC due to increased number of
terminal OH groups that disrupt the crystalline structure. Thermal stability is also
higher in PPDL synthesized at 70ºC since the onset of decomposition starts
50ºC above that observed in PPDL obtained at 70ºC.
2
Introducción
En los últimos años la obtención de plásticos biodegradables a partir de
materiales naturales, ha sido uno de los grandes retos en diferentes sectores:
industrial, agrícola y de materiales para servicios varios. Los poliésteres
alifáticos tales como los polihidroxialcanoatos, PHA´s, y las polilactonas son
poliésteres termoplásticos naturales que pueden ser obtenidos de fuentes
naturales renovables pues son producidos por un amplio rango de
microorganismos y en algunos casos por plantas [1-6]. Ellos presentan la
ventaja de ser biodegradables, un hecho que ha recibido una amplia atención,
además de que puede ser una muy buena opción para producir polímeros que
permitan sustituir en gran medida a los polímeros sintéticos provenientes del
petróleo [7, 8]. El polihidroxibutirato, (PHB) un miembro de la familia de los
PHA´s fue el primer poliéster biodegradable descubierto en 1927 por Legmoine
en bacterias del género Bacillus megaterium [9]. Posteriormente, en 1993, el
grupo de Uyama, Kobayashi y colaboradores [10] y el grupo de Kani [11]
reportaron independientemente la obtención de poliésteres alifáticos a partir de
lactonas, especialmente
-caprolactona y
-valerolactona por polimerización
por apertura de anillo catalizado por lipasas. Estos polímeros han sido
obtenidos además por procesos de fermentación y procesos químicos [12],
aunque también se reporta la polimerización por apertura de anillo catalizada
por enzimas. En este sentido, los parámetros de investigación ensayados han
sido el efecto del origen de la enzima [13, 14], concentración del monómero y
catalizador [15] temperatura de reacción [16, 17,18], tipo de solvente [19, 20], el
uso de líquidos iónicos [21,22, 23] y el uso del contenido de agua [24].
3
Recientemente, los reportes de la literatura han hecho énfasis en que la
polimerización por apertura de anillo es una alternativa muy prometedora
debido a que usa materiales ambientalmente benignos comparado con la
polimerización química, el cual, emplea catalizadores organometálicos [25]. La
polimerización enzimática por apertura de anillo también ha mostrado ser un
método efectivo para el diseño y la síntesis de materiales poliméricos
ambientalmente aceptables [26]. Por otro lado, la alta biocompatibilidad
mostrada por estos polímeros hace que ellos sean adecuados para varias
aplicaciones farmacéuticas y médicas tales como suturas quirúrgicas,
andamios para ingeniería de tejidos y sistemas de liberación de fármacos, entre
otros. Sin embargo, para estas aplicaciones los residuos organometálicos
generados por el catalizador químico no son tolerados debido a su toxicidad.
Por lo tanto, el uso de enzimas para la síntesis de polímeros usados en
aplicaciones biomédicas se ha perseguido en las últimas décadas debido a que
los polímeros obtenidos no son tóxicos y las reacciones pueden ser realizadas
bajo condiciones benignas y amigables [27]. Los biopolímeros obtenidos por
polimerización por apertura de anillo catalizada enzimáticamente, han recibido
mucha atención debido a que son biodegradables, biocompatibles y además,
son ambientalmente amigables. Adicionalmente, ellos presentan propiedades
similares en comparación a los polímeros sintéticos tales como el polietileno y
el polipropileno [9,28, 29]. Sin embargo, existen varias deficiencias para el uso
comercial de estos polímeros, entre ellos se encuentran el costo de producción
pues es relativamente caro comparado con la producción de otros polímeros, y
son algo quebradizos para ser usados por debajo de su temperatura de
transición vítrea; además de que se degradan térmicamente con mayor
4
facilidad por debajo de su punto de fusión. Para reducir esta debilidades varios
copolímeros con diferentes tipos de unidades de poliésteres alifáticos como por
ejemplo poli(hidroxibutirato-co-hidroxivalerato), PHBV, ha sido biosintetizado
[30]. La síntesis enzimática de copoliésteres de poli(12 hidroxidodecanoato)-co12-hidroxiesterato), poli( -pentadecanolactona)-co-poli(trimetilen carbonato),
poli(R)-3-hidroxibutirato)-co-poli( -caprolactona), copolímeros de etil glicolato y
-pentadecanolactona y varios otros han sido sintetizados por la polimerización
por apertura de anillo usando Cándida antártica B inmovilizada en un soporte
acrílico, novozime 435. Sin embargo, solamente algunos de estos copolímeros
han demostrado buenas propiedades termoplásticas [28, 31, 32, 33]. Por otra
parte, la síntesis de los copolímeros de
-pentadecanolactona,
-PDL y -
caprolactona -CL usando Novozime 435 ha sido reportado por Ceccorulli G. et
al and Kumar A. et al, sin embargo, los pesos moleculares obtenidos fueron
entre 20,000 y 38,000 g/mol [34,35].
Basado en esta perspectiva, en el presente trabajo se estudio la polimerización
por apertura de anillo de lactonas, en particular de lactonas con y sin grupo
lateral, catalizado por dos tipos de lipasas; la Cándida antárctica (CALB)
inmovilizada en una resina acrílica, cuyo nombre comercial es Novozyme 435,
(N435) y una lipasa pancreática porcina nativa, (LPP) para preparar lactonas
con diferentes tamaños de cadena. El propósito de usar diferentes tipos de
lactonas es para comparar el efecto del grupo lateral en la síntesis y sobre las
propiedades químicas y térmicas de los polímeros obtenidos. Por otro lado, se
reporta la síntesis y caracterización de copolímeros de -caprolactona, -CL y
un pentadecanolido, PDL, con diferentes concentraciones de lactonas. Dado
5
que los resultados obtenidos en las lactonas con grupo lateral no fue el
esperado en sistemas de un paso, también fue necesario estudiar el efecto del
contenido de agua y la concentración de enzima en un sistema dos pasos.
6
Hipótesis
Es factible obtener polímeros biodegradables a partir de lactonas con diferentes
tamaños de anillos que posean estructuras morfológicas y propiedades
fisicoquímicas diferentes mediante la polimerización enzimática por apertura de
anillo catalizada por lipasas variando la temperatura del medio de reacción y
utilizando condiciones de reacciones menos drásticas y ambientalmente
seguras que los procesos químicos.
7
Justificación
En los últimos años se ha observado una tendencia creciente no solo en el
desarrollo de nuevos métodos o técnicas de obtención sino también en la
búsqueda, desarrollo y empleo de nuevos polímeros que nos permitan la
sustitución temporal o permanente de los polímeros convencionales ya
existentes. Esto, es debido a los inconvenientes asociados con el uso de los
polímeros convencionales, no solo desde el punto de vista ambiental, sino
también con sus métodos de obtención y la disminución de las reservas
petroleras aunado a la creciente demanda en el campo biomédico. Ante esta
perspectiva surgen los biopolímeros o polímeros biodegradables los cuales
puede ser obtenidos polimerización por apertura de anillo catalizado por
enzimas, la cual es una alternativa muy prometedora debido a que usa
materiales ambientalmente benignos comparado con la polimerización química,
el cual, emplea catalizadores organometálicos o por medios bacterianos cuyo
costo de producción es relativamente alto. Por otra parte, estos constituyen una
alternativa ecológica pues presentan la ventaja de ser biodegradables, además
de que resultan ser una muy buena opción para producir polímeros que
permitan sustituir a los polímeros sintéticos tales como el polietileno y el
polipropileno pues ofrecen propiedades similares a estos polímeros. Por otra
parte, la alta biocompatibilidad mostrada por estos polímeros hace que ellos
sean adecuados para varias aplicaciones farmacéuticas y médicas además, de
que son completamente degradados en compuestos que no dañan el medio
ambiente pues sus cadenas poliméricas se convierten en CO2, CH4 y H2O,
biomasa y otros componentes básicos . El lograr el control de la polimerización
8
enzimática por apertura de anillo, de monómeros para producir polímeros
biodegradables, será un avance significativo que permitiría aumentar las
capacidades de producción y reducir los costos de preparación de estos
materiales.
9
Objetivos
Objetivo general
Sintetizar y caracterizar las propiedades térmicas de polímeros y copolímeros
de poli(lactonas) obtenidos por polimerización enzimática a partir de diferentes
lactonas.
Objetivos específicos
 Sintetizar polímeros y copolímeros a partir de 5 diferentes lactonas
utilizando lipasa pancreática porcina y/o la lipasa tipo B de Cándida
antárctica
inmovilizada
sobre
una
resina
acrílica
macroporosa
(Novozyme 435).
 Determinar el efecto de la estructura del monómero de lactona sobre el
rendimiento de la reacción, peso molecular y morfología de la
poli(lactona) obtenida.
 Determinar el efecto del tipo y concentración de la lipasa sobre el
rendimiento de la reacción, peso molecular y morfología de la
poli(lactona) obtenida.
 Determinar el efecto de la temperatura de reacción sobre el rendimiento,
peso molecular y morfología de la poli(lactona) obtenida.
 Determinar las propiedades térmicas de los polímeros y copolímeros
obtenidos.
 Desarrollar películas a partir de las poli(lactonas) obtenidas
10
Capítulo 1
1.1.
Polímeros y biopolímeros
Los polímeros son moléculas grandes formadas por la repetición de
subunidades idénticas, similares o complementarias
llamadas monómeros
[36]. Estos polímeros pueden originarse de fuentes naturales (o pueden ser
producidos sintéticamente por métodos químicos. Así, los polímeros “naturales”
(también llamados biopolímeros), entre los que se encuentran el almidón, el
hule, la seda y el DNA, son producidos por procesos en los que se realizan
múltiples pasos bioquímicos en una célula viva. Por otra parte, los polímeros
sintéticos fueron comercializados por primera vez en 1890 y desde entonces, la
biblioteca de los polímeros sintéticos se ha ampliado drásticamente, lo que los
ha llevado a obtener una posición dominante en nuestra vida diaria por su
aplicación en toda clase de materiales, tales como ropa, materiales de
construcción, recubrimientos, adhesivos y muchas otras aplicaciones [37,38].
Entre la clasificación de polímeros sintéticos se encuentran los biopolímeros
sintéticos también llamados biomateriales, los cuales son producidos a partir
de fuentes de recursos naturales obtenidos de las plantas u organismos vivos.
Así, los polímeros sintéticos biodegradables son una clase de polímeros
diseñados para descomponerse una vez que cumple la función para la que
fueron creados. Por otra parte, estos constituyen una alternativa
ecológica
pues presentan la ventaja de ser biodegradables, hecho que ha recibido una
amplia atención, además de que resultan ser una muy buena opción para
producir polímeros, que permitan sustituir en gran medida, a los polímeros
sintéticos provenientes del petróleo tales como el polietileno y el polipropileno
11
pues pueden ofrecer propiedades similares a estos polímeros [7, 8, 39]. Por
otro lado, desde el punto de vista industrial, los biopolímeros resultan ser
amigables con el medio ambiente pues comienzan a degradarse por la acción
enzimática de los microorganismos tales como bacterias, hongos y algas o por
reacciones químicas con el medio ambiente. La biodegradación convierte sus
cadenas poliméricas en CO2, CH4 y H2O, biomasa y otros componentes
básicos [40]. Las características de biodegradabilidad los hace fuertes
candidatos para ser usados como materiales de embalaje (bolsas de basura,
espumas de relleno suelto, contenedores de alimentos, papel laminado, etc),
tejidos no desechables (telas de ingeniería) y productos de higiene (hisopos de
algodón, etc); bienes de consumo y en aplicaciones biomédicas [41, 42, 43].
Los biomateriales son materiales que han sido modificados para ser usados
solos o formando partes de sistemas más complejos, en medicina humana o
veterinaria;
para dirigir el curso de un procedimiento de diagnostico o
terapéutico, mediante el control de las interacciones con componentes de los
sistemas vivientes [44]. Por lo general, se dividen en biomateriales poliméricos,
metálicos y cerámicos y son ampliamente usados en varios campos
biomédicos, desde lentes de contacto, dializadores de riñón, injertos
cardiovasculares para marcapasos cardiovasculares y liberadores de fármacos
con el propósito de mejorar la calidad de vida del ser humano [45, 46].
12
1.2.
Las enzimas
Las enzimas son moléculas de naturaleza estructural y proteica que catalizan
reacciones químicas.
Figura 1.1. Representación esquemática de una lipasa visualizando la
estructura secundaria y la estructura terciaria que proporciona la conformación
general.
Siempre que sean termodinámicamente posible: una enzima hace que una
reacción química, que es energéticamente posible, pero que transcurre a una
velocidad muy baja, sea cinéticamente favorable, es decir, transcurra a mayor
velocidad que sin la presencia de la enzima. En estas reacciones las enzimas
actúan sobre unas moléculas llamadas sustratos los cuales se convierten en
moléculas diferentes denominadas productos tal como se muestra en la Figura
1.2.
13
Productos
Sustrato
Enzima
Complejo enzima-sustrato
Figura 1.2. Representación esquemática de una reacción enzimática
visualizando
el corte de una enzima que parecería tener forma globular y
mostrando su sitio activo cuya forma permite la interacción con el sustrato que
debe ajustarse a la misma geometría.
A las reacciones mediadas por enzimas se les llama reacciones enzimáticas.
Debido a que las enzimas son extremadamente selectivas con sus sustratos y
su velocidad crece solo con algunas reacciones, el conjunto o set de enzimas
sintetizadas en una célula determina el tipo de metabolismo que tendrá cada
célula. Como todos los catalizadores, las enzimas funcionan disminuyendo la
energía de activación
G de una reacción, de tal forma que aceleran
sustancialmente la tasa de reacción tal como se muestra en la Figura 1.3. Las
enzimas no alteran el balance energético de las reacciones en las que
intervienen, ni modifican, por tanto, el equilibrio de la reacción, pero si
consiguen acelerar el proceso incluso millones de veces. Una reacción que se
produce bajo el control de una enzima o de un catalizador en general, alcanza
el equilibrio mucho más rápido que la correspondiente reacción no catalizada.
14
Figura 1.3. Gráfica de las energías de las diferentes fases de una reacción. Los
sustratos precisan mucha energía para alcanzar el estado de transición, pero
una vez alcanzado, se transforman en productos. La enzima estabiliza el
estado de transición, reduciendo la energía necesaria para formar los
productos.
Al igual de lo que ocurre con otras reacciones, las enzimas no son consumidas
por las reacciones que catalizan, ni alteran su equilibrio químico, sin embargo,
las enzimas difieren de otros catalizadores por ser más específicas. Por otra
parte la actividad de la enzima puede ser afectada por otras moléculas como
son los llamados
inhibidores enzimáticos los cuales son moléculas que
disminuyen o impiden la actividad de las enzimas, mientras que los llamados
activadores son moléculas que incrementan dicha actividad. Así mismo, gran
cantidad de enzimas requieren de cofactores para su actividad [47].
15
Las enzimas son generalmente proteínas globulares que pueden presentar
tamaños muy variables, desde 62 aminoácidos como en el caso de la 4oxalocrotonato tautomerasa hasta los 2500 presentes en la sintetasa de ácidos
grasos. La actividad de la enzima es determinada por su estructura
tridimensional, que a su vez es determinada por la secuencia de aminoácidos.
Sin embargo, aunque la estructura determina la función, predecir una nueva
actividad enzimática basándose únicamente en la estructura de una proteína es
muy difícil y un problema aun no resuelto. Casi todas las enzimas son mucho
más grandes que los sustratos sobre los que actúan y solo una pequeña parte
de la enzima, alrededor de 3 o 4 aminoácidos están directamente involucrados
en la catálisis. La región que contiene estos residuos encargados de catalizar la
reacción es denominada centro activo. Suelen ser muy específicas tanto del
tipo de reacción que catalizan así como del sustrato involucrado en la reacción.
La forma, la carga y las características hidrofílicas e hidrofóbicas de las
enzimas y los sustratos son los responsables de dicha especificidad. También
pueden mostrar un elevado grado de estereoespecificidad, regioselectividad y
quimioselectividad. Casi todas las enzimas conocidas son proteínas. Sin
embargo, las proteínas no tienen un monopolio absoluto sobre la catálisis. Las
proteínas son una clase de macromoléculas, catalizadores altamente efectivos
para una enorme diversidad de reacciones químicas debido a su capacidad
para unirse específicamente a un amplio rango de moléculas. Utilizando todo
su repertorio de fuerzas intermoleculares, las enzimas atraen las sustancias en
una orientación óptima, el preludio para hacer y romper enlaces químicos. Ellas
catalizan la reacción mediante estabilización de estados de transición, la
especie de mayor energía en vía de reacción. Estabilizando selectivamente un
16
estado de transición, una enzima determina cual de las varias posibles
reacciones toma lugar actualmente. Las enzimas son altamente específicas en
las reacciones que ellas catalizan y a la vez para escoger sus reactantes, los
cuales son llamados sustratos. Una enzima generalmente cataliza una sola
reacción química o un juego de reacciones muy relacionadas [48].
1.2.1. Especificidad y selectividad de la enzima
El término especificidad y selectividad es usado mucho en enzimología y a
menudo se mezclas de una manera confusa. Muchas preguntas surgen cuando
se habla de este concepto. Sin embargo, en una reacción específica muchas
de las enzimas muestran una especificidad muy marcada para la reacción que
ellas catalizan. Esta especificidad en la reacción puede explicarse por el hecho
de que las enzimas estabilizan los diferentes estados de transición de la
reacción ya que tienen diferentes aminoácidos catalíticos en su sitio activo. Por
ejemplo, el ácido glutámico puede ser usado como sustrato por una
transaminasa dando el correspondiente -ceto-ácido y un nuevo aminoácido. Y
puede ser usado por una deshidrogenasa dando como resultado una reacción
de desaminación donde son producidos un
-ceto ácido y amonio. Una
descarboxilasa da lugar a su correspondiente amina y dióxido de carbono [49].
Por otro lado, cuando una enzima cataliza dos diferentes tipos de reacciones,
se habla entonces de selectividad de la reacción. En la literatura, esto se
conoce o ha sido llamado promiscuidad catalítica y ha sido dividida en dos tipos
diferentes la accidental (reacción secundaria de tipo silvestre) o inducida
(nueva reacción establecida por una o más mutaciones).
17
Un ejemplo de una
enzima que muestra una promiscuidad catalítica accidental es la Cándida
antárctica lipasa del tipo B. Esta lipasa tiene, además de su actividad
hidrolítica, la habilidad de catalizar las reacciones de Michael
(también
llamadas adición de Michael la cual consiste en la adición de un enolato, una
cetona o un aldehído sobre el carbono
de un compuesto carbonílico
-
insaturado) para la formación de enlaces C-S. En algún punto la mutación
catalítica de la serina que se encuentra en la posición 105 a alanina incrementa
la actividad de la adiciones de Michael [50,51].
1.2.2. Especificidad y selectividad en el sustrato
La especificidad al sustrato es el término que se utiliza para describir la
especificidad o eficiencia de la enzima hacia cierto sustrato. Esta especificidad
es determinada por la constante de especificidad (kcat/Km). Dos enzimas
pueden ser comparables por su especificidad hacia cierto sustrato solo si
catalizan el mismo tipo de reacción o tienen el mismo mecanismo por ejemplo
la quimiotripsina (endopeptidasa de serina) y la quimosina (endopeptidasa
aspártica) catalizan la misma reacción de tal forma que puedes ser
comparadas por su especificidad de sustrato [52]. En cuanto a la selectividad
del sustrato, las enzimas muestran frecuentemente esta selectividad debido a
que pueden distinguir entre los diferentes sustratos. El valor de la selectividad
entre los dos sustratos A y B es expresado por la razón entre la constante de
especificidad de los dos sustratos comparados (kcat/Km)A/(kcat/Km)B.
18
1.2.3. Factores importantes que determinan la selectividad
Los factores más importantes que determinan la selectividad son las
restricciones espaciales, interacciones electrostáticas, la hidrofobicidad del
área alrededor del sitio activo y el medio con que se estabiliza el estado de
transición. Así, las enzimas discriminan entre diferentes grupos químicos,
quimioselectividad, (la Cándida antárctica lipasa del tipo B es 105 veces más
selectiva para alcoholes que para tioles en reacciones de trans acilación). En el
caso de la regio-selectividad la enzima puede tener selectividad para uno o dos
grupos funcionales similares en una molécula de sustrato. Y en cuanto a la
estero (enantio) selectividad las enzimas muestran selectividad entre estéreoisómeros de una molécula de sustrato. Esto significa que uno de los isómeros
reacciona más rápido que otro [47].
1.2.4. Clasificación de las enzimas
Se pueden distinguir dos tipos de polimerización enzimática, en vivo y en vitro.
Así, la polimerización enzimática en vivo incluye la formación de DNA y
proteínas, la formación de hilo de araña [53] y la formación de poli(4hidroxibutirato) [54]. Sin embargo, para la producción de estos polímeros se
requieren que se lleve a cabo un metabolismo mucho más complejo, el cual da
como resultado, polímeros puros y bien definidos. A diferencia de lo anterior,
las enzimas pueden ser aisladas de organismos vivientes tales como bacterias
y aplicadas en medios acuosos o más aún en medios orgánicos para promover
reacciones específicas sin la necesidad de toda la célula del organismo. Este
19
proceso enzimático es el llamado catálisis in vitro. En la actualidad, las enzimas
son aplicadas en muchos procesos (orgánicos) industriales en un orden que
permita reducir el número de pasos de la reacción o para producir quiralidad en
el producto final de la reacción. En la naturaleza las enzimas pueden dividirse
en 6 clases [48, 55].
I
Óxido-reductasa
Cataliza las reacciones redox por transferencia de
electrones.
II
Transferasas
Cataliza la transferencia de un grupo funcional, por
ejemplo, de un grupo metilo a un grupo glicosídico
desde un compuesto (donador) a otro compuesto
(receptor).
III
Hidrolasas
Cataliza la hidrólisis de varios enlaces en orden para
transferir grupos funcionales a agua.
IV
Liasas
Cataliza las rupturas de los enlaces C-C, C-O, C-N y
otros enlaces de tal modo que por hidrólisis u
oxidación.
V
Isomerasas
Cataliza por racemizacion (proceso químico que
consiste en la conversión de un compuesto L en D o
de D en L) o epimeración (En un compuesto
ópticamente activo que contiene dos o más centros
asimétricos, un proceso en el que solamente uno de
estos centros es alterado por alguna reacción para
formar un epímero) de centros quirales. Las
20
isomerasas son divididas de acuerdo a sus centros
quirales.
VI
Ligasas
Cataliza el acoplamiento de dos moléculas con una
hidrólisis concomitantemente de un enlace di fosfato
a un ATP o un trifosfato similar.
De estas seis clases de enzimas únicamente 3 han sido reportadas para
catalizar o inducir polimerización in vitro, las óxido-reductasas, las transferasas
y las hidrolasas. De estas tres clases las hidrolasas son las enzimas que más
se han investigado para síntesis in vitro. Esta clase incluye a las glicosidasas
las cuales son usadas en la síntesis de polisacáridos, las proteasas que son
usadas para la formación de enlaces péptidos y las lipasas que son usadas
para las síntesis de esteres grasos en la naturaleza. Este último, es
particularmente interesante en la síntesis de polímeros. Se sabe que las lipasas
pueden catalizar reacciones en un medio orgánico debido que ellas presentan
actividad en una interface agua-grasa en la célula y no requieren un
cocatalizador. Por otro lado, pueden ser usadas para reacciones de
policondensación y poli transesterificación, polimerizaciones por apertura de
anillo, PPAA [56] y reacciones de modificación de polímeros. De aquí a que el
uso de la palabra enzima se refiere solamente a la lipasa. Por otra parte, la
aplicación de enzimas en la química de polímeros presenta muchas ventajas:
las reacciones de polimerización pueden llevarse a cabo bajo condiciones
suaves con respecto a la presión, temperatura y pH, lo que hace
a las
reacciones enzimáticas muy eficientes energéticamente [55]. También resultan
ser altamente selectivas: quimio, regio y enantioselectivas (todo puede ser
21
inducido enzimáticamente) abriendo una nueva dirección hacia la síntesis
precisa de polímeros. Las enzimas son consideradas como catalizadores
“verdes”, no tóxicos que pueden satisfacer las demandas y requisitos
comerciales, ecológicos y biomédicas cada vez mayores. La aplicación de las
lipasas no se limita a su entorno original o papel natural: las lipasas pueden
catalizar la hidrólisis pero también pueden catalizar una reacción opuesta como
la condensación.
1.3.
Síntesis de poliésteres catalizados por enzimas.
Los poliésteres alifáticos han sido ampliamente investigados debido a su
viabilidad sintética, la disponibilidad de productos con pesos moleculares
suficientemente altos para su uso como materiales a granel y su capacidad
para someterse a la degradación hidrolítica y biológica. Las hidrolasas y en
particular las lipasas han resultado ser muy exitosas en la síntesis de
poliésteres mediante dos métodos: por policondensación o polimerización por
apertura de anillo. Las lipasas catalizan la policondensación de hidroxiácidos
[57] y la policondensación de diácidos o anhídridos con dioles [58]. Esteres
cíclicos por polimerización por apertura de anillo [59], di esteres cíclicos [60] y
carbonatos cíclicos [61] también han sido polimerizados por enzimas.
1.4.
Polimerización por apertura de anillo enzimática
El primer reporte de la polimerización por apertura de anillo apareció en 1993
cuando Kani y colaboradores y Kobayashi y colaboradores reportaron
22
independientemente la polimerización por apertura de anillo de -caprolactona
( -CL) usando una lipasa [62]. Posteriormente, la polimerización por apertura
de anillo de varias lactonas con tamaños de anillos cortos y largos (de 4 a 17
átomos de carbono), han sido eficientemente catalizados por diferentes lipasas
[63]. A diferencia de la catálisis química [64], lactonas con anillos de 16 átomos
de carbono han sido polimerizadas con gran eficiencia por las enzimas [39].
Por otra parte, poliésteres quirales también han sido polimerizados por
polimerización por apertura de anillo de lactonas racémicas sustituidas [65].
Además, copolímeros al azar fueron enzimáticamente obtenidas por la
copolimerización de diferentes lactonas [66] y lactonas con lactatos [67].
También en la literatura se reporta que la polimerización por apertura de anillo
catalizado por lipasa, ha sido usada para injertar poliésteres sobre la cadena
principal de poliestireno [68].
23
1.4.1. Mecanismo de la polimerización por apertura de anillo catalizada
por una enzima.
La polimerización por apertura de anillo enzimática es una forma de transesterificación donde los esteres cíclicos (lactonas) son usadas como sustratos
y son abiertas por la enzima. En la Figura 1.4. Se muestra el mecanismo de la
trans-esterificación enzimática por polimerización por apertura de anillo [55,
69].
Enzima libre
ET1
Acil enzima
ET2
Figura 1.4. Mecanismo propuesto de polimerización por apertura de anillo
catalizado por Cándida antárctica; lipasa tipo B.
El sitio activo de la lipasa es generalmente formado por una triada catalítica
que consiste en serina, Ser, histidina, His, y aspartato, Asp, que son
electrónicamente estabilizadas durante la reacción [70]. La polimerización de
24
por apertura de anillo catalizada enzimáticamente, (ePAA), puede ser dividida
dos pasos: Iniciación en donde un ataque nucleofílico es necesario para abrir
el anillo de la lactona y la propagación donde la lactona abierta actúa como un
nucleófilo, por su grupo hidroxilo terminal, para la apertura del anillo de una
nueva lactona. El mecanismo de la ePAA es ilustrado en el esquema de la
Figura 1.4 donde una lactona (Marrón) es atacada por la serina catalítica de la
enzima pasando por el primer estado de transición (ET1) formando el complejo
acil-enzima. El grupo saliente en este caso es el hidroxilo terminal de la lactona
el cual permanece en la misma molécula. El iniciador (Azul) o la cadena de
propagación (verde) atacaría al complejo acil-enzima pasando por el segundo
estado de transición (ET2) formando la enzima libre, la lactona iniciada o la
cadena propagada [69, 71].
1.4.2. Ventajas del la Polimerización por apertura de anillo
La polimerización por apertura de anillo enzimática o química presenta una
importante ventaja sobre la polimerización por condensación, mientras que el
peso molecular de los polímeros resultantes puede ser controlado usando una
concentración controlada de la relación monómero/iniciador en la poli
condensación no se puede controlar. Por otro lado, presentan ventajas sobre
las reacciones en los cuales se usan catalizadores químicos convencionales.
Usando la ePAA, la presencia de catalizadores de ácido fuertes o altas
temperaturas no son necesarias en el proceso de polimerización [72].
25
1.5.
Cándida antárctica, lipasa tipo B (CALB)
La levadura de Cándida antárctica produce dos diferentes tipos de lipasas, A y
B [73]. Las dos lipasas son muy diferentes; la lipasa A es muy termoestable y
más activa con triglicéridos mientras que la lipasa del tipo B es mucho más
activa en la hidrólisis de un amplio intervalo de esteres [74]. Cándida antárctica
lipasa tipo B (CALB) es una proteína globular que pertenece a la familia de las
hidrolasas
[75]. Su cadena polipéptica está compuesta de 317 aminoácidos
y su peso molecular es de 33 KDa. La estructura cristalina fue determinada por
medio de cristalografía de rayos x en 1994 por Uppenberg et al [76]. El sitio
activo de CALB está situado en el núcleo de la proteína y está compuesto de
dos canales uno que aloja el acilo y el otro que aloja los residuos de alcohol de
sustrato, siendo el primer canal el más espacioso. Esta característica hace que
la enzima sea más selectiva hacia sustratos que contengan alcohol. El sitio de
unión tiene una forma de embudo y está compuesto de una secuencia de
aminoácidos altamente hidrofóbicos que envuelven la cavidad de las paredes
internas. Esta enzima presenta un mecanismo de reacción igual al que
presenta la serina de las proteasas con una triada catalítica (Serina: Ser 105,
Histidina: His 224 y Aspartato: Asp 187) tal como se observa en la Figura 1.5;
además presenta un agujero llamado oxi-anión compuesto por Treonina:Tre 40
y Glutamina:Gln 106 [70].
26
Figura 1.5. Ilustración de la enzima CALB
El mecanismo de reacción llevado a cabo por la lipasa es ilustrado en la Figura
1.6 en donde observa la reacción de trans-acilación. Así, un éster carboxílico
(sustrato 1) se une al sitio activo y el carbón del carbonilo del éster es entonces
atacado por la ser 105 catalítica (nucleófilo) pasando al primer estado de
transición (ET1). Este ataque es promovido por la His 224 que actúa
generalmente como una base y acepta un protón de la Ser 105. Durante el
ataque el doble enlace del C=O se convierte en un enlace sencillo y el átomo
de oxigeno se transforma en un oxianion formando tres enlaces de hidrógeno
con el agujero oxianion (dos para la Tre 40 y uno para Gli 106). El alcohol
(primer producto) deja el sitio activo y el complejo acil-enzima se forma. Un
nucleófilo (alcohol) lleva a cabo un nuevo ataque sobre el carbón del carbonilo
del complejo acil-enzima pasando al segundo estado de transición (ET2),
llevándose a cabo una reacción de trans-acilación y formando el producto
(producto 2) el cual es liberado regenerándose la enzima [70].
27
ET1
Enzima libre
Acil-Enzima
ET2
Figura 1.6. Mecanismo de reacción de Cándida antárctica; lipasa tipo B.
28
Capítulo 2
Parte experimental
2.1. Reactivos.
La
-butirolactona,
-BTL, -decanolactona, -DCL,
-caprolactona,
-CL, 5-
Dodecanólido, 5DDCL y el pentadecanólido, PDL, utilizados como monómeros
en la síntesis de los polímeros en este trabajo fueron obtenidos de Aldrich Inc.,
y fueron usados sin tratamiento alguno. También fueron usadas como
catalizadores dos diferentes tipos de enzimas: una lipasa pancreática porcina,
LPP, en su forma nativa y la lipasa tipo B de Cándida antártica (CALB)
inmovilizada sobre una resina acrílica macroporosa y que tiene por nombre
comercial (Novosyme 435), N435 ambas obtenidas de Aldrich Inc. Además, se
utilizó tolueno grado reactivo como medio orgánico, metanol el cual actúa como
iniciador aunque también fue para precipitar el polímero y cloroformo para
disolver el polímero formado. En la Tabla 2.1 se muestran los monómeros
usados en este trabajo y sus propiedades.
29
Tabla 2.1. Propiedades físicas de los monómeros
Nombre
Código
Estado
físico
Peso
molecular
(g/mol)
Pureza
(%)
-Caprolactona
-CL
Líquido
114.4
97
Pentadecanólido
PDL
Sólido
240.38
98
-Butirolactona
-BTL
Líquido
86.09
98
-Decanolactona
-DCL
Líquido
170.25
99
5DDCL
Líquido
198.30
98
5-Dodecanólido
Estructura
química
2.2. Síntesis de los polímeros y copolímeros
2.2.1. Síntesis de las lactonas usando Lipasa Pancreática Porcina, LPP.
El procedimiento para la síntesis de los polímeros por polimerización por
apertura de anillo, (PAA), usando como catalizador a la lipasa pancreática
porcina, LPP ha sido descrita previamente. El procedimiento para la síntesis
de los polímeros por polimerización por apertura de anillo, (PAA), usando como
catalizador a la lipasa pancreática porcina, LPP ha sido descrita previamente.
En una polimerización enzimática típica, la LPP en forma de polvo (3 g) fue
depositada en un matraz erlenmeyer junto 1.63 ml de monómero ; 0.016 ml de
metanol y 20 ml n-hexano. Posteriormente, se sello el matraz con una septa y
30
se burbujeo nitrógeno por 30 min. El matraz fue calentado hasta 60°C en un
baño de aceite por un tiempo de 500 horas. Una vez detenida la reacción, la
enzima fue removida por filtración y lavada una vez con 20 ml de n-hexano y 2 veces
con 20 ml de Cloroformo. Luego, se combinaron el filtrado y la solución de lavado y
fueron diluidos con 800 ml de metanol frio. Posteriormente, la solución obtenida fue
concentrada con un rotavapor, sin embargo, no se formó precipitado como se
esperaba por lo que la solución se concentró con un rotavapor. Dado que el
resultado obtenido no fue el esperado se realizó nuevamente la reacción
disminuyendo la concentración de la enzima a un 10% (0.163g) con respecto a la
concentración del monómero y se fijó una concentración de 2:1 de n-hexano con
respecto a la concentración de monómero. La disminución de la enzima fue con el
propósito de hacer más diluida la solución de reacción. Aun cuando se ajustaron estos
dos parámetros los resultados fueron similares a los obtenidos anteriormente, no se
formó precipitado como se esperaba . Este método de reacción fue probado con
todas las lactonas; ( -butirolactona,
-BTL,
-decanolactona,
-DCL y el 5
Dodecanólido, 5DDCL), que contenían un grupo lateral obteniéndose nuevamente
productos de bajo peso molecular. Ante estos resultados se optó por probar con
tolueno como medio orgánico, pues en la literatura se reporta que puede dar muy
buenos resultados cuando se usa como medio orgánico en reacciones catalizadas por
enzimas. Para tratar de tener una concentración adecuada de tolueno; esta se fijó una
concentración de 2:1 con respecto a la concentración de monómero, pues se observó
que con una concentración 1:1 la solución era muy concentrada. Se mantuvo la
concentración de la lipasa pancreática porcina a un 10% con respecto a la
concentración del monómero, la concentración de lactona y la de los otros reactivos
así como también la temperatura y el tiempo de reacción. Este método de reacción
fue probado nuevamente con todas las lactonas;
31
-butirolactona,
-BTL,
-
decanolactona, -DCL, y el 5 Dodecanólido, 5DDCL que contenían un grupo
lateral, además, se incluyeron dos lactonas sin grupo lateral, la -caprolactona,
-CL y el pentadecanólido, PDL, sin embargo, los productos presentaban las
mismas características; eran ceras y aceites y con un rendimiento de la reacción entre
4 y 6%. En la Tabla 2.2 se muestran la concentración de solventes usados
como medio orgánico y enzima en la síntesis de lactonas.
Tabla 2.2. Concentraciones de reactivos en el sistema de reacción usada en la
síntesis de las lactonas catalizada por Lipasa Pancreática Porcina, LPP.
Tipo de
enzima
LLP nativa
3g
Solvente del
medio
n-hexano
20 ml
10%(0.163g)
n-hexano
(2:1)
Monómero
-butirolactona
Temperatura
ºC
60
-butirolactona
60
-decanolactona
60
5-dodecanólido
10%(0.163g)
Tolueno
2:1
60
-butirolactona
60
-decanolactona
60
5-dodecanólido
-caprolactona
60
60
60
Pentadecanólido
*Lipasa pancreática porcina, LPP fue de 10% en peso con respecto al monómero.
32
2.2.2. Síntesis de lactonas con lipasa tipo B de Cándida antárctica (CALB).
El procedimiento para la síntesis de los polímeros por apertura de anillo, (PAA),
usando como catalizador a la lipasa Novozyme 435, la cual se encuentra en
forma de pequeñas esferas, ha sido descrita previamente [77]. En una
polimerización enzimática
típica, tal como muestra en el Esquema 1, la
Novozyme 435 (10 % en peso con respecto al peso del monómero, 0.25g) fue
secado en un matraz de 25 ml junto con malla molecular (3Å). Después del
secado, el matraz fue removido de la estufa y cerrado con una septa bajo
atmósfera de nitrógeno y subsecuentemente se le adicionó 5.0 ml de tolueno
usando una jeringa y el sistema fue mantenido en agitación. El matraz fue
calentado hasta 70°C en un baño de aceite después de que se le agregaron
2.5 g de lactona al sistema (Ver Figura 2.1).
Figura 2.1. Sistema de reacción de polimerización por apertura de anillo
catalizado por N435.
Después de 24 horas, una solución viscosa constituida por enzima y polímero
en tolueno fue obtenida; la polimerización fue detenida adicionando un exceso
33
de cloroformo y la enzima fue removida por filtración. El exceso de cloroformo
en el filtrado fue removido por evaporación y el polímero en la solución
concentrada fue precipitado en metanol frio. El polvo blanco obtenido fue
redisuelto en cloroformo y precipitado nuevamente con metanol. Este proceso
se repitió 2 veces para purificar el producto. Finalmente, el producto obtenido
fue secado a 60°C por 24 horas a vacío y posteriormente caracterizado.
O
O
O
N435
H
O
C
Toluene, 70°C
(CH2)14
OH
n
Esquema 1. Polimerización por apertura de anillo catalizado por novozyme
N435 de pentadecanólido, PDL en tolueno a 70°C.
Este método de reacción fue probado con todas las lactonas; -butirolactona, -BTL, -
(±)-decanolactona, -DCL, y el 5 Dodecanólido, 5DDCL que contenían un grupo
lateral, y dos lactonas sin grupo lateral, la
-caprolactona,
-CL y el
pentadecanólido, PDL. De todas las lactonas las
-butirolactona,
-BTL, -(±)-
decanolactona, -DCL, y el 5-Dodecanólido, 5DDCL que contenían un grupo
lateral, presentaron un producto con las mismas características obtenidas con la LPP;
ceras y aceites y con un rendimiento de la reacción entre 4 y 6%, mientras que las dos
lactonas sin grupo lateral, la -caprolactona, -CL y el pentadecanólido, PDL
resultaban ser un polvo blanco y con un rendimiento entre 96 y 98%. En la
Tabla 2.3 se muestran la concentración de solventes usados como medio
orgánico y enzima en la síntesis de lactonas.
34
Tabla 2.3. Concentraciones de reactivos en el sistema de reacción usada en la
síntesis de las lactonas catalizada por Lipasa Cándida antártica, CALB
(Novozyme 435).
Tipo de
enzima
Novozyme 435
10%(0.25g)
Solvente del
medio
Tolueno
2:1
Monómero
2.5 g
-butirolactona
Temperatura
ºC
70
-decanolactona
70
5-dodecanólido
-caprolactona
70
70
70
Pentadecanólido
*Novozyme 435 fue de 10% en peso con respecto al monómero.
2.2.3. Síntesis de los copolímeros -CL/PDL con lipasa tipo B de Cándida
antárctica (CALB).
Los copolímeros fueron sintetizados bajo el mismo procedimiento descrito en la
sección anterior debido a que mostró la formación del polímero y un buen
rendimiento. La diferencia estriba en que una vez secado el matraz con la
enzima se adicionó el pentadecanólido, PDL, por ser un monómero sólido y
posteriormente, el matraz fue cerrado con una septa bajo atmósfera de
nitrógeno. Subsecuentemente, se le adicionó 5.0 ml de tolueno usando una
jeringa y el sistema fue mantenido en agitación. El matraz fue calentado hasta
70°C en un baño de aceite después de que se le agregó la -CL al sistema. Las
concentraciones de los monómeros fueron 75/25, 50/50 y 25/75 % en mol de CL/PDL. Después de 24 horas, una solución viscosa de enzima y polímero en
tolueno fue obtenida; la polimerización fue detenida adicionando un exceso de
cloroformo y la enzima fue removida por filtración. El exceso de cloroformo en
el filtrado fue removido por evaporación y el polímero en la solución
35
concentrada fue precipitado en metanol frio. El polvo blanco obtenido fue redisuelto en cloroformo y precipitado nuevamente con metanol. Este proceso se
repitió 2 veces para purificar el producto. Finalmente, el producto obtenido fue
secado a 60°C por 24 horas a vacío y posteriormente caracterizado.
2.2.4. Síntesis de los polímeros con grupo lateral con lipasa tipo B de
Cándida antártica (CALB) inmovilizada utilizando una síntesis en dos
etapas.
Usando el procedimiento anterior se encontró que las lactonas con grupo
lateral dieron un porcentaje de rendimiento muy bajo, por lo tanto, este fue
modificado debido a que en la literatura reporta que un incremento en la
concentración de agua produce un incremento en el peso molecular [23]. Las
reacciones de polimerización de las lactonas con grupo lateral fueron
realizadas por medio de una síntesis de dos pasos: En el primer paso la
reacción fue realizada adicionando novozyme 435 (10% en peso con respecto
al monómero), 18 % v/v de metanol, 6% v/v de agua y el monómero (2.5g) en
un matraz erlenmeyer. Subsecuentemente, nitrógeno gas fue burbujeado por
30min. El matraz fue entonces agitado y calentado a 60°C en un baño de
aceite. Después de 12 horas una solución viscosa de enzima y polímero fue
obtenida y el proceso de polimerización fue detenido. En el segundo paso de
polimerización 10 ml de tolueno previamente secado en malla molecular y 5 g
de malla molecular (3Å) fueron adicionados y de nueva cuenta, fue burbujeado
nitrógeno gas por 30 min. El matraz fue nuevamente agitado y calentado a
60°C en un baño de aceite por 24 horas. Al término de la reacción la solución
36
obtenida fue disuelta en cloroformo y la solución resultante fue filtrada para
remover la enzima. El exceso de cloroformo en el filtrado fue removido por
evaporación y el polímero en la solución concentrada fue precipitado en
metanol frío. El producto obtenido (cera) fue re-disuelto en cloroformo y
precipitado nuevamente con metanol y recuperado. Este proceso se repitió 2
veces para purificar el producto. Finalmente, el producto obtenido fue secado a
60°C por 24 horas a vacío y posteriormente caracterizado.
Usando el procedimiento anterior de nuevamente se encontró que las lactonas
con grupo lateral dieron un porcentaje de rendimiento muy bajo entre un 8 a
4%, por lo tanto, este fue modificado variando la concentración de la enzima en
30, 40 y 60 % en peso con respecto al peso del monómero.
2.3. Caracterización por espectroscopia de Infrarrojo con transformada de
Fourier, FTIR
Las pruebas de espectroscopia de infrarrojo para los monómeros y los
polímeros obtenidos fueron realizadas en un espectroscopio de infrarrojo con
transformada de Fourier, FTIR, Nicolet 8700 de Thermo scientific utilizando 100
barridos, una resolución de 4 cm-1, con una velocidad 0.6329, en absorbancia.
Las muestras fueron depositadas sobre pastillas de KBr previamente
preparadas para tal fin.
37
2.4. Determinación del peso molecular por GPC
El peso molecular y la polidispersidad de la fracción soluble de las muestras
fueron medidos en un cromatógrafo de líquidos de permeación en gel, GPC
(por sus siglas en inglés), usando un cromatógrafo de líquidos de alta presión,
HPLC de la serie 1100 de Agilent equipado con un detector de índice de
refracción a 25°C, usando 2 columnas Zorbax (300S y 60S) acopladas en serie
en un intervalo de 5x102 a 1x105 g/mol. Como fase móvil se uso
tetrahidrofurano, THF, y utilizando un de volumen de elución de 1 ml/min. La
curva de calibración para el análisis de GPC fue construida usando estándares
de poliestireno.
2.4.1 Cinética de polimerización.
La cinética de polimerización de la reacción fue seguida tomando una alícuota
del sistema de reacción a diferentes tiempos de polimerización y fueron
disueltos en THF. Estas muestras no fueron precipitadas con metanol frio. La
enzima fue removida por filtración y la solución fue analizada por GPC. La
conversión del polímero fue calculada del área bajo la curva del pico para cada
polímero y monómero obtenido por GPC.
2.5. Resonancia Magnética Nuclear, RMN
Los espectros de resonancia
magnética nuclear (RMN) de protones (H1)
fueron obtenidos en un espectrómetro Varian de 600 MHz Premium compact
NMR Magnet System de Agilent Technologies. Los cambios químicos
38
obtenidos fueron reportados en partes por millón para el espectro de H 1. El
tetrametil silano (TMS) fue usado como referencia interna.
2.6. Caracterización térmica.
2.6.1. Determinación de la temperatura de descomposición, T d por análisis
termogravimétrico, TGA
La estabilidad térmica o temperatura de descomposición, T d, fue determinada
en una balanza termogravimétrica, TGA-7, de Perkin Elmer, utilizando un
intervalo de temperatura de 40 a 650°C, con una rampa de calentamiento
10°C/min en atmósfera de nitrógeno.
2.6.2. Determinación de la temperatura de transición vítrea, T g, y de
fusión, Tm por análisis de Calorimetría Diferencia de Barrido, DSC.
La temperatura de de transición vítrea, T g, y de fusión, Tm, fueron determinadas
en un calorímetro diferencial de barrido, DSC-7, de Perkin Elmer, utilizando un
intervalo de temperatura de -60 a 110°C, utilizando una rampa de
calentamiento 10°C/min en atmósfera de nitrógeno. La prueba se mantuvo
isotérmicamente a Tfinal por 5 min y luego se enfrió de 110 a -60°C a 5°C/min.
Este procedimiento fue repetido para determinar si se registra algún cambio en
la fusión del polímero. En el caso de los copolímeros estos fueron analizados
calentando de -60 a 110°C a una rampa de calentamiento de 10°C/min.
39
Capítulo 3
Resultados y discusiones
3.1. Resultados de la Síntesis de las lactonas usando Lipasa Pancreática
Porcina, LPP.
Las reacciones preliminares utilizando el n-hexano y como medio orgánico y butirolactona, -BTL, no formaron precipitado como se esperaba. Este resultado
fue atribuido a que la concentración de enzima era muy alta y dejaba a la
solución muy concentrada impidiendo una buena agitación. Dado que el
resultado obtenido no fue el esperado, se realizó nuevamente la reacción
disminuyendo la concentración de la enzima a un 10% (0.163g) con respecto a la
concentración del monómero y se fijó una concentración de 2:1 de n-hexano con
respecto a la concentración de monómero. La disminución de la concentración de
enzima fue con el propósito de hacer más diluida la solución de reacción y tener una
mejor agitación pues la agitación entra en juego debido a que al ser insoluble la
enzima en el solvente esta tiende a aglomerarse reduciendo la superficie del área de
efecto del catalizador en el sistema. Sin embargo, aun cuando se ajustaron estos dos
parámetros los resultados fueron similares a los obtenidos anteriormente. Aun cuando
no hubo un buen resultado, este método de reacción fue probado con todas las
lactonas;
-butirolactona,
-BTL,
-decanolactona, -DCL y el 5-Dodecanólido,
5DDCL, cuya particularidad es que todas contenían un grupo lateral. Ante estos
resultados se optó por probar con tolueno como medio orgánico, pues en la literatura
se reporta que puede dar muy buenos resultados cuando se usa como medio orgánico
en reacciones catalizadas por enzimas, además de que monómero y polímero son
fácilmente solubles en él. Para tratar de tener una concentración adecuada de tolueno;
40
esta se fijó en una concentración de 2:1 con respecto a la concentración de
monómero, pues se observó que con una concentración 1:1 la solución era muy
concentrada. Se mantuvo la concentración de la lipasa pancreática porcina a un 10%
con respecto a la concentración del monómero, la concentración de lactona y la de los
otros reactivos así como también la temperatura y el tiempo de reacción. Este método
de reacción fue probado nuevamente con todas las lactonas; -butirolactona, -BTL, -
decanolactona, -DCL, y el 5-Dodecanólido, 5DDCL que contenían un grupo
lateral, además, se incluyeron dos lactonas sin grupo lateral, la -caprolactona,
-CL y el pentadecanólido, PDL, sin embargo, los productos presentan las mismas
características; ceras y aceites con peso moleculares de entre 500 y 600 g/mol y con
un rendimiento de la reacción entre 4 y 6%. La baja conversión se atribuyó la baja
actividad de la enzima al encontrarse en su forma nativa aunque también
puede deberse a la presencia de los grupos laterales en la estructura química
de las lactonas, pues estas, disminuyen la habilidad para polimerizar de la
lactona debido a que produce un impedimento estérico.
3.2. Resultados de la Síntesis de las lactonas usando Lipasa Cándida
antárctica (Novozyme 435, N435).
Dado que el resultado obtenido con la LPP no fue el esperado, se realizaron
nuevamente reacciones de polimerización por apertura de anillo, ROP (por sus
siglas en ingles) a partir de las lactonas sin y con grupo lateral catalizadas por
N435 inmovilizada sobre una resina acrílica macroporosa. La ventaja de usar
una enzima inmovilizada es el de permitir incrementar la estabilidad, la
41
reutilización, la operación continua, y la posibilidad de mejor control de las
reacciones y por ende, se pueden esperar factores económicos favorables.
3.2.1. Resultados de peso molecular y porcentaje de conversión de
polilactonas.
Los resultados de peso molecular y conversión para polímeros obtenidos por
polimerización por apertura de anillo, ROP (por sus siglas en ingles) a partir de
las lactonas sin y con grupo lateral catalizadas por N435 son mostradas en la
Tabla 3.1.
Tabla 3.1. Síntesis de varias lactonas por polimerización por apertura de anillo
a 75°C utilizando novozyme 435
Polímero
Código
Estado físico
Mw
Conversion
(g/mol)
(%)
Poli( -caprolactona)
P -CL
Sólido
25,523*
94
Poli(pentadecanólido)
PPDL
Sólido
26,630*
96
P -BTL
Cera
716
8
Poli(decanolactona)
PDCL
Aceite
450
4
Poli(5-dodecanólido)
P5DDCL
Aceite
430
2
Poli( -butirolactona)
*Fracción soluble
Como se puede observar en la tabla, las lactonas sin grupos laterales tales
como la -caprolactona, -CL y el pentadecanólido, PDL, presentan un alto
42
porcentaje de conversión y peso molecular en la fracción soluble comparado
con las lactonas con grupos laterales tales como la -butirolactona, -BTL, decanolactona, -DCL, y la 5-dodecanólido, 5DDCL. La característica principal
de los productos obtenidos por polimerización enzimática de un paso es que
tanto la poli( -caprolactona), P -CL y el polipentadecanólido, PPDL, fueron un
polvo blanco después de la precipitación mientras que, contrario a lo esperado;
el mismo procedimiento de polimerización para lactonas con grupo lateral
produjeron ceras o aceites.
Por otro lado, las lactonas sin grupo lateral
mostraron un porcentaje de conversión de un 96% mientras la -butirolactona,
-BTL, -decanolactona, -DCL, y el 5-dodecanolido, 5DDCL mostraron un
porcentaje de entre 2 y 8% dependiendo del tamaño del grupo lateral, siendo el
porcentaje más bajo para la lactona con el grupo lateral más largo. Por otra
parte, se observó que la poli( -caprolactona), P -CL, y el poli(pentadecanólido),
PPDL, fueron parcialmente solubles en cloroformo, CHCl 3 y tetrahidrofurano,
THF y el peso molecular determinado para la fracción soluble fue de 25,253 y
26,630 g/mol respectivamente. Estos valores fueron más altos que los
obtenidos por Uyama et al para PPDL quien reportó 20,000 g/mol usando
Cándida cylindracea como catalizador [78]. En contraste, los productos
obtenidos de
-butirolactona,
-BTL,
-decanolactona,
-DCL, y el 5-
dodecanólido, 5DDCL fueron solubles en THF y el
peso molecular
determinado fue de entre 716 y 430 g/mol respectivamente. Es importante
hacer notar que el peso molecular fue tomado únicamente de la fracción
soluble y los resultados fueron comparados con estándares de poli(estireno).
La baja conversión alcanzada con
-BTL, -DCL, y 5DDCL se atribuyó a la
43
presencia de los grupos laterales en la estructura química de las lactonas, pues
estas, disminuyen la habilidad para polimerizar de la lactona debido a que
produce un impedimento estérico tal como se reporta en la literatura [79].
3.2.2. Conversión del polímero en función del tiempo.
En la Figura 3.1. Se muestra la conversión del polímero en función del tiempo
para -BTL y -CL en la polimerización de un paso. En esta figura se observa
que el porcentaje de conversión para -BTL fue de 70% después de 2.5 horas
de reacción.
100
-CL
90
80
-BTL
Conversion (%)
70
60
50
40
30
20
10
0
0
5
10
15
20
25
Tiempo (h)
Figura 3.1. Conversión de monómero durante la polimerización enzimática en
un paso.
44
En contraste, el porcentaje de conversión de la
-CL se incrementa
rápidamente hasta que esta alcanza un 93% después de 2.5 h. A partir de este
tiempo, la conversión se incrementa lentamente hasta que alcanza un valor
máximo de 96% después de 12 h. Se encontró que aun cuando la
-BTL
muestra un 78% de conversión solamente se obtuvieron oligómeros y este
comportamiento ha sido atribuido al impedimento estérico inducido por los
grupos laterales presentes en las lactonas. En el caso de la -CL, el producto
se logró rápidamente durante las primeras 12 h a diferencia de lo reportado en
la literatura donde las reacciones se llevaron a cabo hasta por 256 horas [23].
Por otro parte, es importante hacer notar que el cálculo del volumen de muestra
para determinar la conversión fue tomado en muestras que aun retenían a
todos los componentes (incluyendo polímero, oligómeros de bajo peso
molecular, monómero de anillos abiertos y monómero residual) únicamente se
removió la enzima durante la extracción. En el caso del PPDL, el muestreo fue
más difícil debido a que la muestra se solidifica rápidamente incrementando su
insolubilidad en el solvente.
3.2.3. Perfil cromatográfico del sistema de reacción de -CL -BTL.
En la Figura 3.2 se presenta el perfil cromatográfico del sistema de reacción en
diferentes estados de polimerización para -CL por el método de reacción de
un paso. Se puede observar que durante los primeros 30 min de polimerización
solamente se producen oligómeros, monómeros de anillos abiertos y
monómero residual, tal como se observa por la presencia de señales de baja
45
intensidad a
10.18, 10.56
y 10.8 minutos de volumen
de
elución
respectivamente; este comportamiento concuerda con lo sugerido por Bankova
et al para P -CL [80].
-CL
24 H
16 H
12 H
8H
4H
2H
1H
0.5 H
8.0
8.5
9.0
9.5
10.0
10.5
11.0
11.5
Volumen de elucion (min)
Figura 3.2. Perfil de GPC del producto de polimerización de
catalizado por N435 a diferentes tiempos.
-Caprolactona
Estos resultados sugieren que durante el estado inicial de la polimerización, la
reacción predominante fue la apertura de los anillos de los monómeros para
producir oligómeros de cadenas cortas. Después de la primera hora, aparece
una cantidad considerable de polímero con un peso molecular alto desplazando
la señal del valor máximo del tiempo de retención de entre 9.7 y 9.2 min. En la
misma figura, se puede observar que después de 12 horas una gran cantidad
de oligómeros se han convertido en polímero y el remanente consiste
46
de
oligómeros de cadena corta. La intensidad de la señal asignada al monómero
disminuye sugiriendo que el monómero ha sido transformado a polímero.
Después de 24 horas, la composición de la mezcla de reacción no cambia
implicando que la reacción ha alcanzado su máxima conversión. En el caso de
-BTL, el perfil cromatográfico de la reacción es mostrado en la Figura 3.3. En
esta figura, podemos observar que no hay un cambio significativo durante los
diferentes estados de polimerización puesto que el producto obtenido fueron
solamente oligómeros de bajo peso molecular los cuales son observados como
señales de baja intensidad entre 10.29 y 10.6 min de volumen de elución y que
corresponden a la formación de oligómeros, monómeros de cadena abierta y
monómero.
-BTL
24 H
16 H
12 H
8H
4H
2H
1H
30 min
9.6
9.8
10.0
10.2
10.4
10.6
10.8
11.0
Volumen de elucion (min)
Figura 3.3. Perfil de GPC de la reacción de polimerización de -Butirolactona
catalizada por N435 a diferentes tiempos.
47
Estos resultados sugieren que en el estado inicial la reacción dominante es la
apertura del anillo de algunos monómeros para producir oligómeros de cadena
corta. Sin embargo, se puede observar que después de 2 horas de
polimerización la intensidad de la señal que aparece en 10.6 min, atribuida al
monómero, se incrementa mientras la señal asignada a los oligómeros en
10.29 min permanece sin cambiar. Esto indica que durante el estado inicial de
la reacción hay una población combinada de monómeros y oligómeros. La
insolubilidad de polímero obtenido en estas pruebas puede ser atribuida a la
alta cristalinidad del polímero obtenido.
El mecanismo por el cual se lleve a cabo la reacción de polimerización por
apertura de anillo catalizado por la lipasa se muestra en el esquema 3.1.
Esquema 3.1. Mecanismo de polimerización por apertura de anillo catalizado
por la lipasa
De acuerdo a este mecanismo la lipasa cataliza la hidrólisis del enlace del éster
por medio de una triada catalítica compuesta de un nucleófilo de serina residual
48
activado por un enlace de hidrógeno y relacionado con la histidina y el
aspartato o glutamato. Esta triada es la responsable de la reacción por apertura
de anillo de las lactonas.
El residuo de serina participa en el ataque
nucleofílico de la lactona para formar un complejo activado de enzimamonómero, (CEM). La iniciación de la reacción, se da un por un ataque
nucleofílico del agua que está presente en dentro de la enzima (o por un
alcohol primario) sobre el carbono acilo del complejo (CEM) para producir un hidroxi ácido carboxílico. Durante la propagación, el ataque nucleofílico se da
en el grupo hidroxilo terminal del
-hidroxi ácido carboxílico en (CEM)
conduciendo así, a la formación de la cadena del polímero siendo.
3.2.4. Características físicas de los de Poli( -caprolactona), P -CL y
Poli(pentadecanólido), PPDL obtenidos por síntesis enzimática.
En la Figura 3.4. Se muestra algunos aspectos físicos de los polímeros
obtenidos. Se observa que ambos polímeros son sólidos blancos tal como se
esperaba.
49
PPDL
P -CL
Figura 3.4. Aspecto de los polímeros obtenidos por polimerización por apertura
de anillo catalizado por N435 a partir de lactonas sin grupo lateral.
3.3. Caracterización de los polímeros obtenidos
3.3.1. Caracterización por espectroscopia de infrarrojo, FTIR de Poli( caprolactona), P -CL y Poli(pentadecanólido), PPDL.
En la Figura 3.5. Se muestra el espectro infrarrojo, FTIR, de los homopolímeros
de poli( -caprolactona), P -CL, y del poli(pentadecanólido), PPDL, obtenidos.
En la figura se observa la presencia de una banda a 2917 y 2848 cm-1 que
indica la presencia de vibraciones de estiramiento asimétricas y simétricas de –
CH2- respectivamente. Se observa que estas bandas son más intensas para el
PPDL que para la P -CL debido a que los grupos metileno se encuentran en
mayor concentración en la cadena principal.
50
Absorbancia
PPDL
P -CL
4000
3500
3000
2500
2000
Número de onda cm
1500
1000
500
-1
Figura 3.5. Espectros de FTIR de polímeros obtenidos a partir de lactonas sin
grupo lateral mediante polimerización por apertura de anillo.
En esta figura también se encuentran bandas de absorción características a
1725 cm-1 para P -CL y a 1733 cm-1 para PPDL asignadas a vibraciones de
estiramiento de –C=O del grupo carbonilo de ester. La presencia de esta banda
nos permite confirmar la formación del polímero tal como sugirió Messersmith y
colaboradores para P -CL [81]. Las bandas que aparecen a 1467 y 1463 cm-1
se atribuyen a las vibraciones de flexión de C-H. La banda a 1398 cm-1 fue
asignada a la flexión simétrica de grupos metilo. La banda de absorción a 1243
cm-1 se asigno a vibraciones de estiramiento asimétricas de C-O-C. Las bandas
a 1193 y 1195 cm-1 fueron asociadas con vibraciones de estiramiento de OC-C. La banda de absorción a 1108 cm-1 es asignada a estiramiento acoplado de
C-O de esteres C-O.
51
3.3.2. Caracterización por Resonancia magnética nuclear, RMN de Poli( caprolactona), P -CL y Poli(pentadecanólido), PPDL .
En la Figura 3.6. Se muestra el espectro de RMN de protones, 1H de la
poli(caprolactona), P -CL y el poli(pentadecanólido), PPDL, el cual es muy
similar al reportado en la literatura, [82,83] pero obtenido usando otros métodos
de polimerización. El espectro de P -CL exhibe señales a 4.00, 2.24, 1.58 y
1.32 ppm, el cual son característicos de estos polímeros. Las primeras dos
señales son tripletes debido a protones de metilenos unidos a oxígenos ( CH2) y grupos carbonilos ( -CH2) de la cadena principal, respectivamente. La
señal a 1.58 ppm ha sido relacionada con protones de - y -CH2 mientras que
la señal que aparece a 1.32 ppm ha sido asociada a -CH2 (ver Figura 3.6a).
*
HOCH2CH2CH2CH2CH2C
OCH2CH2CH2CH2CH2C
O
O
OR
n
*
* *
a)
*
HOCH2CH2(CH2)10CH2CH2C
OCH2CH2(CH2)10CH2CH2C
O
O
OR
n
*
b)
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
Chemical Shift (ppm)
Figura 3.6. Espectro
1
H NMR de a) poli( -caprolactona) P -CL y b)
poli(pentadecanólido), PPDL, en CDCl3.
52
Por otro lado, el espectro de PPDL mostró valores de cambios químicos muy
cercanos al de P -CL (3.98, 2.21 y 1.54 ppm). Las señales de tripletes que
aparecen a 3.98 ( -CH2) y 2.21 ( -CH2) fueron asignados a hidrógenos de
metilenos unidos al oxígeno y grupo carbonilo, respectivamente (de una
manera muy similar a la P -CL) y la señal a 1.54 fue relacionada a - y -CH2.
También, se observó una señal amplia y clara en el intervalo de 1.13-1.32 ppm
y fue asignada al resto de los metilenos -CH2 presentes en la unidad repetitiva
del polímero (ver Figura 3.6b). Las asignaciones para ambos polímeros fueron
corroborados integrando las diferentes señales de RMN. En adición,
las
señales típicas de la P -CL, el espectro de RMN de protones muestra un
pequeño triplete en el intervalo de 3.55-3.65 (*) ppm el cual puede ser atribuido
a protones de metilenos de CH2OH de grupos terminales del polímero, los
cuales se distinguen claramente debido al bajo peso molecular de la P -CL
sintetizada tal como fue reportado por Kiersnowski et al [84]. En el espectro de
RMN de la P -CL también fue detectada una señal no esperada en 1.19 (*)
ppm y un multiplete centrado en 0.8 ppm ((*)). Es posible que estas señales
estén relacionadas con protones de grupos metilo localizados en el extremo
final de la cadena el cual puede provenir de los residuos de sistema del
iniciador y/o del mecanismo del agente de transferencia de cadena como fue
sugerido por Yang et al [82]. El espectro de PPDL también muestra señales
relacionadas con protones de CH2OH de grupos terminales de el polímero tal
como fue reportado por Jedlinski et al [83].
53
3.3.3.
Caracterización
por espectroscopia
de
infrarrojo,
FTIR,
de
poli(lactonas) con grupo lateral.
En la Figura 3.7 se muestra el espectro de FTIR de la poli( -butirolactona), P BTL, poli(decanolactona), PDCL y el poli(5-dodecanólido), P5DDCL, obtenidos
de lactonas con grupos laterales por el método de polimerización por apertura
de anillo. Como se puede observar, hay un amplio pico a un número de onda
de 3450 cm-1 de gran intensidad el cual puede ser asociado a la presencia de
ácidos carboxílicos y/o a grupos –O-H formando puentes de hidrógeno,
sugiriendo así la presencia de H2O tal como se ha sido reportado en la
literatura. Sin embargo, estas bandas también pueden ser atribuidas a grupos
con un alto contenido de –OH debido a la presencia de una gran cantidad de
oligómeros formados durante la reacción.
1733
P5DDCL
Absorbancia
1776
PDCL
1735
P -BTL
4000
3500
3000
2500
2000
1500
Numero de onda cm
1000
500
-1
Figura 3.7. Espectro de FTIR de productos obtenidos de lactonas con grupo
lateral mediante polimerización por apertura de anillo de un paso.
54
Estos oligómeros tienen una estructura terminal con un alto contenido de –OH
por un lado y grupos carboxílicos por el otro tal como sugirió Chappell et al con
otro sistema [85]. Este comportamiento fue observado únicamente en lactonas
que tienen grupo lateral. Las señales de absorbancia que aparecen en la región
de 2800-3000 cm-1 en particular a 2969, 2928 y 2858 cm-1 son debido carbónhidrógeno, C-H, vibraciones de estiramiento de grupos metilo (-CH3), y
metilenos (-CH2). La bandas de absorbancia observadas a 1735 cm-1 en el P BTL es atribuido a la vibración de estiramiento de C=O del carbonilo del éster
[86, 87]. En el caso de la PDCL y P5DDCL las bandas de absorción
observadas a 1776 y 1733 cm-1 atribuidas a vibraciones de estiramiento de
C=O del grupo carbonilo concuerdan con las bandas observadas en los
espectros de FTIR obtenidos para los monómeros (no mostrados aquí)
indicando que la reacción no se llevo a cabo. Las bandas de absorción que
aparecen entre 1467 y 1150 cm-1 pueden ser asignadas a vibraciones de
flexión de C-H y vibraciones de estiramiento de carbono-oxígeno del grupo
carbonilo.
Los picos que aparecen a 1057 cm-1 son debido al modo de
vibración de estiramiento de carbón-oxígeno, C-O, del grupo hidroxilo terminal.
Estos resultados corroboran lo observado en la secciones 3.2.1, 3.2.2. y 3.2.3.
La baja conversión alcanzada con
-BTL, -DCL, y 5DDCL se atribuyó a la
presencia de los grupos laterales en la estructura química de las lactonas, pues
estas, disminuyen la habilidad para polimerizar de la lactona debido a que
produce un impedimento estérico. Por otro lado, también existe la posibilidad
atribuirse a la fuente de la lipasa, el tipo de soporte y el protocolo de
inmovilización de la enzima.
55
3.4. Caracterización por análisis térmico de los polímeros obtenidos.
3.4.1. Caracterización por calorimetría diferencial de barrido, DSC para
Poli( -caprolactona), P -CL y Poli(pentadecanólido), PPDL .
Técnicas
de
calorimetría
diferencial
de
barrido,
(DSC)
y
análisis
termogravimétrico, TGA) fueron usados para caracterizar los polímeros
sintetizados. Termogramas de DSC de los polímeros sintetizados por el método
de reacción por apertura de anillo catalizado por lipasa a partir de lactonas sin
grupo lateral tales como poli( -caprolactona), P -CL, muestran solamente un
pico de fusión a 60°C en un segundo calentamiento tal como muestra la Figura
3.8a. Este valor de temperatura concuerda con el reportado en la literatura para
P -CL obtenida por sistemas de reacción similares [88,89].
40
60ºC
Poli( -caprolactona), P -CL
35
Endo
30
25
R2
20
R3
15
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
Temperatura ºC
Figura 3.8a. Termogramas de DSC para PCL obtenida de polimerización por
apertura de anillo de un paso; segunda, R2, y tercera, R3, prueba de
calentamiento.
56
Durante las pruebas se observó que después del primer calentamiento, en el
enfriamiento, la cristalización presenta un pico a 44°C tal como se muestras en
la Figura 3.8b. Se aprecia que esta permanece sin cambio en la segunda
corrida indicando con ello una buena estabilidad térmica.
R
1
2
Endo
R
44ºC
Poli( -caprolactona),P -CL
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
Temperatura ºC
Figura 3.8b. Termogramas de DSC del comportamiento de la cristalización para
PCL obtenida de polimerización por apertura de anillo de un paso; primera, R1,
y segunda, R2 corrida de enfriamiento.
Por otro lado, el análisis calorimétrico del poli(pentadecanólido), PPDL,
obtenido bajo el sistema de reacción de un paso muestra un pico de fusión a
93°C aunque también muestra un pequeño hombro a 85°C en una segunda
prueba de calentamiento tal como muestra la Figura 3.9a. El valor de
temperatura de fusión obtenido para PPDL es similar al valor reportado en la
57
literatura para este polímero obtenido por otro sistema de reacción por Jedlinski
et al [83].
60
93ºC
Poli(pentadecanólido) PPDL
55
50
Endo
45
40
35
30
R2
25
R3
20
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
100
Temperatura ºC
Figura 3.9a. Termogramas de DSC para PPDL obtenida de polimerización por
apertura de anillo de un paso; segunda, R 2, y tercera, R3, prueba de
calentamiento.
En la misma figura observamos que después del primer calentamiento el valor
de temperatura del pico de fusión no cambia con un ciclo de calentamientoenfriamiento. Por otra parte, el pico de cristalización aparece a 81°C tal como
muestra la Figura 3.9b y tampoco se observan los cambios con los
calentamientos subsecuentes indicando así una buena estabilidad. Se sugiere
que, la razón por la que la T g de este polímero no se observa en los
termogramas, es debido a que aparece a una temperatura por debajo de -60°C.
58
R1
Endo
R2
81.ºC
Poli(pentadecanólido), PPDCL
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
100
Temperatura ºC
Figura 3.9b. Termogramas de DSC del comportamiento de la cristalización para
PPDL obtenida de polimerización por apertura de anillo; primera, R1, y
segunda, R2 corrida de enfriamiento.
El porcentaje de cristalinidad obtenido por medio del análisis de las entalpias
de fusión es de 55% para la PCL y 78% para la PPDL. El grado de cristalinidad
(Xc) para cada polímero fue calculado directamente de los datos obtenidos del
termograma de DSC usando la siguiente ecuación:
Xc=( Hf/ H°f)*100
Donde
(1)
H°f es la entalpia de fusión endotérmica de la P -CL 100% cristalina
(142 J/g) y para la PPDL es (116 J/g) tal como se reportaron en la literatura [83,
90].
59
Por otra parte, la P -BTL, PDCL y P5DDCL producidos por polimerización por
apertura de anillo, no muestran Tg ni tampoco punto de fusión. Esto es atribuido
a la naturaleza oligomérica de los productos
de la reacción tal como se
observó por GPC y FTIR lo cual corrobora que, en las lactonas que tienen
grupo lateral presentes en el monómero se produce un efecto estérico
impidiendo la polimerización de las lactonas tal como se reporta en la literatura
para otros sistemas [79].
3.4.2. Caracterización por análisis termogravimétrico, TGA para Poli( caprolactona), P -CL y Poli(pentadecanólido), PPDL .
Los termogramas de TGA de los polímeros sintetizados de lactonas que no
tienen grupo lateral presente, P -CL y PPDL, son desplegados en la Figura
3.10. Así, los polímeros muestran una degradación térmica inicial a una
temperatura de 300°C. En la figura se observa que la caída más pronunciada
en la curva de pérdida de peso ocurre a 450°C para la P -CL mientras que para
el PPDL ocurre a 480°C. La estabilidad térmica mostrada por los polímeros es
similar al reportado en la literatura para productos obtenidos por polimerización
de reacciones químicas o procesos de fermentación [89, 90, 91].
60
100
P -CL
Pérdida de masa %
80
PPDL
60
40
20
0
100
200
300
400
500
600
Temperatura ºC
Figura 3.10. Termogramas de TGA de la degradación térmica de P -CL and
PPDL obtenidos por polimerización por apertura de anillo de un paso.
3.4.3. Caracterización por análisis termogravimétrico, TGA para Poli( butirolactona),
P -BTL,
Poli(decaolactona),
PDCL
y
el
Poli(5-
dodecanólido) P5DDCL.
A diferencia de la poli( -caprolactona), P -CL y el poli(pentadecanólido), PPDL,
los polímeros obtenidos de lactonas que tienen un grupo lateral tales como P BTL, PDCL y P5-DDCL muestran valores menores de temperatura de
degradación tal como se muestra en la Figura 3.11.
61
100
Pérdida de masa %
80
PDCL
60
PDDCL
40
P -BTL
20
0
100
200
300
400
500
600
Temperatura ºC
Figura 3.11. Termogramas de TGA de la degradación térmica de productos
obtenidos de lactonas con grupo lateral, P -BTL, PDCL y P5DDCL por
polimerización enzimática por apertura de anillo.
En esta figura se observa que estos polímeros tienen una temperatura de
degradación térmica inicial localizada entre 100 y 150°C. Sin embargo, el
termograma muestra que a diferencia del PDCL; P -BTL y PDDCL muestran 3
perfiles de degradación. Así, el primer perfil de degradación térmica, para P BTL, inicia a 150°C y termina alrededor de 242°C y puede atribuirse a la
degradación de oligómeros. Por otra parte, el P5DDCL muestra este perfil en
entre 150°C y 255°C. La pérdida de peso a esta temperatura es alrededor de
un 40%. El segundo perfil de degradación ocurre entre 242°C y 275°C para P BTL y entre 255°C y 500°C para PDDCL y puede ser atribuido a la presencia
de oligómeros y producto de alto peso molecular.
62
3.5. Polimerización por apertura de anillo en dos pasos de lactonas con
grupo lateral.
Para incrementar el porcentaje de conversión y el peso molecular de las
lactonas que tienen grupo lateral se realizaron pruebas de polimerización por
apertura de anillo intentando un método en dos pasos, tal como se señala en la
sección 2.2.4. del capítulo 2. Tomando en cuenta que la actividad de las
enzimas en un medio no acuoso depende grandemente del contenido de agua
en el sistema de reacción tal como sugiere Dong et al para -PCL [23], la
regulación del contenido inicial de agua es importante para el éxito en la
obtención tanto de una rápida velocidad de polimerización inicial y un alto
porcentaje de conversión así como de productos con un alto peso molecular.
Esto es debido a que el aumento en la concentración de agua le permite a la
enzima mantenerse flexible y accesible a los monómeros durante la reacción.
Considerando lo anterior, el contenido de agua en el primer paso de la reacción
fue incrementado a 3.8%. En este primer paso se observó que la viscosidad se
incrementa notablemente al no tener solvente y el producto no presenta un
peso un incremento en el peso molecular. El agua producida en el sistema fue
removida en el segundo paso adicionando malla molecular al sistema reacción
y la viscosidad disminuye con la adición de solvente. Se observó que, al igual
que en las reacciones de un paso, las tres lactonas no fueron consumidas
eficientemente por la novozyme 435 y las características de los productos
obtenidos fueron similares a aquellas obtenidas por la reacción de
polimerización de un paso.
63
3.5.1. Polimerización por apertura de anillo en dos pasos incrementando
la concentración de enzima en lactonas con grupo lateral.
En otro intento por incrementar el porcentaje de conversión y el peso molecular
de las lactonas que tienen grupo lateral, se realizó una polimerización por
apertura de anillo en dos pasos incrementando la concentración de la enzima
en 30, 40 y 60 % en peso con respecto al peso del monómero, tal como se
señala en la sección 2.1.2.3 del capítulo 2. En la Figura 3.12. Se observa que el
incremento en la concentración de enzima de 30, 40 o a 60 % ocasiona que la
intensidad de la banda entre 2500 a 3600 cm-1 también se incremente. La
presencia de esta banda puede atribuirse a la formación de ácidos carboxílicos
1734
Absorbancia
Poli( -butirolactona)
60 %
40%
30%
4000
3500
3000
2500
2000
1500
Número de onda cm
1000
500
-1
Figura 3.12. Espectros de FTIR de poli( -butirolactona) con Novozime 435
mediante un proceso de síntesis de 2 etapas con 30, 40 y 60% de N435.
64
Las absorciones en 2986, 2924 y 2847 cm-1 corresponden a los estiramientos
de C-H de los metilos y metilenos presentes en la cadena. La absorción muy
intensa a 1738 cm-1 pertenecen a las vibraciones de estiramiento de –C=O del
carbonilo del éster.
La formación de ácidos carboxílicos se observa que depende fuertemente de la
concentración de la enzima. Es probable que un incremento en la
concentración de la enzima incremente el contenido del agua en el sistema
ocasionando con ello un incrementando en el contenido de ácidos carboxílicos.
Estos resultados concuerdan con lo sugerido por algunos autores que reportan
que el control de la estructura del polímero
depende fuertemente de la
actividad del agua. Así, cuando el agua actúa como otro aceptor acilo que
inicia
el
crecimiento
de
la
cadena
o reacciona
con
otros
ésteres
intramoleculares causan degradación de la cadena. Ambas reacciones pueden
ampliar la distribución del peso molecular y alterar la composición de de los
grupos terminales de las cadenas. Estas reacciones competitivas causadas por
el agua dan como resultado la formación de polímero con grupos carboxílicos
terminales por ejemplo, cadenas de polímero que carecen de funcionalidad
para iniciar una subsecuente polimerización por radicales [92, 93, 94]. Se
observó que, al igual que las reacciones de un paso, las tres lactonas con
grupos laterales no fueron consumidas eficientemente por la novozyme 435 y
las características de los productos obtenidos fueron similares a aquellas
obtenidas por la reacción de polimerización de un paso. La baja conversión
alcanzada con -BTL, -DCL, y 5DDCL se atribuyó a la presencia de los grupos
laterales en la estructura química de las lactonas, pues estas, disminuyen la
65
habilidad para polimerizar de la lactona debido a que produce un impedimento
estérico. Por otro lado, también existe la posibilidad atribuirse a la fuente de la
lipasa, el tipo de soporte y el protocolo de inmovilización de la enzima.
3.6. Síntesis
de copolímeros de
-CL-co-PDL por polimerización por
apertura de anillo.
Los resultados de peso molecular y porcentaje de conversión de copolímeros
obtenidos a partir de lactonas por medio de polimerización por apertura de
anillo catalizado por N435 son mostrados en la Tabla 3.2.
Tabla 3.2. Síntesis de copolímeros a partir de -CL y PDL por polimerización
por apertura de anillo a 75°C utilizando novozyme 435
Polímero
Estado
físico
Mw
Conversion
(g/mol)
(%)
P -CL
Sólido
25,523*
94
75 -CL/25PDL
Sólido
40,107*
94
50 -CL/50PDL
Sólido
41,205*
94
25 -CL/75PDL
Sólido
31,630*
96
PPDL
Sólido
26,630*
96
* Fracción soluble
Como se puede ver
los copolímeros presentan porcentajes de conversión
similares a los homopolímeros. Por otro lado, se puede observar que el peso
molecular obtenido únicamente de la fracción soluble es más alto comparado
con los homopolímeros. La principal característica de los productos de la
66
copolimerización enzimática es que son un polvo blanco después de la
precipitación tal como se observa en la Figura 3.13
75 -CL/25PDL ( mol %)
50 -CL/50PDL ( mol %)
25 -CL/75PDL ( mol %)
Figura 3.13. Aspecto de los copolímeros obtenidos por polimerización por
apertura de anillo catalizado por N435 a partir de lactonas sin grupo lateral.
Estos copolímeros mostraron ser parcialmente solubles en cloroformo y
tetrahidrofurano, THF y los pesos moleculares medidos en la fracción soluble
fueron de 40,107, 41,205 y 31,630 g/mol respectivamente. Estos valores
resultaron ser más altos que los obtenidos por Ceccorully et al y Kumar et al
para -CL/PDL quienes reportaron 22,300 g/mol usando Cándida antárctica
como catalizador [34,35]. Bouyahyi et al también reportó 11, 300 g/mol usando
un catalizador orgánico para mismo copolímero [95].
67
3.6.1.
Caracterización
copolímeros de
por espectroscopia
de
infrarrojo,
FTIR,
de
-CL-co-PDL.
Absorbancia
0P -CL
25P -CL
50P -CL
75P -CL
100P -CL
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
-1
Numero de onda cm
Figura 3.14. Resultados de FTIR de copolímeros con concentraciones de
75/25, 50/50 y 25/75 de -CL/PDL en mol %.
En la Figura 3.14 se muestra el espectro de FTIR de los homopolímeros y
copolímeros obtenidos. Las bandas de absorción que aparecen a 2919 y 2850
cm-1 son asignadas a las vibraciones de estiramiento asimétrico y simétrico de
–CH2- respectivamente. Se observa que estas bandas son más intensas
conforme se incrementa la concentración de PDL en el copolímero debido a
que los metilenos se encuentran en mayor concentración en la cadena
principal. En esta figura también se encuentran bandas de absorción
características de los ésteres a 1725 cm-1 para la PCL y a 1733 cm-1 para todas
68
las concentraciones donde hay presencia de PDL. Estas bandas fueron
asignadas a vibraciones de estiramiento de –C=O del carbonilo del ester;
además, la presencia de esta banda nos permite confirmar la formación de los
poliésteres como sugiere Ma et al y Gumel et al para P -CL[88 90]; sin
embargo, esto no nos permite predecir el tipo de copolímero formado. Las
bandas que aparecen a 1470 y 1463 cm-1 fueron asignadas a vibraciones de
flexión de C-H. Las bandas a 1367 cm-1 fueron asignadas vibraciones de
flexión simétricas de grupos metileno. Las bandas de absorción en 1242 y 1220
cm-1 son debidos vibraciones de estiramiento asimétrica y simétrica de C-O-C
respectivamente. La banda a 1197 cm-1 fue asociada con vibraciones de
estiramiento de OC-O. Las bandas de absorción entre 1108-958 cm-1 fueron
asignadas vibraciones de acoplamiento de C-O y C-C.
3.6.2. Caracterización por Resonancia magnética nuclear, RMN de
copolímeros -CL-co-PDL.
La Figura 3.15 muestra el espectro de RMN de los copolímeros obtenidos
usando polimerización por apertura de anillo. El espectro de los copolímeros
muestra señales a 4.00, 2.24, 1.58 y 1.32 ppm las cuales son características de
estos polímeros.
69
O
O
H
[OCH2CH2(CH2)10CH2CH2C] [OCH2CH2(CH2)10CH2CH2C]
O
O
H
OR
[OCH2CH2CH2CH2CH2C] [OCH2CH2(CH2)10CH2CH2C] OR
n
m
[OCH2CH2CH2CH2CH2C] [OCH2CH2CH2CH2CH2C]
R
*
0 -CL
25 -CL
50 -CL
75 -CL
100 -CL
5
*
*
4
3
2
*
1
0
Cambio quimico (ppm)
Figura 3.15. RMN de copoliésteres con concentraciones de 75/25, 50/50 y
25/75 de -CL/PDL en mol %.
Las dos primeras señales son multipletes debido a protones de metilenos
unidos a oxígeno ( -CH2) y grupos carbonilos ( -CH2) de la cadena principal
respectivamente. La señal que se observa a 1.58 ppm ha sido relacionada a
protones de - y -CH2 mientras que la señal de1.32 ppm ha sido asociada a CH2 (ver la Figura 3.15). Se observa que la señal asociada a -CH2 incrementa
su intensidad conforme se incrementa la concentración de PDL. Por otro lado,
se observa que un incremento en la concentración de PDL no muestra un
efecto considerable en los valores del cambio químico, pues resulta ser similar
al obtenido para el homopolímero de PPDL. Las señales de tripletes que
aparecen a 3.98 ( -CH2) y 2.21 ( -CH2) fueron asignados s hidrógenos de
70
metilenos unidos al oxígeno y grupo carbonilo, respectivamente (de una
manera muy similar a la P -CL) y la señal a 1.54 fue relacionada a - y -CH2.
También, una señal amplia en el intervalo de 1.13-1.32 ppm fue claramente
observada y fue asignada al resto de los metilenos -CH2 presentes en la
unidad repetitiva del polímero (ver Figura 3.6b). Las asignaciones para ambos
polímeros fueron corroboradas integrando las diferentes señales en el espectro
de RMN. En adición a las señales típicas de la PCL, el espectro de RMN de
protones de este polímero muestra un pequeño triplete en el intervalo de 3.553.65 (*) ppm el cual puede ser atribuido a protones de metilenos de CH 2OH de
grupos terminales del polímero, siendo estos perceptibles debido al bajo peso
molecular del polímero sintetizado tal como fue reportado por Kiersnowski et al
[84]. Esta señal se observó que se incrementa con el incremento en la
concentración de PDL. En el espectro de RMN también fue detectada una
señal no esperada en 1.19 (*) ppm y un multiplete centrado en 0.8 ppm ((*)). Es
posible que estas señales estén relacionadas con protones de grupos metilo
localizados en el otro lado de la cadena terminal el cual puede provenir de los
residuos de sistema del iniciador y/o del mecanismo del agente de
transferencia de cadena como fue sugerido por Yang et al [82]. El espectro de
PPDL también muestra señales relacionadas con protones de CH2OH de
grupos terminales del polímero tal como fue reportado por Jedlinski et al [83].
71
3.6.3. Caracterización por análisis térmico de los copolímeros obtenidos.
3.6.3.1. Caracterización por calorimetría diferencial de barrido, DSC para
copolímeros -CL-co-PDL.
Las técnicas de calorimetría diferencial de barrido, (DSC) y análisis
termogravimétrico, TGA) fueron usados para caracterizar los copolímeros
sintetizados. Así, la Figura 3.16 muestra el termograma de DSC de los
copolímeros sintetizados a partir de -caprolactona, -CL y pentadecanólido,
PDL a concentraciones de 75/25, 50/50 y 25/75 mol % en el segundo
calentamiento. En la figura se observó que los copolímeros con 75 % mol y 25
% mol de
-CL solamente muestran un pico de fusión a 63°C y 79°C
respectivamente. El valor de temperatura de estos picos aparecen intermedios
al valor de temperatura de los picos de los homopolímeros; ambos cambian
sistemáticamente a valores de temperatura menores con una disminución en el
contenido de las unidades de PDL en el copolímero. Este comportamiento
puede atribuirse a que las unidades de comonómeros están distribuidos al azar
para estas concentraciones tal como sugiere Ceccorulli et al [34].
72
92.84ºC
Endo
79ºC
PPDL
61.7ºC
59.7ºC
71ºC
25 -CL/75PDL
60ºC
50 -CL/50PDL
75 -CL/25PDL
P -CL
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
100
Temperatura ºC
Figura 3.16. Termogramas de DSC de copoliésteres con concentraciones de
75/25, 50/50 y 25/75 de -CL/PDL en mol % en el segundo calentamiento.
Por otra parte, se observó que el copolímero que contiene 50 % mol de -CL
muestra un comportamiento de fusión complejo y que difiere de los otros
copolímeros discutidos anteriormente. Este copolímero muestra dos picos de
fusión una a 61°C y otra a 71°C respectivamente y a temperaturas intermedias
al de los homopolímeros. Estos múltiples endotermas de fusión pueden ser
atribuidos a la fusión de estructuras en bloque presentes en estos copolímeros.
La formación de copolímeros al azar puede ser explicado porque, cuando una
unidad repetitiva de -CL o PDL se encuentra en el extremo final de la cadena
en crecimiento otro de los monómeros se puede adicionar con una probabilidad
igual para formar un copolímero al azar.
Por otra parte, probablemente la
reacción de trans-esterificación del copolímero al 50% mol ocasione un
reacomodo progresivo de las unidades del comonómero a lo largo de la cadena
73
del copolímero yendo de copolímeros al azar esencialmente a copolímeros con
una distribución en bloque.
3.6.3.2. Caracterización por análisis termogravimétrico, TGA, para
copolímeros -CL-co-PDL.
La Figura 3.17 muestra los termogramas de copolímeros sintetizados a partir
de -caprolactona, -CL y pentadecanólido, PDL a concentraciones de 75/25,
50/50 y 25/75 mol %. Los termogramas de los homopolímeros son mostrados
como referencia.
100
PPDL
Pérdida de masa %
25 -CL
80
50 -CL
75 -CL
60
40
20
P -CL
0
100
200
300
400
500
600
700
Temperatura ºC
Figura 3.17. Termogramas de TGA de copoliésteres con concentraciones de
75/25, 50/50 y 25/75 de -CL/PDL en mol %.
En la figura de observa que el copolímero con 75% mol de -CL tiene una
temperatura degradación térmica inicial a 250°C ligeramente por debajo de la
temperatura de degradación de los homopolímeros. En contraste, el copolímero
74
con un 50% mol de -CL muestra dos perfiles de degradación térmica. Así, el
primer perfil inicia a 250°C y termina alrededor de 345°C y puede ser atribuido
a la degradación de -CL. La pérdida de peso a esta temperatura es alrededor
de un 25%. El segundo perfil de degradación ocurre entre 345°C y 500°C y
este puede ser atribuido a la degradación térmica del PDL. Por otra parte, estos
dos perfiles de descomposición pueden ser atribuidos a la degradación de las
estructuras en bloque presentes en estos copolímeros. El copolímero con un
25 % mol de -CL de nuevo mostró una temperatura de degradación térmica
inicial a 300°C a la misma temperatura mostrada por los homopolímeros. El
comportamiento térmico de los copolímeros con una concentración 75 y 25 %
mol de
-CL puede ser atribuido al hecho de que las unidades de
comonómeros se encuentran distribuidas al azar a estas concentraciones tal
como se observó por DSC.
3.7. Propiedades térmicas para mezclas físicas de P -CL/ PDL 50:50.
3.7.1. Análisis de calorimetría diferencial de Barrido, DSC para Mezcla
física de P -CL/ PPDL 50:50.
La Figura 3.18 muestra el termograma de DSC para una película obtenida a
partir de poli( -caprolactona), P -CL y poli(pentadecanólido), PPDL en un
concentración de 50/50 % en peso.
75
45
88.15ºC
M:P -CL/PPDL 50/50
40
53.43ºC
Endo
35
30
56.93ºC
77.27ºC
25
20
15
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
100
Temperatura ºC
Figura 3.20. Termogramas de DSC de una película obtenida por mezcla física
en un concentración de 50/50 % en peso de P -CL/PPDL.
Así, en la figura se observa que la mezcla física de estos dos polímeros resultó
ser inmiscible, pues el termograma muestra claramente dos picos de fusión una
a 53°C que corresponde a la P -CL y otra a 88.1°C que corresponde al PPDL.
No obstante que la mezcla muestra ser un sistema inmiscible esta muestra un
ligero corrimiento en el valor de temperatura de fusión con respecto al valor de
los polímeros individuales (60°C para la P -CL y 93°C para la PPDL).
76
3.7.2. Análisis termogravimétrico, TGA, para Mezcla física de P -CL/ PPDL
50:50.
Los termogramas de TGA de la mezcla física de polímeros sintetizados de
lactonas sin grupo lateral tales como P -CL y PPDL son desplegados en la
Figura 3.21.
100
0
-5
60
40
-10
Primera derivada
Pérdida de masa %
80
20
Película
0
-15
413ºC
Mezcla:P -CL/PPDL 50/50
100
200
300
400
500
600
Temperatura ºC
Figura 3.21. Termogramas de TGA de la degradación térmica para la película
de P -CL/PPDL en un concentración de 50/50 % en peso mezclando
físicamente los polímeros.
En la figura se observa que los polímeros muestran una sola degradación
térmica que inicia a una temperatura de 250°C. También, se observa que la
caída más pronunciada en la curva de pérdida de peso ocurre a 450°C. La
estabilidad térmica mostrada para esta mezcla es similar a la obtenida para los
homopolímeros por separado. El hecho de que no se observe la degradación
por separado en el termograma puede deberse a que ambos polímeros se
degradan casi a la misma temperatura.
77
3.8. Síntesis de lactonas a dos diferentes temperaturas 70 y 90ºC por
polimerización por apertura de anillo.
La -CL y PDL fueron sintetizadas utilizando el método de polimerización por
apertura de anillo de un paso utilizando las mismas concentraciones de
enzima, monómero y solvente, sin embargo, la temperatura de reacción fue
incrementada a 90°C por 24 horas. Lo que se observó como resultado de la
reacción fue que la -CL no mostró reacción alguna a diferencia del PDL que
presentó un porcentaje de conversión de aproximadamente un 98%. Debido a
que la PPDL obtenidos a 70 y 90ºC resultaron se parcialmente solubles en
CHCl3 estos fueron probados en un GPC de alta temperatura. Así, la PPDL
obtenida a 70ºC presentó un Mn y Mw de 2,115 y 5,760 respectivamente con
un índice de polidispersidad de 2.72 mientras que la PPDL obtenida a 90ºC
presentó un bajo peso molecular; Mn= 2,115 y Mw =5,760 con un índice de
polidispersidad de 2.29 similar al que presenta la PPDL obtenida a 70ºC. El
incremento en la temperatura de reacción reduce el peso molecular del
polímero obtenido pero sin afectar la distribución. En la literatura se reporta que
en general el peso molecular promedio del polipentadecanólido, PPDL, en una
reacción catalizada por la novozyma 435 disminuye conforme se incrementa la
temperatura de polimerización debido a un incremento en el número de
cadenas. Este comportamiento es consistente con los resultados encontrados
en éste trabajo, pues la reacción a 90°C da como producto un PPDL con un
peso molecular más bajo. Sin embargo, el hecho de que la distribución de
peso molecular no sea afectada es un indicio de que el mecanismo de reacción
de la apertura del anillo y la adición de monómero durante la polimerización
enzimática es mantenido pero el número de cadenas formadas en la reacción
78
es más alto. Por otro lado, los resultados de peso molecular obtenidos no son
comparables con los reportados en la literatura en términos de peso molecular
absoluto debido a que estos, son comparados con estándares de poliestireno,
además de que fueron disueltos en 1,2,4-triclorobenceno un solvente usado
para polioleofinas a alta temperatura, sin embargo, se observa que algunos
valores son similares a los reportados para PPDL obtenida a 70ºC [89, 96].
3.8.1.
Caracterización
por
espectroscopia
de
infrarrojo,
FTIR
de
Poli(pentadecanólido), PPDL obtenida a 70 y 90°C.
En la Figura 3.22a se muestra el espectro de FTIR para PPDL obtenidas a 70 y
90ºC, en donde se observa que ambos espectros son muy similares. Ambas
muestras presentan bandas de absorción a 2917 cm-1 y 2849 cm-1 atribuidas a
vibraciones de estiramiento de -CH2- asimétricas y simétricas respectivamente.
Estas bandas muestran ser las señales más intensas en el espectro debido a
que los grupos metileno están presentes en un número más grande que otros
grupos en la estructura del polímero. El espectro también muestra bandas a
1733 cm-1 relacionado con las vibraciones de estiramiento de –C=O del
carbonilo del ester. Las bandas que aparecen a 1472 y 1463 cm-1 pueden ser
atribuidas a las vibraciones de flexión de C-H del grupo metileno mientras que
las bandas que aparecen a 1197 y 1180 cm-1 fueron asociadas a las
vibraciones de estiramiento del C-O del grupo ester. Absorciones a 731 y 719
cm-1 son causadas por vibraciones de flexión del –(CH2)n- cuando n ≥4. Por
otra parte, se observa que aun cuando el espectro de FTIR obtenida a 70ºC es
muy similar al obtenido a 90ºC, una inspección más detallada del espectro
mostraron algunas diferencias importantes como la apariencia de una banda
79
pequeña y amplia centrada en 3435 cm-1 y la presencia de un hombro en la
banda del carbonilo que aparece a 1738 cm-1 tal como se observa en la Figura
3.22 b que corresponde a al espectro de PPDL sintetizado a 70 y 90ºC.
1.2
a)
2917
2849
1733
Absorbancia
1.0
1197,1180
0.8
1472,1463
0.6
3435
731,719
0.4
90‫؛‬C
0.2
70‫؛‬C
0.0
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
-1
Numero de onda cm
1.2
1733
b)
1738
1.0
Absorbancia
0.8
0.6
90‫؛‬C
0.4
0.2
70‫؛‬C
0.0
1740
1720
1700
-1
Numero de onda cm
Figura 3.22. Espectro de FTIR para polipentadecanólido, PPDL obtenida a 70 y
90ºC.
La primera banda que puede atribuirse a la vibración de estiramiento O-H que
puede ser atribuida ya sea a agua o grupos hidroxilos terminales de la cadena
80
polimérica. Después de un proceso de secado muy cuidadoso, la banda
permanece en el espectro por lo que esta puede ser atribuida a OH de grupos
terminales de PDL tal como fue reportado por Jedlinski et al [83]. Por otro lado,
la banda que aparece traslapada y compuesta de dos picos localizados a 1733
y 1738 cm-1 que exhibe la PPDL obtenida a 90ºC, puede ser atribuida al
estiramiento C=O de la fase cristalina y amorfa respectivamente, Las
asignaciones hechas para las lactonas de este trabajo concuerda
con lo
reportado en la literatura para polihidroxialcanoatos [97,98,99]. Por otro lado, tal
como se muestra en la sección de caracterización térmica, la PPDL sintetizada
a 90ºC presente una baja cristalinidad; es más amorfo que el PPDL obtenido a
90ºC;
lo
cual
permite
sugerir
que
la
aproximación
usada
en
polihidroxialcanoatos puede ser aplicada en la PPDL.
3.8.2. Caracterización por resonancia magnética nuclear, RMN de
Poli(pentadecanólido), PPDL obtenida a 70 y 90°C
En la Figura 3.23 se muestra el espectro de PPDL sintetizado a 70 y 90ºC el
cual es muy similar al reportado en la literatura pero obtenido usando otros
tipos de polimerizaciones [83,100].
81
*
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
Cambio quimico (ppm)
Figura 3.23. Espectro de RMN para polipentadecanólido, PPDL obtenida a
70ºC (abajo) y 90ºC (arriba).
El espectro muestra señales a 3.98 y 2.21 ppm y pueden ser atribuidos a
protones de metilenos unidos a oxígeno ( -CH2) y al carbonilo ( -CH2),
respectivamente. La señal a 1.54 ppm atribuidos a protones de
- y -CH2
mientras que una señal amplia que aparece en el intervalo de 1.13-1.32 ppm
fue asignada al resto de los metilenos ( -CH2) presentes en la unidad repetitiva
del polímero. Estas asignaciones fueron corroboradas integrando las diferentes
señales de resonancia en el espectro de RMN. En el espectro también se
82
observan pequeñas señales típicas de PPDL en el intervalo de 3.55-3.65 (*)
ppm el cual es atribuido a los protones de metileno de de grupos terminales de
CH2OH en el polímero. Este pico es distinguible debido al bajo peso molecular
del polímero sintetizado de acuerdo a lo reportado por Jedlinski et al. [83]. Este
hecho confirma la existencia de los grupos hidroxilo en el polímero observado
por FTIR.
3.8.3. Difracción de Rayos X para Poli(pentadecanólido), PPDL obtenida a
70 y 90°C
En la Figura 3.24 se muestran los resultados obtenidos por difracción de rayos
x. Estos resultados indican que la temperatura de reacción no afectan el tipo de
cristales formados pues ambos polímeros muestran la misma forma de pico
(110) y (200) a 2 =21.6º y 24.1º para PPDL polimerizado a 90ºC. Se observa
una pequeña diferencia en el pico de difracción (110) que aparece a 21.0º y
24.2 2 para la PPDL polimerizada a 70ºC. La fracción cristalina calculada por
la integración de las áreas de los picos fue de 54% y 49% de cristalinidad para
PPDL polimerizada enzimáticamente a 70°C y 90°C respectivamente. Estos
valores son muy similares a los reportados en la literatura por difracción de
rayos x [83,89] el cual fueron 50 y 64%. La diferencia en el porcentaje de
cristalinidad indica que el incremento en la temperatura de polimerización
afecta disminuyendo la fracción cristalina del polímero formando cristales con
pequeñas diferencias debido a un incremento de los OH de grupos terminales
en el PPDL polimerizado a 90°C tal como fue confirmado por FTIR y 1HNRM.
83
21.6
90‫؛‬C
Intensidad
70‫؛‬C
24.1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
2
Figura 3.24.Difracción de rayos x de PPDL obtenido por polimerización por
apertura de anillo a 70 y 90°C).
3.8.4. Caracterización por análisis térmico para Poli(pentadecanólido),
PPDL obtenida a 70 y 90°C.
3.8.4.1. Caracterización por calorimetría diferencial de barrido, DSC para
para Poli(pentadecanólido), PPDL obtenida a 70 y 90°C.
Análisis
de
calorimetría
diferencial
de
barrido,
DSC
y
análisis
termogravimétrico, TGA fueron utilizados de nueva cuenta para caracterizar al
poli(pentadecanólido), PPDL, sintetizados a dos diferentes temperaturas 70 y
90°C. Los termogramas de DSC de estos polímeros sintetizados muestran
diferencias no solamente en la forma de la transición sino también en los
valores del punto de fusión dependiendo de dependiendo de la temperatura de
síntesis tal como se observa en la figura 3.25.
84
10
PPDL
8
Endo
6
4
90‫؛‬C
70‫؛‬C
2
-40
-20
0
20
40
60
80
100
Temperatura ‫؛‬C
Figura 3 25. Termogramas de DSC para PPDL obtenido por polimerización
enzimática a 70 y 90°C.
Así, mientras la PPDL sintetizada a 70°C muestra un apreciable endoterma de
fusión a 94.0°C y un pequeño hombro a 82.2°C, en el segundo calentamiento,
la PPDL sintetizada a 90°C muestra un endoterma muy amplio con tres picos
de fusión a 83.2°C, 76.3°C y 70.4 y un pequeño hombro a 82.2°C, en el
segundo calentamiento, la PPDL sintetizada a 90°C muestra un endoterma
muy amplio con tres picos de fusión a 83.2°C, 76.3°C y 70.4°C y un pequeño
hombro a 56°C.
Se observó que el punto de fusión obtenido en la PPDL
sintetizada a 70°C es muy similar al reportado en la literatura por Levedev et al,
Jedlinski et al y Focarete et al [83, 89,101]. En el caso de la PPDL obtenida a
90°C la presencia de los tres picos de a más bajas temperaturas que la de
PPDL obtenida a 70°C es debido a la formación de cristales de tamaños más
pequeños. Es importante señalar que este comportamiento cristalino que
presenta el PPDL obtenido a 90°C no ha sido reportado anteriormente y puede
85
ser atribuido a la presencia de un gran número de grupos OH terminales en la
cadena por el bajo valor reportado para Mn. Para corroborar estos resultados el
polímero fue purificado 3 veces para prevenir impurezas. Por otra parte, las
mediciones de DSC para la medición de la fusión y cristalización fueron
realizadas por duplicado en la misma muestra. De igual forma, este mismo
procedimiento fue repetido bajo las mismas condiciones en otra muestra
obteniéndose los mismos resultados para el comportamiento de la cristalización
y fusión y a misma temperatura. Por otra parte, nosotros hemos observado
que el porcentaje de cristalinidad también muestra diferencias dependiendo de
la temperatura de síntesis. El grado de cristalinidad (X c) de cada polímero de
este trabajo fue calculado usando directamente de los datos del termograma de
DSC mediante la siguiente ecuación:
Xc=( Hf/ H°f ) * 100
Donde
(2)
Hf es la entalpia de fusión medida por DSC y
H°f es la entalpia de
fusión endotérmica para el PPDL 100% cristalino (116 J/g) tal como se reportó
en la literatura [83, 89,101]. El porcentaje de cristalinidad determinado por DSC
fue de 74.9° para PPDL sintetizado a 70°C y 69.5% para PPDL sintetizada a
90°C.
El comportamiento de cristalización realizado bajo un proceso de enfriamiento
lento (5°C/min) es mostrado en la Figura 3.26. En el termograma se observa
que aunque ambas muestras de PPDL muestran picos exotérmicos atribuibles
86
al proceso de cristalización, la muestra sintetizada a 90°C presenta 2 o 3
eventos traslapados (un pico de cristalización apreciable a 72°C seguido de un
pequeño pico a 64.4°C y un pequeño hombro a 44.2°C) mientras que el
producto obtenido a 70°C muestra solamente un pico a 80.5°C. Este ultimo
valor es similar al reportado por Namekawa et al [100] a 86°C. La presencia de
varios eventos de cristalización indica que el bajo peso molecular en el PPDL
sintetizado a 90°C da lugar a la formación de cristales más pequeños, el cual
como se mencionó anteriormente, funden a bajas temperaturas. Sin embargo,
como se observó en la medición de difracción de rayos x presentan el mismo
arreglo cristalino.
De nueva cuenta, es importante señalar que este
comportamiento de cristalización que presenta el PPDL obtenido a 90°C no ha
sido reportado anteriormente.
Endo
15
10
90‫؛‬C
5
70‫؛‬C
PPDL
0
-40
-20
0
20
40
60
80
100
Temperatura ‫؛‬C
Figura 3.26. Termogramas de DSC del comportamiento de cristalización para
PPDL obtenido por polimerización enzimática a 70 y 90°C.
87
3.8.4.2. Caracterización por análisis termogravimétrico, TGA,
para
Poli(pentadecanólido), PPDL obtenida a 70 y 90°C.
Los termogramas de TGA de PPDL sintetizado a dos diferentes temperaturas
70 y 90°C son desplegados en la Figura 2.27.
100
90
70‫؛‬C
Perdida de masa %
80
90‫؛‬C
70
60
50
40
30
20
10
PPDL
0
100
200
300
400
500
600
Temperatura ‫؛‬C
Figura 3.27. Termogramas de la pérdida de masa por TGA para PPDL obtenido
a dos diferentes temperaturas 70 y 90°C.
En esta figura se observó que los termogramas obtenidos muestran una sola
pérdida de masa, sin embargo, también se observa que mientras que el PPDL
sintetizado a 70°C muestra una temperatura de degradación térmica inicial a
250°C, la PPDL sintetizada a 90°C muestra esta temperatura a 200°C. La
disminución en el onset de la temperatura de descomposición es atribuida a
especies de bajo peso molecular en el PPDL obtenido a 90°C aun cuando en
los termogramas las descomposiciones finales a 450 ° C se traslapan unas con
otras. Por otra parte, aun cuando los termogramas obtenidos muestran una
sola pérdida de peso, la primera derivada de las curvas de TGA revela dos
88
fenómenos centrados en 425 y 475°C traslapándose aparentemente una con
otra tal como se muestra en la Figura 3. 28.
0
70‫؛‬C
Primera derivada
90‫؛‬C
-5
-10
-15
PPDL
50
100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650
Temperatura ‫؛‬C
Figura 3.28. Termogramas de la primera derivada para PPDL obtenido a dos
diferentes temperaturas 70 y 90°C.
El análisis realizado para PPDL sintetizado a 2 diferentes temperaturas 70 y
90°C muestran valores similares a aquellos reportados por Focarete et al, pero
con un valor Td ligeramente más alto (438 y 484°C), el cual puede ser debido al
hecho de que la cristalinidad de las muestras preparadas por nosotros es
ligeramente más alta que aquellas reportadas en la literatura [89]. También se
ha apreciado que la temperatura de 90°C utilizada en la síntesis de PPDL
disminuye ligeramente la estabilidad térmica del polímero formado.
89
Conclusiones
Se realizaron reacciones de polimerización por apertura de anillo de butirolactona, -BTL,
-decanolactona, -DCL,
-caprolactona,
-CL,
5-
dodecanólido, 5DDCL y el pentadecanólido, PDL utilizando una enzima
comercial inmovilizada sobre una resina acrílica, novozyme 435, N435 y una
lipasa pancreática porcina, LPP, en su forma nativa. De las cinco lactonas
seleccionadas para la polimerización solamente la
-caprolactona, -CL y el
pentadecanólido, PDL produjeron polímeros con alto peso molecular. Los
resultados obtenidos muestran que las lactonas sin grupos laterales tales como
-caprolactona, -CL y el pentadecanólido, PDL, son susceptibles de reaccionar
en presencia de la novozyma 435 para producir poliésteres. Además, se logran
productos de alto peso molecular rápidamente durante las primeras 12 horas.
Se ha encontrado que los polímeros obtenidos de estas lactonas presentan alta
propiedades térmicas y un peso molecular similar a los reportados para los
mismos polímeros obtenidos por medio de reacciones con catalizadores
químicos o por fermentación. Por otro lado, las lactonas que tienen grupos
laterales tienen rendimientos pobres dando como resultado de la reacción
principalmente oligómeros con terminaciones en ácidos carboxílicos con ambas
enzimas. Se ha determinado que no es posible incrementar el peso molecular
aun cuando se modifique la reacción a un sistema de dos pasos o se
incremente la concentración de enzima. La polimerización por apertura de
anillo para lactonas que tienen grupos laterales produce productos de peso
molecular con bajos rendimientos y baja estabilidad térmica atribuible a un
90
impedimento estérico producido por el grupo lateral impidiendo la reacción de
la lactona catalizada por la enzima.
Los copolímeros biodegradables sintetizados de la
-caprolactona, -CL y el
pentadecanólido, PDL en concentraciones de 75/25, 50/50 y 25/75% mol
mostraron tener un peso molecular más alto que el de los homopolímeros y que
los reportados en la literatura obtenidos por reacciones químicas. Se encontró
que los copolímeros con 75 y 25 % mol obtenidos presentan propiedades
intermedias a los homopolímeros y tienen un comportamiento al azar mientras
que los copolímeros con 50% mol tiene un comportamiento más complejo que
los posiciona como copolímero en bloque, además, de que muestran un
Hf y
un grado de cristalinidad menor que de los copolímeros con un 25 % mol de CL.
Los resultados obtenidos para las polimerizaciones catalizadas por la lipasa
pancreática porcina muestran que todas las lactonas tienen rendimientos
pobres dando como resultado de la reacción principalmente oligómeros
terminados en ácidos carboxílicos. Se ha determinado, que no es posible
incrementar el peso molecular aun cuando se modifique la reacción a un
sistema de dos pasos o se incremente la concentración de enzima. La
polimerización por apertura de anillo para lactonas con grupos laterales
produce productos de peso molecular con bajos rendimientos y baja estabilidad
térmica atribuible a la baja actividad de la enzima.
La película obtenida de una mezcla física a partir de poli( -caprolactona), P -CL
y poli(pentadecanólido), PPDL en un concentración de 50/50 % en peso mostró
91
ser inmiscible. No obstante, presentó un ligero corrimiento en el valor de
temperatura de fusión y valores de
Hf y un grado de cristalinidad menor con
respecto al valor de los polímeros individuales.
Se determinó que un incremento en la temperatura de reacción a 90°C impide
la reacción de la
-caprolactona, -CL, aunque si permite la reacción del
pentadecanólido, PDL. Por otro lado, un incremento de la temperatura de
síntesis de 70 a 90°C para la PPDL afecta el peso molecular disminuyéndolo
casi a la mitad sin afectar la polidispersidad del polímero. Se ha encontrado
que la región amorfa es detectable por FTIR y este es indicado por el hombro
que aparece a 1738 cm-1 de C=O. Sin embargo, la principal diferencia entre la
PPDL sintetizada a 70 y 90°C es el porcentaje de cristalinidad y punto de fusión
y cristalización detectado por DSC. La PPDL polimerizada a 70°C presenta una
cristalinidad más alta con un solo pico de fusión centrado en 86°C mientras que
la PPDL presenta un endoterma múltiple a más baja temperatura. Es
importante mencionar que este comportamiento no ha sido reportado en la
literatura. Se observa también un solo evento de cristalización para la PPDL
sintetizada a 70°C y múltiples picos para la PPDL obtenida a 90°C. El hecho de
que varios eventos de cristalización aparezcan en el PPDL sintetizada a 90°C
indica la presencia de un bajo peso molecular dando lugar a la formación
cristales más pequeños.
92
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