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Producción a Nivel Pre-piloto de Enzima Fitasa de Aspergillus Ficuum, Utilizando Sistemas de Fermentación en Estado Líquido y Sólido Tesis presentada como parte de los requisitos para optar al grado de Licenciado en Ciencia de los Alimentos FRANCISCO ANDRÉS VILLARROEL ROJAS Valdivia - Chile 2009 PROFESOR PATROCINANTE: MARCIA COSTA L. Ingeniero Civil Bioquímico, Diploma Ingeniería Industrial Instituto de Ciencia y Tecnología de los Alimentos PROFESORES INFORMANTES: RENATE SCHÖBITZ T Tecnóloga Médica, MSc Instituto de Ciencia y Tecnología de los Alimentos KONG SHUN AH-HEN Ingeniero en Alimentos, Doctor en Ingeniería Instituto de Ciencia y Tecnología de los Alimentos i INDICE DE MATERIAS Capítulo 1 Página RESUMEN 1 SUMMARY 2 2 INTRODUCCIÓN 3 3 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 5 3.1 Aspergillus sp 5 3.1.1 Identificación y taxonomía 5 3.1.2 Aspergillus ficuum 6 3.2 Fitasa 6 3.2.1 Efecto de las fitasas sobre la disponibilidad de los nutrientes 8 3.3 Ácido fítico 10 3.4 Producción de fitasa 12 3.4.1 Aspectos físicos 13 3.4.2 Aspectos nutricionales 13 3.5 Producción de enzimas mediante hongos 14 3.5.1 Fermentación en estado sólido (SSF) 14 3.5.1.1 Variables de operación 17 3.5.1.2 Parámetros de diseño para el escalamiento 20 3.5.2 Fermentación en fase líquida o cultivo sumergido (SmF) 22 3.5.2.1 Variables de operación 22 3.5.2.2 Parámetros de diseño para el escalamiento 23 4 MATERIAL Y MÉTODO 25 4.1 Microorganismo y preparación del inóculo 25 4.2 Determinación de actividad enzimática 25 4.3 Fermentación en cultivo sumergido 25 4.4 Fermentación en estado sólido 27 ii 4.4.1 Seguimiento de la producción 28 4.4.2 Extracción y concentración de la enzima 28 5 PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS 29 5.1 Fermentación en estado líquido 29 5.2 Fermentación en estado sólido 31 6 CONCLUSIONES 33 7 BIBLIOGRAFÍA 34 8 ANEXOS 44 iii INDICE DE CUADROS Cuadro Página 1 Principales microorganismos productores de fitasa 7 2 Fósforo y fosfato total en alimentos para pollos 11 3 Ensayos en cultivo sumergido 26 4 Tabla resumen fermentaciones en sustrato líquido 45 5 Tabla resumen de actividad enzimática para fermentación 48 en sustrato sólido 6 Curva de calibración 52 iv INDICE DE FIGURAS Figura Página 1 Fermentador New Brunswick 26 2 Fermentador en sustrato sólido de confección propia 27 3 Resumen de la evolución de la actividad enzimática neta de 29 las fermentaciones en estado líquido 4 Evolución de la actividad fitásica neta en el tiempo para 32 fermentación en sustrato sólido 5 Variación de actividad enzimática en el tiempo para 45 fermentación en sustrato líquido 0 vvm 200rpm 6 Variación de actividad enzimática en el tiempo para 46 fermentación en sustrato líquido 0 vvm 300 rpm 7 Variación de actividad enzimática en el tiempo para 46 fermentación en sustrato líquido 0 vvm 400 rpm 8 Variación de actividad enzimática en el tiempo para 47 fermentación en sustrato líquido 0,5 vvm 200rpm 9 Variación de actividad enzimática en el tiempo para 47 fermentación en sustrato líquido 0,5 vvm 300 rpm 10 Variación de actividad enzimática en el tiempo para 48 fermentación en sustrato sólido 11 Cultivo de A. ficuum en placa Petri en agar papa dextrosa 49 12 Observación al microscopio de fermentación en estado 49 líquido v INDICE DE ANEXOS Anexo Página 1 Detalle de fermentaciones líquidas 45 2 Detalle fermentación sólida 48 3 Imágenes de A. ficuum 49 4 Detalle de reacción enzimática para la 50 determinación de actividad 5 Detalle de preparación de sustratos de 53 cultivo 6 Detalle de cálculo de rendimiento de las fermentaciones 54 1 1. RESUMEN Producción a nivel piloto de enzima fitasa de Aspergillus ficuum, utilizando sistemas de fermentación en estado líquido y sólido Las materias primas de origen vegetal han adquirido cada vez mayor importancia en la fabricación de alimentos para animales, por su gran aporte proteico, como es el caso de cereales y legumbres, pero la presencia del ácido fítico restringe su uso. El ácido fítico es considerado un componente antinutricional no digerible por animales monogástricos, además de actuar como quelante de varios minerales y proteínas de unión, además inhibe enzimas como α amilasa, tripsina, tirosinasa y pepsina. Por otra parte, las fitasas (mioinositol hexafosfato 3-fosfohidrolasas) son fosfatasas ácidas que hidrolizan el ácido fítico generando mioinositol y fosfato inorgánico, se han constituido en un aditivo importante en alimentos elaborados a base de cereales y legumbres, ya que aumentan la disponibilidad de fósforo y otros minerales importantes en la nutrición. Hongos como el Aspergillus ficuum, Aspergillus niger y Rhizopus oligosporus liberan fitasa extracelular. En la presente tesis se utilizó una cepa de Aspergillus ficuum para la producción de fitasa usando como indicador de producción la actividad enzimática neta. La determinación de la actividad enzimática se basó en la detección colorimétrica de Pi con una reacción fosfomolíbdica y un reactivo para desarrollar color. Los ensayos se realizaron en sistemas de cultivo sumergido y sólido. Para la fermentación en cultivo sumergido se utilizó un fermentador New Brunswick y para la fermentación sólida un fermentador de confección propia tipo tambor rotatorio. Los rendimientos obtenidos para la fermentación sumergida fueron de 15,83 U/gss al sexto día, mientras que para la fermentación sólida corresponde a 67,34 U/gss al séptimo día, lo que demuestra la conveniencia de esta modalidad de cultivo para la producción de la enzima. Palabras clave: fitasa, ácido fítico, Aspergillus ficuum, fermentación en cultivo sumergido, fermentación en estado sólido. 2 SUMMARY Production of phytase enzyme from Aspergillus ficuum at a pilot level, using submerged fermentation and solid state fermentation Vegetal raw material is getting more and more important in the animal food industry due to its high protein content, like cereals and pulses (leguminous crops), but the presence of phytic acid limits its use in food production. Phytic acid in pulses and cereals is considered an anti-nutritional non-digestible component for monogastric animals. It works chelating various minerals and binding-proteins, also inhibiting enzymes such as amylase, trypsin, tyrosinase and pepsin. On the other hand, phytase (myo-inositol hexakisphosphate 3phosphohydrolase) catalyses the release of phosphate from phytate (myco-inositol hexakiphosphate) and has become a main additive in food being elaborated on a cereal and pulse basis, increasing availability of phosphorus and other important minerals for nutrition. Fungi like Aspergillus ficuum, Aspergillus niger and Rhizopus oligosporus liberate extracelular phytase. In the present study a strain of Aspergillus ficuum was used for the production of the enzyme, using the net enzymatic activity as a production indicator. Determination of the enzyme activity was made with the detection of the Pi with a phosphomolybdic reaction and a reagent for developing color. The different assays were carried out in submerged and solid fermentation. A New Brunswick fermentator for the submerged fermentation and a self-made rotating drum fermentator for the solid fermentation were used. The yield obtained for the submerged fermentation is of 15.83 U/gds (dried solid) on the sixth day, whereas for the solid fermentation it is of 67.34 U/gds on the seventh day, which shows the advantage of this type of culture for the production of the enzyme. Keywords: phytase, phytate, Aspergillus ficuum, submerged fermentation, solid state fermentation. 3 2. INTRODUCCIÓN La mayoría de los cereales y las legumbres son ricas en proteínas, pero la presencia de ácido fítico disminuye su uso en alimentos. El ácido fítico presente en legumbres y cereales es un componente antinutricional no digerible por animales monogástricos. Funciona como quelante de varios minerales y proteínas de unión, además inhibe enzimas como α-amilasa, tripsina, tirosinasa y pepsina. Por esto, la fitasa es un aditivo importante en alimentos elaborados a base de cereales y legumbres, ya que hidroliza el ácido fítico, aumentando la disponibilidad de fósforo y otros minerales importantes en la nutrición. Por otra parte, se han reportado características anticancerígenas del ácido fítico, cuando es administrado en pequeñas dosis. Hongos como el Aspergillus ficuum, Aspergillus niger y Rhizopus oligosporus liberan fitasa extracelular. Hipótesis Si se cultiva Aspergillus ficuum a nivel prepiloto en modalidades de fermentación sólida (SSF) y sumergida (SmF), sobre desechos agroindustriales vegetales como sustrato, será posible determinar y definir los mejores parámetros de producción de fitasa. Para lo anterior se plantearon los siguientes objetivos: Objetivo General: Producir elevadas concentraciones de enzima fitasa utilizada en alimentación de animales monogástricos cultivando Aspergillus ficuum en sistemas de fermentación sólida y sumergida, sobre sustratos compuestos por subproductos agroindustriales. 4 Objetivos Específicos: - Determinar las mejores condiciones de operación de la producción de fitasa en un fermentador New Brunswick de 14 L, cultivando Aspergillus ficuum en un medio líquido basado en subproductos agroindustriales y sulfato de amonio a temperatura y pH constantes, variando los parámetros de aireación (vvm) y agitación (rpm). - Verificar la producción fitasa en modalidad de fermentación sobre sustrato sólido SSF, usando un prototipo de equipo tipo tambor rotatorio de 2 L, cultivando Aspergillus ficuum usando un medio basado en subproductos de la agroindustria a temperatura constante. 5 3. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 3.1 Aspergillus sp. El género Aspergillus incluye una serie de hongos comúnmente considerados como asexuales, aunque se han encontrado algunos que se reproducen en forma sexual. Están ampliamente distribuidos en la naturaleza y es posible encontrarlos en una gran variedad de habitats debido a que son capaces de colonizar una amplia variedad de sustratos. 3.1.1 Identificación y taxonomía. Como en la mayoría de los hongos, el Aspergillus está principalmente clasificado por su morfología que por sus características fisiológicas, bioquímicas y genéticas, comúnmente utilizado en la clasificación de bacterias. La clasificación es la siguiente: Reino: Fungi Phylum: Ascomycota Orden: Eurotiales Familia: Trichocomaceae Género: Aspergillus (TSCA, 1997). El género Aspergillus está definido generalmente como hongos saprófitos asexuales que producen conidias negras o cafés por largas fiálides que están unidas al conidiosporo. La clasificación del género Aspergillus se basa fundamentalmente en cuatro características: presencia de teleomorfo, presencia o ausencia de métulas; disposición de las métulas o fiálides sobre la vesícula y coloración de las colonias (ABARCA, 2000). Si las reglas por nombrar son rigurosamente aplicadas, el nombre A. niger podría desaparecer como un nombre legítimo, causando una gran confusión comercial (TSCA, 1997). Sin embargo, RAPER y FENNEL (1965) proponen el nombre de Aspergillus niger. Por otra parte, FRISVAD et al., (1990) creen que existe un caso claro por conservar el nombre de A. niger, porque el A. niger es "la fuente de producción comercial de ácido 6 cítrico y otros ácidos orgánicos alrededor del mundo, y claramente de importancia económica mayor” (TSCA, 1997). La taxonomía de los componentes de Aspergillus sección Nigri es una de las más complejas del género. Basándose en características morfológicas, las doce especies propuestas por RAPER y FENNELL (1965), se redujeron a cinco especies diferentes por AL-MUSALLAM (1980). 3.1.2 Aspergillus ficuum. El Aspergillus ficuum presenta algunos problemas al momento de revisar la literatura, lo que se debe principalmente la nomenclatura escogida. Esto se puede ver claramente en que algunos autores hacen una diferencia entre Aspergillus ficuum y Aspergillus niger pero sin especificar el nivel taxonómico de la diferencia (WODZINSKI y ULLAH, 1996; BRENES et al., 2002; ZHANG, et al., 2000). Otros simplemente hablan de Aspergillus niger, sin hacer referencia de que cepa se trata. Sólo algunos textos se indica que Aspergillus ficuum pertenece al grupo de Aspergillus niger, sin especificar que Aspergillus ficuum es una variedad (SHIEH y WARE, 1968). La cepa que se utilizará en esta tesis, es Aspergillus ficuum DSMZ 932, que puede ser encontrada como Aspergillus ficuum MUCL 31164 o Aspergillus ficuum NRRL 3135, según la DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany. 3.2 Fitasa Las reacciones de fosforilación y desfosforilación son dos aspectos fundamentales de la vida. Estas reacciones catalizadas por numerosas enzimas son utilizadas para almacenar y recuperar energías químicas, el metabolismo y señales de transducción. Las fosfatasas son un grupo de enzimas que catalizan la hidrólisis de fosfomonoésteres ligados a sistemas biológicos (SHIN et al., 2001). Estas varían de muchas maneras, por ejemplo, el pH óptimo, peso molecular, y tal vez la más importante, en que ión metálico es un cofactor requerido para la catálisis. Las fosfatasas han sido tradicionalmente divididas en, ácidas y alcalinas (VINCENT, 1992). Las fitasas son distintas de otras fosfatasas porque prefieren ácido fítico como sustrato. Muchas fitasas, tales como las de Aspergillus ficuum (ULLAH y SETHUMADHAVAN, 1998) y de E. coli (LIM et al., 2000) han sido clonadas y caracterizadas. Estas fosfatasas no presentan una secuencia similar entre ellas y con otras fosfatasas conocidas, excepto 7 por la secuencia RHGXRXP conservada en la fosfatasa ácida de alto peso molecular (SHIN et al., 2001). Actividad de fitasa ha sido detectada en una gran variedad de microorganismos (CUADRO 1). De estas fuentes, la enzima está mayormente distribuida entre los hongos, particularmente entre hongos que se encuentran en el suelo y el agua como los del género Aspergillus y Rhizopus sp. (WODZINSKI y ULLAH, 1996). Las fitasas (mioinositol hexafosfato 3-fosfohidrolasas) son enzimas fosfatasas ácidas que dividen eficientemente las partes de fosfato del ácido fítico (mioinositol hexafosfato), generando mioinositol y fosfato inorgánico (MITCHELL et al., 1997). CUADRO 1 Principales microorganismos productores de fitasa Localización de la Bacterias Aerobacter aerogenes enzima Unida a la célula Referencia GREAVES et al., 1967 POWAR y JAGAANNATHAN, Bacillus subtilis Extracelular Escherichia coli Unida a la célula Lactobacillus amylovorus Pseudomonas sp. 1982 GREINER et al., 1993 Extracelular SREERAMULU et al., 1996 Unida a la célula IRVING y COSGROVE,1971 Hongos A. flavus Extracelular SHIEH y WARE, 1968 A. niger Extracelular SKOWRONSKI, 1978 Penicillium sp. Extracelular SHIEH y WARE, 1968 Mucor spp. Unida a la célula CASIDA, 1959 Rhizopus spp. Unida a la célula CASIDA, 1959 Levaduras Candida spp. Extracelular NAKAMURA et al., 2000 Kluyveromyces lactis Extracelular NAKAMURA et al., 2000 Pichia spp. Extracelular NAKAMURA et al., 2000 S. cerevisiae Extracelular NAKAMURA et al., 2000 FUENTE: Adaptado de VOHRA y SATYANARAYANA, 2003 8 3.2.1 Efecto de las fitasas sobre la disponibilidad de los nutrientes. En los últimos años se han realizado un gran número de experimentos con fitasas de distintos orígenes (microbianas y vegetales) para determinar su eficacia en aumentar la disponibilidad del fósforo y otros nutrientes en ingredientes vegetales con alto contenido de fósforo fítico (BRENES et al., 2002). La introducción de fitasa como suplemento en la dieta animal, tiene importancia desde dos puntos de vista: la cantidad de fósforo inorgánico requerido disminuye, y el nivel de fósforo en las excretas se reduce (SCHWARTZ, 1996). La adición de fitasa mejora la disponibilidad del fósforo fítico de la pasta de soya, sorgo y gluten de maíz, lo que se refleja en mayor ganancia de peso, consumo de alimento y mejor mineralización de las tibias de los pollos de engorda (CUCA et al., 2003). Esto demuestra que la fitasa hidroliza el ácido fítico dejando el fósforo disponible para su utilización al adicionar 600 FTU 1 /kg de fitasa en la dieta, aumenta el consumo de alimento en aves de 21 días de edad (DENBOW et al., 1995 y BROZ et al., 1994); también se menciona que en dietas con pasta de soya y adición de 600 y 800 FTU por kilogramo de alimento aumenta el consumo (QIAN et al., 1996). En el caso de los cerdos no existe una respuesta lineal entre la fitasa añadida y la digestibilidad del fósforo (KORNEGAY y QIAN, 1996), siendo la magnitud de la respuesta por unidad de fitasa mucho más acentuada con niveles bajos de fitasa (KORNEGAY, 1999). Después de ciertos niveles de adición de fitasa o fósforo disponible no hay efecto benéfico en conversión alimenticia, debido a que hay un aumento simultáneo de ganancia de peso y consumo de alimento (CUCA, 2003). La adición de fitasa en una dieta de maíz y soya en ratas demostró que en cantidades de 500, 1000 y 2000 U de fitasa por kg, incrementó significantemente la absorción aparente de zinc. También se apreciaron incrementos en la concentración de zinc en el plasma y fémur (RIMBACH et al., 1998). Por otra parte la acción hidrolítica de la fitasa sobre los fitatos en el estómago, no sólo aumenta la digestibilidad del fósforo proveniente del ácido fítico, sino que también eleva la 1 Una unidad de fitasa (FTU) es la cantidad de enzima que libera un micromol de, fósforo inorgánico de fitato de sodio por minuto 0.0051 moles/ litro a 37°C y a pH 5,0. 9 digestibilidad del calcio que esta unido a éste. Se ha estimado que se produce una equivalencia de 0,73 g de calcio para 500 U de fitasa/kg de dieta (KORNEGAY y QIAN, 1996); otros estudios establecen que se producen valores de 0,4 a 0,7 g de calcio (JONGBLOED et al., 1996). Investigaciones realizadas sobre la disponibilidad de minerales traza han demostrado que la adición de 1350 U de fitasa/kg a una dieta a base de maíz-soya reducida en fósforo (0,3%) y zinc (30 mg/kg), mejora la biodisponibilidad del fósforo y zinc al reestablecer los valores normales de crecimiento además de los de zinc y fosfatasa alcalina en plasma (LEI et al., 1993). Se ha obtenido una elevación significativa en la absorción de magnesio y zinc, para el caso de los lechones, mediante la suplementación a la dieta de 500 ó 1000 U de fitasa/kg (PALLAUF et al., 1992). Se señala que en el caso de los lechones, existe una mejora del crecimiento y de la retención de los minerales traza zinc, cobre, fósforo y calcio, cuando se suplementan a la dieta 1500 U de fitasa/kg (ADEOLA et al., 1995). También se sabe que la adición de 1200 U de fitasa/kg produce una hidrólisis del fierro ligado al fitato en una dieta a base de maízsoya, mejorando su biodisponibilidad en lechones (STAHL et al., 1998). El efecto de las fitasas sobre la digestibilidad de las proteínas y los aminoácidos no está ampliamente estudiada (BRENES et al., 2002). Se ha estudiado el efecto del ácido fítico en forma independientemente. Entre los estudios realizados para conocer el efecto de la fitasa se ha demostrado que en pruebas in vitro, se ha observado que los fitatos quelan aminoácidos libres, especialmente lisina. Experimentos realizados mediante la incubación de lisina en HCl con salvado de arroz, que son ricos en fitatos, muestran que un 20% de esta lisina queda ligada a éstos. La adición de fitasa al medio de incubación libera el 50% de esta lisina quelada (RUTHERFURD et al., 2002). En pruebas experimentales realizadas in vivo, se ha observado que la adición de fitasa en la dieta mejora la digestibilidad aparente de las proteínas y aminoácidos (BIEHL Y BAKKER, 1996). Señalándose en este sentido, que el empleo de fitasa produce una mejora a la digestibilidad aparente total de la proteína (JONGBLOED et al., 1996). Se ha encontrado que existe una reducción significativa en la digestibilidad total de la grasa, y especialmente de los ácidos grasos insaturados, cuando se incluye fitasa en la 10 dieta. También, se ha demostrado que la adición de vitamina E a la dieta suplementada con fitasa mejora la digestibilidad de los ácidos grasos (GEBERT et al., 1998). Otros autores han sugerido que las fitasas podrían cumplir un rol en la oxidación de los ácidos grasos. Esto debido a que la oxidación de los ácidos grasos, especialmente de los insaturados, se ve favorecida por los minerales traza que son liberados por la acción de la fitasa (GEBERT et al., 1999). Debido a esto, se recomienda que además de agregar fitasa en la dieta, haya una suplementación extra de vitamina E (BRENES et al., 2002). 3.3 Ácido fítico Mioinositol es el alcohol cíclico derivado de la glucosa (LOEWUS y MURTHY, 2000) utilizado en muchos procesos metabólicos de las células vegetales y síntesis de polisacáridos de la pared celular. De sus numerosos derivados fosforilados el mioinositol – 1,2,3,4,5,6 – hexafosfato (IP6) es el más abundante. En un comienzo fue llamado ácido fítico (AF) y descrito como una abundante forma de fósforo en semillas y otros tejidos y órganos vegetales, como polen, raíces y tubérculos (COSGROVE, 1980; RABOY, 1997). Una función clara para el mioinositol – 1,2,3,4,5,6 – hexafosfato en el metabolismo de los vegetales es el almacenamiento y recuperación de fósforo y mioinositol durante el desarrollo y la germinación (RABOY, 2003). La mayoría de los alimentos de origen vegetal contienen de un 50 a un 80 % de su fósforo total como fitato (HARLAND y MORRIS, 1995). En la década de los 80 y 90 quedó demostrado que el AF está ampliamente distribuido en especies eucariontes y es típicamente el Inositol fosfato más abundante en las células (SASAKAWA et al., 1995). Estudios han demostrado que AF y sus derivados, incluidos los mayormente fosforilados pirofosfatos, sirven en un una gran variedad de funciones y procesos, además de almacenamiento de nutrientes. AF representa la mayor fuente metabólica en la vía del Inositol fosfato, involucrado en la transducción y regulación de señales y posiblemente en la transducción de energía y la regeneración del ATP (SAFRANY et al, 1999). AF y sus derivados tienen una función en la exportación del ARN, reparación del ADN y la recombinación del ADN (HANAKAHI y WEST, 2002), en la endocitosis y tráfico vesicular (SAIARDI et al., 2002) y por último como antioxidante (GRAF et al., 1987). 11 Entre el 60 y 70 % del fósforo presente en el sorgo y la pasta de soya (ver Cuadro 2), que se utiliza como alimento para pollos en engorda, se encuentra como ácido fítico, que no puede ser hidrolizado por las enzimas endógenas de los animales monogástricos (CUCA et al., 2003). Además se señala que sólo entre el 30 y 40 % del fósforo fítico está disponible, por lo que sería necesario que las dietas se complementen con fósforo inorgánico, para satisfacer la necesidad del animal (NELSON et al., 1968). Las plantas utilizan mucho del fósforo que toman del suelo en desarrollar semillas, y las semillas sintetizan la mayoría de este fósforo en AF. Es por esto que no es sorprendente que una estimación reciente de la cantidad neta de AF producida por semillas, anualmente, sea equivalente a más del 50% del fósforo fertilizado anualmente en el mundo (LOTT et al., 2000). CUADRO 2 Fósforo y fosfato total en alimentos para pollos Ingredientes P total (%) Fitato total (%) % de P total Maíz 0,39 0,25 64 Arroz 0,15 0,09 60 Trigo 0,44 0,27 61 Sorgo 0,30 0,22 73 Cebada 0,33 0,20 61 Bajra 0,31 0,23 74 Maní 0,60 0,46 77 Poroto de soja 0,88 0,56 64 Semilla de algodón 0,93 0,79 82 Girasol 0,90 0,45 51 Cereales Harinas de semillas FUENTE: TYAGI et al., 1998 AF sirve también como una fuente de almacenamiento de cationes minerales, ya que forma sales de fosfato con Mg, K, Ca, Mn y Zn (OTEGUI et al., 2002). El ácido fítico es uno de los antioxidantes más prometedores. Su actividad antioxidante se manifiesta inhibiendo la generación de oxígeno reactivo de H2O2, quelando algunos metales (MIDORIKAWA et al., 2001). 12 Estudios en animales demuestran el efecto inhibidor de la fibra dietética en el desarrollo de neoplasmas intestinales, dependiendo del origen de la fibra. La fibra de trigo tiene un efecto inhibidor mayor, antes que otras fuentes de fibra como la avena o el maíz. La administración de ácido fítico, que se encuentra en niveles altos en el trigo inhibe la carcinogénesis de colon (BANDARU, 1999). El ácido fítico reduce la digestibilidad de de proteínas, almidón y lípidos. El fosfato forma complejos con las proteínas, haciéndolas menos solubles de manera tal que resisten la proteólisis (DVORAKOVA, 1998). Polifenoles y el ácido fítico pueden afectar la digestibilidad del almidón, a través de interacciones con la amilasa (THOMPSON y YOON, 1984). La acción de ciertas enzimas, como las amilasa, tripsina, fosfatasa ácida y tirosinasa, es inhibida por el ácido fítico. (HARLAND y MORRIS, 1995). 3.4 Producción de fitasa Fitasa puede ser producida de una gran cantidad de microorganismos que incluyen bacterias, levaduras y hongos. Es así como, VOHRA y SATYANARAYANA (2003) en su trabajo presentan información relevante en cuanto a los microorganismos productores de fitasa, indicando temperatura, pH óptimos además de indicar que para la mayoría de los microorganismos y en especial los hongos la fitasa es una enzima constitutiva. Sólo algunas bacterias como Bacillus subtilis presentan inducibilidad en cuanto a la producción. Durante los últimos 40 a 50 años el uso de hongos filamentosos en la producción de enzimas ha crecido rápidamente y fitasa no es la excepción a esto (PANDEY et al., 2001). Fermentación en cultivo sumergido (SmF) ha sido ampliamente empleada como la tecnología de producción. Sin embargo, en los últimos años, la fermentación en estado sólido (SSF) ha ganado gran interés en la producción de metabolitos primarios y secundarios (PANDEY, 1992). Tanto SmF como SSF han sido utilizados para la producción de fitasa. Tipo de cepa, condiciones del cultivo, naturaleza del sustrato y disponibilidad de nutrientes son factores que afectan el rendimiento y son críticos al momento de elegir la técnica. Por ejemplo, un hongo filamentoso en SmF está expuesto a fuerzas hidrodinámicas, pero en SSF la superficie de las partículas sólidas actúa como matriz del cultivo. MOO-YOUNG et al. (1978) establecieron que el crecimiento microbiano en este tipo de sistemas depende de 13 la disponibilidad de nutrientes y de la configuración geométrica de la matriz. PAPAGIANI et al. (2000) investigaron las relaciones cualitativas entre composición del medio, morfología de A. níger y producción de fitasa en SmF y SSF. 3.4.1 Aspectos físicos. Los parámetros más importantes en el crecimiento de microorganismos y la producción de metabolitos, son el pH, temperatura, agitación, oxigeno disuelto y presión. Prácticamente todos los microorganismos productores de fitasa son mesófilos a, excepción de algunos hongos termófilos como Thermomyces lanuginosus (BERKA et al., 1998), Talaromyces thermophilus (PASAMONTES et al., 1997) y Sporotrichum termophile (GHOSH, 1997). La temperatura óptima para la producción de fitasa, para la mayoría de los microorganismos se encuentra en el rango de los 25 a 37 ºC. El pH tiene un importante efecto en la producción de fitasa. Para la mayoría de las bacterias y los hongos el rango se encuentra entre 5,0 y 7,0. Una aireación y agitación apropiadas del medio son importantes para mantener los constituyentes del medio, las células microbianas y el oxígeno uniformemente suspendidos (VOHRA y SATYANARAYANA, 2003). Para Schwanniomyces castellii, la producción de fitasa se llevo a cabo en un fermentador continuo aireado a 1 vvm y con agitación a 600 rpm (SEGUEILHA et al., 1992). En la producción de fitasa con algunos hongos como Aspergillus niger, Aspergillus ficuum NRRL 3135 y Aspergillus terreus se llevo a cabo con agitación a 270 rpm (SHIEH y WARE, 1968). Aspergillus carbonarius produce fitasa en una fermentación en estado sólido (SSF) usando harina de canola como sustrato (AL-ASHEH y DUVNJAK, 1994). 3.4.2 Aspectos nutricionales. La fuente y la concentración óptima de la fuente de carbono son factores muy importantes en la producción de fitasa. Glucosa ha sido el sustrato mayormente preferido en su producción. En una concentración del 1% fue óptima para Lactobacillus amylovorus (SREERAMULU et al., 1996), para Bacillus subtilis se utilizó una concentración del 2% (KEROVUO et al., 1998). Por otro lado salvado de trigo en una concentración del 6% se utilizó como fuente de carbono para Bacillus sp. DS11 (KIM et al., 1998). Para hongos se ha utilizado un medio de cultivo con extracto de levadura. Con fuentes como glucosa y sacarosa como única fuente de carbono se observaron bajos 14 rendimientos en la producción de fitasa para Aspergillus niger NRRL 3135. Sin embargo con la utilización de algunos tipos de harina de maíz se obtuvo un rendimiento mayor (SHIEH y WARE, 1968). En Aspergillus ficuum se utilizó harina de canola con una suplementación de glucosa (5,2%), en una fermentación en estado sólido y se incrementó el rendimiento de la producción de fitasa (EBUNE et al., 1995). El nitrógeno es otro parámetro importante en el medio de cultivo, que influye en el crecimiento y en la producción de enzima. Fuentes orgánicas de nitrógeno, como peptona han sido utilizados con Aerobacter aerogenes en una concentración del 1% (GREAVES et al., 1967). Una fuente de nitrógeno inorgánico como el sulfato de amonio se utilizó en la producción de la enzima con Pseudomonas sp. (IRVING y COSGROVE, 1971) y Enterobacter sp. (YOON et al., 1996). Algunos microorganismos necesitan, además de las fuentes de carbono y nitrógeno, algunos elementos traza y vitaminas, como es el caso de algunas levaduras (GALZY, 1964). Para microorganismos como Bacillus subtilis (POWAR y JAGANNATHAN, 1967), E. coli (GREINER et al., 1993) y Aspergillus ficuum NRRL 3135 (SHIEH y WARE, 1968), no es necesario la adición de éstos. 3.5 Producción de enzimas mediante hongos Las enzimas son uno de los productos de mayor interés obtenidos a través de fuentes microbianas. Un gran número de procesos en las áreas industriales, ambientales y de los alimentos utilizan enzimas en alguna etapa de producción. Los actuales desarrollos en la biotecnología están desarrollando nuevas aplicaciones para las enzimas. La fermentación en estado sólido presenta un gran potencial en la producción de enzimas (PANDEY, 2003). 3.5.1 Fermentación en estado sólido (SSF). La fermentación en estado sólido usualmente ha desarrollado la producción de productos de valor agregado (antibióticos, alcaloides, factores de crecimiento en plantas, etc.), biocombustibles, enzimas, ácidos orgánicos, etc. Esta tecnología ha ganado una renovada atención por parte de la industria, porque se ha convertido en una alternativa más atractiva a la fermentación en estado líquido (PÉREZ-GUERRA, 2003). 15 La fermentación en estado sólido puede ser definida como “el crecimiento de microorganismos (principalmente hongos) sobre materiales sólidos húmedos en la ausencia de agua de flujo libre” (CANNEL y MOO-YOUNG, 1980). Las principales características de estos sistemas son las que se indican a continuación: • La baja disponibilidad de agua reduce la posibilidad de contaminación por bacterias y levaduras. Esto permite trabajar bajo condiciones asépticas, en algunos casos (RAIMBAULT, 1998). • Permite trabajar en un ambiente parecido a los habitats de los hongos, que son los principales microorganismos utilizados en SSF. • Niveles de aireación mayor, especialmente adecuados para procesos que demandan un metabolismo oxidativo intenso. • La inoculación con esporas (en el caso de los hongos) facilita una distribución uniforme en el medio. • Medios de cultivo bastante simples. El sustrato provee generalmente todos los nutrientes necesarios para el crecimiento • Reactores de diseño simple, con requerimientos de espacio bajos, debido a la naturaleza concentrada de los sustratos. • Bajos volúmenes de efluentes contaminantes. Menos requerimientos de solventes son necesarios para la extracción del producto, debido a su alta concentración. La SSF presenta también algunas desventajas, tales como: • Sólo microorganismos que pueden crecer a bajos niveles de humedad pueden ser utilizados. • La determinación de la biomasa es más difícil. • La naturaleza sólida del sustrato causa problemas en la determinación de los parámetros del proceso (pH, humedad, oxígeno y concentración de biomasa) • Transferencia de masa limitada a la difusión. 16 • Esporas tienen un periodo de latencia mayor, debido a la germinación. • Tiempos de proceso mayores. En la SSF pueden darse dos tipos de procesos, dependiendo de la naturaleza de la fase sólida. En el primero, y más utilizado, los sólidos sirven como soporte y como fuente de nutrientes. Los sustratos son comúnmente heterogéneos e insolubles en agua. Usualmente son productos de la agricultura o subproductos de la industria de los alimentos (PANDEY, 1992). El otro proceso utiliza un soporte inerte, como los residuos de la caña de azúcar (bagazo), fibra de cáñamo, fibras inertes, resinas, espumas de poliuretano, etc. y que son impregnadas con un medio líquido que contiene todos los nutrientes (azúcares, lípidos, ácidos orgánicos, etc.). Esta estrategia es menos usada, pero presenta algunas ventajas. El uso de un medio líquido definido y un soporte inerte homogéneo, permite un mejor control, monitoreo y reproducibilidad de la fermentación. En algunos casos el uso de un soporte inerte presenta algunas desventajas económicas (OOIJKAAS et al., 2000) En la adhesión a superficies participan proteínas llamadas hidrofobinas y otras moléculas como glicoproteínas. Éste proceso pude ser dividido en tres etapas: a) Adhesión, la que es fuertemente incrementada por la hidrofobicidad de las esporas del A. ficuum. b) Crecimiento inicial y fase de desarrollo desde la germinación de la espora hasta la colonización de la superficie. c) Fase de maduración, en la cual la densidad de la biomasa se ve incrementada. Para el caso de los hongos fermentaciones en sustrato sólido presentan condiciones similares a las que encuentran en forma natural, no así en cultivo sumergido. Esta diferencia podría determinar las diferencias en producción y tal vez diferencias bioquímicas en los metabolitos producidos, que se ven claramente reflejadas en los resultados obtenidos. En cualquiera de los dos casos las características físicas del medio, favorecen la difusión de los nutrientes y gases, así como la fijación de los microorganismos (MITCHELL Y LONSANE, 1992). También es necesario tomar en cuenta algunas características físicas del soporte, que podrían influir en el desarrollo de la SSF: tamaño y forma de la partícula, porosidad y consistencia del material (MITCHELL y LONSANE, 1992). 17 Las fermentaciones en sustrato sólido presentan rendimientos más altos en comparación con las fermentaciones en sustrato líquido. Esto contrariamente a lo que usualmente se piensa, no es debido al bajo contenido de agua, si no a la adhesión del hongo a las partículas sólidas. Relacionado con esto existen dos principales tipos de procesos. En primer lugar están los procesos que utilizan sustratos sólidos naturales, tales como residuos de celulosa, granos o sus subproductos o desechos de la industria azucarera. En estos casos el sustrato es usado tanto como fuente de carbono como de nutrientes para el desarrollo microbiano. En segundo lugar se encuentran los procesos que utilizan sustratos artificiales inertes, tales como espumas de poliuretano. En estos últimos éste es usado solamente como una estructura de soporte para los microorganismos (GUTIÉRREZ- CORREA y VILLENA, 2003). Desde el punto de vista de la ingeniería los soportes inertes son mejores, ya que no cambian sus características geométricas ni físicas debido al crecimiento microbiano, permitiendo un mejor control del calor y de la transferencia de masa. Los hongos – especialmente mediante los micelios – tienen una mayor posibilidad de penetrar en el sustrato y de esta manera obtener los nutrientes. Los hongos en general están naturalmente adaptados a crecer en superficies y es en estas condiciones donde muestran un comportamiento fisiológico particular, que cambia cuado se encuentra en sustrato líquido (PÉREZ – GUERRA et al. 2003). La adhesión a las superficies en el caso de los hongos filamentosos es principalmente mediante una clase pequeña de proteínas llamadas hidrofobinas y que son producidas por ascomycetes y basidiomycetes y eventualmente por zygomycetes. Las hidrofobinas estabilizan la adhesión de esporas y micelios a superficies hidrofóbicas naturales como inertes (GUTIÉRREZ – CORREA y VILLENA, 2003). 3.5.1.1 Variables de operación. En SSF son varias las variables de proceso que pueden ser manejadas, y los efectos de las mismas son diversos. Las variables frecuentemente operacionalizadas son: contenidos de humedad y aw, densidad del inóculo, temperatura, pH, tamaño de partículas de los sustratos, aireación, agitación/mezclamiento. El contenido de humedad es un factor crítico en el proceso de SSF, debido que este factor tiene influencia en el crecimiento y la biosíntesis y secreción de diferentes metabolitos 18 (KRISHNA y CHANDRASEKARAN, 1996, ELLAIAH et al. 2002). Un contenido bajo de humedad causa una reducción en la solubilidad de los nutrientes del sustrato y una alta tensión del agua. Por otro lado, niveles altos de humedad pueden producir reducción del rendimiento de la enzima debido a un obstáculo estérico del crecimiento de la cepa productora por la reducción de la porosidad (espacios entre las partículas) de la matriz sólida, interfiriendo con esto en la transferencia de oxígeno (LONSANE et al., 1985). Generalmente el contenido de agua del sustrato oscila entre 30 y 75%. Niveles más bajos pueden inducir a una esporulación del microorganismo, mientras que niveles más altos reducen la porosidad del sistema, limitando la transferencia de oxígeno e incrementando el riesgo de contaminación bacteriana. Durante el proceso de fermentación el contenido de humedad puede variar, debido a evaporación y actividad microbiana. En general el resultado de todos estos procesos es la pérdida de humedad, siendo necesario agregar agua utilizando humidificadores o un flujo de aire saturado de agua (PÉREZ – GUERRA et al., 2003). Los requerimientos de agua del microorganismo es mejor definirlo como actividad de agua (aw) antes que contenido de agua del sustrato (RAIMBAULT, 1998). Desde un punto de vista microbiológico aw indica el agua disponible o accesible para el crecimiento del microorganismo. La actividad de agua afecta el desarrollo de la biomasa, las reacciones metabólicas y los procesos de transferencia de masa (GERVAIS y MOLIN, 2003; BELLON – MAUREL et al., 2003). Si bien aw es una función de la concentración de los solutos, en estos sistemas donde las soluciones están adsorbidas a la matriz, los valores de aw también dependen de la estructura física y la naturaleza química de ésta. El valor adecuado de aw depende del producto y de los requerimientos del microorganismo. Generalmente la aw para la producción de metabolitos es más alta que para el crecimiento (GERVAIS y MOLIN, 2003). En SSF la transferencia de masa, por difusión, relacionada con gases y nutrientes está fuertemente influenciada por la estructura física de la matriz y por la fase líquida del sistema (RAIMBAULT, 1998; GERVAIS Y MOLIN, 2003; RAGHAVARAO et al., 2003). RAGHAVARAO et al., 2003 describen dos tipos de fenómenos de transferencia de masa, uno a una micro escala y otro a una macro escala en el exterior de la célula. El primero se 19 relaciona con la transferencia de masa tanto hacia adentro como hacia fuera de las células del microorganismo. El segundo incluye más factores: la mayor parte del aire fluye hacia adentro y luego hacia fuera del fermentador, convección natural, difusión y conducción a través del sustrato, los materiales del fermentador, el daño por corte del microorganismo y la integridad de las partículas del sustrato. Dentro de la difusión de gases la aireación tiene esencialmente dos funciones: (1) suministrar oxígeno para el metabolismo aeróbico y (2) remover el CO2, calor, vapor de agua y compuestos volátiles producidos durante el metabolismo (GERVAIS Y MOLIN, 2003). El intercambio de O2 y CO2 entre la fase sólida y la fase gaseosa tiene lugar tanto a nivel inter-particular como intra-particular. Esto depende de aquellos factores que incrementan la superficie de contacto entre las fases: fracción de vacío de la matriz, tamaño del poro y diámetro de las partículas, grado de mezclamiento y profundidad de la matriz, aireación adicional generada por la agitación y el nivel de humedad del sustrato. En general la difusión de gases aumenta con el tamaño del poro y disminuye con la reducción del diámetro de las partículas, debido a un compactamiento del sustrato (CANNEL y MOO-YOUNG, 1980). En el caso de la difusión de nutrientes, ésta ocurre a un nivel intra-particular e incluye la difusión de nutrientes hacia las células y la hidrólisis del sustrato sólido por las enzimas microbianas. Esto último es un punto importante debido a que la mayor parte del sustrato es agua insoluble (RAGHAVARAO et al., 2003). La difusión de nutrientes es especialmente importante en SSF de bacterias y levaduras, no así en SSF con hongos, ya que los micelios penetran más fácilmente el sustrato sólido. El incremento de la temperatura en SSF es una consecuencia de la actividad metabólica cuando la eliminación de calor no es suficiente. Esto afecta directamente la germinación de esporas, crecimiento y la formación de producto. La temperatura está en función del tipo de microorganismo, la porosidad, el diámetro de las partículas y la profundidad del sustrato (RAIMBAULT, 1998; RAGHAVARAO et al., 2003). La transferencia de calor en un sistema SSF es muy baja debido a la capacidad limitada de transferencia de los sustratos sólidos utilizados. La transferencia total de calor depende del ritmo de transferencia intra- e inter-particular y de la velocidad con que el calor es transferido desde la partícula a la fase gaseosa (RAIMBAULT, 1998). 20 El control de la temperatura en sistemas SSF es más complicado que en SmF. Así los métodos utilizados en SmF no son apropiados para SSF. En un contexto industrial monitorear y controlar esta variable es crítica para un escalamiento (BELLON – MAUREL, et al., 2003). Una aireación convencional es el principal método utilizado para controlar la temperatura del sustrato (RAIMBAULT, 1998; RAGHAVARAO et al., 2003). Debido a que grandes flujos de aire pueden disminuir la aw del sustrato por evaporación, normalmente se utiliza aire saturado con agua. La agitación del sustrato también puede ayudar a controlar la temperatura. El control y medición del pH es una variable complicada en sistemas SSF. Sin embargo los sustratos utilizados, normalmente tienen un efecto tampón, debido a su compleja composición química. En estos casos el control de pH no es necesario. Cuando esta variable tiene que ser controlada se utilizan soluciones tampón como fase líquida, pero ésta metodología puede ser inadecuada cuando el proceso es escalado (PÉREZ – GUERRA et al., 2003). Otra posibilidad de controlar el pH consiste en adicionar una mezcla de fuentes de nitrógeno con una influencia opositora en la evolución del pH. De esta manera sales de amonio han sido utilizadas en combinación con urea o sales de nitrato debido a sus respectivos efectos de acidificación y alcalinización (TORRADO et al., 1998). 3.5.1.2. Parámetros de diseño para el escalamiento. Los sistemas de SSF involucran varios y complejos procesos como son transferencia de masa y energía. Estos procesos son multivariables y difíciles de modelar y por la misma razón de definir o encontrar parámetros de diseño para el modelamiento. Importantes parámetros de operación son el nivel de llenado y la velocidad de rotación. Estos parámetros tienen una influencia directa con la transferencia de masa, transferencia de calor, mezclamiento y corte. Además de la geometría del sistema, son parámetros de importancia (SHUTYSER, 2003). El proceso de mezclamiento puede ser modelado utilizando variados modelos discretos de partícula. Entre ellos, los que han demostrado entregar convenientes vías de estudio para el flujo granular son: Simulaciones Monte Carlo (ROSATO, 1986), modelos celulares automáticos (KTITAREV y WOLF, 1998) y reestructuración del fondo a superficie (BAUMAN et al., 1994). Sin embargo, el método de simulación más ampliamente utilizado está basado en simulaciones dinámicas moleculares, donde las fuerzas de interacción 21 son modeladas en partículas individuales. Este método se denomina dinámica granular (RISTOW, 1994). La limitante de estos métodos es que los cálculos computacionales son muy extensos y debido a eso el número de partículas involucradas es todavía limitado (<106). Las aproximaciones adoptadas del modelo de dinámica granular se pueden dividir en dos grandes grupos, dependiendo de la densidad y características del flujo granular modelado. Una partícula esférica se aproxima a baja densidad y flujo rápido; y una partícula esférica blanda se aproxima a una densidad alta y flujo lento. En estudios recientes el modelo de la partícula blanda fue aplicado para estudiar dinámicas de flujo de partículas, tambores rotatorios (DURY y RISTOW, 1997), lechos fluidizados (HOOMANS, 2000; MIKAMI, et al., 1998), flujos de tuberías (TSUJI et al., 1992), y llenado de silos (CLEARY, 2000). Debido a que estos estudios están orientados a flujos de polvos finos o mezclas de partículas finas es que se presentan similitudes con mezclas de las partículas de los sustratos en SSF, sería posible utilizar esta metodología para estudiar el mezclamiento en SSF. Utilizando una aproximación de partícula discreta es posible de determinar el flujo de calor entre partículas individuales en un sistema rotatorio de tambor mixto. Una ventaja clara de este modelo es que puede ser fácilmente usado para predecir los flujos de transferencia de calor para diferentes geometrías de reactores, debido a que la conductividad térmica del aire (0,025 Wm-1 K-1 a 20ºC) es baja en comparación con la conductividad de los sólidos. La contribución de la convección a la transferencia de calor es despreciable, el aire inter-particular tiene una baja conductividad térmica y la transferencia de calor se produce por puntos de contacto entre dos partículas adyacentes (SHUTYSER, 2003). Algunos estudios recientes han involucrado la distribución de líquido durante el proceso (GOLDSCHMIDT, 2001; LITSTER et al., 2001). Durante la granulación el líquido sirve como conector en la aglomeración de polvos a gránulos más grandes y la distribución del líquido tiene que ser controlada para obtener el tamaño deseado. En el caso que las gotas del líquido sean considerablemente más pequeñas que las partículas del sustrato, éstas pueden ser despreciadas al momento de los cálculos, ya que no influyen. (SHUTYSER, 2003). 22 3.5.2 Fermentación en fase líquida o cultivo sumergido (SmF). La fermentación en estado líquido tiene una larga historia. En un comienzo, en los años 40, esta técnica fue utilizada para la producción de penicilina y estreptomicina (HUMPHREY, 1998). Se utilizaban fermentadores de acero al carbón pero con el tiempo y el uso estos se corroían fácilmente. En los siguientes 40 años la industria de la fermentación presentó un desarrollo inmenso, cambiando los reactores por acero inoxidable, que si bien eran más caros pero tenían una duración mayor. Esta fermentación utiliza un soporte y fuente de nutrientes en solución líquida. Las principales características de la fermentación en sustrato líquido se indican a continuación: • Tiene que ser vigilado constantemente • Las fuentes de carbono y nitrógeno pueden ser obtenidas de glucosa y extracto de levadura, p.ej. • El sustrato permite la determinación de los parámetros del proceso (pH, humedad, oxigeno y concentración de biomasa), fácilmente. • Tiene una gran cantidad de agua disponible • Los reactores se encuentran ampliamente distribuidos. Este tipo de fermentación también presenta sus desventajas: • Medios de cultivo caros • Debido a que hay una gran disponibilidad de agua y nutrientes, existe un mayor riesgo de contaminación con algún microorganismo no deseado. • Los costos de producción son más elevados • Generación de metabolitos no deseados como ácido oxálico, azúcares residuales y micelio en el caso de los hongos. 3.5.2.1 Variables de operación. En esta tesis las variables a estudiar corresponden a la aireación y agitación del medio. Debido a que la cantidad y tamaño de las burbujas de aire es difícil de determinar, el área es frecuentemente expresada con el coeficiente de transferencia de masa kLa. En este caso la “L” en kL indica que la resistencia de la película líquida es predominante para un gas poco soluble como lo es el oxígeno. La relación entre la concentración de oxígeno y el crecimiento es del tipo de Michaelis – Menten. Cuando el proceso está limitado por el oxígeno, el coeficiente específico de respiración (QO2) aumenta a medida que también aumenta la concentración de oxígeno disuelto, 23 hasta alcanzar un estado de equilibrio. Esta concentración se denomina concentración crítica de oxígeno y fluctúa frecuentemente de 0,5 a 2,0 ppm para bacterias, levaduras y hongos distribuidos uniformemente, que crecen a temperaturas de 20 a 30ºC. Sobre esta concentración crítica el consumo específico de oxígeno sólo aumenta levemente al aumentar la concentración de oxígeno disuelto. 3.5.2.2 Parámetros de diseño para el escalamiento. Un apropiado medio de escalamiento para procesos aeróbicos es la medición del nivel de oxígeno disuelto que es necesario en equipos pequeños y ajustar las condiciones en la planta hasta que este nivel de oxígeno disuelto es alcanzado. Antiguos métodos de escalamiento de fermentaciones insisten en similitudes geométricas basadas en dimensiones físicas proporcionales. Se pensaba que aplicando la misma energía por unidad de volumen que en el equipo piloto se conseguirían rendimientos equivalentes en grandes fermentadores. Como los dispositivos de mezcla tienen áreas (dimensiones cuadradas) para mover volúmenes (dimensiones cúbicas), métodos basados en similitudes dimensionales no son recomendados. Escalamientos basados en la equivalencia del coeficiente de transferencia de oxígeno, kLa has resultado exitosos (PERRY, 1999). Otros factores de escalamiento son la agitación, tiempo de mezclamiento, número de Reynolds, momentum y el mezclamiento debido a las burbujas ascendentes. La agitación puede ser estimada de la siguiente ecuación: ⎛ Di S s = S l ⎜⎜ ⎝ Di s l ⎞ ⎟⎟ ⎠ 1 3 (1) Donde los subíndices s y l representan pequeño y grande respectivamente y Di es el diámetro del agitador (STEEL et al., 1962). Algunas fermentaciones de hongos presentan esporulaciones tempranas, rompimiento del micelio y bajos rendimientos si es que la agitación es excesiva. Una velocidad de 250 cm/s a 500 cm/s es considerada aceptable. El mezclamiento se ha propuesto como un factor de escalamiento pero poco se puede hacer para implementarlo en un fermentador debido a que gigantes motores serían necesarios para lograr un mezclamiento adecuado. 24 La constante de Reynolds no es utilizado para el escalamiento de fermentaciones; hay solamente un factor en la aireación. Esto también se aplica al considerar los mezcladores como una bomba e intentar escalar a través del momentum constante. En fermentaciones de biomasa la productividad frecuentemente varia de 2 a 5 g/l h esto representa una demanda de oxígeno del rango de 1,5 a 4 gO2/l h. En un fermentador de 500 m esto significa alcanzar niveles del coeficiente de transferencia de oxígeno del orden 250 a 400 h-1. Estas capacidades de transferencia de oxígeno pueden ser alcanzadas con flujos de aireación de 0,5 vvm (volumen de aire por volumen de medio) y agitación mecánica con energías que van de 2,4 a 3,2 KW/m. 25 4. MATERIAL Y MÉTODO 4.1 Microorganismo y preparación del inóculo La cepa utilizada en la tesis, es la Aspergillus ficuum DSM 932, que puede ser encontrada como Aspergillus ficuum MUCL 31164 o Aspergillus ficuum NRRL 3135, según la DSMZDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany. El medio para su propagación inicial fue agar papa dextrosa en tubo inclinado. Luego se transfirió a una placa Petri con el mismo medio. Ambos se cultivaron a 25 – 30ºC hasta que el hongo cubrió la totalidad de la placa. Posteriormente, las esporas fueron removidas y transferidas a un Medio Líquido de Cereales (MLC) para la preparación del inóculo y llegar a un volumen de 2 l aproximadamente. 4.2 Determinación de actividad enzimática La medición de la actividad se realizó mediante un método de HARLAND y HARLAND (1980), modificado el cual se basa en el uso del reactivo de Taussky-Shorr, que mide la cantidad de fósforo inorgánico (Pi) liberado por la acción enzimática (ANEXO 4). 4.3 Fermentación en cultivo sumergido Se trabajó en el fermentador New Brunswick (FIGURA 1) a una temperatura de 28 ºC y a un pH de 5,5. Se realizaron 5 fermentaciones (CUADRO 3) de 7 días cada una 2 . Se tomaron dos muestras al día durante cada uno de los ensayos. Estas muestras fueron centrifugadas a 10.000 rpm por 10 minutos. Se utilizó el sobrenadante para realizar la prueba de actividad enzimática. Las muestras fueron refrigeradas y analizadas todas juntas una vez terminado el ensayo. 26 El MLC está compuesto por subproductos de la agroindustria (chuchoca, afrechillo, harina integral de trigo), agua destilada, y sulfato de amonio (ANEXO 5). El CUADRO 3, presenta el diseño experimental llevado a cabo en las fermentaciones en cultivo sumergido donde se varía la oferta de aire al cultivo. CUADRO 3. Ensayos en cultivo sumergido vvm Velocidad de rotación del agitador, rpm 0 200 300 400 0,5 200 300 --- FIGURA 1. Fermentador New Brunswick usado en las fermentaciones en cultivo sumergido. 2 Inicialmente se planificaron 9 fermentaciones, pero debido a la destrucción del equipo no fue posible desarrollarlas todas. 27 4.4 Fermentación en estado sólido Se realizó una fermentación por quince días. Para este ensayo se utilizó un fermentador de confección propia prototipo de tambor rotatorio de 2 L sin agitación interior (FIGURA 2). El Medio Sólido de Cereales (MSC) está compuesto por subproductos de la agroindustria (chuchoca, afrechillo, harina integral de trigo) y sulfato de amonio (ANEXO 5). La humedad necesaria la entregó el inóculo. La cantidad de MSC utilizada fue de 365 g y el inóculo fue preparado de la misma manera que para la SmF y corresponde a 190 ml. Luego todo se introdujo todo en una botella Schott de dos litros a modo de fermentador de tambor rotatorio. 3 5 4 2 1 1) Termostato; 2) fuente de calor; 3) botella contenedora del medio; 4) motor; 5) rodillos de movimiento y soporte FIGURA 2. Fermentador en sustrato sólido de confección propia. Prototipo de tambor rotatorio de 2 L sin agitación interior. Equipo montado sobre rodillos en movimiento (3 rpm) dentro de una caja de poliestireno expandido dotado de calefactor y termostato (+1°C) 28 4.4.1 Seguimiento de la producción. La toma de muestra se realizó una vez al día. La muestra consistía en una cantidad del mismo cultivo de aproximadamente 6 gramos tomadas en forma aséptica. Las muestras fueron almacenadas y refrigeradas en tubos Falcon estériles de 50 mL y que facilitaron la posterior extracción de la enzima para el análisis. Estos recipientes fueron previamente tarados, para poder calcular el peso neto de muestra recolectada. 4.4.2 Extracción y concentración de la enzima. En este caso se realizó una extracción sólido – líquido para separar la enzima de los sólidos. Se utilizó una solución al 0,1% de Triton X-100 para la extracción de ésta. La proporción utilizada de Tritón X-100 para la elusión fue de 5 mL por cada gramo de muestra. Posteriormente los tubos fueron colocados en un agitador orbital a 200 rpm por 1 hora a 25ºC. Luego las muestras fueron centrifugadas a 10.000 rpm por diez minutos a 4ºC. Para el ensayo de actividad enzimática se utilizó el sobrenadante, a modo de extracto enzimático. 29 5. PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS 5.1 Fermentación en estado líquido Como puede apreciarse en la FIGURA 3, para la fermentación 0 – 200 (sin incorporación de aire adicional, sólo 200 rpm de agitación) la máxima actividad de enzima se produjo al quinto día con una actividad 0,0133 U/ml. En el caso de la 0 – 300 el pico de actividad se produjo al sexto día con valor de 0,383 U/ml. La fermentación con las variables 0 – 400 tiene su máxima actividad al sexto día siendo esta de 0,244 U/ml. Las fermentaciones de 0,5 – 200 y 0,5 – 300 tuvieron actividades de 0,226 U/mL y 0,245 U/ml respectivamente, ambas en el sexto día. 0 vvm - 200 rpm 0,4 0 vvm - 300 rpm A c tiv id a d fitá s ic a n e ta (U /m L ) 0 vvm - 400 rpm 0.5 vvm - 200 rpm 0,3 0.5 vvm - 300 rpm 0,2 0,1 0,0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 -0,1 Tiempo (días) FIGURA 3. Resumen de la evolución de la actividad enzimática neta de las fermentaciones en estado líquido. 30 La fermentación 0 – 200 presentó la actividad más baja de todos los ensayos. En el caso de los ensayos 0 – 400, 0,5 – 200 y 0,5 – 300 se obtuvieron resultados similares en cuanto a los niveles de actividad. La fermentación 0 – 300 presentó el nivel de actividad más elevado de todos los ensayos alcanzando un nivel de 0,383 U/ml (CUADRO 4). El máximo nivel de actividad se alcanzó en casi todos los ensayos en el sexto día a excepción del ensayo 0 – 200 que ocurrió en el quinto día. Para los ensayos 0 – 200 y 0,5 – 200, donde se mantuvo constante la variable de agitación, pero incrementó el nivel de aireación, se observa un incremento de 12.62 veces la actividad. Este incremento de la actividad indicaría que un aumento de la aireación sería beneficioso para la producción de enzima. La transferencia de oxígeno en fermentaciones en estado líquido se ve limitada cuando los medios de cultivo son demasiado viscosos o cuando el microorganismo, en este caso un hongo, forma micelios. La limitación puede ser contrarrestada aumentando la velocidad de agitación o aireación y de esta manera obtener un flujo más turbulento del medio; así también se pueden romper los micelios aumentando la transferencia de oxígeno (PAPAGIANI, 1999). De la misma manera si analizamos el par de ensayos 0 – 300 y 0,5 – 300 observamos que el incremento de la aireación produjo un efecto negativo en cuanto a la producción de enzima, ya que el nivel de actividad alcanzado en el ensayo con adición de aire es de casi la mitad al alcanzado por el ensayo sin aireación, contrariamente a lo que presentan algunos autores PAPAGANI (1999) o KAUR y SATAYANARAYANA (2005), donde se obtuvieron mejores resultados en un fermentador de 22 l, con un buen mezclamiento de los nutrientes y a una mejor oxigenación del medio de cultivo. Si se toma en cuenta la variable de agitación (ensayos 0 – 200, 0 – 300, 0 – 400) se observa que al incrementar la agitación también se incrementan los niveles de actividad, pero sólo hasta un cierto punto. Al incrementar la velocidad de agitación de 200 a 300 rpm el incremento en la actividad es de casi 30 veces, pero en el siguiente incremento (300 a 400 rpm) se produce una baja a prácticamente la mitad de la actividad, con respecto al ensayo 0 – 300. Dependiendo de las condiciones del cultivo y del genotipo de la cepa, el hongo puede presentar dos condiciones de crecimiento, una formando pellets y otra filamentosa, cada una con sus características de crecimiento y que pueden afectar los procesos de transferencia de masa (NIELSEN, 1996). El fenómeno de la disminución en los niveles de actividad con el incremento de la agitación o la aireación, podría deberse a que en un cierto punto la turbulencia del medio de cultivo es tan elevada que afecta la estructura del 31 hongo, impidiendo que éste continúe produciendo la enzima y privilegie el desarrollo celular. Para el ensayo en SmF de mayor producción (0 – 300) se calculó un rendimiento de 15,83 U/g de sólidos secos, a partir de los cuales se produjo la enzima. 5.2 Fermentación en estado sólido La FIGURA 4 muestra la evolución de la actividad enzimática neta experimentada por la fermentación en estado sólido llevada a cabo en el presentó la máxima producción de enzima al séptimo día con una actividad de 1,293 U/ml. En la SSF desarrollada en esta tesis el sustrato utilizado cumplía con la función de servir como soporte y además como fuente de nutrientes para el microorganismo, tal como lo señala PEREZ-GUERRA, et al. (2003) pues el hongo ve facilitado su penetración en el sustrato y con ello la obtención de nutrientes. La composición del sustrato (MSC) le confiere una cierta granulosidad al medio de cultivo, además el equipo construido no contaba con paletas interiores que facilitara el desmembramiento del MSC. Esta situación permitía que se formaran aglomerados de MSC facilitado por la humedad que aportó el inóculo. Ésta situación evitaba, tal vez, que los micelios del hongo resultaran dañados y así un comportamiento más parecido al natural del hongo. Esto como ya ha sido mencionado podría ser una respuesta a los altos rendimientos obtenidos en comparación con la SmF. La baja en la actividad después del pico de producción en el día 7 podría deberse a la falta de disponibilidad de nutrientes en el medio, resultados similares encontraron KRISHNAN et al. (2006), cultivando Mucor racemosus en granos de trigo. En estudios anteriores donde se llevó a cabo SSF y SmF para comparar los distintos niveles de producción los resultados obtenidos también concuerdan con que la SSF obtiene mayores niveles de producción. Este es el caso de LERCHUNDI (2006), sobre sustratos de composición muy similar al de esta tesis en que el máximo de producción se produce al 4º día. El nivel de producción alcanzado en ese estudio es de 0,695 U/ml en SSF mientras que en la presente tesis es de 1,293 U/ml. Esto significa un aumento del doble la producción de fitasa en SSF. 32 Actividad fitásica neta (U/mL) 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 -0,2 0 2 4 6 8 10 12 14 Tiempo (días) FIGURA 4. Evolución de la actividad fitásica neta en el tiempo para fermentación en sustrato sólido. Es posible que esta diferencia se deba a la utilización del equipo de fabricación propia, ya que, permite una mejor mezcla del medio de cultivo con el inóculo, además de presentar ventajas en la aireación. En el trabajo de de LERCHUNDI (2006) se utilizó un medio sólido en placas Petri estáticas de 11 cm inoculando la superficie del medio con una suspensión concentrada de esporas del hongo. El rendimiento calculado para la SSF es de 67,34 U/gss (U/g sólido seco), a partir de los cuales se produjo la enzima. En resumen, con la información recabada en la tesis, se demuestra el gran potencial que presenta la fermentación en estado sólido en cuanto a los niveles de producción de enzima alcanzados (1,293 U/ml o 67,34 U/gss) en contraste de los obtenidos en SmF (0,383 U/ml o 15,83 U/gss). Esto adquiere gran importancia debido a la creciente utilización de aditivos enzimáticos en la alimentación animal, favoreciendo la absorción de variados nutrientes (minerales y proteínas), aumentando el rendimiento del animal y también reduciendo la contaminación ambiental disminuyendo los niveles de Pi excretados. Además la utilización del equipo de confección propia fue exitosa y demuestra las ventajas de la SSF sobre la SmF en cuanto a los niveles de actividad y abre un camino para el perfeccionamiento del diseño del mismo. 33 6. CONCLUSIONES Con la información obtenida de los ensayos realizados, es posible establecer las siguientes conclusiones: • Es posible cultivar A. ficuum en sistemas de fermentación sumergida y sólida sobre subproductos de la agroindustria como sustratos a un nivel prepiloto y detectar importantes niveles de actividad fitásica. • Las fermentaciones en cultivo sumergido sobre subproductos de la agroindustria indican que las mejores condiciones para la producción de fitasa se presentan cuando el cultivo recibe una agitación media y no es aireado (0 vvm – 300 rpm). • De los resultados obtenidos es posible concluir que SSF es una tecnología más eficiente para producir fitasa con A. ficuum sobre subproductos de la agroindustria, al presentar niveles de actividad de 67,34 U/gss, es decir 4,25 veces superiores al SmF (15,83 U/gss). 34 7. BIBLIOGRAFÍA ABARCA M.L. (2000) Taxonomy and identification of the species involved in nosocomial aspergillosis Rev. Iberoam. 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(2000) Comparison of phytase from genetically engineered Aspergillus and canola in weanling pig diets J. Anim. Sci., 78, 2868-2878 44 8. ANEXOS 45 Anexo 1. Detalle de fermentaciones líquidas CUADRO 4. Tabla resumen fermentaciones en sustrato líquido Actividad fitásica neta (u/ml) Día 0 vvm - 200 rpm 0 vvm - 300 rpm 0 vvm - 400 rpm 0.5 vvm - 200 rpm 0.5 vvm - 300 rpm 0 0 0 0 0 0 1 0,004 0,004 0,003 0,001 2 0,003 -0,022 -0,019 -0,021 3 0,003 -0,056 -0,055 -0,053 -2,46E-04 -0,038 4 0,007 -0,017 0,037 0,029 0,039 5 0,013 0,183 0,173 0,164 0,160 6 0,009 0,383 0,244 0,226 0,245 7 -0,009 0,034 0,075 0,067 0,072 4,91E-04 Actividad fitásica neta (U/mL) 0,015 0,01 0,005 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 -0,005 -0,01 Tiempo (días) FIGURA 5. Variación de actividad enzimática en el tiempo para fermentación en sustrato líquido 0 vvm 200rpm 46 Actividad fitásica neta (U/mL) 0,45 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 -0,05 0 1 2 3 4 5 6 7 8 -0,1 Tiempo (días) FIGURA 6. Variación de actividad enzimática en el tiempo para fermentación en sustrato líquido 0 vvm 300 rpm Actividad fitásica neta (U/mL) 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 -0,05 0 1 2 3 4 5 6 7 -0,1 Tiempo (días) FIGURA 7. Variación de actividad enzimática en el tiempo para fermentación en sustrato líquido 0 vvm 400 rpm 8 47 Actividad fitásica neta (U/mL) 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 -0,05 -0,1 Tiempo (días) FIGURA 8. Variación de actividad enzimática en el tiempo para fermentación en sustrato líquido 0,5 vvm 200rpm Actividad fitásica neta (U/mL) 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 -0,05 0 1 2 3 4 5 6 7 -0,1 Tiempo (días) FIGURA 9. Variación de actividad enzimática en el tiempo para fermentación en sustrato líquido 0,5 vvm 300 rpm 8 48 Anexo 2. Detalle fermentación sólida Actividad fitásica neta (U/mL) 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 -0,2 0 2 4 6 8 10 12 14 Tiempo (días) FIGURA 10. Variación de actividad enzimática en el tiempo para fermentación en sustrato sólido CUADRO 5. Tabla resumen de actividad enzimática para fermentación en sustrato sólido Día Actividad (U/mL) Día Actividad (U/mL) Día 0 0 5 1 1,07E-03 6 1,04 11 5,99E-01 2 -3,84E-02 7 1,29 12 5,78E-01 3 -3,95E-02 8 1,23 13 5,38E-01 4 3,13E-01 9 1,01 14 5,32E-01 6,30E-01 10 Actividad (U/mL) 7,71E-01 49 Anexo 3. Imágenes de A. ficuum FIGURA 11. Cultivo de A. ficuum en placa Petri en agar papa dextrosa FIGURA 12. Observación al microscopio de fermentación en estado líquido 50 Anexo 4. Detalle de reacción enzimática para la determinación de actividad El análisis corresponde a un ensayo de tiempo fijo, en el que se mide la cantidad de fósforo inorgánico (Pi) el cual es liberado en la reacción enzimática. La reacción enzimática se realizará en tubos de ensayos en las siguientes condiciones y por duplicado para cada muestra - En un tubo de ensayo, se realiza la reacción enzimática en condiciones de reacción positiva (Rx. (+)). - En otro tubo de ensayo, se realiza la reacción enzimática en condiciones de reacción negativa (Rx. (-)). La medición de la absorbancia (abs.) correspondiente a la cantidad de Pi liberado por la reacción enzimática, se calcula mediante las siguientes formulas: Abs. Pi liberado = [Abs. muestra Rx. (+) - abs. muestra Rx. (-)] concentrac ión del Pliberado ⎛ Abs . Pi liberado = [Pi ] = ⎜⎜ ⎝ pendiente curva calibració ⎞ (2) ⎟ n ⎟⎠ Preparación del ensayo. A continuación se detalla la reacción enzimática positiva y negativa. Reacción enzimática en condiciones de reacción positiva (Rx. (+)). Para ello se procederá de la siguiente manera: i. Agregar: - 1,0 mL MgSO4 0,1M en buffer acetato 0,2 M pH 5,15 - 0,6 mL del extracto con la enzima o muestra - 2,4 mL de solución de ác. Fítico 6,82 mM en buffer acetato 0,2 M pH 5,15 51 ii. Incubar por 1 hora a 55ºC. iii. Agregar: - 0,5 mL de ácido tricloroacético (TCA) al 10% para detener la reacción - 1,0 mL de H2O d y refrigerar por 20 min, para disminuir la temperatura. - 2,4 mL del reactivo de Taussky-Shorr. Esperar 30 min y medir Abs. A 660 nm. Reacción enzimática en condiciones de reacción negativa (Rx. (-)). Se procede de la siguiente manera: i. Agregar: - 1,0 mL MgSO4 0,1M en buffer acetato 0,2 M pH 5,15 - 0,6 mL de Extracto con la enzima (muestra) - 0,5 mL de ácido tricloroacético (TCA) AL 10% (Para detener la reacción). - 2,4 mL de solución de Ácido Fítico 6,82 mM en buffer acetato 0,2 M pH 5,15 Esperar por 1 h a Tº ambiente. ii. Agregar: - 1,0 mL de H2Od y refrigerar por 20 min. (Para equiparar el volumen y la temperatura con los ensayos de Rx. (+)). iii. Agregar: - 2,4 mL del reactivo de Taussky-Shorr. Esperar 30 min y medir Abs. A 660 nm. 52 Curva de calibración. Se construyó una curva de calibración en el rango de 0,04 a 1 uM/mL de KH2PO4 para el reactivo de Taussky-Shorr (Cuadro 6) CUADRO 6. Curva de calibración Tubo Concentración Volumen (mL) Volumen (mL) Volumen Volumen (mL) Pi (μmol/mL) Pi 2 μmol/mL H2Od (mL) MgSO4 0,1 M TCA en buffer 10% acetato 0,2 M pH 5,15 1 1,00 1,50 2,50 0,50 1,00 2 0,83 1,25 2,75 0,50 1,00 3 0,60 0,90 3,10 0,50 1,00 4 0,40 0,60 3,40 0,50 1,00 5 0,30 0,45 3,55 0,50 1,00 6 0,20 0,30 3,70 0,50 1,00 7 0,10 0,15 3,85 0,50 1,00 8 0,08 0,12 3,88 0,50 1,00 9 0,04 0,06 3,94 0,50 1,00 Blanco - - 4,00 0,50 1,00 Cálculo para la medición de actividad de fitasa. Se define como una unidad de actividad enzimática de la fitasa (U), como la cantidad de enzima que libera 1 µmol de Pi en un minuto, bajo las condiciones que se realizó el ensayo. Después de obtener la concentración del Pi liberado [Pi] la cual corresponde a los μmoles Pi liberado en 1 h, por una solución de enzima diluida; la actividad se mide de la siguiente forma: ⎛ [Pi ] ∗ N º de dilución de muestra U = ⎜⎜ min utos de ensayo ⎝ ⎞ ⎟⎟ = μ moles / min ⎠ (3) 53 Anexo 5. Detalle de preparación de sustratos de cultivo Composición medio líquido a base de desechos agroindustriales • Chuchoca 0.5 % • Afrechillo 0.25 % • Harina integral de trigo 0.25 % • NH4SO4 1.7 % • H2O 97.3 % Composición medio sólido a base de desechos agroindustriales • Chuchoca 18.6 % • Afrechillo 9.2 % • Harina integral de trigo 9.2 % • NH4SO4 63 % La humedad necesaria es aportada por el inóculo. 54 Anexo 6. Detalle de cálculo de rendimiento de las fermentaciones Fermentación en cultivo sumergido actividad de fitasa U ml U * 1000 = actividad de fitasa ml l l actividad de fitasa U volumen de cultivo l U * = actividad de fitasa l g sustrato sólido g sustrato (4) Fermentación en cultivo sólido actividad de fitasa U volumen de muestra ml U * * factor dilución = actividad de fitasa ml g sustrato sólido en muestra * % humedad g sustrato sólido sec o (5)