Download Respuesta de las neuronas sensitivas al estrés genotóxico inducido

UNIVERSIDAD DE CANTABRIA
Facultad de Medicina
Dpto. de Anatomía y Biología Celular
Respuesta de las neuronas sensitivas al estrés
genotóxico inducido por radiaciones ionizantes
y por la inhibición del proteasoma
Tesis doctoral presentada por Ana Palanca Cuñado
para optar al Grado de Doctor por la Universidad de Cantabria
Santander, Abril 2014
D. MIGUEL LAFARGA COSCOJUELA, Catedrático del Area de Biología
Celular de la Universidad de Cantabria, y Dña. MARIA TERESA BERCIANO
BLANCO, Catedrática del Area de Biología Celular de la Universidad de
Cantabria,
CERTIFICAN: Que D. Ana Palanca Cuñado ha realizado bajo nuestra
dirección el presente trabajo de Tesis Doctoral titulado: “Respuesta de las
neuronas sensitivas al estrés genotóxico inducido por radiaciones ionizantes y
por la inhibición del proteasoma”.
Consideramos que dicho trabajo se encuentra terminado y reúne los
requisitos necesarios para su presentación como Memoria de Doctorado al
objeto de poder optar al grado de Doctor por la Universidad de Cantabria.
Y para que conste y surta los efectos oportunos, expedimos el presente
certificado en Santander, a 4 de Abril de 2014.
Fdo. Miguel Lafarga Coscojuela
Fdo. Mª Teresa Berciano Blanco
Esta Tesis ha sido financiada con las siguientes ayudas:
- Ayuda predoctoral de formación de personal investigador (FPI; BES-2009-013358)
asociada al proyecto de investigación (BFU2008-00175). Ministerio de Ciencia e
Innovación.
- Centro de Investigación Biomédica en Red sobre Enfermedades Neurodegenerativas
CIBERNED CB06/05/0037.
Agradezco, en primer lugar, a los profesores Maite Berciano y Miguel Lafarga, por
todos sus consejos y su apoyo durante estos años y para la realización de esta Tesis
Doctoral. Especialmente a Maite, por su generosidad científica y por transmitirme esa
inagotable energía y entusiasmo por la investigación.
A mis compañeros de laboratorio: Rocío, Íñigo, Saray, Olga, María, Jorge y Javi. Gracias por
todos estos años aprendiendo con vosotros y por la confianza con la que me habéis tratado y
por vuestra amistad. A Vanesa, su apoyo y su implicación científica en el laboratorio ha sido
fundamental en el desarrollo de mi formación investigadora.
A los miembros del Departamento de Anatomía y Biología Celular por su acogida y su apoyo
durante todos estos años. Especialmente a los “ex-vecinos” del laboratorio del profesor
Hurlé, con los que he compartido muchos momentos profesionales y personales. A Raquel,
por su ayuda en la microscopía electrónica. A África, por no dejar que me ahogue en esta
montaña de papeles.
Agradecer también a los Departamentos de la Facultad de Medicina, a sus profesores por
permitirme trabajar en sus laboratorios siempre que lo he necesitado y a los compañeros de
estos laboratorios, con los que he aprendido y compartido ciencia. Gracias también por esos
ratos fuera del laboratorio y especialmente ahora, por continuar así pese a la distancia. A mis
compañeras de piso, por conocerme “pretésica” y aguantarme.
Al SEEA, especialmente a su director, Miguel García por su asesoramiento y su ayuda para
desarrollar los experimentos; y a Mar, porque siempre puedo contar con ella y por cuidar de
“mis pequeñas”. A Pepe, en el Departamento de Física Médica, por su ayuda en la utilización
del equipo de radiación. A Virginia Martínez de la Farmacia Hospitalaria de Valdecilla por su
amabilidad y disponibilidad siempre que necesité el fármaco bortezomib.
Al grupo de “Respuesta Celular al Estrés Oxidativo” de la Universidad de Oviedo,
especialmente a las profesoras Ana Coto Montes y Pepa Rodríguez Colunga por permitirme la
integración en su grupo de trabajo y por ser, junto con los compañeros del grupo, las que me
hicieron pensar en continuar con la investigación. A Covi Huidobro, por introducirme “en el
mundillo” y porque desde que la conocí me ha ofrecido su amistad y apoyo.
Agradecer de forma especial al profesor Federico Mayor y a su grupo “Mecanismos de
señalización y regulación de receptores acoplados a proteínas G”, con los que realicé dos
estancias que me permitieron aprender técnicas bioquímicas que han enriquecido mi
formación. Muchas gracias por vuestra paciencia y por tratarme como una más dentro y
fuera del laboratorio.
Personalmente darles las gracias a mis padres, a Cristina, a Berto, a mis amigos “de toda la
vida” y a la comida de mi madre (que merecería un apartado). En definitiva, a toda esa
gente especial sin cuyo cariño esta Tesis y yo misma, no hubiéramos sido lo mismo. Gracias
por haber confiado en mí, aunque a veces ni yo misma lo hiciera.
En aquella época me preguntaba:
“¿Qué hay detrás de esta montaña, qué esconde su vista?”.
Y sentía curiosidad por ir a ver.
Hasta que subí y vi que detrás de ese macizo había otros.
Michel Sébastien "Cimas Pirenaicas"
Índice
Índice
ABREVIATURAS................................................................................................1
1. INTRODUCCIÓN.................................................................................................7
1.1 ANATOMÍA GENERAL DEL GANGLIO TRIGÉMINO DE LA RATA........................9
1.1.1 Clasificación de las neuronas del GT...........................................................10
1.2 BIOLOGÍA CELULAR DEL NÚCLEO Y EL CITOPLASMA....................................12
1.2.1 Núcleo celular interfásico.........................................................................12
1.2.1.1 Territorio cromosómico.................................................................13
1.2.1.2 Dominio intercromatínico..............................................................17
El nucleolo.....................................................................................17
El cuerpo nuclear de Cajal...............................................................20
Las granulaciones intercromatínicas o “speckles” nucleares..................26
La envoltura nuclear y el microambiente perinuclear............................27
1.2.2 El citoplasma............................................................................................31
1.3 MECANISMOS DE RESPUESTA Y REPARACIÓN DEL DNA...............................32
1.3.1 Respuesta al daño del DNA de doble cadena...............................................33
1.3.2 Reparación del DNA dañado por rotura de doble cadena...............................35
1.4 LA VÍA UBIQUITINA-PROTEASOMA..............................................................38
2. OBJETIVOS..................................................................................................45
3. MATERIAL Y MÉTODOS.....................................................................................49
3.1 MODELOS EXPERIMENTALES DE RADIACIÓN IONIZANTE Y
DE ADMINISTRACIÓN DE DROGAS...................................................................51
3.2 PROCESAMIENTO DEL MATERIAL BIOLÓGICO..............................................52
3.2.1 Técnica de fijación por perfusión......................................................52
3.2.2 Obtención de disociados neuronales.................................................52
3.3 MICROSCOPÍA CONFOCAL............................................................................53
3.3.1 Inmunofluorescencia....................................................................53
3.3.2 Hibridación in situ para RNAs poliadenilados......................................54
3.3.3 Ensayo de transcripción “run-on” mediante la incorporación de
5’-fluorouridina in vivo....................................................................55
3.3.4 Inmunodetección de muerte celular mediante TUNEL..........................55
3.3.5 Ensayo de cometa neutro................................................................55
3.4 MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA.......................................................................56
3.4.1 Microscopía electrónica de transmisión convencional...................................56
3.4.2 Inmunocitoquímica ultraestructural...........................................................57
3.4.3. Microscopía inmunoelectrónica de los sitios de incorporación de 5’-FU........................58
3.5 ANÁLISIS CUANTITATIVO Y ESTADÍSTICO....................................................58
3.6 ANÁLISIS DE PROTEÍNAS POR WESTERN BLOT.............................................59
3.7 ANÁLISIS DE TRANSCRIPCIÓN DE RNA POR PCR CUANTITATIVA................61
Índice
3.7.1 Extracción de RNA..................................................................................61
3.7.2 Obtención de cDNA.................................................................................62
3.7.3 Diseño de oligonucleótidos cebadores para PCR cuantitativa.........................62
3.7.4 Detección de la expresión génica mediante PCR cuantitativa a tiempo real......63
3.7.5. Cuantificación y análisis de la expresión génica relativa...................................64
4.RESULTADOS....................................................................................................65
4.1 RESPUESTA AL DAÑO DEL DNA INDUCIDO POR RADIACIÓN IONIZANTE
DE LAS NEURONAS SENSITIVAS TIPO A........................................................67
4.1.1 Planteamiento del trabajo.........................................................................67
4.1.2 Organización espaciotemporal y dinámica funcional de los focos de DNA
dañado por RI..........................................................................................69
4.1.3 Las roturas de doble cadena inducidas por radiación ionizante activan la
vía p53/p21 en las neuronas del ganglio del trigémino.................................74
4.1.4 El daño en el DNA inducido por RI bloquea transitoriamente la
transcripción neuronal...............................................................................76
4.1.5 La RI induce cambios estructurales y epigenéticos en la cromatina................77
4.1.6 Los IRIFs de DNA dañado reclutan componentes de la vía
ubiquitina-proteasoma..............................................................................80
4.2 RESPUESTA DE LAS NEURONAS SENSITIVAS AL ESTRÉS INDUCIDO POR
LA INHIBICIÓN DEL PROTEASOMA..................................................................81
4.2.1 Planteamiento del trabajo.......................................................................81
4.2.2 La inhibición del proteasoma induce cambios en la posición, forma y
polaridad nuclear y afecta a los grumos de Nissl citoplasmáticos...................82
4.2.3 El tratamiento con Btz induce rotura de la doble cadena en el DNA sin
comprometer la supervivencia neuronal.................................................88
4.2.4 Respuesta neuroprotectora a la inhibición del proteasoma...........................90
4.3 PAPEL NEUROPROTECTOR DEL NUCLEOLO Y DE LOS CUERPOS NUCLEARES
DE CAJAL EN RESPUESTA A LA INHIBICIÓN DEL PROTEASOMA......................97
4.3.1 Planteamiento del trabajo........................................................................97
4.3.2 La inhibición del proteasoma incrementa el tamaño y número de nucleolos
en las neuronas de tipo A.........................................................................98
4.3.3 El tratamiento con Btz no altera la citoarquitectura nucleolar........................99
4.3.4 El tratamiento con Btz no interfiere la transcripción nucleolar......................101
4.3.4 El tratamiento con Btz incrementa el número de CBs.................................106
5. DISCUSIÓN.....................................................................................................109
5.1 RESPUESTA AL DAÑO EN EL DNA INDUCIDO POR RADIACIÓN IONIZANTE
EN LAS NEURONAS SENSITIVAS DE TIPO A...................................................111
5.2 RESPUESTA DE LAS NEURONAS SENSITIVAS AL ESTRÉS INDUCIDO POR
Índice
LA INHIBICIÓN DEL PROTEASOMA...................................................................120
Papel neuroprotector del nucleolo y del CB en la respuesta neuronal al
estrés proteotóxico.........................................................................................128
6. CONCLUSIONES............................................................................................135
7. BIBLIOGRAFÍA..............................................................................................139
8. ARTÍCULOS....................................................................................................159
Índice
Abreviaturas
Abreviaturas
53BP1: p53-binding protein 1
5’-FU: 5´-Fluorouridina
19S: Unidad reguladora del proteasoma 26S
20S: Unidad catalítica del proteasoma 26S
APE1: AP endonuclease 1
ATM: “Ataxia Telangiectasia Mutated protein”
B23: Nucleofosmina
BAF: “Barrier-to-autointegration factor”
BDNF: “Brain derived neurotrophic factor”
BER: Reparación por escisión de bases
BIPN: Neuropatía periférica inducida por bortezomib
B-NHEJ: NHEJ alternativa o plan B
BRCA1: Breast cancer associated
Btz: Bortezomib
Btz-DA: Dosis alta de bortezomib
Btz-DB: Dosis baja de bortezomib
Btz-IF: Foco de daño inducido por bortezomib
CAP: Caperuza de 7-metil guanosina
CB: Cuerpo nuclear de Cajal, “Cajal body”
CF: Centro fibrilar
CFD: Componente fibrilar denso
CG: Componente granular
CNP: Complejos nucleares del poro
Cy5: Cyanine (blue fluorescent dye)
DBUs: Enzimas con actividad desubiquitilasa
DDR: Respuesta al daño en el DNA
DNA pol I: DNA polimerasa I
DNA topo I: DNA topoisomerasa I
D-NHEJ: NHEJ canónica
DSB: Rotura de doble hebra en el DNA
EN: Envoltura nuclear
FITC: Fluorescein isothiocyanate (green fluorescent dye)
GCNO: “NO-sensitive guanylyl cyclase”
GFP: “Green fluorescent protein”
GT: Ganglio trigémino
GTa: Ganglio trigémino accesorio
GTp: Ganglio trigémino principal
H2AX: Variante de la H2A
γH2AX: H2AX fosforilada
H2A-Ub: H2A ubiquitilada
3
Abreviaturas
H2AX-Ub: H2A ubiquitilada
H2B-Ub: H2B ubiquitilada
H3K9me3: Histona 3 trimetilada en la lisina 9
H3K27me3: Histona 3 trimetilada en la lisina 27
H4Ac: Histona 4 acetilada
H4K20me3: Histona 4 trimetilada en la lisina 20
hnRNA: RNA heterogéneo
Hp: Hipófisis
HP1: Proteína de la heterocromatina 1
HR: Recombinación homóloga
HRR: Reparación por HR
hTERT: Telomerasa transcriptasa inversa humana
IkB: Inhibidor de NF-kB
IRIF: Focos de daño inducidos por radiación ionizante
LBR: Receptor de lámina B
MAN1: LEMD3 o “LEM domain-containing protein 3”
MDC1: “Mediator of DNA damage checkpoint 1”
MNI: Membrana nuclear interna
MNE: Membrana nuclear externa
Mre11: Meiotic recombination 11 homolog A (S. cerevisiae)
MRN: Complejo formado por las proteínas Mre11, Rad50 y Nbs1
mRNA: RNA mensajero
NBS1: NBN, nibrina
NEMO: Modulador esencial de NFkB
NF-kB: “Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells”
NHEJ: “Non-homologous end joining”, unión de extremos no homólogos
NHEJR: Reparación por NHEJ
NLS: Señal de localización nuclear
NOs: Nervios ópticos
NORs: Regiones organizadoras del nucleolo
NPM: Nucleofosmina, B23
Nup: Nucleoporina
Nups FG: Nucleoporina ricas en fenilalanina y glicina
PABPN1: “Poly(A) binding protein nuclear 1”
PABPC1: “Poly(A) binding protein cytoplasmic”
PARP1: “Poly (ADP-ribose) polymerase”
PI: Ioduro de propidio
PML: “Promyelocytic leukemia protein”
PNKP: “Polynucleotide kinase/phosphatase”
Poli(A): Poliadenosinas
4
Abreviaturas
Poli(A) RNA: RNA poliadenilado
Poli(U): Poliuridinas
RER: Retículo endoplasmático rugoso
RI: Radiación ionizante
RNA pol I: RNA polimerasa I
rRNA: RNA ribosomal
rDNA: DNA ribosoma
RNP: Ribonucleoproteína
ROS: Especiees reactivas de oxígeno
SMN: Factor de supervivencia de las motoneuronas
SNC: Sistema nervioso central
scaRNAs: “Small Cajal body-specific RNAs”
snRNA: RNA pequeño nuclear
snoRNA: RNA pequeño nucleolar
snoRNPs: Ribonucleoproteínas nucleolares pequeñas
SNP: Sistema Nervioso Periférico
snRNPs: Ribonucleoproteínas nucleares pequeñas
SON: Núcleo del supraóptico
SSB: rotura de hebra simple en el DNA
SUMO1: “Small Ubiquitin-related MOdifier 1”
SUN: Dominios C-terminal conservados de las proteínas Sad1p y UNC-84
TBP: Proteína de unión a TATA
TCAB1: “Telomere Cajal Body protein 1”
TDP1: Tyrosyl-DNA phosphodiesterase 1
TERC: Componente ribonucleotídico (RNA) de la telomerasa
tRNA: RNA de transferencia
TUNEL: “Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling”
Ub: Ubiquitina
U2B: U2 small nuclear ribonucleoprotein B''
Ubc9: Conjugasa específica de sumoilación (E2)
UBF: Upstream binding factor
U snRNA: RNAs pequeños nucleares ricos en uridina
U snoRNA: RNAs pequeños nucleolares ricos en uridina
USPL: “Ubiquitin-specific peptidase-like protein 1”
VUP: Vía ubiquitina proteasoma
WB: Western blot
WRN: Proteína del síndrome de Werner
XLF: XRCC4-like factor
XRCC4: X-ray repair crosscomplementing protein 4
5
Abreviaturas
6
1. Introducción
Introducción
1.1 ANATOMÍA GENERAL DEL GANGLIO TRIGÉMINO DE LA RATA
El ganglio del trigémino (GT), semilunar o ganglio de Gasser de la rata, al igual que en los
mamíferos superiores, es un ganglio nervioso intracraneal que alberga diferentes poblaciones
neuronales que proporcionan las fibras nerviosas somatosensitivas del nervio trigémino. El
GT es grande, de aproximadamente 10mm de largo y 3mm de ancho. Está superficialmente
cubierto por una cápsula conectiva densa y se ubica en una depresión del hueso petroso.
Observado con lupa, muestra la organización estructural anatómica característica en la que
las células ganglionares están segregadas en dos zonas bien definidas e independientes
entre sí, el ganglio principal (GTp) de gran tamaño y el ganglio accesorio (GTa) mucho más
pequeño y organizado en el borde posterolateral externo del ganglio (Fig. 1A). En ambas
localizaciones las neuronas emiten una prolongación periférica y otra central que discurren
centrípetamente por el nervio trigémino. Las fibras periféricas pertenecientes a las neuronas
del GTp se incorporan a las ramas oftalmológico-maxilar e inervan la cara superior, el ojo y
las cavidades bucal y nasal. Por su parte, las neuritas de las neuronas del GTa discurren por
la rama mandibular e inervan la cara inferior y las correspondientes zonas de la cara, de la
boca y de la lengua. Esta rama mandibular es sensitiva y motora (Pannese, 1994) (Fig. 1B).
NOs
GTp
GTa
Hp
A
B
Figura 1. A. Imagen de la base del cráneo de la rata que muestra los GTs acoplados a la silla turca. Se señalan
los ganglios principal (GTp) u oftálmico-maxilar y ganglio accesorio (GTa) o mandibular. B. Esquema ilustrativo
de la distribución de las ramas del nervio trigémino oftálmica y maxilar, originadas a partir del GTp. Éstas
inervan la cara, el ojo y las cavidades nasal y bucal. Por su parte, la rama mandibular, originada a partir del
GTa, inerva la parte inferior de la cara y de la mucosa bucal (tomado de Viana, 2011). NOs: nervios
ópticos; Hp: hipófisis.
9
Introducción
1.1.1 Clasificación de las neuronas del GT
Independientemente de su localización, las neuronas sensitivas son morfológicamente
idénticas y exhiben un soma oval del que emerge una prolongación única (neurita) muy
tortuosa (glomérulo de Cajal) cuyo calibre está directamente relacionado con el volumen
celular. Esta neurita se divide en la proximidad del soma neuronal en dos prolongaciones, las
neuritas, o axones, aferente y la eferente (Fig. 2). Sin embargo, de acuerdo con el tamaño
somático, con la cantidad de maquinaria para la síntesis de proteínas (grumos de Nissl/
dictiosomas de Golgi) y con el número y tamaño de los nucleolos, las neuronas del GT se
clasifican en tres categorías: neuronas de tipo A, de tipo B, y de tipo C (Pena y cols., 2001).
De esta forma, se consideran neuronas de tipo A a las de mayor tamaño somático
(diámetro>40μm), medianas o de tipo B a aquellas cuyo diámetro somático oscila entre
40-20μm y pequeñas o de tipo C a las neuronas con un diámetro inferior a 20μm. A su vez,
las neuronas de tipo A tienden a ser mononucleoladas y sus citoplasmas albergan gran
abundancia de grumos de Nissl y de dictiosomas de Golgi distribuidos por todo el citoplasma.
Por su parte, las neuronas de tipo B exhiben más nucleolos y la distribución de los grumos de
Nissl queda más confinada a zonas concéntricas del citoplasma marginal. En el caso de las
neuronas de tipo C, muestran mayor número de nucleolos y, la proporción de grumos de
Nissl y de dictiosomas de Golgi es menor (Rambourg y cols., 1983; Pena y cols., 2001).
Por otra parte, en función del tamaño axonal (neurítico) y del grosor de la mielina que
lo envaina, se clasifican tres principales grupos de fibras nerviosas sensitivas. Las fibras
primarias aferentes de los subtipos Aα y Aβ, que corresponden a las neuronas de tipo A
caracterizadas por tener gran diámetro axonal (5-10μm) muy mielinizado. Esta categoría de
fibras nerviosas tiene propiedades bioeléctricas o de transmisión del impulso nervioso
saltatorio muy rápido y sus terminaciones nerviosas están principalmente especializadas en
la propiocepción y en el tacto suave o ligero de la piel, pero no responden a estímulos
dolorosos. El segundo tipo de fibras nerviosas sensitivas son las fibras Aδ, que se
corresponden con las neuronas de tipo B. Éstas tienen un diámetro axonal medio
ligeramente mielinizado (1-5μm) y están especializadas en la percepción térmica (~43-53ºC)
y en la nocicepción rápida. Su capacidad de transmisión es saltatoria pero lenta. Finalmente,
las fibras C, correspondientes al tipo neuronal C, son amielínicas y de un diámetro inferior a
1μm. Su función sensorial es eminentemente nociceptiva lenta pero también intervienen en
la sensibilidad térmica inocua (<43ºC). En estas fibras la capacidad de conductancia es
continua y muy lenta (Julius y Basbaum, 2001).
Tanto el soma como el segmento inicial de la neurita están revestidos por una cápsula
continua de elementos celulares de la glía, las células de la glía satélite. Antes de que la
neurita se dicotomice, las células satélites son sustituidas por las de Schwann. Éstas
10
Introducción
acompañan a las neuritas hasta la emisión de los receptores sensitivos. Las neuritas que
superan 1μm de diámetro son mielinizadas por las células de Schwann, mientras que las de
menor tamaño forman fascículos y están envainadas conjuntamente por una célula de
Schwann formando las fibras amielínicas. El calibre de la envoltura mielínica formado por las
células de Schwann está directamente relacionado con el calibre axonal y, consecuentemente,
con la velocidad de conducción del estímulo sensitivo. La superficie externa de las células
satélite y de las células de Schwann está tapizada por una lámina basal bien definida que
establece la interfase entre la glía y el compartimento conectivo endoneural (Peters y cols.,
1991; Pannese, 1994) (Fig. 2).
Neurona de tipo C
Célula Satélite
Fibra
amielínica
Célula Schwann
d
Fibra
mielínica
c
Célula Schwann
a
b
Célula Satélite
Lámina Basal
Neurona de tipo A
Figura 2. El esquema ilustra una neurona de tipo A (grande) y otra de tipo C (pequeña). Ambas
neuronas muestran un soma oval del que emerge una neurita tortuosa que se dicotomiza en las
prolongaciones aferente y eferente. La aferente se ramifica e inerva la piel y la eferente alcanza el asta
posterior de la médula espinal y el cerebro contralateral. Los dos tipos neuronales muestran grumos de
Nissl somáticos (violeta) pero la proporción es mayor en la neurona grande. En el núcleo se ilustran el
nucleolo/s (rojo) y cuerpos nucleares de Cajal (verde). Obsérvese, cómo el soma y la porción inicial del
axón están cubiertos por la glía satélite, y la porción distal por las células de Schwann. Estas células
mielinizan el axón en la neurona A pero en la neurona tipo C permanece amielínico. Las células satélite y
de Schwann están rodeadas por la lámina basal (linea amarilla, flecha). Se representan varios tipos de
receptores sensitivos cutáneos, los corpúsculos de Pacini (a) y Meissner (b) y los discos de Merkel (c)
que proceden de las terminaciones nerviosas de las neuronas de tipo A y terminaciones nerviosas libres
originadas de las neuronas tipo C responsables de la nocicepción (d).
11
Introducción
1.2 BIOLOGÍA CELULAR DEL NÚCLEO Y CITOPLASMA
Dado que el presente proyecto de Tesis Doctoral se ha realizado utilizando como
modelo biológico las neuronas ganglionares de tipo A, la descripción citológica del núcleo y
del citoplasma que vamos a desarrollar a continuación se basa en un modelo teórico de una
célula post-mitótica cuyas características fenotípicas son, por lo general, la contrapartida de
un modelo celular metabólicamente muy activo en la transcripción y traducción de proteínas
comparable al de las neuronas sensitivas grandes del GT.
1.2.1 Núcleo celular interfásico
Los estudios modernos de Biología Celular y Molecular in situ demuestran que el núcleo de
las células no proliferantes está compartimentalizado estructural y funcionalmente en dos
dominios fundamentales: el territorio cromosómico, en el que cada cromosoma interfásico
ocupa un subvolumen nuclear determinado, y el dominio intercromosómico o intercromatínico
(Cremer y Cremer, 2006; Cremer y cols., 2006). Este dominio incluye el nucleolo y un grupo
importante y heterogéneo de cuerpos
CNP
EN
nucleares implicados funcionalmente en el
procesamiento de los mRNAs, los
“speckles” nucleares, el cuerpo nuclear de
CB
Cajal (CB), los cuerpos PML y los
NS
T
clastosomas (Berciano y cols., 2002;
Lafarga y cols., 2009; Moore y Proudfoot,
No
2009; Misteli y Spector, 2011) (Fig. 3).
C
Para preservar el genoma, el núcleo se
rodea de una doble membrana, la
envoltura nuclear (EN), que alberga los
Cl
complejos nucleares del poro (CNP) (Fig.
3). En la actualidad se considera que
Figura 3. Compartimentos nucleares. En el dominio
cromosómico, la cromatina facultativa se representa en
violeta y los telómeros (T, azul oscuro) y los centrómeros
(C, fucsia) El rDNA se introduce parcialmente en el
interior nucleolo (No). En el dominio intercromatínico
aparecen además, los “speckles” nucleares (NS en
verde), los CBs (rojo) y los clastosomas (azul turquesa).
La envoltura nuclear (EN) muestra doble membrana y los
complejos nucleares del poro (CNP).
esta envoltura nuclear, junto con el
microambiente nuclear y citoplasmático
que la rodea, constituyen una plataforma
funcionalmente integrada que garantiza
la expresión fenotípica celular (Dauer y
Worman, 2009; Mekhail y Moazed,
2010). En las neuronas sensitivas la correcta organización del compartimento nuclear junto
con el microambiente perinuclear que le rodea es fundamental ya que debe garantizar una
tasa transcripcional y traduccional muy alta correspondiente a su enorme actividad
bioeléctrica.
12
Introducción
1.2.1.1 Territorio cromosómico
En las neuronas sensitivas de tipo A el dominio cromosómico representa un subvolumen
nuclear muy grande debido a su enorme actividad transcripcional. Poseen un patrón de
cromatina eminentemente eucromatínico, es decir, que la cromatina muestra mayoritariamente
el nivel más elemental de condensación del DNA, las cadenas lineales polinucleosomales. Estas
cadenas tienen ~10nm de diámetro y están formadas por la doble hélice de DNA enrollada
alrededor de un octámero de histonas, el nucleosoma (Fig. 4B). Es bien conocido que cada
nucleosoma (unidad fundamental de la cromatina) está constituido por 146pb de DNA
enrollado 1,7 veces alrededor del núcleo central en el que se organizan ocho histonas (en cada
octámero se integran dos copias de las histonas H2A, H2B, H3 y H4) (Fig. 4A). Las histonas
son proteínas globulares con gran afinidad para interaccionar intranucleosomalmente entre sí y
con el DNA enroscado a ellas. El extremo N-terminal es largo y se extiende fuera del
nucleosoma; el C-terminal es más corto y queda confinado en el interior del nucleosoma. A su
vez, los nucleosomas están separados por un DNA espaciador de 10-16pb. La cadena
polinucleosomal constituye el grado máximo de descondensación o relajación de la cromatina
donde puede producirse la transcripción activa. Este grado de descondensación representa la
eucromatina, cromatina abierta o inducible. En el siguiente nivel de compactación, las cadenas
polinucleosomales unen la histona H1, que comprime los nucleosomas lineales en fibras
cromatínicas silentes de 30nm de diámetro (Fig. 4C) (ver Fernandez-Capetillo y cols., 2004;
genome.nhgri.nih.gov/histones/complete.shtml).
Cadena polinucleosomal de 10nm diámetro
B
Fibra cromatínica de 30nm diámetro
C
A
Figura 4. Estructura de la cromatina. A. Organización e interacción de las cuatro histonas más
habituales formando uno de los dos complejos del octámero nucleosomal, H2A (amarillo), H2B (rojo) y
H3 (azul) y H4 (verde). B. Nucleosomas lineales organizados en la cadena polinucleosomal de 10nm
(eucromatina). C. Compactación nucleosomal formando fibras cromatínicas de 30nm (heterocromatina).
13
Introducción
En la heterocromatina se organizan secuencias repetidas no codificantes del DNA,
formando la heterocromatina constitutiva, y regiones cromosómicas que incluyen genes
codificantes que se expresan de forma facultativa (silenciados). En el caso de las neuronas
sensitivas de tipo A, la heterocromatina está representada por pequeños agregados,
principalmente asociados a la envoltura nuclear y al nucleolo (Pena y cols., 2001). Aunque en
las neuronas sensitivas normales la cromatina muestra un patrón muy específico, en
situaciones de estrés experimentan un remodelamiento muy rápido por heterocromatinización
masiva reversible (Navascues y cols. 2004). La plasticidad estructural y funcional de la
cromatina se debe a que las células somáticas disponen de estrategias de regulación génica
muy importantes entre las que destacan las modificaciones post-traduccionales de las histonas
nucleosomales (Fernandez-Capetillo, 2004).
En las células post-mitóticas las modificaciones post-traduccionales de las histonas
nucleosomales en regiones génicas son imprescindibles para regular procesos tan importantes
como la transcripción, el silenciamiento génico, la heterocromatinización o a reparación del
DNA (Munshi y cols., 2009). Estas modificaciones de las histonas se producen
fundamentalmente en los extremos NH2 y COOH terminales (Fig. 5A-B). El extremo N-terminal
es largo y cargado positivamente al estar enriquecido en residuos de lisina (K) y arginina (R)
que afianzan su afinidad con el DNA. Dichos residuos pueden modificarse específicamente por
acetilación y metilación modificando su afinidad por el DNA. Además, presenta aminoácidos
fosforilables de serina (S) y treonina (T). Por su parte, el extremo C-terminal es más corto y,
preferentemente, se modifica por ubiquitilación (Schneider y Grosschedl, 2007; Patel y Wang,
2013). Se ha propuesto que algunas marcas epigenéticas son estables y etiquetan histonas
nucleosomales sintetizadas de novo, como son la monometilación de la H3 en la K27
(H3K7me1) y de la H4 en la K20 (H4K20me1) (Balakrishnan y Milavetz, 2010) (Fig. 5A-B).
Pero realmente, lo que regula la transcripción son las modificaciones alternativas y, por lo
general, reversibles de las histonas nucleosomales. Estas marcas confieren a las histonas gran
diversidad proteómica, permiten su propia autorregulación y modulan su interacción molecular
con otras proteínas, con las RNPs y con el DNA (Munshi y cols., 2009). Por ejemplo, el ciclo de
acetilación/deacetilación coordina la expresión génica; así, la acetilación de la histona H4 (en
K5, K8 o K12) es una marca que induce la eucromatinización y activa la transcripción,
mientras que su deacetilación la reprime (Peterson y Laniel, 2004; Blasco, 2007; Munshi y
cols., 2009) (Fig. 5A). Además, las propias enzimas acetiltransferasas responsables de la
acetilación de H4 actúan como co-activadores transcripcionales. Al contrario de la acetilación,
la metilación de determinadas histonas estabiliza la cromatina en estado silente (Fig. 5B). En
el núcleo interfásico, los nucleosomas silentes de la eucromatina y de la heterocromatina
constitutiva y facultativa están específicamente hipoacetilados e hipermetilados. En particular,
en los nucleosomas silentes de la eucromatina y de la heterocromatina constitutiva, las
histonas H3 y H4 están etiquetadas por trimetilación, la H3 se metila en K9 (H3K9me3) y la H4
14
Introducción
lo hace en la K20 (H4K20me3) (Fig. 5B). Por su parte, en la cromatina facultativa, la metilación
de histonas también es muy importante, pero en este caso la represión transcripcional
depende ,además, de la metilación de la H4 y de la hipermetilación selectiva de la H3 en la K27
(H3K27me3) (Kourmouli y cols., 2004; Fedorova y Zink, 2008; Munshi y cols., 2009). Estas
modificaciones post-traduccionales favorecen la interacción de la cromatina con las proteínas
HP1 (“Heterochromatin Protein 1”) y BAF (“Barrier to autointegration factor”), que a su vez
estabilizan la asociación de la cromatina con la lámina nuclear y organizan espacialmente cada
cromosoma en un territorio específico de tipo celular (Misteli, 2007; Schneider y Grosscheld,
2007; Munshi y cols. 2009; Meldi y Brickner, 2011). No obstante, la metilación no siempre es
una señal de silenciamiento génico. De hecho, la H3K36me3 se asocia específicamente a la fase
de elongación de la transcripción y, co-transcripcionalmente, al “splicing” y a la poliadenilación
de los pre-mRNAs (Moore y Proudfoot, 2009). Otras modificaciones post-traduccionales
importantes de las histonas nucleosomales son la fosforilación y la ubiquitilación. La fosforilación
del extremo N-terminal de las histonas H3 y H2B activa la transcripción, mientras que la
fosforilación de la H2A la reprime (Peterson y Laniel, 2004). Recientemente se ha demostrado en
células eucariotas superiores que las H2A y H2B pueden monoubiquitilarse en K119 (H2A-Ub) y
K120 (H2B-Ub). A nivel transcripcional, la ubiquitilación regula el remodelamiento de la
cromatina, H2A-Ub participa en el silenciamiento génico y H2B-Ub favorece la elongación de la
transcripción (Ma y cols., 2011). Ambas histonas ubiquitiladas están implicadas en la respuesta
al daño del DNA (Batta y cols., 2011).
Activación transcripcional génica
Inhibición transcripcional génica
Figura 5. Modificaciones post-traduccionales de las histonas nucleosomales. La multiacetilación
de residuos de K de las cuatro histonas nucleosomales potencia la transcripción, mientras que la
modificación de lisinas por trimetilación de las H3 en K9 y K27 y H4K20 tiene un efecto represor. No
obstante, cuando la metilación se produce en las lisinas K4, K36 y K79 de la H3, se favorece la
transcripción. Con la excepción de la ubiquitilación (Ub) que es del extremo C-terminal de la H2A y de la
H2B, la mayor parte de las modificaciones se producen en el extremo N-terminal. En color salmón se
representan las histonas etiquetadas de forma estable.
15
Introducción
En las histonas nucleosomales existen ciertas variantes, como son las de la histona
H2A, que incluyen la H2AX, H2AZ, macroH2A y H2AB (Kamakaka y Biggins, 2005). De este
“pool”, la H2AX se distribuye regularmente en el genoma y, en los mamíferos, constituye
entre un 2-25% del total de la H2A (Fernandez-Capetillo, 2004). Como se comentará más
adelante, la histona H2AX juega un papel muy importante en la señalización molecular del
DNA dañado (Rogakou y cols., 1998). Asimismo, la H3 también presenta las variantes
centromérica (cenH39) y la H3.3 (Kamakaka y Biggins, 2005).
Otro aspecto importante relacionado en la regulación génica es la localización espacial
de los cromosomas y la formación de unidades de cromatina formando bucles o lazos de
fibras cromatínicas o de cadenas polinucleosomales. Estos bucles cromosómicos han cobrado
mucha entidad funcional en la organización del genoma, ya que pueden incluir secuencias
génicas silentes, aproximar espacialmente secuencias del genoma alejadas y formar bucles
de genes activos transcripcionalmente (Fig. 6). Con frecuencia, los bucles de DNA activado
transcripcionalmente se asocian a los complejos del poro nuclear, creando factorías que
favorecen rápidamente el ensamblaje de la maquinaria de transcripción necesaria para la
síntesis y maduración de RNAs y la exportación directa de los tránscritos al citoplasma.
Actualmente se propone que estos bucles tienen memoria transcripcional, lo que favorece
que en activaciones sucesivas la respuesta sea más rápida y eficiente (Misteli, 2007;
Schneider y Grosschedl, 2007; Moore y Proudfoot, 2009; Meldi y Brickner, 2011). De hecho,
las neuronas sensitivas de tipo A, cuya tasa transcripcional es muy alta, muestran un patrón
de fibrillas pericromatínicas muy prominente y particularmente localizado en el
microambiente perinuclear del poro (Casafont y cols., 2006).
Complejo del poro
Lámina nuclear
Bucle de DNA activo
Figura 6. Organización espacial de la cromatina con la envoltura nuclear. Mientras que el
anclaje de las fibras cromatínicas (heterocromatina) a la lámina nuclear está mediado por las proteínas
de heterocromatinización HP1 y BAF, los bucles de eucromatina transcripcionalmente activa se
aproximan al complejo del poro nuclear (CNP). Estos bucles favorecen que la maquinaria transcripcional
pueda ser compartida dando lugar a una factoría transcripcional (FT).
16
Introducción
Merece la pena destacar, aunque sea brevemente, la organización de la cromatina
nucleolar, ya que tiene algunas peculiaridades específicas. Como se comentará en el
siguiente apartado, el nucleolo es el compartimento nuclear donde se localizan los genes
ribosomales (rDNA), siendo el rDNA nucleolar la base estructural y funcional del nucleolo. En
este sentido, el nucleolo podría considerarse un subcompartimento del dominio
cromosómico. El rDNA del nucleolo está esencialmente representado por genes ribosomales
repetidos y ordenados en tándem en las regiones organizadoras del nucleolo (NORs) de
determinados cromosomas (Sogo y cols., 1984; Hadjiolov, 1985). El número de cromosomas
portadores de NORs es variable entre especies animales, en la rata sólo tres pares de
cromosomas tienen rDNA por lo que las neuronas sensitivas, por ser diploides, podrían tener
un número máximo de seis nucleolos (Kano y cols., 1976). No obstante, las neuronas
sensitivas nunca poseen tantos nucleolos (Pena y cols., 2001), lo que apoya que en la
nucleologénesis no participan necesariamente todas las NORs. Sin embargo, es interesante
matizar que el número de nucleolos no es un buen indicador de actividad transcripcional ya
que las neuronas de tipo A, más activas transcripcionalmente que las de tipo B o C,
organizan preferentemente los NORS activos en un único nucleolo. Probablemente, la
formación de un único nucleolo de gran tamaño puede favorecer el reclutamiento de los
genes ribosomales activos y de la maquinaria molecular para la transcripción y
procesamiento del rRNA en un único dominio nuclear. Este proceso podría incrementar la
eficiencia de biogénesis nucleolar de los pre-ribosomas (Pena y cols., 2001).
1.2.1.2 Dominio intercromatínico
Entre los territorios cromosómicos se encuentra el espacio intercromosómico o
intercromatínico, donde se organizan numerosas estructuras nucleares. Estos cuerpos
nucleares son principalmente de naturaleza protéica y, aunque carecen de membrana
limitante, se consideran sub-organelas con entidad propia, ya que poseen una clara identidad
morfológica, concentran componentes específicos y están implicados en distintas funciones
(Lamond y Spector, 2003; Misteli 2005). Las estructuras más relevantes del dominio
intercromatínico de las neuronas sensitivas de la rata son el nucleolo, los cuerpos nucleares
de Cajal (CBs), las áreas de factores de “splicing” o “speckles” nucleares y la envoltura
nuclear o microambiente perinuclear.
El nucleolo
El nucleolo es una organela multifuncional altamente especializada en la organización
de los genes en “tándem” que constituyen el rDNA y en la biogénesis de los ribosomas. Esta
biogénesis es un proceso complejo que requiere una serie de etapas consecutivas que
incluyen: i) la activación y transcripción inicial de los genes ribosomales (tránscritos
primarios de pre-rRNA 45S) ii) el corte de los pre-rRNA 45S en las tres categorías de rRNAs
17
Introducción
nucleolares, 28S, 18S y 5,8S; iii) la modificación post-transcripcional de los tránscritos y iv)
el ensamblaje de los rRNAs 28S, 18S, 5,8S y 5S, este último de origen extranucleolar. A
partir de los cuales se forman la subunidades grande (60S) y pequeña (40S) del ribosoma
(Raska y cols., 2006; Boisvert y cols., 2007). Dichos procesos ocurren en subcompartimentos
nucleolares bien definidos que incluyen los centros fibrilares (CFs), el componente fibrilar
denso (CFD), el componente granular (CG) y los intersticios (Fig. 7A-B). La organización
estructural y la proporción de estos componentes está directamente relacionada con la
actividad metabólica celular, razón por la que las neuronas sensitivas son un excelente
modelo para correlacionar la estructura y la función del nucleolo. De hecho, las neuronas de
tipo A muestran generalmente un único nucleolo muy grande y visible con la microscopía de
luz por su elevado índice de refracción debido a la alta concentración de rRNAs y proteínas
que posee. Sus componentes muestran un alto nivel de organización, con numerosos CFs
pequeños distribuidos por todo el nucleolo y un CF de gran tamaño (centro fibrilar gigante,
CFG) cuyo significado funcional no es bien conocido (Casafont y cols., 2007). Los CFs están
rodeados parcial o totalmente por el CFD y, entre ambos subcompartimentos, se organiza el
componente granular (CG) y los intersticios nucleolares (Pena y cols., 2001) (Fig. 7A-B).
Cada CF junto con la cápsula del CFD constituyen las unidades estructurales y
funcionales del nucleolo donde se produce la biogénesis y procesamiento inicial de los rRNAs
(Fig. 7A-B). En los CFs se organizan numerosas copias de genes ribosomales activados o
inhibidos transcripcionalmente (Hadjiolov, 1985). Los genes de rDNA silentes se sitúan,
preferentemente en la zona más central del CF, mientras que el rDNA activo se dispone en la
periferia y se extiende en el CFD, donde se produce la transcripción (Raska y cols., 2006;
Boisvert y cols., 2007). En el CF se almacenan moléculas implicadas en la transcripción como
son el factor de transcripción UBF (“Upstream binding factor”), la RNA polimerasa I, la TBP
(“TATA binding protein”), la DNA topoisomerasa I y algunos tránscritos de los propios prerRNAs (Carmo-Fonseca y cols., 2000; Sirri y cols., 2008; Tremblay y cols., 2009; McKeown y
Shaw, 2009) (Fig. 7A-C). Desde un punto de vista funcional podemos decir que los CFs son
los organizadores estructurales del rDNA y sitios de almacenamiento transitorio de
componentes de la maquinaria de transcripción, procesamiento y maduración de los rRNAs
(McKeown y Shaw, 2009). Por su parte, el CFD está constituido por fibrillas densamente
empaquetadas en las que se disponen buena parte de los genes ribosomales activos. Está
enriquecido en componentes de la maquinaria de transcripción (RNA-polimerasa I y a la
nucleolina), ribonucleoproteínas nucleolares (snoRNPs), “procesomas” y productos génicos,
los tránscritos primarios (Dragon y cols., 2002; Mongelard y Bouvet, 2007; Sirri y cols.,
2008). Entre las proteínas constituyentes de las snoRNPs, tienen particular importancia la
chaperona Nopp140, la pseudouridina sintasa disquerina/NAP57 y la rRNA metiltransferasa
fibrilarina (Fig. 7C). Estas enzimas son responsables de la pseudouridinación y metilación de
18
Introducción
los pre-rRNAs, dos modificaciones post-transcripcionales fundamentales para la posterior
escisión del pre-rRNA 45S en las tres modalidades de rRNAs 18S, 28S y 5,8S (Sweet y cols.,
2008; Montanaro y cols., 2008) (Fig. 10).
El CG se denomina así porque a nivel ultraestructural lo forman gránulos de unos
15-20nm de diámetro correspondientes a las subunidades pequeñas y grandes preribosomales (Fig. 7A-B). En este subcompartimento nucleolar finaliza el ensamblaje de las
subunidades de los ribosomas y es un sitio de depósito de estas subunidades hasta su
exportación al citoplasma (Raska y cols., 2006). En las neuronas de tipo A este componente
nucleolar es muy evidente y ocupa prácticamente todos los intersticios que quedan entre los
CF/CFD (Pena y cols., 2001). Una proteína característica y muy importante funcionalmente
del CG es la fosfoproteína B23, también conocida como nucleofosmina (NPM), NO38 o
numatrina (Fig. 7C). Es una de las proteínas con mayor “pluriempleo” celular ya que,
además de tener un papel crítico en el ensamblaje final y exportación de las partículas preribosomales, actúa como endonucleasa, ribonucleasa y chaperona (Boisvert y cols., 2007).
CFD
CG
*
I
A
C
B
Componentes moleculares de los subcompartimentos nucleolares
CF: UBF, TBP, rDNA, pre-rRNA, DNA topoI, RNA polI
CFD: Disquerina, fibrilarina, Nopp140, nucleolina, snoRNPs rDNA, rRNAs,RNA polI, procesoma
CG: B23, rRNA, subunidades ribosomales
Figura 7. Compartimentos del nucleolo. A. Imagen ultraestructural de un nucleolo perteneciente a
una neurona sensitiva de tipo A. Se identifican los tres subcompartimentos canónicos del nucleolo,
centros fibrilares pequeños y numerosos (asterisco), componente fibrilar denso (CFD), componente
granular (CG) y los intersticios (I). B. Esquema de un nucleolo que representa los tres
subcompartimentos característicos del nucleolo. La línea violeta corresponde al rDNA que se introduce
en el CF (rDNA silente, en oscuro) y parcialmente organizado en el borde interno del CFD (rDNA activo
transcripcionalmente, fucsia). En el CG los gránulos grises representan las partículas ribosomales
grandes y pequeñas. C. En los recuadros se resumen algunas moléculas que se localizan
específicamente en cada compartimento.
19
Introducción
La versión moderna que tenemos del nucleolo añade a su función primaria, la
biogénesis de ribosomas, otras funciones tales como la regulación de la mitosis, la
progresión del ciclo celular y proliferación, la respuesta al estrés y a la infección vírica, el
proceso de carcinogénesis y la biogénesis de múltiples ribonucleoproteínas (RNPs) de
pequeño tamaño (Boisvert y cols., 2007). Además, los avances en el campo de la
microscopía confocal con la expresión ectópica y seguimiento in vivo de proteínas
fluorescentes, y los estudios de proteómica han contribuido significativamente a conocer la
multifuncionalidad del nucleolo. El grupo de Lamond (Dundee, UK), pionero en el campo de
la proteómica nucleolar, ha demostrado que los nucleolos aislados continúan transcribiendo
el rRNA, indicando que funcional y estructuralmente son organelas autónomas y muy
estables (Boisvert y cols., 2007). Además, estudios de seguimiento in vivo de proteínas
nucleolares fluorescentes han demostrado que los compartimentos nucleolares son muy
dinámicos y que sus componentes están sometidos a un intercambio continuo con el
nucleoplasma (Andersen y cols., 2005; Hernandez-Verdun, 2006). Por otra parte, la
combinación de proteómica nucleolar con el análisis de proteínas por espectrometría de
masas demuestra que, aproximadamente, el 30% de las casi 5000 proteínas identificadas en
el nucleolo están funcionalmente relacionadas con la producción de las subunidades del
ribosoma. El resto de proteínas, de entidad y función muy diversa, justifican la idea de que el
nucleolo tiene funciones adicionales a la biogénesis de ribosomas. Entre las proteínas no
ribosomales destacan factores implicados en el procesamiento de mRNAs, el control del ciclo
celular y la reparación del DNA (Boisvert y cols., 2007; Ahmad y cols., 2009).
El cuerpo nuclear de Cajal (CB)
El CB es una organela nuclear del dominio intercromosómico descubierta por Santiago
Ramón y Cajal en 1903 en diversos tipos neuronales y en varias especies de mamíferos.
Cajal la describe como una estructura nuclear argirófila, de forma esférica y bordes nítidos,
de aproximadamente 0,5 a 1μm de diámetro, con una textura homogénea y localizada libre
en el nucleoplasma o asociado al nucleolo (Fig. 8). Cajal consideró que esta organela estaba
relacionada con el nucleolo, razón por la que la bautizó con el nombre de “cuerpo accesorio”
del nucleolo (Cajal, 1903; Lafarga y cols., 1983). Posteriormente, demostró que el cuerpo
accesorio es una estructura constante en la mayoría de tipos neuronales y que presenta
variaciones en el número y tamaño dependiendo de la población neuronal (Cajal, 1910). El
cuerpo accesorio despertó escaso interés entre los científicos de la época hasta que, en la
década de 1950, el equipo de Barr (University Western Ontario), estimulado por la
demostración de la cromatina sexual en el núcleo neuronal de las hembras (en la actualidad
el cromosoma X inactivo), dedicó un gran esfuerzo al estudio del núcleo neuronal y publicó
tres artículos sobre la organización del cuerpo accesorio en neuronas de varios centros
20
Introducción
nerviosos del gato (para revisión ver Lafarga y cols., 2009). En estos estudios se
confirmaban las observaciones de Cajal, se demostraba la ausencia de DNA
en el cuerpo
accesorio (Feulgen negativo) y se aportaban las primeras evidencias de su comportamiento
dinámico en respuesta a los cambios de la expresión génica asociados con la axotomía
(Lafarga y cols., 2009).
Con la incorporación de las técnicas de microscopía electrónica al estudio del núcleo
celular, Monneron y Bernhard (1969) describen en hepatocitos un cuerpo nuclear formado
por hebras densas arrolladas de material fibrilar denso, que denominaron “coiled body” (de
cuerpo arrollado). En su estudio estos investigadores no hacen referencia a los artículos de
Cajal (1910), probablemente no los conocían y presentan el “coiled body” como una
estructura nuclear nueva. En 1983, Lafarga y sus colaboradores adaptaron el método del
nitrato de plata reducido para su aplicación a la microscopía electrónica demostrando en
varios tipos neuronales que el cuerpo accesorio de Cajal y el “coiled body” de Monneron y
Bernhard (1969) eran la misma estructura. Sin embargo, fue necesario esperar hasta 1999
para que la comunidad científica internacional reconociese el descubrimiento a Cajal. Así, en
un “EMBO Workshop” sobre la organización funcional del núcleo celular celebrado en Praga
en 1999, el profesor Gall (Carnegie Institution of Baltimore), apoyándose en las
observaciones de nuestro laboratorio y en las de otros investigadores, propuso como
homenaje a Cajal, y en reconocimiento a su descubrimiento del “cuerpo accesorio”, la
adopción del nombre de “Cajal body” (CB) en sustitución de “coiled body”, (Carvalho y cols.,
1999; Gall, 2000). Desde esta fecha, el nombre de “Cajal body” (cuerpo nuclear de Cajal) ha
sido universalmente aceptado en la literatura internacional, incluyendo los textos de Biología
Celular (para revisión ver Lafarga y cols., 2009).
Sin ninguna duda, un avance fundamental para conocer la importancia funcional de
esta organela ha sido su caracterización molecular. Durante la década de los 90 se alcanzó
un gran progreso en el conocimiento de la composición molecular del CB que dio importantes
pistas acerca de la funcionalidad de esta organela. Así, la identificación del marcador
molecular específico, la coilina (Andrade y cols., 1991) y el desarrollo de nuevos anticuerpos
y sondas de hibridación, permitieron localizar en el CB factores implicados en el “splicing” de
los pre-mRNAs, incluyendo los U snRNAs espliceosomales, proteínas del “splicing” (complejo
Sm) y las propias ribonucleoproteínas espliceosomales (snRNPs). Asimismo, con sueros
autoinmunes y anticuerpos específicos, se demostró que el CB estaba enriquecido en el
complejo multiprotéico Sm y U2B”, que forma parte del núcleo central del espliceosoma
(Carmo-Fonseca y cols., 1992; Lamond y Carmo-Fonseca, 1993; Gall, 2000). Otro
componente del CB es el factor de supervivencia de las motoneuronas (“survival motor
neuron protein”, SMN) que está relacionado con la biogénesis de los snRNPs en el citoplasma
y con su destino nuclear al CB. Inicialmente la proteína SMN fue identificada por Liu y
21
Introducción
Dreifuss (1996) en el citoplasma y formando cuerpos nucleares que denominó gemelos o
“gems” del CB, porque se encontraron asociados a esta organela (Liu y Dreifuss, 1996; Liu y
cols., 2009). Estudios posteriores (Matera y Frey, 1998; Carvalho y cols., 1999; Young y
cols., 2000; Pena y cols., 2001; Berciano y cols., 2007) en diferentes líneas celulares y
tejidos animales, han revelado que el factor SMN y sus proteínas asociadas normalmente
colocalizan con la coilina y snRNPs en el CB. También son dianas del CB una amplia familia
de ribonucleoproteínas nucleolares (snoRNPs) y de RNAs pequeños asociados al CB
(scaRNAs) (Cioce y Lamond, 2005, Nizami y cols., 2010; Hebert, 2013). Además, la lista
creciente de nuevas moléculas identificadas en el CB abre nuevas expectativas funcionales
para esta estructura. Por ejemplo, la presencia del RNA de la telomerasa, de la transcriptasa
inversa humana (hTERT) y de las subunidades catalíticas de la telomerasa (TERC, diskerina y
TCAB1) (para revisión, ver Cioce y Lamond, 2005). El CB también asocia determinados loci
génicos, particularmente de las histonas, y concentra moléculas requeridas para el
procesamiento de los pre-mensajeros de las histonas (Ciclina E/CDK2, P220 y U7 snRNA)
(Hoffmann y Birnstiel, 1990; Fernandez y cols., 2002). Más recientemente, nuestro grupo ha
demostrado que algunos CBs están enriquecidos en el modificador post-traduccional SUMO1
(“Small Ubiquitin-like modifier-1”) (Navascues y cols., 2008) y que la sumoilación de la
proteína SMN es crucial para la organización del CB (Tapia y cols., 2014, en prensa). A la vez
el grupo de Melchior ha añadido al listado molecular de los componentes del CB la presencia
de la enzima específica de desumoilación USPL1 (Schulz y cols., 2012) (Fig. 8).
A pesar de que el CB concentra gran variedad de componentes para la biogénesis de
mRNAs y rRNAs, no es un sitio de transcripción ni de “splicing” como demuestra la ausencia
de sustratos hnRNPs o poli(A) RNAs y de otros factores de “splicing” esenciales como las
proteínas SC35 y U2AF (Lamond y Carmo-Fonseca, 1993; Gama-Carvalho y cols., 1997).
Además, el CB carece de DNA, de histonas y no incorpora uridina tritiada (Lamond y CarmoFonseca, 1993; Gall, 2000). Sin embargo, dada la gran cantidad de componentes implicados
en la expresión génica y que su número y tamaño está directamente relacionado con la
actividad transcripcional celular, se mantuvo el interés por demostrar que no era una
organela de mero depósito molecular sino una estructura dinámica con actividad funcional
(Carmo-Fonseca y cols., 1993; Lafarga y cols., 1998; Pena y cols., 2001; Berciano y cols.,
2007; Hebert, 2013). De hecho, el seguimiento en células vivas de proteínas del CB
fusionadas con proteínas fluorescentes ha permitido conocer que esta organela tiene un
importante dinamismo molecular y sus componentes moleculares están en flujo constante
con el nucleoplasma (Misteli, 2008). Además, el CB se mueve libremente en el nucleoplasma
y se relaciona espacialmente con otros compartimentos nucleares, particularmente con el
nucleolo, determinados dominios de la cromatina y los cuerpos PML (Platani y cols., 2002;
Cioce y Lamond, 2005; Mistelli, 2007; 2008; Berciano y cols., 2007). Así, la relación espacial
22
Introducción
física de los CBs con otros cuerpos nucleares como son los “speckles” nucleares, el nucleolo,
los telómeros y los cuerpos nucleares PMLs ha permitido proponer la existencia de un tráfico
molecular activo entre el CB y dichos dominios nucleares (ver Frey y Matera, 1995; Cioce y
Lamond, 2005). Sobre la base de las relaciones espaciales del CB y de su composición
molecular, se ha propuesto que el CB está implicado en funciones tan importantes como la
biogénesis de los snRNAs espliceosomales (Fig. 8A) y de los snoRNAs nucleolares (Fig. 8B);
el procesamiento de pre-mRNAs de determinadas histonas (Fig. 8C); en la sumoilación/
desumoilación de sustratos (Fig. 8D), y la maduración de la telomerasa (Fig. 8 E).
Figura 8. Se esquematizan cinco funciones del CB. En el CB culmina la maduración de las
ribonucleoproteínas espliceosomales (snRNPs) (A) y de las ribonucleoproteínas nucleolares (snoRNPs)
(B). En la fase S del ciclo celular, el CB está relacionado con la la transcripción y procesamiento de
histonas nucleosomales (C). El CB almacena el complejo de la telomerasa y contribuye a la maduración
de la DNA-telomerasa (D). En (E) se ilustra su asociación y posible relación funcional con la sumoilación
y el tráfico bidireccional de proteínas.
Las cinco funciones del CB presentadas en la figura 8 tienen enorme transcendencia
funcional, pero en el contexto del presente proyecto de Tesis Doctoral tienen particular
relevancia la participación del CB en la biogénesis de las snRNPs espliceosomales implicadas
en el “splicing” de los mRNAs y en la biogénesis de las snoRNPs nucleolares. Por esta razón,
aunque sea brevemente, vamos a describir con más detalle la implicación del CB en la
maduración de ambas ribonucleoproteínas.
En el caso de la participación del CB en la biogénesis de las snRNPs espliceosomales la
secuencia de acontecimientos sería la siguiente: en primer lugar, tras la transcripción, los
23
Introducción
UsnRNAs espliceosomales son exportados al citoplasma donde se modifican posttranscripcionalmente por hipermetilación del extremo 5’ (caperuza de trimetil-guanosina,
TMG). En el citoplasma, estos U snRNAs se ensamblan con el complejo proteico
espliceosomal Sm (SmB/B’, SmD1, SmD2, SmD3, SmE, SmF y SmG) formando la pre-snRNP
espliceosomal. Para que este ensamblaje se produzca se requiere la participación del
complejo SMN, compuesto por la proteína SMN y, al menos, 7 proteínas denominadas
“geminis” (Carissimi y cols., 2006). Una vez ensamblado el complejo pre-snRNP (snRNA/Sm/
SMN), la snurimportina/importina β dirige su importación y destino al CB (Stanek y cols.,
2008). Esta fase está mediada por la interacción de la SMN y de la Sm de las pre-snRNPs con
la coilina del CB (Fig. 9). En el CB se produce la maduración funcional de las pre-snRNPs a
las snRNPs mediante dos modificaciones en los snRNAs, la 2’-O-metilación de residuos de
ribosa y la conversión de uridinas en pseudouridinas. En ambos procesos son clave los
scaRNAs o RNAs-guías específicos del CB (Darzacq y cols., 2002; Jady y cols., 2003). Una
vez que los snRNAs de las snRNPs son metilados y seudouridinados, el complejo SMN se
debe disociar, un requisito previo para que las snRNPs sean transferidas a los “speckles” y a
los sitios de transcripción activa donde se ensamblan en el espliceosoma responsable del
“splicing” de los pre-mRNAs (Lamond y Spector, 2003; Lafarga y cols., 2009) (Figs. 8A y 9).
Figura 9. Etapas de la biogénesis de snRNPs espliceosomales. Tras la transcripción, los snRNAs
espliceosomales se exportan al citoplasma donde se ensamblan con los complejos SMN y Sm para
formar las pre-snRNPs que son reimportadas al núcleo por la importina β (no representada) y al CB. En
el CB, tras interaccionar con la coilina (rojo), culminan su maduración por metilación (Me) y
pseudouridinación (ψ) de los snRNAs. Los scaRNAs dirigen este proceso. Las snRNPs maduras se
almacenan transitoriamente en los “speckles” nucleares. Las snRNPs se integran en el espliceosoma
para participar en el “splicing” de los pre-mRNAs.
Con respecto a la participación del CB en la biogénesis de las snoRNPs nucleolares
también tiene gran entidad funcional para la génesis de los rRNAs. Existen múltiples tipos de
24
Introducción
snoRNPs que se agrupan en dos familias según el RNA pequeño (snoRNA) que contengan: las
snoRNPs tipo C/D con actividad metiltransferasa y los snoRNPs del tipo H/ACA que actúan como
pseudouridina sintasa. La participación del CB en la maduración de snoRNPs comienza con la 2’O-ribosa-metilación y pseudouridinación de los snoRNAS, un proceso dirigido por los scaRNAs del
CB (Matera y cols., 2007). Una vez modificados los snoRNAs se ensamblan molecularmente con
la chaperona Nopp140. A continuación, las pre-snoRNPs que van a formar la familia C/D unen a
la metiltransferasa fibrilarina, mientras que las snoRNPs H/ACA interaccionan con la
pseudouridina sintasa disquerina/NAP57 (Fig. 10). Completada su maduración, las snoRNPs
activas son transferidas desde el CB al nucleolo, donde cumplirán su función en el procesamiento
de los pre-rRNAs. La fibrilarina metila el pre-rRNA 45S naciente y la disquerina/NAP57 cataliza la
conversión de uridinas en pseudouridinas. Estas modificaciones son esenciales para el corte del
pre-rRNA 45S que dará lugar a los rRNAs 18S, 28S y 5,8S previo el ensamblaje con los
procesomas. El rRNA 18S unido al procesoma forma la subunidad pequeña del ribosoma y los
rRNAs 28S y 5,8S, junto con el rRNA 5S, se unen al procesoma par formar la subunidad grande
del ribosoma (Carmo-Fonseca y cols., 2000; Verheggen y cols., 2001; Boisvert y cols., 2007;
Sirri y cols., 2008; Machyna y cols., 2013) (Fig. 10).
Figura 10. Etapas de la biogénesis de snoRNPs nucleolares. Tras su transcripción los snoRNAs se
incorporan al CB donde se modifican por metilación y pseudouridinación y se ensamblan con los complejos
Nopp140-fibrilarina y Nopp140-NAP57. Las snoRNPs activas se exportan al CFD del nucleolo donde dirigen la
maduración del pre-rRNA 45S por metilación y pseudouridinación. El pre-rRNA 45S maduro es cortado en los
RNAs 28S, 5,8S y 18S. Estos tránscritos se unen al procesoma para formar la subunidad ribosomal grande y
el 18S que junto con el procesoma pequeño formarán la subunidad ribosomal pequeña.
25
Introducción
Las granulaciones intercromatínicas o “speckles” nucleares
Las granulaciones intercromatínicas fueron descritas inicialmente por Swift (1962) y han
recibido esta denominación ya que a nivel ultraestructural están constituidas por gránulos
muy electrodensos. Su patrón de expresión puede ser difuso por el nucleoplasma excluyendo
el nucleolo, o formando agregados de granulaciones intercromatínicas (IGCs). Dado que las
IGCs están enriquecidas en factores de “splicing” y en RNAs poliadenilados, en la actualidad
a dichas áreas de IGCs se denominan áreas de factores para el “splicing” o sencillamente
“speckles” nucleares. No incorporan uridina tritiada y carecen de DNA, lo que indica
claramente que no son sitios de transcripción
activa (Spector, 1993; Mintz y cols., 1999). Sin
embargo, el hecho de que asocien en la
periferia muchos focos activos de transcripción
ha servido para proponerlos como depósitos
moleculares dinámicos que suministran factores
de “splicing” a los genes asociados activos
transcripcionalmente (Misteli y Spector, 1997;
Pena y cols., 2001; Casafont y cols., 2006). El
tamaño de los “speckles” está inversamente
relacionado con la actividad transcripcional. Este
Figura 11. Los “speckles” en el proceso del
“splicing” de mRNAS. Se representa un
complejo transcripcional de varios genes que
comparten la maquinaria de la Polimerasa II
asociados a un “speckle” que aporta las snRNPs
que formaran parte del espliceosoma. Los premRNAs (rojo) asociados a al DNA muestran
bucles de intrones que son eliminados por los
espliceosomas para madurar a mRNA
traduccionalmente correctos (rojo).
hecho fue confirmado en nuestro laboratorio,
utilizando como modelo experimental los tres
tipos neuronales sensitivos del GT, grandes,
medianas y pequeñas, con decreciente actividad
metabólica. Así, inmunodetectando el complejo
Sm espliceosomal, se comprobó que las
neuronas pequeñas, con poca actividad transcripcional, reclutan los factores de splicing
preferentemente en “speckles” grandes y abundantes. Inversamente, en las neuronas de
tipo A las granulaciones intercromatínicas adoptan un patrón difuso y sus “speckles” son
pequeños y poco numerosos (Pena y cols., 2001). Esta dinámica de los “speckles” también
ha sido demostrada en mioblastos humanos controles y de pacientes afectados por la OPMD
(“Oculopharyngeal Muscular Dystrophy”); en este caso, inmunodetectando la proteína
PABPN1 (“Poly(A)-Binding Nuclear Protein 1”) silvestre y expandida ubicua en los “speckles”.
Este estudio corroboró que en los mioblastos de la OPMD, con déficit transcripcional, la
PABPN1 formaba “speckles” de gran tamaño (Bengoechea y cols., 2012). Con frecuencia los
“speckles” aparecen asociados físicamente a los CBs, por lo que se ha propuesto que esta
relación íntima puede facilitar el intercambio molecular entre ambas organelas (Lafarga y
cols., 1998).
26
Introducción
La envoltura nuclear y el microambiente perinuclear
El núcleo celular es una organela muy compleja con funciones tan esenciales como la
estabilidad genómica, la replicación del DNA y la expresión génica. Para cumplir estas
funciones biológicas las células eucarióticas separan las actividades nucleares y
citoplasmáticas organizando la envoltura nuclear (EN). La microscopía electrónica reveló que
la EN comprende tres estructuras fundamentales: (i) dos endomembranas concéntricas, la
externa (MNE) y la interna (MNI), relacionadas con el citoplasma y el nucleoplasma
respectivamente, y separadas por el espacio intermembranoso o perinuclear; (ii) los
complejos del poro (CNP) o poros nucleares insertados en la doble membrana, los cuales
median en el intercambio de componentes; y (iii) el nucleoesqueleto de la lámina nuclear
que está íntimamente asociado con la MNI y proporciona estabilidad mecánica al núcleo. La
MNE asocia ribosomas y está directamente vinculada citológica y funcionalmente con el RE
granular (RER) (Fig. 12).
Figura 12. Organización de los componentes esenciales de la envoltura y de la lámina nuclear.
La membrana nuclear externa (MNE) se continúa con el RE que asocia ribosomas (RER). La membrana
nuclear interna (MNI) asocia la lámina nuclear que se interrumpe a nivel de los poros nucleares, si bien
interacciona en la superficie del poro. Ambas membranas, MNE y MNI, se fusionan a nivel del complejo
del poro y dejan entre ellas espacio intermembranoso o luz perinuclear.
Históricamente se consideró que la envoltura nuclear era poco más que una barrera
física destinada a aislar a los cromosomas interfásicos del citoplasma. Posteriormente, la
identificación ultraestructural de los poros nucleares permitió saber que existía una
comunicación nucleocitoplasmática (Callan y Tomlin, 1950). Ahora, con una visión más
moderna basada en datos combinados obtenidos con métodos de biología celular, genéticos,
bioquímicos y de proteómica, sabemos que los poros nucleares son estructuras con un flujo
molecular muy dinámico y que tanto la MNE como la MNI expresan proteínas transmembrana
con identidad y función propia. Por ejemplo, la MNE expresa proteínas no compartidas con el
RE asociado y la MNI (aunque unida a nivel de los poros a la MNE) tiene su propia
composición, integrando un grupo de proteínas que la polarizan eficientemente hacia la cara
nuclear (Chow y cols., 2012).
27
Introducción
Recientemente se ha demostrado que la interacción de determinadas proteínas
transmembrana de la EN con su respectivo entorno, es clave para determinar la expresión
fenotípica celular. Así, el dominio citosólico de las proteínas transmembrana Nesprinas se
ensambla el citoesqueleto perinuclear de filamentos finos de actina e intermedios a la MNE
(Fig. 13). Los microtúbulos centrosomáticos también se asocian a la MNE pero no se conoce
la identidad de la proteína de anclaje en las células eucariotas superiores (de las Heras y
cols., 2013). Por su parte, en la MNI el dominio nuclear de la proteína transmembrana SUN
interacciona con el nucleoesqueleto y ambas (Nesprina-SUN) establecen un nexo
transluminal que enlaza a los compartimentos perinucleares, citoplasmático y nuclear (Fig.
13). Por otra parte, la lámina nuclear subyacente a la MNI tiene gran relevancia en la
organización nuclear. Está constituida por una red de filamentos intermedios denominados
láminas, incluyendo los tipos, A, C, B1 y B2. Las láminas forman parte del nucleoesqueleto
pero a nivel de la EN se organizan en una densa red, la lámina nuclear, acoplada a la MNI
mediante su interacción molecular con los dominios nucleoplasmáticos de las proteínas
MAN1, LBR, Emerina, Nesprina y SUN (Fig. 13). Dichas proteínas transmembrana de la MNI
además de unir la lámina nuclear a la EN, sirven para el anclaje directo e indirecto de la
cromatina periférica. Así, SUN y Nesprina exhiben dominios de interacción directa con el
DNA, mientras que MAN1, LBR, Emerina requieren su interacción con las proteínas
responsables de la heterocromatinización BAF y HP1 para asociar la heterocromatina a la EN
(Fig. 13). Funcionalmente, la lámina nuclear es tan importante que mutaciones puntales en
algún componente (laminopatías) conllevan devastadoras consecuencias clínicas con
enfermedades muy severas incluyendo, cardiomiopatías, lipodistrofias o progeria (Dauer y
Worman, 2009; Chow y cols., 2012; de las Heras y cols., 2013) (Fig. 13).
Figura 13. Relación de la EN con el entorno citoplasmático y nuclear. En la MNE la proteína
Nesprina ancla a los filamentos finos e intermedios mientras la proteína SUN (MNI) fija el
nucleoesqueleto de la lámina nuclear. Las MNE y la MNI quedan acopladas intraluminalmente por la
interacción de ambas proteínas. La lámina nuclear (filamentos verdes) permanece asociada a la MNI por
interacción con SUN, LBR, Emerina, Nesprina y MAN1. La interacción de porción nucleoplasmática de
estas proteínas con BAF y HP1 sirve de andamiaje para el anclaje la heterocromatina periférica.
28
Introducción
Los poros nucleares o complejos del poro (CNP) son canales acuosos que atraviesan la
EN y conectan el núcleo con el citoplasma. Pueden considerarse como puertas para un
transporte bidireccional altamente selectivo de un elevado número de moléculas (Wente y
Rout, 2010). A nivel de los CNP, las membranas de la EN se continúan dejando un ojal para
su implantación. Con el microscopio electrónico se observan como estructuras cilíndricas
huecas, de un tamaño de 100-150nm en el eje mayor y 50-70nm en el eje menor. Muestran
una simetría octagonal muy rigurosa en la que se diferencian un núcleo central (anillo central
del poro) flanqueado por ocho filamentos polarizados hacia el citoplasma y hacia el
nucleoplasma. Los CNP están constituidos molecularmente por al menos 30 proteínas
diferentes denominadas nucleoporinas (Nups). Las proteínas Nups están evolutivamente muy
conservadas y, mayoritariamente, forman subcomplejos estructurales específicos de cada
parte del poro. De hecho, en la estructura molecular del poro nuclear participan más de 400
polipéptidos de Nups. En el anillo central, los subcomplejos de Nups forman ocho columnas
dispuestas perpendicularmente al eje de la EN. Cada una asocia un componente adluminal
de anclaje a la EN y otro que se proyecta a la luz reduciendo el espacio útil de transporte a
unos 50nm. Este núcleo central está flanqueado por dos anillos, uno externo y otro interno,
de los que emergen los componentes filamentosos del CNP. Los ocho filamentos
citoplasmáticos del CNP discurren paralelos y perpendiculares a la EN y los nucleoplasmáticos
adoptan la típica morfología en cesto, convergiendo en un anillo nuclear (Fig. 14).
Figura 14. Complejo nuclear del poro (CNP) tomado de Alberts y cols., 2008.
Una peculiaridad común es que todas las Nups tienen múltiples sitios de interacción
molecular destinados, en unos casos, a favorecer la propia organización estructural y en
otros, a seleccionar el tráfico bidireccional núcleo-citoplasmático. En este sentido tienen
particular relevancia las Nups enriquecidas en fenilalanina y glicina (FG). Una parte de estas
nucleoporinas se organizan alrededor