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CAPÍTULO 2.4.13.
RINOTRAQUEITIS INFECCIOSA BOVINA /
VULVOVAGINITIS PUSTULAR INFECCIOSA
RESUMEN
Definición de la enfermedad: La rinotraqueitis bovina infecciosa/vulvovaginitis pustular infecciosa,
causada por el herpesvirus 1 bovino (BoHV-1), es una enfermedad del ganado bovino doméstico y
del salvaje. El virus está distribuido por todo el mundo, pero se ha erradicado de Austria,
Dinamarca, Finlandia, Suecia, Italia (Provincia de Bolzano), Suiza y Noruega, y otros países han
iniciado programas de control.
Descripción de la enfermedad: La enfermedad se caracteriza por los síntomas clínicos del tracto
respiratorio superior, como rinorrea purulenta, y conjuntivitis. Los síntomas generales son fiebre,
postración, inapetencia, aborto y reducción de la producción de leche. El virus también puede
infectar el tracto genital y originar vulvovaginitis pustular y balanopostitis. El análisis post mórtem
revela rinitis, laringitis y traqueítis. La mortalidad es baja. Muchas infecciones siguen un curso
subclínico. Las infecciones bacterianas secundarias pueden ocasionar una enfermedad respiratoria
más grave.
Identificación del agente: El virus se puede aislar a partir de frotis nasales o frotis genitales de los
animales con vulvovaginitis o balanopostitis durante la fase aguda de la infección, y de varios
órganos post mórtem.
Para aislar el virus, se utilizan varios tipos de cultivos celulares de origen bovino, como células
secundarias de cultivos de pulmón o riñón, o la línea celular Madin–Darby de riñón bovino. A los 2–
4 días el virus produce un efecto citopático. Se identifica mediante métodos de neutralización o de
detección de antígenos con sueros monoespecíficos o anticuerpos monoclonales. Los aislamientos
de BoHV-1 se pueden clasificar en los subtipos 1.1, 1.2 y 1.3 mediante el análisis del ADN con
enzimas de restricción, y los aislamientos de BHV 1.2 se pueden subdividir en 2a y 2b. El virus
previamente mencionado como BHV 1.3, un agente neuropatógeno, se clasifica ahora como BHV5.
Se han desarrollado métodos de detección del ADN vírico y la técnica de la reacción en cadena de
la polimerasa se utiliza cada vez más en el diagnóstico rutinario.
Pruebas serológicas: Las pruebas más ampliamente utilizadas para la detección de anticuerpos
son las de neutralización del virus y varios tipos de enzimoinmunoensayo (ELISA). Con el ELISA,
los anticuerpos pueden detectarse en el suero y, cuando la sensibilidad es baja, en la leche.
Requisitos para las vacunas y el material de diagnóstico: Se dispone de vacunas atenuadas e
inactivadas. Las vacunas deben proteger clínicamente al ganado en caso de infección y reducir
notablemente la difusión subsiguiente de virus. Las vacunas no deben producir enfermedad, aborto
ni reacciones locales o sistémicas y deben ser genéticamente estables. Actualmente se dispone de
vacunas de glicoproteína E BoHV-1 con un mutante anulado. La utilización de una técnica gE
ELISA permite distinguir entre ganado infectado y ganado vacunado con esas vacunas marcadas.
A. INTRODUCCIÓN
La rinotraqueitis bovina infecciosa/vulvovaginitis pustular infecciosa (RBI/VPI), causada por el herpesvirus bovino
tipo 1 (BoHV-1), es una enfermedad del ganado bovino doméstico y del salvaje. El BoHV-1 es un miembro del
género Varicellovirus de la subfamilia Alfaherpesvirinae, que pertenece a la familia Herpesviridae. El genoma
vírico consta de ADN bicatenario que codifica para unas 70 proteínas, de las que se conocen 33 que son
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Capítulo 2.4.13. — Rinotraqueitis infecciosa bovina /vulvovaginitis pustular infecciosa
estructurales y hasta 15 que no son estructurales. Las glicoproteínas víricas, que se localizan en la envoltura
superficial del virión, tienen un papel importante en la patogénesis y en la inmunidad. Por diferencias en el
análisis del ADN con enzimas de restricción, el BoHV-1 se puede diferenciar en los subtipos 1.1, 1.2a, 1.2b y 1.3
(25). Se ha clasificado de nuevo a BoHV-1.3, que es un agente neuropatógeno, como BoHV-5 (21). Los subtipos
BoHV-1.2 pueden ser menos virulentos que el subtipo 1.1 (11)
Después de un período de incubación de 2–4 días, se pone de manifiesto una notable rinorrea de tipo seroso,
tialorrea, fiebre, inapetencia y postración. En unos pocos días la rinorrea y la conjuntivitis se convierten en
mucopurulentas. La infección genital puede originar vulvovaginitis o balanopostitis cuando se practica la monta
natural. Muchas infecciones siguen un curso subclínico (41).
Los casos de enfermedad respiratoria o genital provocados por BoHV-1 sin complicaciones duran 5–10 días.
El virus penetra en el animal por vía nasal y se replica con títulos altos en las membranas mucosas del tracto
respiratorio superior y en las amígdalas. Después se disemina por la conjuntiva y mediante su transporte por el
axón de las neuronas alcanza el ganglio trigémino. En una infección genital, el BoHV-1 se replica en la
membrana mucosa de la vagina o del prepucio, y se establece de forma latente en los ganglios sacros. El ADN
del virus permanece en las neuronas de los ganglios, probablemente durante toda la vida del hospedador. El
estrés, como el producido por el transporte o el parto, puede inducir la reactivación de la infección latente. El virus
puede, por tanto, diseminarse de modo intermitente.
La infección induce normalmente una respuesta de anticuerpos y una respuesta inmune célular en 7–10 días. La
respuesta inmune parece durar toda la vida, aunque puede estar bajo los límites de detección de algunas
pruebas. Los anticuerpos maternos se transfieren por el calostro a los terneros jóvenes que, como consecuencia,
están protegidos contra la enfermedad ocasionada por el BoHV-1 (24). Estos anticuerpos tienen una vida media
de aproximadamente 3 semanas, pero en ocasiones se pueden detectar en animales de hasta 9 meses de edad
y raramente en animales más viejos.
El virus se encuentra distribuido por todo el mundo, de acuerdo con la distribución del ganado doméstico. Otros
rumiantes se pueden infectar por el BoHV-1. Después de la infección, se detecta la diseminación nasal de virus
durante 10–14 días, con títulos máximos de 108–1010 DICT50 (dosis infecciosa 50% cultivo tisular) por ml de
secreción nasal. El semen de un toro infectado puede contener BoHV-1 y el virus puede, por tanto, transmitirse
mediante la monta natural y la inseminación artificial (28).
El control del BoHV-1 se basa en las medidas higiénicas normales de una granja. Idealmente, se impone al
ganado de nueva adquisición un período de cuarentena de 2–3 semanas y solo se admite el que sea
seronegativo para el BoHV-1. En general, las vacunas evitan la manifestación de síntomas clínicos graves y
reducen la liberación del virus después de la infección, pero no evitan la infección. Se están llevando a cabo
varias campañas de erradicación en varios países que incluyen pruebas y programas de erradicación y/o
campañas de vacunación (véase la sección C.)
Se puede sospechar que la infección por BoHV-1 es la causa de la enfermedad por los síntomas clínicos, los
patológicos y los epidemiológicos. Sin embargo, para hacer un diagnóstico definitivo, se necesita un diagnóstico
de laboratorio. Un procedimiento de diagnóstico completo en el laboratorio trata de detectar el virus causante (o
los componentes víricos) y los anticuerpos específicos que induce.
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
1.
Identificación del agente
a)
Recogida y procesamiento de las muestras
Se recogen hisopos nasales de varios animales afectados (de cinco a diez) en la primera fase de la
infección. Este ganado todavía mostrará una rinorrea serosa en vez de mucopurulenta. En los casos de
vulvovaginitis o balanopostitis se toman hisopos de los genitales. Los hisopos deben frotarse vigorosamente
contra las superficies mucosas. También se puede lavar el prepucio con solución salina y recoger el líquido
de lavado. Las muestras se suspenden en un medio de transporte (un medio de cultivo de células que
contenga antibióticos y 2–10% de suero fetal bovino para evitar la inactivación de los virus), se enfrían a
4°C y se envían rápidamente al laboratorio.
En la necropsia, se recogen para la detección del virus las membranas mucosas del tracto respiratorio y
porciones de las amígdalas, pulmones y ganglios linfoides bronquiales. En casos de aborto, se examina el
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hígado fetal, los pulmones, el bazo, el riñón y un cotiledón placentario. Las muestras se deben enviar al
laboratorio en hielo con la mayor rapidez posible.
Después de su llegada al laboratorio, los hisopos se agitan en el medio de transporte para desprender el
virus y se dejan a temperatura ambiente durante 30 minutos. Despues de extraer los bastoncillos se clarifica
el medio de transporte por centrifugación a 1.500 g durante 10 minutos. Los tejidos se homogeneizan para
formar suspensiones al 10–20% (p/v) en medio de cultivo celular antes de centrifugar a 1.500 g durante
10 minutos. Los sobrenadantes de estas muestras se filtran a través de filtros de 0,45 µm y se utilizan para
el aislamiento de virus.
El aislamiento de virus a partir del semen requiere algunas adaptaciones particulares, porque el fluido
seminal contiene enzimas y otros factores que son tóxicos para las células e inhiben la replicación del virus
(ver más adelante).
b)
Aislamiento vírico
Para aislar los virus, se pueden utilizar varios tipos de cultivos celulares. Resultan adecuadas las células
primarias o secundarias de riñón de bovinos, de pulmón o de testículos, las cepas celulares derivadas de
pulmón fetal bovino, de cornetes nasales o de tráquea, y las líneas celulares establecidas, como la línea
celular Madin–Darby de riñón bovino. Los cultivos celulares pueden cultivarse en tubos de vidrio o de
plástico, en placas o en discos. Cuando se utilizan placas de plástico de 24 pocillos, se inoculan en los
cultivos celulares 100–200 µl de los sobrenadantes descritos anteriormente. Después de un período de
absorción de 1 hora, se lavan los cultivos y se añade medio de mantenimiento. El suero empleado como
suplemento del medio de mantenimiento debe estar libre de anticuerpos contra el BoHV-1. Los cultivos
celulares se observan diariamente para comprobar el ECP, que normalmente aparece a los tres días de la
inoculación. Se caracteriza por la agrupación de células redondeadas en forma de racimos que se juntan
alrededor de un hueco en la monocapa; a veces, se pueden observar células gigantes con varios núcleos.
Se requiere experiencia para reconocer esta apariencia característica. Si después de 7 días no aparece el
ECP, se debe realizar otro pase. El cultivo celular se congela y se descongela, se clarifica por
centrifugación, y se usa el sobrenadante para inocular monocapas recién preparadas (6, 9).
Para identificar como BoHV-1 el virus que produce el ECP, el sobrenadante del cultivo debe neutralizarse
con un antisuero monoespecífico contra el BoHV-1 o con un anticuerpo monoclonal (MAb) neutralizante.
Con este fin, se llevan a cabo diluciones decimales del sobrenadante de prueba y se añade a cada dilución
un antisuero monoespecífico contra BoHV-1 o un suero negativo como control. Después de incubar a 37°C
durante 1 hora, se inoculan las muestras en un cultivo celular; a los 3–5 días se calcula el índice de
neutralización. El índice de neutralización es el título del virus (en log10) en presencia del suero control
negativo, menos el título del virus en presencia del antisuero específico. Si el índice de neutralización es
mayor de 1,5, el aislamiento se considera como BoHV-1. Para acortar el procedimiento de aislamiento del
virus, se pueden inocular dos muestras en cultivo celular: una que se haya preincubado con antisuero
monoespecífico y otra que se haya incubado con el suero control negativo. Si el antisuero monoespecífico
inhibe el ECP, el aislamiento se considera como BoHV-1.
Un método alternativo de identificación del virus consiste en la demostración directa del antígeno del BoHV1 en las células próximas al ECP mediante una prueba de inmunofluorescencia o inmunoperoxidasa (16)
con un antisuero monoespecífico o con MAb conjugado.

Aislamiento de virus del semen (Una prueba prescrita para el comercio internacional)
Se deben probar al menos 0,5 ml de una extensión de semen o 0,02 ml de semen natural, con dos pases
en un cultivo celular. Para el semen conservado, se debe utilizar un enfoque que asegure que se examina el
equivalente a 0,05 ml de semen natural. El semen fresco natural es generalmente citotóxico y debe
prediluirse antes de añadirlo a los cultivos celulares. A veces surge un problema similar con el semen
conservado. A continuación se expone un procedimiento adecuado de prueba.

Procedimiento de la prueba
i)
Se diluyen 200 µl de semen fresco en 2 ml de suero bovino fetal (libre de anticuerpos contra el BoHV1) que contenga antibióticos.
ii)
Se mezcla vigorosamente y se mantiene 30 minutos a temperatura ambiente.
iii)
Se inocula 1 ml de la mezcla semen/suero en una monocapa de células susceptibles (véase
“Aislamiento del virus” anteriormente) en una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos.
iv)
Se incuban las placas durante 1 hora a 37°C.
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v)
Se elimina la muestra, se lava dos veces la monocapa con 5 ml de medio de mantenimiento, y se
añaden 5 ml de medio de mantenimiento a cada pocillo.
vi)
Se incluyen en la prueba controles negativos y positivos para el BoHV-1. Se ha de tener mucho
cuidado para evitar la contaminación de los pocillos de ensayo con el control positivo; por ejemplo,
manejando siempre el control al final, y utilizando placas separadas.
vii)
Se observan diariamente las placas al microscopio para detectar la aparición del ECP. Si aparece el
ECP, se realizan pruebas confirmativas para BoHV-1 por métodos de neutralización específica o de
marcaje inmune (véase más arriba).
viii) Si después de 7 días no se observa el ECP, los cultivos se congelan y se descongelan, se clarifican
por centrifugación, y se utiliza el sobrenadante para inocular nuevas monocapas.
ix)
c)
La muestra se considera negativa si no se pone de manifiesto el ECP a los 7 días de la incubación de
los cultivos del nuevo pase.
Detección del antígeno vírico
Los hisopos nasales, oculares o genitales se pueden extender directamente, en portaobjetos de vidrio o
bien, después de centrifugar, se puede colocar en los portas el depósito celular (véase la sección B.1.a.).
Estos portaobjetos se someten a una prueba estándar de inmunofluorescencia directa o indirecta. En la
prueba de inmunofluorescencia directa, el antisuero monoespecífico se conjuga con isotiocianato de
fluoresceína, mientras que, en el procedimiento indirecto, es el segundo anticuerpo contra la
inmunoglobulina de la especie el que se conjuga con el isotiocianato de fluoresceína. Para obtener los
mejores resultados, se necesita muestrear varios animales procedentes de una población que presenten
fiebre y con una leve rinorrea serosa. Los frotis deben secarse al aire y se fijan con acetona dentro de las
24 horas. Los frotis de escobillones nasales del ganado bovino con una rinorrea mucopurulenta o
hemorrágica suelen ser negativos (37). La ventaja de esta técnica de detección de antígeno es que puede
permitir el diagnóstico en el mismo día. Sin embargo, la sensibilidad de este procedimiento es menor que la
del aislamiento del virus (9). Se deben incluir controles positivos y negativos en cada prueba.
El tejido recogido post mórtem se puede para detectar la presencia del antígeno de BoHV-1 mediante la
prueba de inmunofluorescencia en secciones o cortes congelados. También se puede utilizar la
inmunohistoquímica. La ventaja es que se puede determinar la localización del antígeno. Se está
incrementando el uso de los MAb para detectar antígeno de BoHV-1, lo que conduce a un aumento de la
especificidad de la prueba. Sin embargo, tales MAb deben ser seleccionados cuidadosamente, ya que
deben dirigirse contra epitopos conservados que estén presentes en todos los aislamientos del BoHV-1.
Otra posibilidad para la detección rápida y directa del antígeno vírico es la utilización de un
enzimoinmunoensayo (ELISA). El antígeno se puede capturar por MAb o por anticuerpos policlonales
fijados a una fase sólida, generalmente el pocillo de una microplaca. Se necesitan cantidades de antígeno
equivalentes a 104–105 DICT50 de BoHV-1 para obtener una tasa elevada de resultados positivos (7). Esto
no resulta excesivamente elevado porque el ganado bovino puede excretar fluido nasal a los 3–5 días de la
infección con BoHV-1 con títulos de 108–109 DICT50/ml. La sensibilidad se puede aumentar mediante
sistemas de amplificación (véase la ref. 10 para un ejemplo).
Las ventajas de los métodos de detección del antígeno frente a los de aislamiento del virus se basan en que
no se necesitan cultivos celulares y que se puede hacer un diagnóstico de laboratorio en 1 día. Las
desventajas radican en la menor sensibilidad de la detección directa del antígeno y en la necesidad extra de
realizar el aislamiento del virus, si se necesita el aislamiento para estudios posteriores.
d)
Detección del ácido nucleico
En la última década se han descrito varios métodos para demostrar la presencia del ADN del BoHV-1 en
muestras clínicas, incluyendo la hibridación ADN–ADN y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La
utilización de la PCR en el diagnóstico rutinario está creciendo (26). En comparación con el aislamiento de
virus, la PCR tiene la ventaja principal de que es más sensible y más rápida: puede realizarse en 1–2 días.
También puede detectar ADN en ganglios sensoriales con infección latente (38). La desventaja es que es
fácil de contaminar y por consiguiente, hay que tomar medidas para evitar falsos resultados positivos. El
riesgo de contaminación disminuye notablemente con las nuevas técnicas de la PCR, como la denominada
PCR en tiempo real o cuantitativa (QPCR) (1, 20).
Hasta la fecha la PCR se ha utilizado principalmente para detectar ADN del BoHV-1 en muestras de semen
infectado artificial (19) o naturalmente (38). Los investigadores destacan que es importante optimizar
cuidadosamente las condiciones de la prueba PCR, incluyendo la preparación de las muestras, la
concentración de Mg2+, los cebadores y la polimerasa Taq, y los programas de ciclos. La región a amplificar
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debe estar presente en todas las cepas del BoHV-1 y la secuencia nucleotídica debe estar conservada. Se
han utilizado los genes TK, gB, gC, gD y gE como dianas para la amplificación mediante la PCR. Para
diferenciar entre un virus de campo y las cepas vacunales con el gen gE suprimido, se pueden utilizar las
PCR basadas en la detección de las secuencias de gE (14, 35). Con la técnica de la PCR no es posible
discriminar entre la infección con cepas IBR virulentas y la infección con otras cepas vivas atenuadas. Se
han desarrollado pruebas PCR que distinguen entre el BoHV-1 y el BoHV-5 (2, 33).
Experimentalmente, la PCR resulta más sensible que el aislamiento del virus: en muestras de semen
obtenido a partir de toros infectados y diluido en yema de huevo, se detectó con la PCR un número de
muestras positivas cinco veces mayor que con el aislamiento del virus (39). Además, la PCR tiene un límite
de detección de tan solo tres moléculas. Sin embargo, no se puede excluir la posibilidad de falsos
resultados negativos. Para identificar los posibles resultados negativos falsos, se recomienda introducir un
ADN molde de control interno en el tubo de reacción de la muestra del semen, que se amplifique con los
mismos cebadores. Tal ADN molde de control se puede construir insertando, por ejemplo, un fragmento de
100 pares de bases en la región analizada. Este molde de control también hace posible semicuantificar la
cantidad de ADN detectada (33, 38). Cuando se está utilizando un control interno, es necesaria una prueba
extensa para garantizar que la amplificación por PCR del control interno añadido no compite con el
diagnóstico de la PCR y por lo tanto, disminuye la sensibilidad analítica (véase también el capítulo 1.1.5).
e)
Reacción en cadena de la polimerasa (una prueba prescrita para el comercio internacional)
Se ha desarrollado el siguiente método para la prueba de la PCR en tiempo real para detectar el BoHV-1 en
una extensión de semen bovino destinado al comercio internacional. Se ha validado el método tal como se
describió en los capítulos 1.1.4 y 1.1.5, lo que implica una comparación internacional exhaustiva entre los
diversos laboratorios especializados en aplicar pruebas para la RBI.
En varios estudios se ha puesto de manifiesto que las pruebas de la PCR son más sensibles que el
aislamiento del virus (36, 39, 42, 47). Se ha utilizado la PCR en tiempo real para la detección de BoHV-1 y
BoHV-5 en ganado y ratones infectados de forma experimental (1, 20), y se han utilizado varias pruebas de
la PCR convencional para la detección del ADN del BoHV-1 en muestras de semen bovino infectado de
forma natural o artificial (8, 15, 23, 38, 44, 45, 47, 49). La detección convencional de los productos de la
PCR se basa en el análisis mediante electroforesis en gel (32). Se han seleccionado cebadores específicos
de secuencia para amplificar las diferentes partes del gen conservado de la glicoproteína del genoma del
BHV-1, que incluye el gen de la glicoproteína B (gB) (15, 34), el gen gC (36, 39), el gen gD (36, 47), el gen
gE (15), y el gen de la timidina quinasa (tk) (26, 50).
La PCR en tiempo real se diferencia de la PCR estándar en que los productos de la PCR amplificados se
detectan directamente durante el ciclo de la amplificación utilizando una sonda de hibridación, lo que mejora
la especificidad de la prueba. Las pruebas de la PCR en tiempo real tienen varias ventajas sobre las
pruebas de la PCR convencional. Las pruebas de la PCR en tiempo real en las que solo se utiliza un par de
cebadores son capaces de proporcionar una sensibilidad casi igual o igual que las pruebas de la PCR
anidada, con un riesgo de contaminación mucho menor. La amplificación y la detección de la diana se
realizan de forma simultánea. No hay que manipular el producto de la PCR tras la amplificación, lo que
reduce de forma significativa el riesgo de contaminación, y permite realizar análisis cuantitativos con
sistemas de PCR en tiempo real.
En la PCR que aquí se describe se utilizan un par de cebadores específicos de secuencia para la
amplificación del ADN diana y una sonda para la nucleasa 5’ (TaqMan) para la detección de los productos
amplificados. La oligosonda es un solo oligonucleótido específico de secuencias designado con dos
fluoróforos diferentes, el aceptante/donante, 5-carboxifluoresceína (FAM) en el extremo 5’, y el
aceptante/”quencher” 6-carboxitetrametilrodamina (TAMRA) en el extremo 3’. Esta prueba de la PCR en
tiempo real está diseñada para detectar el ADN vírico de las cepas del BHV-1, incluyendo los subtipos 1 y 2,
en la extensión de semen bovino. Con la prueba se amplifica una secuencia de 97 pares de bases del gen
de la glicoproteína B (gB). Los detalles de los cebadores y las sondas se ofrecen en el protocolo esbozado a
continuación.
•
Preparación de las muestras, equipos y reactivos
i)
Las muestras típicas utilizadas en la prueba son las extensiones de semen bovino guardadas en
nitrógeno líquido. Esas muestras se pueden transportar al laboratorio en nitrógeno líquido, o se
pueden enviar a 4°C, y guardar en nitrógeno líquido a –70°C (durante un largo periodo de tiempo) o a
4°C (durante un corto periodo de tiempo). El hecho de guardar el semen a 4°C durante un corto
periodo de tiempo (hasta 7 días) no parece afectar al resultado de la prueba de la PCR.
ii)
Se procesan tres pajuelas de cada lote de semen. Se deben realizar por duplicado las amplificaciones
por PCR para cada preparación de ADN (un total de seis amplificaciones) para asegurar la detección
del ADN en las muestras que contienen niveles bajos de virus.
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Capítulo 2.4.13. — Rinotraqueitis infecciosa bovina /vulvovaginitis pustular infecciosa
iii)
Para realizar la prueba, se requiere un sistema de detección mediante la PCR en tiempo real y el
correspondiente soporte lógico para el análisis de los datos. Se pueden obtener de varias fuentes
diversos sistemas de detección mediante la PCR en tiempo real. En el procedimiento descrito más
adelante, se utilizó un RotorGene 3000, Corbett Research Ltd, Australia. También se pueden utilizar
otros sistemas de detección de la PCR en tiempo real. Otro equipamiento necesario para la prueba
incluye una microcentrífuga, un bloque de calentamiento, una bañera con agua hirviendo, un microvórtex, un agitador magnético y micropipetas. Con las pruebas de la PCR en tiempo real se pueden
detectar cantidades minúsculas del ácido nucleico diana; de ahí que deban adoptarse medidas
adecuadas para evitar la contaminación1.
iv)
La prueba de la PCR en tiempo real que aquí se describe consta de dos procedimientos distintos. En
primer lugar se extrae el ADN del BoHV-1 del semen utilizando resina quelatante Chelex-100, junto
con proteinasa K y DL-Ditiotreitol (DTT). El segundo procedimiento consiste en la amplificación y
detección del ADN molde extraído mediante el sistema de detección por la PCR en tiempo real
utilizando la siguiente mezcla de reacción para la PCR: Platinum Quantitative PCR SuperMix-UDG,
Invitrogen Technologies (téngase en cuenta que existen varios kits de amplificación por PCR en
tiempo real que se pueden obtener de varios proveedores en el mercado, y el kit seleccionado debe
ser compatible con la plataforma de la PCR en tiempo real seleccionada). Los cebadores y sondas
requeridas pueden ser sintetizados por varias compañías comerciales. En este protocolo, todos los
cebadores y sondas utilizados fueron sintetizados por Sigma-Genosys.
•
Extracción de ADN
i)
En un tubo de 1,5 ml con tapón de rosca se añade:
Sodio y Chelex 100 (Sigma) (10% p/v en agua destilada desionizada)
Proteinasa K (10 mg/ml, Sigma)
DL-Ditiotreitol (1 M, Sigma)
Agua libre de nucleasa
Muestra de semen
100 µl.
11,5 µl
7,5 µl
90 µl
10 µl
Se mezcla suavemente pipeteando2.
ii)
Los tubos de muestra se incuban a 56°C durante 30 minutos y se agitan con vórtex a gran velocidad
durante 10 segundos.
iii)
Luego se incuban los tubos en un baño de agua hirviendo durante 8 minutos y se agitan con vórtex a
gran velocidad durante 10 segundos.
iv)
Se centrifugan los tubos a 10.000 g durante 3 minutos.
v)
Se transfiere el sobrenadante3 a un nuevo microtubo y puede utilizarse directamente para la PCR o
almacenarse a –20°C para realizar pruebas en una fecha posterior.
•
Preparación de los reactivos
La mezcla de reacción para la PCR en tiempo real (Platinum Quantitative PCR SuperMix-UDG, u otra
mezcla de reacción) se proporciona normalmente como 2 × concentración lista para su uso. Deben seguirse
las instrucciones del fabricante para la aplicación y el almacenaje.
Las soluciones base de trabajo para los cebadores se preparan con agua libre de nucleasa a una
concentración de 4,5 µM y 3 µM, respectivamente. La solución base de los cebadores y la sonda se
guardan a –20°C y la solución con la sonda debe guardarse en la oscuridad. Se pueden preparar alícuotas
de un solo uso para limitar la congelación/descongelación de los cebadores y las sondas y ampliar su fecha
de caducidad.
1
2
3
6
•
Procedimiento de la prueba de la PCR en tiempo real
i)
Secuencias de cebadores y sondas
Las fuentes de contaminación pueden ser el transporte de productos procedentes de muestras positivas o, con mayor
frecuencia, de la reacción cruzada por productos de la PCR procedentes de experimentos anteriores. Las muestras y los
reactivos deberían manejarse en zonas separadas y con equipos diferentes para la preparación de las muestras y los
reactivos y para la amplificación/detección.
Es importante que el sodio con Chelex 100 se distribuya por igual en la solución durante el pipeteado puesto que el sodio
con Chelex 100 no es soluble. Esto puede conseguirse poniendo el recipiente con la solución de Chelex-100 en un
agitador magnético mientras se pipetea.
Algunas muestras de ADN pueden volverse borrosas y ocasionalmente puede formarse una fina membrana blanca
después de la congelación y la descongelación. No parece que esto influya en la realización de la PCR. No es necesario
calentar o volver a centrifugar las muestras.
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Capítulo 2.4.13. — Rinotraqueitis infecciosa bovina /vulvovaginitis pustular infecciosa
La selección de los cebadores y la sonda aparece esbozada en Abril et al. (2004) y se describe a
continuación.
Cebador gB-F: 5’-TGT-GGA-CCT-AAA-CCT-CAC-GGT-3’ (posición 57499–57519 GenBank®, con
número de acceso AJ004801)
Cebador gB-R: 5’-GTA-GTC-GAG-CAG-ACC-CGT-GTC-3’ (posición 57595–57575 GenBank®, con
múmero de acceso AJ004801)
Sonda TaqMan: 5’-FAM-AGG-ACC-GCG-AGT-TCT-TGC-CGC-TAMRA-3’ (posición 57525–57545
GenBank®, con número de acceso AJ004801)
ii)
Preparación de las mezclas de reacción
Se preparan las mezclas de reacción para la PCR en una sala limpia del laboratorio. Se mezclan todos
los reactivos excepto las muestras de la prueba antes de distribuirlos en cada tubo de reacción
individual. Para cada prueba de la PCR deben incluirse los controles adecuados. Como mínimo, deben
incluirse un control NTC (solo reactivo) controles negativos adecuados, i.e. 1 por cada 10 muestras de
prueba, y dos controles positivos (uno fuerte y otro débil). Cada muestra y control de prueba se
ensayan por duplicado. Las amplificaciones de la PCR se realizan en un volumen de 25 µl.
a)
Se añaden mezclas de reactivos para la PCR en una sala limpia (en la que no deben manipularse
cultivos víricos, extractos de ADN ni productos de amplificación)
2 × Platinum Quantitative PCR SuperMix-UDG
ROX reference dye (opcional)
Cebador directo (gB-F, 4.5 µM)
Cebador inverso (gB-R, 4.5 µM)
Sonda (3 µM)
Agua libre de nucleasa
b)
iii)
12,5 µl
0,5 µl
1 µl
1 µl
1 µl
4 µl
Se añaden 5 µl de ADN molde a la mezcla de reactivos para PCR a un volumen final de 25 µl. Se
preparan muestras de ADN y se añaden en una sala diferente.
Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (TaqMan)
Se colocan los tubos para PCR en el sistema de detección por PCR en tiempo real en una sala
diferente destinada a la PCR.
Se programa el sistema de detección por PCR para la prueba de la siguiente manera:
Parámetro4 de reacción por la PCR
iv)
Un ciclo:
Mantener a 50°C
2 minutos
Un ciclo:
Mantener a 95°C
2 minutos5
45 ciclos
Mantener a 95°C
15 segundos
Mantener a 60°C
45 segundos
Análisis de los datos de la PCR en tiempo real
Normalmente se fija el nivel de corte de acuerdo con las instrucciones del fabricante para el soporte
lógico seleccionado que se utilice para el análisis. Como alternativa, las muestras de semen en los
aislamientos víricos negativos procedentes de animales seronegativos pueden realizarse de forma
exhaustiva (ej. hasta en 60 ciclos de amplificación) para determinar la reacción de fondo asociada con
el sistema de detección utilizado.
•
Interpretación de los resultados
•
Controles de las pruebas
En cada prueba de PCR, deben incluirse los controles positivos y negativos así como los reactivos control.
Como control negativo, puede utilizarse el semen negativo procedente de aislamientos víricos negativos de
toros seronegativos. Como control positivo, es preferible utilizar el semen positivo de toros infectados de
forma natural. No obstante, puede resultar difícil de obtener. Como alternativa, los controles positivos
pueden derivarse de semen al que se añaden cantidades conocidas de virus BoHV-1
4
5
Estos parámetros de la PCR se basan en los más adecuados para RotorGene 3000, Corbett Research Ltd, Australia, y
pueden variar según las diferentes plataformas de la PCR.
Los sistemas de Taq polimerasa de la PCR de diferentes proveedores comerciales un tiempo de desnaturalización inicial
prolongada (95°C) de hasta 10 minutos. Se recomienda seguir las instrucciones del fabricante.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
7
Capítulo 2.4.13. — Rinotraqueitis infecciosa bovina /vulvovaginitis pustular infecciosa
•
Resultados de la prueba
Resultado positivo: Cualquier muestra que tenga un valor de corte para los ciclos (Ct) igual o menor de
45 se considera positiva. El control positivo debe tener un valor Ct dentro de un rango aceptable (± 3 valores
de Ct) como se haya establecido previamente mediante pruebas de repetibilidad.
Resultado negativo: Cualquier muestra que no tenga un valor Ct se considera negativa. El control negativo y
el control NTC no deben tener valores Ct.
f)
La diferenciación de subtipos de herpesvirus 1 bovino y de los virus relacionados con el
herpesvirus 1 bovino
El subtipo 1 de BoHV-1 y el subtipo 2b pueden diferenciarse (31, 48) utilizando los ensayos de MAb e
inmunofluorescencia, radioinmunoprecipitación, inmunoperoxidasa o inmunotransferencia. El análisis de
endonucleasas de restricción HindIII posibilita la diferenciación entre todos los subtipos 1, 2a y 2b de BoHV1. Esta diferenciación se basa en el peso molecular de tres fragmentos de ADN relevantes (I, K y L) (25). El
análisis de endonucleasas de restricción incluye la extracción del ADN de los viriones o de las células
infectadas, la digestión del ADN aislado por las endonucleasas de restricción, y la separación de los
fragmentos resultantes mediante la electroforesis en geles de agarosa. Las mencionadas técnicas tienen un
valor diagnóstico limitado, pero pueden utilizarse en estudios epidemiológicos.
Cuando es necesaria la diferenciación entre los alfaherpesvirus relacionados antigénica y genéticamente
(BoHV-1 y BoHV-5), el herpesvirus caprino (CpHV-1) y el herpesvirus 1 de los cérvidos (CvHV-1 y CvHV-2),
se dispone de métodos perfeccionados en los que se utilizan anticuerpos monoclonales (17).
g)
Interpretación de los resultados
El aislamiento del BoHV-1 en un animal no significa necesariamente que el virus sea la causa del brote de
la enfermedad. Por ejemplo, puede tratarse de un virus latente que se haya reactivado debido a condiciones
de estrés. Se debe hacer un diagnóstico de laboratorio confirmativo con un grupo de animales, y debe estar
acompañada de seroconversión de negativos a positivos o de un aumento en el título de anticuerpos contra
BoHV-1 de cuatro veces o más. El ganado del que se recogen los frotis nasales se sangra dos veces, con
2–3 semanas de diferencia. Estas muestras de pares de sueros se examinan juntas en una prueba
serológica para la presencia de anticuerpos específicos (véase ka sección B.2).
2.
Pruebas serológicas
Las pruebas serológicas se pueden utilizar para diferentes fines:
i)
Para diagnosticar una infección aguda: se examinan en una prueba muestras de suero de las fases agudas
y de convalecencia de la infección en los mismos animales. Una seroconversión de negativos a positivos o
un aumento de cuatro veces o más en el título de anticuerpos se considera que es indicativo de la infección.
ii)
Para demostrar la ausencia de infección, por ejemplo, con relación al mercado internacional.
iii)
Para determinar la prevalencia de la infección en los estudios seroepidemiológicos.
iv)
Para apoyar programas de erradicación y el control subsiguiente.
v)
Para fines de investigación, por ejemplo, la evaluación de la respuesta de anticuerpos después de la
vacunación y de una infección de desafío.
Para detectar los anticuerpos contra el BoHV-1 en el suero, normalmente se utilizan pruebas de neutralización
vírica (NV) (4) y varios ELISA (19). Una prueba serológica alternativa es la inmunofluorescencia indirecta (33).
Como la latencia del virus es una secuela normal de la infección por BoHV-1, la identificación de los animales
serológicamente positivos supone un indicador útil y fiable del estado infectivo. Cualquier animal con anticuerpos
contra el virus se considera portador y excretor potencial intermitente del virus. Las únicas excepciones a esto
son los terneros jóvenes que han adquirido de modo pasivo los anticuerpos por el calostro de sus madres y el
ganado no infectado, vacunado con vacunas inactivadas.
En general, las pruebas serológicas para el BoHV-1 pueden dividirse en convencionales y marcadoras. La única
prueba serológica marcadora de la que se dispone en la actualidad es el ELISA de bloqueo de anticuerpos antigE de BoHV-1 (40). Para la serología convencional, se utilizan la prueba de neutralización vírica, el ELISA
bloqueador de anticuerpos frente al BoHV-1 y los ELISA indirectos.
8
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
Capítulo 2.4.13. — Rinotraqueitis infecciosa bovina /vulvovaginitis pustular infecciosa
Los métodos ELISA, incluyendo el gE-ELISA, se utilizan cada vez más para detectar anticuerpos en muestras de
leche entera (45), pero presentan algunas limitaciones. En los ensayos con leche entera, una prueba específica
para el gB positiva indica que la infección se ha extendido por el rebaño (13). Con un ELISA de bloqueo de gE, la
leche entera da una reacción positiva cuando está infectado más del 10–15% del rebaño (46). Por consiguiente,
no es posible declarar que un grupo de animales o una población esté libre de la infección por BoHV-1
basándose en pruebas con leche individual o colectiva, y una prueba de leche negativa debería ir seguida de un
análisis de las muestras individuales de suero de todo el ganado de la explotación. A efectos de un control
general, las pruebas en los tanques de leche entera pueden proporcionar una estimación de la prevalencia del
BoHV-1 en un rebaño, un área o un país (27). Estas deberían suplementarse con pruebas de suero (individual o
colectivo) de explotaciones no lecheras.
En un amplio estudio llevado a cabo recientemente, se evaluaron las pruebas para la detección de anticuerpos
realizadas de forma rutinaria por los laboratorios nacionales de referencia de Europa (18). En el estudio
participaron 12 países europeos. Se enviaron por duplicado y debidamente codificadas cincuenta y tres muestras
de suero procedentes de varios países a los laboratorios participantes. Las muestras de suero incluían los tres
sueros de referencia europeos EU1 (positivo a anticuerpos), EU2 (positivos débiles a anticuerpos y definidos
como muestra dudosa) y EU3 (negativo a anticuerpos) (30). Se llegó a la conclusión de que la prueba de
neutralización vírica y los ELISA específicos para gB son las pruebas más sensibles para la detección de
anticuerpos en el suero. Por el contrario, se encontró que los ELISA indirectos eran los más sensibles para la
detección de anticuerpos en la leche. Más aún, se observó que los ELISA de origen comercial ofrecían mejores
prestaciones que los ELISA artesanales.
Recientemente, se han desarrollado nuevos ELISA que son muy sensibles y específicos. Los resultados de estos
ELISA son comparables con los obtenidos mediante los ELISA de bloqueo del gB o la prueba de neutralización
vírica (3).
a)
Neutralización del virus (prueba prescrita para el comercio internacional)
Las pruebas de NV se llevan a cabo con varias modificaciones. Las pruebas varían respecto de la cepa de
virus utilizada en el protocolo de la prueba, la dilución inicial de suero, el período de incubación de la mezcla
virus/suero (1–24 horas), el tipo de células utilizadas, el día de la lectura final, y la lectura de punto final
(50% frente a 100%) (29). De estas variables, el período de incubación de la mezcla virus/suero posee el
efecto más importante sobre el título de anticuerpos. Un período de incubación de 24 horas puede detectar
títulos hasta 16 veces superiores a los obtenidos tras un período de incubación de 1 hora (4), y se
recomienda cuando se requiere la máxima sensibilidad (por ejemplo, a efectos del mercado internacional).
En la prueba de NV resulta adecuado utilizar varias células bovinas o líneas celulares, incluyendo células
secundarias de riñón o de testículo de bovino, estirpes celulares de pulmón de bovino o de células de la
tráquea, o la línea celular establecida de Madin–Darby de riñón bovino.
A continuación se indica un protocolo adecuado para una prueba de NV.
i)
Se inactivan los sueros, incluidos los sueros control estándar, durante 30 minutos en un baño de agua
a 56°C.
ii)
Se preparan diluciones dobles de los sueros de prueba en un medio de cultivo celular. Se comienza
con el suero no diluido y se continúa horizontalmente hasta la dilución 1/1024 en una placa de
microtitulación de grado de cultivo celular, con 96 pocillos de fondo plano. Se utilizan por lo menos dos
pocillos por dilución y 50 µl por pocillo. En la prueba también se incluyen diluciones de un suero control
positivo, de un positivo débil y de un control negativo. Se utiliza un pocillo adicional con suero sin diluir
como control de la toxicidad de los sueros.
iii)
Se añaden a cada pocillo 50 µl del stock del BoHV-1 diluido en un medio de cultivo de modo que
suponga 100–200 DICT50 por pocillo. En los pocillos de control de la toxicidad, se añaden 50 µl del
medio de cultivo en lugar de virus. Se añaden 100 µl del medio de cultivo a diez pocillos vacíos para el
control de las células.
iv)
Se hacen por lo menos cuatro diluciones decimales del stock residual de virus (re-titulación) en un
medio de cultivo, 50 µl por pocillo y al menos cuatro pocillos por cada dilución.
v)
Se incuban las placas durante 24 horas a 37°C.
vi)
Se añaden 100 µl por pocillo de la suspensión celular a razón de 3 × 104 células por pocillo.
vii)
Se incuban las placas durante 3–5 días a 37°C.
viii) Se leen al microscopio las placas para el ECP. Se valida la prueba comprobando la re-titulación del
virus (que debería dar un valor de 100 DICT50, con una variación permisible de 30–300 DICT50), los
sueros control y los pocillos de control de células. El suero control positivo debería dar un título de ±
1 dilución doble (± 0.3 unidades logarítmicas decimales) respecto a su valor. El suero positivo débil
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
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Capítulo 2.4.13. — Rinotraqueitis infecciosa bovina /vulvovaginitis pustular infecciosa
debería ser positivo. El suero negativo no debería producir la neutralización cuando se prueba sin diluir
(equivalente a una dilución final de 1/2 en la fase de neutralización). En los pocillos de control de
células, la monocapa debería estar intacta.
ix)
b)
Los resultados de la prueba sobre el suero se expresan como el inverso de la dilución del suero que
neutraliza el 50% de los pocillos. Si en el 50% de los pocillos con suero no diluido se neutralizó el
virus, el título (de la dilución inicial) se considera 1 (1/2 utilizando la dilución final convencional). Si
todos los pocillos con suero no diluido y el 50% de los pocillos con suero diluido a 1/2 mostraran
neutralización del virus, el título (de la dilución inicial) sería 2 (dilución final 1/4). Para resultados
cualitativos, cualquier neutralización de título 1 o superior (dilución inicial convencional) se considera
positiva. Si se observa citotoxicidad en los pocillos de control de la toxicidad del suero, la muestra se
describe como tóxica (sin resultado), a menos que se observe una neutralización del virus sin
citotoxicidad a diluciones más altas y se pueda establecer un título sin ambigüedad. Cuando existe
citotoxicidad con un suero del que resulta crítico obtener un resultado, el cambiar el medio en los
pocillos de las diluciones más bajas 16–24 horas después de añadir las células puede eliminar el
efecto citotóxico con muchos sueros problema.
Enzimoinmunoensayo (una prueba prescrita para el comercio internacional)
Los métodos de ELISA para detectar anticuerpos contra el BoHV-1 parecen estar reemplazando
gradualmente a las pruebas de NV. No se ha establecido un procedimiento ELISA estándar. Hay
disponibles en el mercado varios tipos de ELISA, incluyendo ELISA indirectos y de bloqueo. Existen
diversas preparaciones comerciales ELISA, algunas de las cuales son también adecuadas para detectar
anticuerpos en la leche (18). Por razones de estandarización en un país o estado, sería deseable comparar
la calidad de las preparaciones comerciales y realizar pruebas de lotes para su comercialización respecto a
criterios definidos previamente en un laboratorio nacional de referencia, antes de su uso en otros
laboratorios del país.
Existen ciertas variaciones en los procedimientos para el ELISA. Los más comunes son: las preparaciones
de antígenos y los recubrimientos, la dilución de la muestra de ensayo, el período de incubación del
antígeno y la muestra de ensayo, y la solución de substrato/cromógeno. Antes de su uso rutinario, un ELISA
debería validarse respecto a la sensibilidad, especificidad y reproducibilidad (véase el capítulo 1.1.4). Con
este fin, se debería probar un juego de sueros bien definidos (por ejemplo, mediante la prueba de NV) que
fueran muy positivos, débilmente positivos y negativos.

Enzimoinmunoensayo indirecto
El principio del ELISA indirecto se basa en la unión de los anticuerpos específicos para el BoHV-1 presentes
en la muestra de prueba con el antígeno del BoHV-1 inmovilizado. Los anticuerpos unidos se detectan
mediante el uso de antisuero para la inmunoglobulina anti-bovina macada con enzimas. La presencia de
anticuerpos en la muestra de prueba provocará el desarrollo del color después de añadir la solución de
cromógeno/substrato.

Enzimoinmunoensayo de bloqueo
El principio del ELISA de bloqueo o competitivo se basa en bloquear la unión del antígeno a un antisuero
contra el BoHV-1 o a un MAb anti-BoHV-1 marcado con un enzima, mediante los anticuerpos presentes en
la muestra de prueba. La presencia de anticuerpos en la muestra de prueba bloqueará la unión, originando
un descenso en el desarrollo del color después de añadir la solución de cromógeno/substrato. A
continuación se ofrece un ejemplo de ELISA de bloqueo para la gB.
10
i)
Se prepara el antígeno haciendo crecer el BoHV-1 en cultivos celulares. Cuando se observa que se ha
desarrollado el ECP, se congela el medio y las células a –20°C. Después de descongelar, la lisis
celular resultante se centrifuga durante 4 horas a 8.500 g. El precipitado que contiene el virus se
resuspende en un pequeño volumen de tampón salino fosfatado (PBS), se enfría con hielo, y se
desintegra con ultrasonidos. Después se centrifuga la preparación de antígeno durante 10 minutos a
800 g y, si es necesario, se inactiva añadiendo detergente (concentración final de 0,5 % Nonidet P 40).
La preparación de antígeno se utiliza a una dilución apropiada para recubrir las placas de
microtitulación. En la literatura publicada sobre el tema se pueden encontrar muchos métodos
alternativos para la producción de antígeno.
ii)
Se recubren con antígeno las placas de microtitulación añadiendo 100 µl de antígeno diluido (en
0,05 M de tampón carbonato, pH 9,6) cada pocillo de la microplaca. Se sellan las placas, se incuba a
4°C toda la noche y se guarda a –20°C.
iii)
Antes de realizar la prueba, se lavan las placas con 0,05% de Tween 80. Se añaden 100 µl de suero
negativo (suero de ternero fetal, FCS), 100 µl de cada una de las muestras de prueba y 100 µl de
sueros control positivo, débilmente positivo, y negativo. Normalmente, las muestras de suero se
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
Capítulo 2.4.13. — Rinotraqueitis infecciosa bovina /vulvovaginitis pustular infecciosa
ensayan sin diluir. Se agita, se sellan las placas y se incuban toda la noche a 37°C. Con algunos
ELISA, es necesario calentar los sueros durante 30 minutos a 56°C antes de la prueba a fin de evitar
respuestas inespecíficas débiles.
iv)
Se lavan las placas cuidadosamente y se añaden 100 µl de anticuerpo monoclonal contra el gB de
BoHV-1, conjugado con peroxidasa de rábano a una dilución predeterminada y se incuban de nuevo
durante 1 hora a 37°C. Debe seleccionarse cuidadosamente el anticuerpo monoclonal respecto a su
especificidad para la gB de BoVH-1
v)
Se lavan las placas y se añade una solución recién preparada de substrato/cromógeno (por ejemplo,
tampón 0,05 M de ácido cítrico, pH 4,5, que contenga 2, 2´-azino-bis-[3-etilbenzotiazolina]-6 ácido
sulfónico [ABTS; 0,5 mg/ml] y una solución al 3% de H2O2 recién añadido [5 µl/ml], y se incuba durante
el tiempo adecuado (una o dos horas a temperatura ambiente).
vi)
Se mide la absorbancia de las placas en un fotómetro de microcapas a 405 nm.
vii)
Se calcula el porcentaje de bloqueo para cada muestra de ensayo [(ODFCS – ODmuestra de
prueba)/ODFCS × 100%]
viii) Se considera positiva una muestra de ensayo si el valor de la absorbancia es, por ejemplo, el 50% o
superior. La prueba es válida si los sueros de control positivo y débilmente positivo son positivos y si el
suero control negativo es negativo. Los límites aceptables para los valores control y de corte deben
determinarse para el ensayo individual.
c)
Estandarización
En cada prueba serológica se deberían incluir controles adecuados de suero muy positivo, de suero
débilmente positivo, y de suero negativo. En Europa, un grupo de científicos encabezado por el grupo de
veterinarios de inseminación artificial de la Unión Europea (EU) ha acordado utilizar un suero muy positivo
(EU1), uno débilmente positivo (EU2) y otro negativo (EU3) para la estandarización de las pruebas sobre el
BoHV-1 en los laboratorios que examinan rutinariamente muestras de los centros de inseminación artificial
(30). Estos sueros se han adoptado como estándares internacionales de la OIE para pruebas con el BoHV1 y están disponibles en cantidades limitadas en los laboratorios de referencia de la OIE para RBI/VPI6. Las
pruebas ordenadas con fines de comercialización internacional (NV o ELISA) deben ser capaces de
registrar como positivos tanto los estándares positivos fuertes como los débiles (o los estándares nacionales
secundarios de potencia equivalente). Debido a la limitada disponibilidad de los sueros estándar
internacionales, es preciso preparar un nuevo y amplio panel de muestras de suero liofilizado de referencia
(y de leche) tomadas de animales infectados y de animales vacunados. Este panel debe utilizarse para
validar las nuevas pruebas que se vayan elaborando y para armonizar las pruebas de los distintos
laboratorios.
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y EL MATERIAL DE DIAGNÓSTICO
En la actualidad se dispone de varias vacunas con BoHV-1 atenuado e inactivado. Las vacunas contienen cepas
deL virus que por lo general han crecido durante múltiples pases en cultivo celular. Algunas de las cepas de virus
vacunales tienen un fenotipo sensible a la temperatura, es decir, no se multiplican a 39°C o a temperaturas
superiores. Las vacunas atenuadas se administran por vía intranasal o intramuscular. Las vacunas inactivadas
contienen altos niveles de virus inactivados o porciones de las partículas víricas (glicoproteínas) suplementadas
con un adyuvante para estimular una respuesta inmune adecuada. Las vacunas inactivadas se administran por
vía intramuscular o subcutánea.
En varios países existen vacunas marcadoras o DIVA (diferenciación entre animales infectados y vacunados).
Estas vacunas marcadoras, atenuadas o inactivadas, se basan en mutantes deleccionados o en una subunidad
del virión, por ejemplo, la glicoproteína D. El uso de tales vacunas marcadoras con pruebas diagnósticas
paralelas permite distinguir entre el ganado infectado y el ganado vacunado suministrando así las bases para
nuevos programas de erradicación del BoHV-1. Los programas de vacunación intensiva pueden reducir la
prevalencia de los animales infectados (5, 22), que puede ser analizada por pruebas diagnósticas en paralelo. En
situaciones donde resulte económicamente justificable, los animales infectados restantes podrían ser eliminados
si fuera necesario, lo que daría como resultado una región libre de BoHV-1. En algunos países, el control y
erradicación de la enfermedad comenzó con el inicio de los años 80. Se han utilizado diferentes estrategias
debido a las diferencias existentes con respecto a la prevalencia de los rebaños, las prácticas de cría y los planes
6
Se pueden obtener del Central Institute for Animal Disease Control, Division of Virology, P.O. Box 2004, 8203 AA
Lelystad, The Netherlands, y de Anses Lyon, Laboratoire de pathologie bovine, 31 avenue Tony Garnier, BP 7033, 69342
Lyon Cedex 07, Francia.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
11
Capítulo 2.4.13. — Rinotraqueitis infecciosa bovina /vulvovaginitis pustular infecciosa
de erradicación de la enfermedad. Durante este tiempo, solo se han comercializado y utilizado vacunas DIVA,
con gE suprimido, para esos programas de control y erradicación en la Unión Europea.
Las directrices para la producción de vacunas veterinarias se presentan en el capítulo 1.1.8. Principios de
producción de vacunas veterinarias. Las normas dadas aquí y en la capítulo 1.1.8. son de tipo general y se
pueden complementar con otros requisitos nacionales y regionales.
1.
Control de inóculos
a)
Características del inóculo
La vacuna se prepara utilizando un sistema de lotes de inóculo. Se debe documentar el origen, la historia de
los pases y las condiciones de mantenimiento del inóculo primario de virus (MSV). En el MSV se debe
realizar una prueba de identidad del virus. El lote de inóculo contiene cepas de BoHV-1 que se han
atenuado para originar una cepa viva vacunal. Las cepas se pueden atenuar por pases múltiples en cultivo
celular, por adaptación del virus a crecer a bajas temperaturas (mutantes sensibles a la temperatura), o
mediante la ingeniería genética, por ejemplo, seleccionando uno o más genes del virus (ej., la glicoproteína
del BoHV-1) que no sean esenciales para su replicación. Debería haber algún medio para diferenciar entre
el virus vivo vacunal y el virus natural (por ejemplo, mediante modelos de crecimiento específico
dependientes de la temperatura, o por el análisis del polimorfismo en fragmentos de restricción). Las cepas
utilizadas para la preparación de las vacunas inactivadas no necesitan ser atenuadas. El lote de inóculo
debe carecer de contaminantes.
b)
Método de cultivo
Las células utilizadas para la producción de vacunas se preparan también mediante un sistema de lotes de
inóculo. El virus debe cultivarse en líneas celulares establecidas que se haya comprobado que resultan
adecuadas para la producción de vacunas, por ejemplo, la línea celular de Madin–Darby de riñón bovino. Se
debe conocer la historia de la línea celular. Debe estar libre de agentes indeseables y puede probarse para
la capacidad oncogénica.
c)
Validación como vacuna
Cualquiera que sea el método de preparación del lote de inóculo del virus vacunal, el lote de virus de
siembra destinado para su incorporación a una vacuna viva debe ser eficaz, seguro y puro.
i)
Eficacia
La eficacia se debe demostrar en un experimento de desafío de la vacunación en condiciones de
laboratorio. Se presentan varios ejemplos de normas en una monografía de la Farmacopea Europea
(12). En resumen, se administra la vacuna a cinco terneros seronegativos para el BoHV-1, de 2–
3 meses de edad. Se mantienen dos terneros como control. Todos los terneros se inoculan
intranasalmente 3 semanas después con una cepa virulenta de BoHV-1 que origina los síntomas
típicos de infección por BoHV-1. Los terneros vacunados no deben mostrar síntomas o solamente
síntomas leves. El título máximo de virus en la mucosa nasal de los terneros vacunados debe ser por
lo menos 100 veces inferior al de los terneros control. El período de excreción del virus debe ser al
menos 3 días más corto en los terneros vacunados que en los terneros control.
ii)
Inocuidad
Una cantidad de virus equivalente a diez dosis de vacuna debería (a) no inducir reacciones localizadas
o sistémicas significativas en los terneros jóvenes, (b) no causar infección fetal o aborto, y (c) no
revertir a la forma virulenta durante cinco pases seriados en terneros. Para una vacuna inactivada, se
suele administrar generalmente una dosis doble. La prueba de reversión a la virulencia no es aplicable
a las vacunas inactivadas.
iii)
Pureza
El lote de inóculo se prueba para comprobar la ausencia de virus extraños y de contaminación con
bacterias, hongos y micoplasmas. En las vacunas con BoHV-1 se deben excluir específicamente los
siguientes virus indeseables: adenovirus, virus de Akabane, coronavirus bovino, herpesvirus bovino
tipos 2, 4 y 5, parvovirus bovino, virus respiratorio sincitial de los bóvidos, virus de la diarrea vírica,
rotavirus bovino, virus vaccinia, y los virus de la enfermedad de Aujeszky, lengua azul, fiebre efímera
bovina, leucemia bovina, papiloma bovino, estomatitis popular bovina, viruela vacuna, fiebre aftosa o
glosopeda, enfermedad nodular cutánea, fiebre catarral maligna, parainfluenza 3, rabia, peste bovina,
y estomatitis vesicular. Como el virus de la diarrea vírica bovina (con ECP y/o sin ECP) se ha
encontrado con frecuencia como contaminante de las vacunas, se debe tener especial cuidado para
asegurar que está ausente.
12
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
Capítulo 2.4.13. — Rinotraqueitis infecciosa bovina /vulvovaginitis pustular infecciosa
2.
Método de fabricación
Todas las substancias utilizadas en la producción de las vacunas deben estar libres de contaminación. Se deben
utilizar células que no tengan más de 20 pases a partir del inóculo inicial. El virus de inóculo no debería de tener
más de 5 pases a partir del MSV. Las cepas de virus vacunales obtenidas por ingeniería genética se tratan del
mismo modo que las cepas atenuadas por métodos convencionales. Cuando se crecen suficientes células, se
produce la infección de la línea celular con el virus de la vacuna. La adición de antibióticos se reserva, por lo
general, al medio líquido de cultivo. El sobrenadante se recoge cuando la producción de virus (antígeno) alcanza
el máximo. Para las vacunas vivas, el sobrenadante se clarifica, se mezcla con un estabilizador, se liofiliza y se
envasa. Para la producción de vacunas clásicas inactivadas, el sobrenadante se homogeniza antes de añadir el
agente inactivante para asegurar una inactivación adecuada. Después del proceso de inactivación se lleva a
cabo una prueba para comprobar la inactivación completa del virus. La prueba consiste en efectuar al menos dos
pases en células. La suspensión de los virus inactivados se mezcla después con un adyuvante y se envasa. La
producción de vacunas debe seguir las directrices de Buenas Prácticas de Producción (GMP).
3.
Control interno
El inóculo de células de trabajo y el inóculo de virus de trabajo deben estar libres de contaminación. Las células
deben tener su morfología normal antes de inocular el virus. Se comprueban para ECP durante el cultivo. Las
células control no inoculadas deben mantener su morfología hasta el tiempo de la recogida del material. Se
realiza una titulación del virus en el sobrenadante recogido. Durante la producción de las vacunas inactivadas, se
realizan pruebas que aseguran la inactivación. El material final debe ser probado para la ausencia de
contaminantes.
4.
Control de lotes
Normalmente se realizan las siguientes pruebas en cada lote. Se pueden encontrar ejemplos de normas para
realizar el control de los lotes en las directrices de la EU, la Farmacopea Europea y el Código de Regulaciones
Federales del Departamento de Agricultura de los EE.UU.
a)
Esterilidad
No deben estar presentes bacterias, hongos, micoplasmas ni virus ajenos. Las pruebas de esterilidad y de
ausencia de contaminación en los materiales biológicos se describen en el capítulo 1.1.9.
b)
Inocuidad
Una dosis doble de vacuna, para el caso de las vacunas inactivadas, y una dosis diez veces superior a la
normal, para el caso de las vacunas vivas, no debe producir efectos adversos en terneros jóvenes que sean
seronegativos para el BoHV-1.
c)
Potencia
Es suficiente probar un lote representativo para la eficacia, como se describe en la sección C.1.c.i. Para las
vacunas vivas, se debe determinar el título de virus de cada lote y no debe ser superior a 1/10 de la dosis a
la que la vacuna es segura ni inferior al título mínimo de distribución. Para las vacunas inactivadas, la
potencia se ensaya utilizando otro método validado, por ejemplo, la determinación de la eficacia en los
terneros.
d)
Duración de la inmunidad
Es suficiente probar este parámetro en el lote de inóculo del virus de la vacuna. Una vacuna eficaz con
BoHV-1 debería inducir una inmunidad protectora por lo menos durante 1 año, aunque muchas vacunas
existentes no han sido probadas al respecto.
e)
Estabilidad
Para las vacunas vivas, se deben realizar titulaciones de virus pasados 3 meses desde la fecha de
caducidad que se indica. Además, se realizan pruebas para determinar el contenido en humedad,
concentración de conservantes y pH. Para las vacunas inactivadas, también se prueba la viscosidad y la
estabilidad de la emulsión.
f)
Conservantes
Debe demostrarse la eficacia de los conservantes y comprobarse su concentración y persistencia durante el
período de validez. La concentración debe acomodarse a los límites de conservante establecidos.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
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Capítulo 2.4.13. — Rinotraqueitis infecciosa bovina /vulvovaginitis pustular infecciosa
g)
Precauciones (riesgos)
No se necesitan precauciones especiales. El BoHV1 no es patógeno para el hombre.
5.
Pruebas sobre el producto final
a)
Inocuidad
Cada producto debe ser seguro por lo menos en dos terneros susceptibles que reciban una dosis doble de
la vacuna (vacunas inactivadas) o diez veces superior (vacunas vivas).
b)
Potencia
Véase la sección C.4.c.
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*
* *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la rinotraqueítis bovina infecciosa/vulvovaginitis pustular
infecciosa (véase el cuadro en la parte 3 de este Manual de animales terresres o consúltese la lista actualizada
en la página web de la OIE: www.oie.int).
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
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