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XX Congreso Nacional de Ingeniería Bioquímica
IX Congreso Internacional de Ingeniería Bioquímica
XIV Jornadas Científicas de Biomedicina y Biotecnología
Molecular
Veracruz, México 16-18, Marzo 2016
Clave: TAM34LAR20151214
ESTUDIO DE LOS MECANISMOS DE RESISTENCIA METÁLICA EN LA
CEPA PSEUDOMONAS STUTZERI LRO
Zaida Zuleica Lara Chavero, María Isabel Neria González
DIRECCIÓN DE LOS AUTORES
Tecnológico de Estudios Superiores de Ecatepec, Av. Tecnológico S/N, Valle de Anáhuac,
Ecatepec de Morelos, México, 55210, México
CORREO ELECTRÓNICO
[email protected]
XX Congreso Nacional de Ingeniería Bioquímica
IX Congreso Internacional de Ingeniería Bioquímica
XIV Jornadas Científicas de Biomedicina y Biotecnología
Molecular
Veracruz, México 16-18, Marzo 2016
INTRODUCCIÓN
La liberación de metales al ambiente ha
provocado que los microorganismos,
especialmente las bacterias, desarrollen
mecanismos eficientes para resistir la
toxicidad de los metales, estos
mecanismos de destoxificación pueden
ayudar a explicar los mecanismos de
remoción de metales en áreas
contaminadas, o bien
pueden
desarrollarse biosensores para el control
ambiental y monitoreo de metales
pesados.
Los
principales
mecanismos
de
resistencia metálica estudiados en
bacterias son: componentes celulares
que capturan los iones metálicos
neutralizando su toxicidad; enzimas que
modifican el estado redox de los iones
metálicos convirtiéndolos en formas
menos tóxicas; y transportadores de
membrana que expulsan las especies
nocivas del citoplasma como las ATPasas
tipo P1B y sistemas quimiósmoticos
(Cervantes,
2000).
Los
genes
relacionados a estos mecanismos se
localizan en el cromosoma o plásmidos.
El gen cadA es inducido por cadmio y zinc
y el gen chrA por cromo, ambos son
ejemplos de genes relacionados con los
mecanismos de resistencia metálica.
En este trabajo se estudia a nivel
molecular el tipo de mecanismo de
resistencia metálica que sigue la cepa
LRO, ésta fue aislada de lodos residuales
de la mina Bolañitos, Guanajuato.
Además, el análisis filogenético basado
en el gen 16S rDNA mostró una relación
con Pseudomonas stutzeri con una
similitud del 99 %. En base a datos
reportados se sabe qué P. stutzeri tiene
resistencia al Cr, Hg, Cd, As, Pb, Cu, Ag y
Zn, entre otros. (Bennasar et. al, 2006)
OBJETIVOS
Estudiar los mecanismos de resistencia
metálica en la cepa Pseudomonas stutzeri
LRO mediante la detección de genes de
resistencia
metálica.
Además
de
determinar la concentración mínima
inhibitoria de la cepa LRO para el cromo,
cadmio y plomo.
MATERIALES Y MÉTODOS
Concentración mínima inhibitoria
La concentración mínima inhibitoria
(CMI) se determino a través del
crecimiento bacteriano en caldo nutritivo
a diferentes concentraciones de cada
metal (Cr6+, Cd2+ y Pb2+). Los cultivos
fueron incubados a 37 °C 150 rpm y se
observó el crecimiento a las 24 horas.
Genes de resistencia a metales pesados
El DNA genómico de la cepa LRO fue
extraído bajo un protocolo estándar, y
este fue utilizado como DNA molde para
la amplificación de los genes cadA, zntA y
chrA. Los iniciadores utilizados en este
trabajo
son:
zntA22F
(5’CCATCAGCGCGACGTCGGCGGT3’),
zntA22R
(5’TGATGACSATCGCCGYGAYC3’), cadAF
(5´TSRACCAGTCCCCGATCACC3’), cadAR
(5´GCRTCRTTGATGCCGTCRCC3’), chrAF
Mar del Norte No. 5, Col. San Álvaro Azcapotzalco C. P. 02090, México, D. F.
Tel. y Fax: 5623 3088 email: [email protected], [email protected]
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(5’GAGCGTTGCGAATGAAGAGTCG3’)
y
chrAR (5’GGGACTCGGTTTCATGCTTCC3’)
(Morón, 2015). La reacción de PCR fue
preparada bajo las recomendaciones de
manufactura de la DNA Taq polimerasa
(Gotaq DNA polymerase, PROMEGA,
USA). La reacción de PCR se realizó bajo
el
siguiente
programa:
una
desnaturalización inicial de 94°C por 5
min; 22 ciclos que incluyen una
desnaturalización a 94°C por 1 min, un
alineamiento a Tm de cada par de
iniciadores, y una extensión a 72°C por 1
min; y una extensión final de final a 72°C
por 5 minutos; mantener a 4°C.
RESULTADOS
Concentración mínima inhibitoria (CMI)
Se
observo
crecimiento
en
concentraciones de hasta 70 mg/L para
Cr6+ y 100 mg/L para Cd2+ y Pb2+ siendo
estas
la
concentración
mínima
inhibitoria.
Genes de resistencia metálica
Como se puede observar en la figura 1 se
obtuvieron los amplicones de 850, 1200 y
750 pb que corresponden a los genes
cadA, zntA y chrA, respectivamente, los
cuales coinciden con lo reportado por
Morón, 2015.
Figura 1: Detección de los genes de
resistencia metálica en la cepa P.
stutzeri LRO. En la imagen se observan
los amplificados obtenidos de cada
iniciador probado para los genes de
resistencia metálica chrA, cadA y zntA en
la cepa LRO.
DISCUSIÓN
Los resultados indican que la cepa tiene
una CMI de 70 mg/L para Cr6+ y 100 mg/L
para Cd2+ y Pb2+, lo cual nos habla de una
buena resistencia a metales pesados en
comparación con los reportados en
bibliografía de 1200 µg/mL en el caso de
cadmio (Ahmed et. al, 2013) y de 15 µM
para cromo (Bento et. al, 2005)
Los amplicones obtenidos para al gen
cadA y zntA indican que la resistencia
metálica podría deberse a la expulsión
del Cd2+, Zn2+ y Pb2+ vía translocación a
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nivel membrana celular (Simon y Le,
2005) ; y el amplicon correspondiente al
gen chrA involucra la síntesis de la
enzima thioredoxin reductasa reportada
en Pseudomonas aeruginosa PAO1H2O
(Nawarat et al. , 2012), que confiere
resistencia al cadmio, zinc, mercurio y
cromo, además se ha reportado que
puede reparar las proteínas dañadas por
metales pesados disminuyendo el estrés
oxidativo, y también reducir el U6+ y Cr6+.
(Ramírez et al., 2006)
resistance by Pseudomonas stutzeri,
Bull environ contam toxicol, No. 90, p.
323-328.
2. Bennasar Antoni, Bosch Rafael, Lalucat
Jorge,García Elena, Palleroni Norberto,
(2006):
Biology
of Pseudomonas
stutzeri, Microbiology and molecular
biology reviews, Vol. 70, No. 2,
p. 510–547 .
3. Bento Fatima, Camargo Flavio, Okekeb
Benedict, Frankenberger William,
(2005): Diversity of chromiumresistant bacteria isolated from soils
CONCLUSIONES
contaminated
with
dichromate,
Applied Soil Ecology, Vol. 29, p. 193–
Se encontró que la cepa LRO tiene un
202.
espectro mayor de resistencia a metales
4. Caballero F., Silva S., Cervantes Carlos,
pesados para cromo, cadmio y plomo
(2012): Distribución de los genes chrA
que en los encontrados para otras cepas
en bacterias de origen nosocomial.
de la misma especie.
FEMS Microbiology Letters, Vol, No.
327, p. 148-154.
Los amplicones obtenidos corresponden
5. Cervantes Carlos, (2000): Mecanismos
a los genes de resistencia metálica cadA,
de expulsión de metales tóxicos en
zntA y chrA por lo que podría suponerse
bacterias, Bol. Educ. Bioq. Vol, No. 19,
que los mecanismos de resistencia a
p. 24-31.
cadmio, zinc y plomo están relacionados
6. Morón Marcos, (2015): Identificación
a ATPasas y la resistencia a cromo a la
de genes de resistencia metálica en la
enzima thioredoxin reductasa.
bacteria
sulfato
reductora
Desulfovibrio alaskensis 6SR, Tesis de
La identificación de estos genes podrían
Maestría.
ayudar a entender en trabajos
7. Nawarat Somprasong, Thichakorn
posteriores los mecanismos de remoción
Jittawuttipoka, Jintana Duang-nkern,
de metales.
Adisak Romsang, Pimchai Chaiyen,
Herbert P. Schweizer, Paiboon
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Vattanaviboon, y Skorn Mongkolsuk,
(2012): Pseudomonas aeruginosa
1. Ahmed S F, Basu M, Deb S, (2013):
Thiol Peroxidase Protects against
Metal accumulation in cell wall: a
Hydrogen Peroxide Toxicity and
possible mechanism of cadmium
Displays Atypical Patterns of Gene
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Regulation, Journal of Bacteriology,
Vol. 194, No. 15, p. 3904 –3912.
8. Ramírez Martha , Campos Jesús,
Vargas Eréndira y Cervantes Carlos,
(2006): Mecanismos bacterianos de
tolerancia al cromo, Instituto de
Investigaciones
Químico-Biológicas,
UMSNH. Ciencia Nicolaita, No. 45.
9. Simon Silver y Le T. Phung, (2005): A
bacterial view of the periodic table:
genes and proteins for toxic inorganic
ions, J Ind Microbiol Biotechnol, Vol.
No.32, p. 587–605.
REFERENCIAS INFORMÁTICAS
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