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PREPARACIÓN DE EXTENDIDOS Y
TÉCNICAS DE TINCIÓN
PROGRAMA DE NUTRICIÓN Y DIETÉTICA
GUIA PRÁCTICA N°11
Versión 3
Código: IV.4.1.19.03.16
Proceso: Investigación – IV
Febrero de 2016
Una Institución Universitaria enfocada en el ser humano como eje central de calidad
Código: IV.4,1.19.03.16
PREPARACIÓN DE EXTENDIDOS Fecha: 19/02/2016
Y TÉCNICAS DE TINCIÓN
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1. OBJETIVO
 Adquirir destreza en la preparación de placas de extendidos de cultivos
bacterianos.
 Observar mediante el uso de diferentes coloraciones: la forma, el tamaño, y
composición de las bacterias.
2. ALCANCE
Esta guía prácticadeberá leerse y comprender su contenido para posteriormente
poder desarrollar a cabalidad el objetivo propuesto.
3. DEFINICION
La determinación de la morfología en la identificación de los microorganismos,
juega un papel fundamental como ayuda para su clasificación. A través de las
determinaciones morfológicas y una adecuada consulta bibliográfica científica, se
puede efectuar una aproximación a la identificación de los microorganismos. El
estudio microscópico de las bacterias se facilita notablemente al tratarlas con
colorante, debido a que en condiciones naturales son difíciles de observar. Los
colorantes son compuestos orgánicos que contienen radicales cromóforos (que
producen color) pueden ser ácidos, básicos o neutros.
Los colorantes ácidos, tiñen las partes básicas y los colorantes básicos tiñen las
partes ácidas. La coloración de las células parece deberse a una combinación de
fenómenos químicos y físicos como la capilaridad, absorción, osmosis,
intercambio de iones entre colorantes y sitios activos en la superficie o en el
interior de la célula. La coloración simple es el método que consiste en teñir,
utilizando un solo colorante ácido o básico, como por ejemplo: azul de metileno,
cristal violeta, fucsina o safranina. Estos colorantes se emplean para apreciar la
forma y el tamaño, pero no muestran detalles de la estructura interna.
La morfología de las bacterias se puede confirmar de dos maneras: 1)
observándolas sin teñir se puede evidenciar su movilidad u 2) observándolas
muertas teñidas con colorantes. Algunos colorantes diferenciales sirven para
observar la estructura interna de las células. Estos colorantes se utilizan en
tinciones como:


Coloración de Gram
Coloración de cápsula
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


Coloración de espora
Prueba de KOH
Prueba de motilidad
La coloración de Gram fue elaborada, por el danés Hans Gram en 1884. Esta
técnica permite distinguir entre diferentes bacterias que pueden mostrar una
morfología similar. Con este procedimiento no solo se hace visible la forma,
tamaño y otros detalles estructurales, sino que pueden agruparse en tipos Grampositivos y Gram-negativos por sus reacciones frente a los colorantes. La
diferencia en la reacción de coloración entre las positivas y negativas, se atribuye
a la diferencia en la composición química de su pared celular.
Las paredes de las células Gram negativas tienen un contenido lipídico más
elevado que las positivas, y aunque en ambas se forma un complejo cristal violetayodo, el alcohol extrae el lípido de las células Gram-negativas y aumenta la
permeabilidad celular. Esto da como resultado la pérdida del complejo cristal
violeta-yodo, y los microorganismos se colorean posteriormente de rojo con
safranina o fucsina. El colorante es retenido por las células Gram-positivas, en las
cuales la deshidratación por el alcohol ocasiona una disminución de la
permeabilidad, reteniendo el complejo cristal violeta-yodo tras la decoloración.
Al examen microscópico de un extendido coloreado por el método de Gram que
contenga una flora bacteriana mixta, se puede observar las características
diferenciales del método. Muchas bacterias conservan la combinación violeta-yodo
y se teñirá de purpura (Gram-positivas), otras se colorean de rojo por la safranina
o el colorante que se emplee en la contra-coloración (Gram-negativas).
Las características de la coloración de Gram pueden ser atípicas en cultivos muy
jóvenes o muy viejos. Las bacterias que poseen capsula no tienen la misma
afinidad por los colorantes que otros componentes de las células por eso exigen el
empleo de coloraciones especiales.
En la coloración de cápsula se colorea la célula y el interior, pero no la capsula, de
manera que la envoltura se aprecia por contraste, aplicando por ejemplo el método
de Anthony. Otros procedimientos producen un efecto colorante diferencial,
cuando la capsula admite un contra-colorante, o se utiliza el principio de coloración
negativa como el método de la tinta china.
La prueba de motilidad se presenta en algunas bacterias que presentan movilidad
debido a la presencia de flagelos. Este hecho puede ser fácilmente demostrable
en condiciones de laboratorio.
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4.CONDICIONES GENERALES
Se debe leer esta guía previamente al día de la práctica, diseñando un mapa
conceptual en el que presente las ideas más relevantes y los pasos a seguir
durante el desarrollo de la práctica. Igualmente, solo se podrá ingresar al
laboratorioportando la bata de laboratorio blanca, un dulceabrigo o toalla para
limpiar superficies de trabajo y libreta de apuntes, junto con materiales propios de
cada práctica.
5. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA
5.1 PROPOSITO
Adquirir la destreza necesaria en la preparación y montaje de extendidos
bacterianos y observar mediante el uso de diferentes coloraciones: la forma, el
tamaño y composición bacteriana.
5.2 PROCESO DE LA PRÁCTICA
Antes de empezar la práctica el docente dará una explicación previa al desarrollo
del laboratorio donde presentara los equipos y los reactivosque se utilizaran
durante la práctica, explicando que cuidados se deben tener y las normas de
seguridad para evitar cualquier accidente.
5.3 MATERIALES Y EQUIPO
Proporcionado a cada equipo por la institución:
 Asa de inoculación
 Mechero
 Goteros
 Lugol de Gram
 Alcohol-acetona (decolorante)
 Safranina (contra-tinción)
 Cultivo bacterianos
 Colorantes: azul de metileno, cristal violeta, safranina o tinta china
 Bandeja de coloración
 Agua destilada estéril
 Aceite de inmersión
 Papel lente
Cada grupo debe traer para su práctica:
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
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

Laminas porta-objetos
Cubreobjetos
Guantes de Látex
Bata de laboratorio (uso obligatorio)
Marcador sharpie
Libreta de apuntes
Cronometro
5.4PRÁCTICA
A. Preparación de extendidos
1. Esterilice el asa para bacterias, poniéndola verticalmente a la llama del mechero
hasta que se ponga de color rojo en toda su longitud.
2. Enfrié el asa introduciéndola en el borde del medio de cultivo.
3. En una lámina porta-objetos limpia, coloque con el asa una gota de agua estéril.
4. Tome con el asa de argolla suavemente una pequeña porción de colonias
bacterianas del medio de agar
5. Coloque la muestra sobre la gota de agua del porta-objetos, haga una extensión
delgada, con el fin de que las bacterias queden bien esparcidas. Nota: Sí usted
observa que lasuspensión no se extiende en la superficie de porta-objetos, sino
que se recoge en gotas, significa que el porta objetos esta engrasado y debería
repetir el proceso en uno completamente limpio.
6. Realice extendido con todos los cultivos de bacterias que se entregaron.
7. Deje que la preparación se seque al aire.
8. Fije la preparación pasándola dos veces sobre la llama del mechero, así las
bacterias quedan firmemente adheridas al porta-objetos.
Nota: cuando se hacen extendido a partir de medios líquidos (caldo), no es
necesario colocar la gota de agua.
B. Coloraciones Simples
1. Coloque las láminas porta-objeto en las que realizó los extendidos sobre una
bandeja de coloración.
2. Cubra totalmente los extendidos con los colorantes. Debe tener tres extendidos
de cada bacteria para aplicar a cada uno un colorante. Deje actuar los
colorantes así:
 Cristal violeta-----------------1 minuto
 Azul de metileno-------------5 minutos
 Safranina----------------------30 segundos
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3. Lave las placas con agua, escurra y deje secar a temperatura ambiente.
4. Coloque en el extremo de un porta-objetos una gota de tinta china, tome con el
asa una muestra de Klebsiellapneumoniae, mézclela suavemente con la gota.
Utilice un porta-objetos limpio para extender la gota y formaruna película
delgada. Deje secar.
5. Una vez estén secas las láminas, observe al microscopio en 10X, 40X y 100X.
Describa la forma, distribución y coloración. Realice esquemas de lo observado
o tome fotos.
C. Coloraciones diferenciales (Tinción de Gram)
1. Prepare un extendido fino de una colonia bacteriana y déjelo secar al aire.
2. Fije el material al porta-objetos, de modo que no sea arrastrado durante el
proceso de tinción, pasando el porta-objetos 3 o 4 veces sobre la llama del
mechero.
3. Coloque el preparado sobre un soporte de tinción y cubra la superficie con
solución de cristal-violeta durante 1 minuto.
4. Lave bien con agua destilada estéril.
5. Cubra el preparado con solución de yodo (lugol de Gram), durante 1
minuto.
6. Lave nuevamente con agua destilada estéril.
7. Sostener el porta-objetos entre el pulgar y el índice, y bañar la superficie
con unas gotas del colorante (alcohol-acetona) por 10 segundos.
8. Lave nuevamente con agua corriente y coloque el porta-objetos
nuevamente sobre el soporte, cubra la superficie con safranina durante un
minuto; lavar con agua corriente.
9. Examine el preparado al microscopio, las bacterias Gram-positivas se
observan de color violeta y las Gram-negativas rojo o rosadas.
PASO
Colorante básico
Mordiente
Decoloración
Contraste
COLORANTE/
TIEMPO
Cristal violeta
1 minuto
Lugol
1 minuto
Alcohol-acetona
10 segundos
Safranina
1 minuto
RESULTADOS
GRAM +
GRAM Se tiñe de violeta
Se tiñe de violeta
Permanece violeta
Permanece violeta
Siguen violeta
Se decoloran
Siguen violeta
Se decoloran
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Figura 1. Procedimiento tinción de Gram
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REPORTE DE PRÁCTICA
PRÁCTICA 2: PREPARACIÓN DE EXTENDIDOS Y TÉCNICAS DE TINCIÓN
PRESENTADO POR:
1
2
3
4
5
6
OBJETIVO:
Adquirir la destreza necesaria en la preparación y montaje de extendidos
bacterianos y observar mediante el uso de diferentes coloraciones: la forma, el
tamaño y composición bacteriana.
ACTIVIDAD:
1. Esquematice un montaje bacteriano Gram + y uno Gram-negativo, visualizado
en 100X.
2. Porque antes de colorear se debe fijar la muestra? En qué consiste la fijación?
3. Para que sirven las coloraciones simples?
4. Diferencie la tinción negativa de otras?
5. Los frotis de las bacterias capsuladas no se lavan con agua ni se calientan. Por
qué?
6. Como se correlaciona la presencia de capsula con la virulencia de una
bacteria? Describa un método por el cual se pueda obtener muestras de pared
celular para analizar su composición química?
7. Que son las formas L?
8. Clasifique las siguientes bacterias como Gram-positivas, Gram-negativas,
conos: Proteusvulgaris, Clostridiumtetani, Staphilococcusaureus, Salmonella,
Streptococcuspneumoniae, Bacilluscereus, Pseudomonasso, Bacillussubtilis.
9. Establezca las diferencias entre pared celular de una bacteria Gram-positiva y
una Gram-negativa.
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6. REVISIÓN Y ACTUALIZACIÓN
Esta Guía será actualizada por el Docente encargado de la práctica en el
laboratorio, revisado por la Dirección Técnica de Investigaciones y la Vicerrectoría
Administrativa, esta última como Representante de la Dirección para el SIG, y
aprobado por el Vicerrector Académico
Aprobación del Documento
Nombre
Elaboró
Responsable
Javier Andrés
Bustamante
Docente Microbiología
Olga Cecilia Suárez
Director Técnico de
Investigaciones
María Isabel Andrade
Representante de la
Dirección del SIG
Reviso
Aprobó
Firma
Fecha
19/02/2016
19/02/2016
Roger Micolta Truque Vicerrector Académico
19/02/2016
Control de los Cambios
Versió
n No.
Fecha de
Aprobación
1
30/01/2015
2
30/07/2015
Descripción de los Cambios
Justificación del cambio
Se actualiza la información registrada en el Reestructuración
del
numeral 6 Revisión y Actualización
organigrama institucional
Se cambia la versión y la fecha por
Nuevo período de la Rectoría
actualización del slogan
Una Administración Universitaria con Sentido Humano