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Revista Latinoamericana el Ambiente y las Ciencias 1Perfil 6(13): 30-43 2015 de expresión de la enzima versátil peroxidasa (VP) durante el crecimiento de Pleurotus ostreatus en presencia de colorantes. Expression profile of versatile peroxidase (VP) enzyme during grown of Pleurotus ostreatus in the presence of dyes. 1 Sarai K. Cruz Pacheco, 1Soley B. Nava Galicia, 2Rubén Díaz Godinez, 1Martha D. Bibbins Martínez. 1 CIBA-IPN Ex-Hacienda San Juan Molino Carretera Estatal Tecuexcomac-Tepetitla Km 1.5, Tlaxcala C.P. 90700, México. 2 Centro de Investigación en Ciencias Biológicas, Universidad Autónoma de Tlaxcala, México RESUMEN. Pleurotus ostreatus es un hongo basidiomiceto empleado para el desarrollo de métodos de biorremediación de compuestos xenobióticos y recalcitrantes. Las tres principales familias de enzimas ligninolíticas producidas por P. ostreatus son las lacasas, manganeso y versátil peroxidasas. La versátil peroxidasa es una peroxidasa del grupo hemo que posee una estructura hibrida entre una manganeso y lignino peroxidasa, por lo cual estas enzimas pueden oxidar Mn2+ y también alcohol veratrilico, compuestos fenólicos y no fenólicos, compuestos aromáticos de alto peso molecular incluyendo colorantes (Asgher y col., 2008). El objetivo del presente trabajo fue estudiar el efecto de colorantes textiles en el perfil de expresión de los genes que codifican para la enzima VP en P. ostreatus. Las cinéticas de crecimiento realizadas en presencia y ausencia de colorantes, no presentaron diferencias significativas en la velocidad de crecimiento (µ) y biomasa máxima obtenida (Xmax) obteniéndose valores de 0.0176 h-1 y 5.53 gL-1 espectivamente. La actividad enzimática se vio inducida en presencia de ambos colorantes. Los valores máximos de actividad fueron de 703 U/L y 1515 U/L para la fermentación con amarillo y azul respectivamente. La actividad máxima obtenida en la fermentación sin colorante fue de 448 U/L a la 175 h. Con respecto al patrón de expresión de los genes vp1, vp3 y vp4. El gen vp1 presentó la mayor inducción en presencia del colorante amarillo azo, y los genes vp3 y vp4, su inducción fue mayor en presencia del colorante RBBR. Estas diferencias de Recibido: Abril, 2015. Aprobado: Junio, 2015 30 Revista Latinoamericana el Ambiente y las Ciencias 6(13): 30-43 2015 expresión en los colorantes pueden asociarse a la diferencia en la estructura química de los mismos. ABSTRACT. Pleurotus ostreatus is a basidiomycete fungus used for the development of methods of bioremediation of xenobiotics and recalcitrant compounds. The three major families of ligninolytic enzymes produced by P. ostreatus are laccases, manganese and versatile peroxidases. The versatile peroxidase is a peroxidase heme having a hybrid structure from a manganese peroxidase lignin, therefore these enzymes can oxidize Mn2+ and veratryl alcohol, phenolic and non-phenolic, aromatic compounds of high molecular weight including dyes (Asgher and col., 2008). The aim of this work was to study the effect of textile dyes in the expression profile of genes encoding the enzyme in P. ostreatus VP. Growth kinetics carried out in the presence and absence of dyes, no significant differences in the growth rate (μ) and high biomass obtained (Xmax) obtaining values of 0.0176 h-1 and 5.53 gL-1 respectively. Enzyme activity was induced in the presence of both dyes. The maximum activity values were 703 U / L and 1515 U / L for fermentation with yellow and blue respectively. The maximum activity obtained in the fermentation without dye was 448 U/L to 175 h. Regarding the expression pattern of genes vp1, vp4, vp3. The vp1 gene showed the highest induction in the presence of azo yellow dye, and vp3 and vp4 genes, their induction was higher in presence of the dye RBBR. These differences in expression obtained with the different dyes may be the result of the differences in their chemical structure. Palabras Clave: Biorremediación, expresión de genes, peroxidasa. Pleurotus ostreatus, versátil Key words: Bioremediation, Pleurotus ostreatus, gene expression, versatile peroxidase. INTRODUCCIÓN 31 Revista Latinoamericana el Ambiente y las Ciencias 6(13): 30-43 2015 Diferentes estudios han demostrado que la actividad y número de isoenzimas de las diferentes fenoloxidasas en hongos, dependen de diferentes factores ambientales entre ellos la temperatura, pH, inductores, condiciones de cultivo y la composición del medio (Durán, 2002; Téllez, 2008; Pezzella, 2012; Díaz, 2013), asimismo se sabe que estas enzimas pueden ser producidas de forma constitutiva o ser inducidas (Téllez, 2005). Las enzimas versátil peroxidasa (EC. 1.11.1.16), son oxidorreductasas capaces de degradar compuestos fenólicos y diversos tipos de compuestos recalcitrantes entre los que se encuentran los colorantes sintéticos. Por lo anterior estas enzimas pueden ser aplicadas en diversas aplicaciones biotecnológicas y sin duda representan una alternativa potencial para la birremediación de contaminantes de diversos orígenes (Cohen y col., 2002). Por lo anterior el objetivo del presente trabajo fue el de estudiar el efecto de colorantes textiles en el perfil de expresión del/los genes que codifican para la enzima versátil peroxidasa en Pleurotus ostreatus. METODOLOGÍA 2.1 Propagación y condiciones de cultivo de P. ostreatus Se utilizó la cepa de Pleurotus ostreatus de la American Type Culture Collection (Maryland, U.S.A), con número ATCC32783, propagando la cepa a 25°C durante 7 días en agar papa destroza (PDA) y extracto de paja al 10 %, posteriormente se colocó a 4°C para conservarla. El extracto al 10 % se preparó a partir de 100 g de paja de trigo en un litro de agua, la mezcla se calentó 80 ºC durante una hora. El lixiviado se filtró con papel filtro Whatman número 1 y se utilizó como base para la preparación del medio PDA. 2.2 Fermentación sumergida Se realizaron fermentaciones sumergidas por triplicado en matraces erlenmeyer de 125 mL con 50 mL de medio liquido reportado por (Tellez, 2008), a pH de 6.5 ajustado con NaOH 1N. Los matraces se inocularon con 3 fragmentos de micelio de 4 mm de diámetro cortados de la periferia de la colonia y posteriormente se incubaron a 25ºC durante 501 horas (21 días) con agitación orbital a 120 rpm. Se tomaron muestras cada 24 horas. 32 Revista Latinoamericana el Ambiente y las Ciencias 6(13): 30-43 2015 Se realizaron 2 fermentaciones independientes de dos condiciones diferentes y una fermentación basal, con adición de colorante azul remazol brillante R (Remazol Brillant Blue R, SIGMA) con un peso molecular de 626.54 gmol-1, y una con la adición de amarillo azo (4-Amino-1,1’-azobenzene-3,4’-disulfonic acid, sodium salt, ALDRICH) con peso molecular de 379.35 gmol-1. Adicionando 500 ppm a cada uno de los matraces. 2.3 Obtención de biomasa y extractos enzimáticos La biomasa producida se separó del extracto enzimático (EE) por filtración, utilizando papel filtro Whatman No.1. La cual se reportó en gramos de biomasa seca (X) por litro de medio (gL-1). La biomasa se secó en horno a 60 °C durante 24 horas (Díaz, 2001; Tlecuitl, 2003). También se obtuvo micelio para la posterior extracción de RNA, congelándolo inmediatamente con nitrógeno líquido y posteriormente fue molido en un mortero de porcelana hasta ser reducido a polvo fino. Las muestras se conservaron a -70 °C hasta su utilización. El extracto enzimático extracelular (EEE) es el caldo de la fermentación obtenido de cada tiempo muestreado, posteriormente se guardaron a -20°C. 2.4 Determinación de la actividad enzimática Para determinar la actividad extracelular de versátil peroxidasa se utilizó la metodología de (Rodríguez, 2004) 2.5 Expresión diferencial de genes de oxidasas Para determinar los patrones de expresión de los genes de versátil peroxidasas de P. ostreatus bajo las condiciones de estudio, se diseñaron oligonucleótidos, mismos que fueron empleados en los ensayos de RT-PCR 2.6 Ensayos de RT-PCR 33 Revista Latinoamericana el Ambiente y las Ciencias 6(13): 30-43 2015 Se extrajo el RNA total del micelio generado en la fermentación y el mismo se utilizó para la síntesis de la primera cadena de cDNA mediante retrotranscripción utilizando la enzima SuperScriptTM II Reverse Transcriptase de Invitrogen. Se realizaron stocks de 50 µL a una concentración de 250 ngµL-1 de cDNA para posteriormente utilizar como templado en los ensayos de la PCR. Los productos amplificados se visualizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 2% teñidos con BrEt. Se utilizó un marcador molecular de 100 pb, Gene RulerTM, 100 pb DNA ladder de Fermentas, para determinar el tamaño de los fragmentos amplificados, para lo cual se cargaron 5 µL de muestra (producto de PCR) y 3µL de buffer de carga. Los primers utilizados en los ensayos de RT-PCR se especifican en la tabla 1 Tabla 1. Diseño de primers para las diferentes isoformas de versátil peroxidasas de P. ostreatus Oligonucleótidos PSA-VPL 1 Po-VP 2 Po-VP 3 Po-VP 4 Po-VP Gpd Sentido Secuencia 5'-->3' ATGCTGGTTCTGCTGCTATG CGTTACCAACTGTCCTGGTG CTGCTTGCTGTGTCCTCTTC GTCGTCTGGCTCCTTTCTTC TATCGCTCGTCACAACATCA TCTGCGGTGTTAACCTTGAGTCGT Antisentido Secuencia 5'-->3' AGCCTCGGTATATTCGCAAC CCAGACAACCTCGACAGAGA GAACGTAAGGACGGAACCAT AAGGAAGTTCCACGGAGTTG GAAAGGCTCTGGGACAAGAC TGGTAGCGTGGATGGTGCTCATTA RNA nt 200 188 140 140 165 149 RESULTADOS 3.1 Cinética de crecimiento de Pleurotus ostreatus En la figura 1 se muestra la cinética de crecimiento de P. ostreatus en las tres condiciones de fermentación evaluadas (sin colorante, con colorante azul remazo y con colorante amarillo azo). 34 Revista Latinoamericana el Ambiente y las Ciencias 6(13): 30-43 2015 Figura 1. Comparación de las cinéticas de crecimiento de P. ostreatus en fermentación basal(▲), con RBBR(●) y AYG(♦ ) a pH inicial de desarrollo de 6.5 La velocidad especifica de crecimiento (µ), biomas máxima producida (Xmax) obtenidas para cada una de las fermentaciones no mostraron diferencia significativa obteniéndose valores promedio de µ de 0.0176 h-1, Xmax de 5.53 gL-1, sin embargo para las diferentes fases de crecimiento (adaptación, exponencial y estacionaria) en presencia de colorantes, principalmente la fase exponencial se vio modificada abarcando el periodo de 120 a 456 h para las fermentaciones con colorante en comparación con 168 a 384 h para la fermentación sin colorante. Estos resultados sugieren que P. ostreatus puede metabolizar estos compuestos sin afectar su crecimiento. 3.2 Determinación de la actividad enzimática 3.2.1 Actividad Enzimática de Versátil Peroxidasa 35 Revista Latinoamericana el Ambiente y las Ciencias 6(13): 30-43 2015 La actividad de versátil peroxidasa en presencia de MnSO4 se muestra en la figura 2. El mayor pico de actividad de versátil peroxidasa se observó a las 187 h con un valor de 703.8 UmL-1 dentro de la fase de adaptación en presencia de colorante AYG en comparación con la fermentación basal en la cual la actividad máxima fue de 448 Uml-1 a la 175 h. Figura 2. Actividad enzimática versátil peroxidasas en presencia de MnSO4 bajo dos condiciones basal y colorante AYG. En la figura 3 se muestran los resultados de actividad de versátil peroxidasa para la fermentación en presencia del colorante azul remazol. La actividad de VP fue mayor en presencia del colorante, obteniéndose una actividad máxima de 1515 UmL-1 a las 384 h en comparación con 276 UL-1 en la fermentación basal al mismo tiempo de la fermentación. Cabe resaltar que la máxima actividad obtenida en la fermentación basal fue de 492 UmL-1 en el tiempo 175 h. 36 Revista Latinoamericana el Ambiente y las Ciencias 6(13): 30-43 2015 Figura 3. Actividad enzimática versátil peroxidasas en presencia de MnSO4 bajo dos condiciones basal y colorante RBBR 3.3 Perfil de expresión 3.3.1 Ensayos de RT-PCR En las figuras 4 y 5 se muestra la comparación del perfil de expresión de los genes estudiados en las condiciones, basal, y con la adición de colorantes. El gen gdp se utilizó como control interno y presentó niveles de expresión contantes en las tres condiciones evaluadas. La expresión del gen vp1 fue estable en todos los tiempos evaluados, sin embargo se observa una mayor expresión en la condición con colorante amarillo, misma que se mantuvo constante hasta el tiempo 247 h en el cual se observó una ligera disminución. La expresión del gen vp3 se vio claramente inducida en presencia del colorante azul remazol mostrando niveles de expresión más elevados y dependientes del tiempo de la fermentación. Sin embargo en la condición basal la expresión observada fue mayor que en la condición en presencia del colorante amarillo azo. En el caso del gen vp4 el patrón de expresión fue muy similar al patrón observado para vp3, la expresión fue mayor en la condición con colorante azul remazol y al igual que para vp3, en la condición basal se observó una mayor expresión que en la condición con colorante amarillo. 37 Revista Latinoamericana el Ambiente y las Ciencias 6(13): 30-43 2015 Figura 4. Comparación del perfil de expresión de los genes de las isoformas de verstil peroxidasas de P. ostreatus en fermentación basal y en presencia del colorante AYG Figura 5. Comparación del perfil de expresión de los genes de las isoformas de verstil peroxidasas de P. ostreatus en fermentación basal y en fermentación con presencia del colorante ARBR DISCUSIÓN 38 Revista Latinoamericana el Ambiente y las Ciencias 6(13): 30-43 2015 Los hongos que producen podredumbre blanca entre ellos el género Pleurotus, son capaces de degradar moléculas complejas como la lignina además de una gran diversidad de compuestos xenobióticos como los colorantes, lo cual les confiere interés en diferentes aplicaciones biotecnológicas, entre ellas la biorremediación. En este trabajo se determinaron los patrones de producción y expresión de la enzima modificadora de lignina versátil peroxidasa en presencia de los colorantes sintéticos amarillo azo (AYG) y azul remazol brillante (ARBR) con el objetivo de conocer la participación de dicha enzima en la decoloración y posible mineralización de dicho compuesto. Para poder conocer más sobre los procesos involucrados en la degradación de los colorantes AYG y ARBR, se realizaron fermentaciones sumergidas de P. ostreatus empleando un medio basal con un pH inicial de desarrollo del hongo de 6.5 en ausencia y presencia de los colorantes antes mencionados, determinando la actividad enzimática extracelular y el nivel de expresión relativa de los genes de las enzimas oxidasas bajo estudio, con lo cual se observó la participación coordinada y regulada de esta enzimas. Primeramente se evaluó el efecto de los colorantes sobre los parámetros cinéticos de crecimiento, la velocidad especifica de crecimiento (µ), biomas máxima producida (Xmax) obtenidas para cada una de las fermentaciones no mostraron diferencia significativa obteniéndose valores promedio de µ de 0.0176 h-1, Xmax de 5.53 gL-1, sin embargo para las diferentes fases de crecimiento (adaptación, exponencial y estacionaria) en presencia de colorantes, principalmente la fase exponencial se vio modificada abarcando el periodo de 120 a 456 h para las fermentaciones con colorante en comparación con 168 a 384 h para la fermentación sin colorante. Los resultados obtenidos son comparables con lo reportado por Tellez-Tellez et al (2008) y (Pérez, 2013) quienes obtuvieron una Xmax en fermentación basal de 5.6 g/L y 5.71 g/L respectivamente. Asgher (2008), reporta que los hongos de la pudrición blanca son organismos versátiles y robustos los cuales tiene un enorme potencial para la bioremediación oxidativa de una gran variedad de contaminantes de origen químico. En diversos estudios se ha demostrado que Pleurotus ostreatus es capaz de utilizar como fuente de carbono un gran número de compuestos tóxicos, lo anterior como resultado de su sistema oxidativos multienzimático no especifico. (Eichlerova, 2002; Rodríguez, 2004). En relación al actividad enzimática se obtuvieron actividades máximas en las fermentaciones con el colorante amarillo y azul de 703.8 UL-1 y 1515 UL-1 respectivamente en comparación en la fermentación basal en la cual se obtuvo una actividad máxima de 448 39 Revista Latinoamericana el Ambiente y las Ciencias 6(13): 30-43 2015 UL-1. Diversos trabajos han reportado la influencia de diferentes factores sobre la actividad enzimática de VP. Susla & Novotny, (2007) reportó que una de las razones por las cuales se incrementa la actividad en presencia de inductores (en este caso la presencia de colorantes), es el papel que desempeña en la protección contra el estrés oxidativo causado por los radicales libres que se originan bajo la presencia de compuestos aromáticos, entre ellos el AYG o ARBR; aunque el patrón de inducción indicaría que solo ciertas isoenzimas son producidas para la protección del hongo bajo estas condiciones. Ruiz-Dueñas et al., 2009 reportó que la enzima VP de P. chrysosporium presenta un alto potencial de oxidación con compuestos fenólicos y no fenólicos así como con el colorante negro reactivo 5. FernándezFueyo et al., 2014, postuló que la VP desempeña en P. ostreatus y probablemente en otras especies del orden Agaricales, en cuyos cultivos y genomas no se han encontrado nunca evidencias de presencia de LiP (Floudas et al., 2012), el papel desempeñado por las LiPs en P. chrysosporium y otras especies de Poliporales. Salame et al. (2013) encontró que en la VP había ligeras diferencias en sus constantes catalíticas frente a cinco sustratos representativos. En tanto que Fernández-Fueyo et al., 2014, caracterizó bioquímicamente tres isoenzimas de VP de P. ostreatus obteniendo grandes diferencias en su estabilidad a la temperatura (con valores de T50 de 43-63 ºC, tras 10 min a pH 5) y al pH (con actividades residuales de 0-96 % a pH 3 y de 0-57 % a pH 9, en ambos casos tras 4 h a 4 ºC). Con respecto a los patrones de expresión génica, se observaron diferencias entre isoformas y condiciones evaluadas. El patrón de expresión de los colorantes evaluados (AYG y ARBR.) se vio modificado en los genes vp1, vp3 y vp4. El gen vp1 presentó la mayor inducción en presencia del colorante amarillo azo, y los genes vp3 y vp4, su inducción fueron mayores en presencia del colorante azul remazol. Los resultados obtenidos indicaron que la presencia de los colorantes AYG y ARBR actúan como inductores de la actividad enzimática y expresión génica, modificaron el perfil de expresión de los genes de las oxidasas lo cual nos permite sugerir la presencia de mecanismos de regulación altamente sensibles debido a múltiples factores presentes, como lo fueron, el medio de cultivo empleado, las diferencias químicas y estructurales de cada colorante. Por lo tanto, la inducción de la expresión génica en presencia de ambos colorantes representa la respuesta desarrollada por los hongos para contrarrestar estos compuestos tóxicos. Una característica en la evolución de las enzimas que componen el sistema oxidativo de los hongos, es la existencia de duplicaciones recientes codificando diferentes isoformas. Dichas isoenzimas difieren escasamente en su secuencia y, a pesar de que existen pocos datos al respecto, deben poseer características diferentes de forma que su expresión confiera al hongo una ventaja evolutiva en determinados hábitats o sustratos. Las condiciones óptimas 40 Revista Latinoamericana el Ambiente y las Ciencias 6(13): 30-43 2015 de cultivo coinciden con el máximo de actividad y con el mayor nivel de expresión de los genes. Salame et al., 2012; 2013 observó que en condiciones óptimas se expresan dos genes principalmente, MnP3 seguida de VP1. Aunque no se ha encontrado una correlación entre el secretoma y la transcripción de la isoenzima más expresada, Ruíz-Dueñas 2012, analizó el proteoma intracelular detectándose la presencia de esta proteína y demostrándose que su baja secreción era el factor limitante. Sin embargo, sí se observó que la proteína codificada por el segundo gen que más se transcribía era la más abundante en el secretoma. Por otra parte expresión de los genes de estas peroxidasas se ve más afectada por los cambios de pH, temperatura. Existiendo una correlación entre el nivel de expresión y la actividad peroxidasa (Fernández-Fueyo et al., 2014c). CONCLUSIONES Los colorantes evaluados (AYG y ARBR.) modificaron el patrón de expresión de los genes vp1, vp3 y vp4. El gen vp1 presentó la mayor inducción en presencia del colorante amarillo azo, y los genes vp3 y vp4, su inducción fue mayor en presencia del colorante azul remazol. Estas diferencias de expresión en los colorantes pueden asociarse a la diferencia en la estructura química de los mismos. Con respecto a la actividad, se vio claramente inducida en presencia de ambos colorantes y el patrón de producción fue significativamente diferente en cada una de las etapas de la fermentación. Los valores máximos de actividad para las fermentaciones en presencia de colorantes fueron de 703 UL-1 y 1515 UL-1 para la fermentación con amarillo y azul respectivamente. La actividad máxima obtenida en la fermentación sin colorante fue de 448 UL-1 a las 175 h. Los resultados obtenidos indican la participación primaria de la enzima versátil peroxidasa en la oxidación y posible mineralización de los colorantes estudiados. La selección de genes que sean principalmente inducidos en presencia de estos compuestos, representa una aplicación potencial para el desarrollo de métodos de biorremediación enzimáticos que favorezcan la oxidación de compuestos recalcitrantes, los cuales puedan emplearse en la remediación de efluentes de la industria textil y de otras industrias generadoras de compuestos recalcitrantes. 41 Revista Latinoamericana el Ambiente y las Ciencias 6(13): 30-43 2015 BIBLIOGRAFÍA Asgher M.; Bhatti HN.; Ashraf M y Legge RL. (2008). Recent developments in biodegradation of industrial pollutants by white rot fungi and their enzyme system. Biodegradation. 19:771–783 Cohen R.; Persky L.; Hadar Y. (2002). Biotechnological applications and potential of wood-degrading mushrooms of the genus Pleurotus. Appl Microbiol Biotechnol.: 58:582– 594 Díaz, G. 2013. Patrones de lacasas de Pleurotus ostreatus desarrollado en fermentación sumergida a diferentes pH del medio de cultivo. Tesis Doctoral UAM, 123. 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