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Revista Latinoamericana el Ambiente y las Ciencias
1Perfil
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de expresión de la enzima versátil peroxidasa (VP) durante el crecimiento de
Pleurotus ostreatus en presencia de colorantes.
Expression profile of versatile peroxidase (VP) enzyme during grown of Pleurotus
ostreatus in the presence of dyes.
1
Sarai K. Cruz Pacheco, 1Soley B. Nava Galicia, 2Rubén Díaz Godinez, 1Martha D. Bibbins
Martínez.
1
CIBA-IPN Ex-Hacienda San Juan Molino Carretera Estatal Tecuexcomac-Tepetitla Km 1.5,
Tlaxcala C.P. 90700, México.
2
Centro de Investigación en Ciencias Biológicas, Universidad Autónoma de Tlaxcala, México
RESUMEN. Pleurotus ostreatus es un hongo basidiomiceto empleado para el desarrollo de
métodos de biorremediación de compuestos xenobióticos y recalcitrantes. Las tres
principales familias de enzimas ligninolíticas producidas por P. ostreatus son las lacasas,
manganeso y versátil peroxidasas. La versátil peroxidasa es una peroxidasa del grupo hemo
que posee una estructura hibrida entre una manganeso y lignino peroxidasa, por lo cual
estas enzimas pueden oxidar Mn2+ y también alcohol veratrilico, compuestos fenólicos y no
fenólicos, compuestos aromáticos de alto peso molecular incluyendo colorantes (Asgher y
col., 2008).
El objetivo del presente trabajo fue estudiar el efecto de colorantes textiles en el perfil de
expresión de los genes que codifican para la enzima VP en P. ostreatus.
Las cinéticas de crecimiento realizadas en presencia y ausencia de colorantes, no
presentaron diferencias significativas en la velocidad de crecimiento (µ) y biomasa máxima
obtenida (Xmax) obteniéndose valores de 0.0176 h-1 y 5.53 gL-1 espectivamente. La
actividad enzimática se vio inducida en presencia de ambos colorantes. Los valores
máximos de actividad fueron de 703 U/L y 1515 U/L para la fermentación con amarillo y
azul respectivamente. La actividad máxima obtenida en la fermentación sin colorante fue
de 448 U/L a la 175 h. Con respecto al patrón de expresión de los genes vp1, vp3 y vp4. El
gen vp1 presentó la mayor inducción en presencia del colorante amarillo azo, y los genes
vp3 y vp4, su inducción fue mayor en presencia del colorante RBBR. Estas diferencias de
Recibido: Abril, 2015.
Aprobado: Junio, 2015
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expresión en los colorantes pueden asociarse a la diferencia en la estructura química de los
mismos.
ABSTRACT. Pleurotus ostreatus is a basidiomycete fungus used for the development of
methods of bioremediation of xenobiotics and recalcitrant compounds. The three major
families of ligninolytic enzymes produced by P. ostreatus are laccases, manganese and
versatile peroxidases. The versatile peroxidase is a peroxidase heme having a hybrid
structure from a manganese peroxidase lignin, therefore these enzymes can oxidize Mn2+
and veratryl alcohol, phenolic and non-phenolic, aromatic compounds of high molecular
weight including dyes (Asgher and col., 2008).
The aim of this work was to study the effect of textile dyes in the expression profile of
genes encoding the enzyme in P. ostreatus VP.
Growth kinetics carried out in the presence and absence of dyes, no significant differences
in the growth rate (μ) and high biomass obtained (Xmax) obtaining values of 0.0176 h-1 and
5.53 gL-1 respectively. Enzyme activity was induced in the presence of both dyes. The
maximum activity values were 703 U / L and 1515 U / L for fermentation with yellow and
blue respectively. The maximum activity obtained in the fermentation without dye was 448
U/L to 175 h. Regarding the expression pattern of genes vp1, vp4, vp3. The vp1 gene
showed the highest induction in the presence of azo yellow dye, and vp3 and vp4 genes,
their induction was higher in presence of the dye RBBR. These differences in expression
obtained with the different dyes may be the result of the differences in their chemical
structure.
Palabras Clave: Biorremediación, expresión de genes,
peroxidasa.
Pleurotus ostreatus, versátil
Key words: Bioremediation, Pleurotus ostreatus, gene expression, versatile peroxidase.
INTRODUCCIÓN
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Diferentes estudios han demostrado que la actividad y número de isoenzimas de las
diferentes fenoloxidasas en hongos, dependen de diferentes factores ambientales entre ellos
la temperatura, pH, inductores, condiciones de cultivo y la composición del medio (Durán,
2002; Téllez, 2008; Pezzella, 2012; Díaz, 2013), asimismo se sabe que estas enzimas
pueden ser producidas de forma constitutiva o ser inducidas (Téllez, 2005). Las enzimas
versátil peroxidasa (EC. 1.11.1.16), son oxidorreductasas capaces de degradar compuestos
fenólicos y diversos tipos de compuestos recalcitrantes entre los que se encuentran los
colorantes sintéticos. Por lo anterior estas enzimas pueden ser aplicadas en diversas
aplicaciones biotecnológicas y sin duda representan una alternativa potencial para la
birremediación de contaminantes de diversos orígenes (Cohen y col., 2002).
Por lo anterior el objetivo del presente trabajo fue el de estudiar el efecto de colorantes
textiles en el perfil de expresión del/los genes que codifican para la enzima versátil
peroxidasa en Pleurotus ostreatus.
METODOLOGÍA
2.1 Propagación y condiciones de cultivo de P. ostreatus
Se utilizó la cepa de Pleurotus ostreatus de la American Type Culture Collection
(Maryland, U.S.A), con número ATCC32783, propagando la cepa a 25°C durante 7 días en
agar papa destroza (PDA) y extracto de paja al 10 %, posteriormente se colocó a 4°C para
conservarla. El extracto al 10 % se preparó a partir de 100 g de paja de trigo en un litro de
agua, la mezcla se calentó 80 ºC durante una hora. El lixiviado se filtró con papel filtro
Whatman número 1 y se utilizó como base para la preparación del medio PDA.
2.2 Fermentación sumergida
Se realizaron fermentaciones sumergidas por triplicado en matraces erlenmeyer de 125 mL
con 50 mL de medio liquido reportado por (Tellez, 2008), a pH de 6.5 ajustado con NaOH
1N. Los matraces se inocularon con 3 fragmentos de micelio de 4 mm de diámetro cortados
de la periferia de la colonia y posteriormente se incubaron a 25ºC durante 501 horas (21
días) con agitación orbital a 120 rpm. Se tomaron muestras cada 24 horas.
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Se realizaron 2 fermentaciones independientes de dos condiciones diferentes y una
fermentación basal, con adición de colorante azul remazol brillante R (Remazol Brillant
Blue R, SIGMA) con un peso molecular de 626.54 gmol-1, y una con la adición de amarillo
azo (4-Amino-1,1’-azobenzene-3,4’-disulfonic acid, sodium salt, ALDRICH) con peso
molecular de 379.35 gmol-1. Adicionando 500 ppm a cada uno de los matraces.
2.3 Obtención de biomasa y extractos enzimáticos
La biomasa producida se separó del extracto enzimático (EE) por filtración, utilizando
papel filtro Whatman No.1. La cual se reportó en gramos de biomasa seca (X) por litro de
medio (gL-1). La biomasa se secó en horno a 60 °C durante 24 horas (Díaz, 2001; Tlecuitl,
2003). También se obtuvo micelio para la posterior extracción de RNA, congelándolo
inmediatamente con nitrógeno líquido y posteriormente fue molido en un mortero de
porcelana hasta ser reducido a polvo fino. Las muestras se conservaron a -70 °C hasta su
utilización. El extracto enzimático extracelular (EEE) es el caldo de la fermentación
obtenido de cada tiempo muestreado, posteriormente se guardaron a -20°C.
2.4 Determinación de la actividad enzimática
Para determinar la actividad extracelular de versátil peroxidasa se utilizó la metodología de
(Rodríguez, 2004)
2.5 Expresión diferencial de genes de oxidasas
Para determinar los patrones de expresión de los genes de versátil peroxidasas de P.
ostreatus bajo las condiciones de estudio, se diseñaron oligonucleótidos, mismos que
fueron empleados en los ensayos de RT-PCR
2.6 Ensayos de RT-PCR
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Se extrajo el RNA total del micelio generado en la fermentación y el mismo se utilizó para
la síntesis de la primera cadena de cDNA mediante retrotranscripción utilizando la enzima
SuperScriptTM II Reverse Transcriptase de Invitrogen. Se realizaron stocks de 50 µL a una
concentración de 250 ngµL-1 de cDNA para posteriormente utilizar como templado en los
ensayos de la PCR. Los productos amplificados se visualizaron mediante electroforesis en
gel de agarosa al 2% teñidos con BrEt. Se utilizó un marcador molecular de 100 pb, Gene
RulerTM, 100 pb DNA ladder de Fermentas, para determinar el tamaño de los fragmentos
amplificados, para lo cual se cargaron 5 µL de muestra (producto de PCR) y 3µL de buffer
de carga.
Los primers utilizados en los ensayos de RT-PCR se especifican en la tabla 1
Tabla 1. Diseño de primers para las diferentes isoformas de versátil peroxidasas de P.
ostreatus
Oligonucleótidos
PSA-VPL
1 Po-VP
2 Po-VP
3 Po-VP
4 Po-VP
Gpd
Sentido
Secuencia 5'-->3'
ATGCTGGTTCTGCTGCTATG
CGTTACCAACTGTCCTGGTG
CTGCTTGCTGTGTCCTCTTC
GTCGTCTGGCTCCTTTCTTC
TATCGCTCGTCACAACATCA
TCTGCGGTGTTAACCTTGAGTCGT
Antisentido
Secuencia 5'-->3'
AGCCTCGGTATATTCGCAAC
CCAGACAACCTCGACAGAGA
GAACGTAAGGACGGAACCAT
AAGGAAGTTCCACGGAGTTG
GAAAGGCTCTGGGACAAGAC
TGGTAGCGTGGATGGTGCTCATTA
RNA
nt
200
188
140
140
165
149
RESULTADOS
3.1 Cinética de crecimiento de Pleurotus ostreatus
En la figura 1 se muestra la cinética de crecimiento de P. ostreatus en las tres condiciones
de fermentación evaluadas (sin colorante, con colorante azul remazo y con colorante
amarillo azo).
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Figura 1. Comparación de las cinéticas de crecimiento de P. ostreatus en fermentación basal(▲),
con RBBR(●) y AYG(♦ ) a pH inicial de desarrollo de 6.5
La velocidad especifica de crecimiento (µ), biomas máxima producida (Xmax) obtenidas
para cada una de las fermentaciones no mostraron diferencia significativa obteniéndose
valores promedio de µ de 0.0176 h-1, Xmax de 5.53 gL-1, sin embargo para las diferentes
fases de crecimiento (adaptación, exponencial y estacionaria) en presencia de colorantes,
principalmente la fase exponencial se vio modificada abarcando el periodo de 120 a 456 h
para las fermentaciones con colorante en comparación con 168 a 384 h para la fermentación
sin colorante. Estos resultados sugieren que P. ostreatus puede metabolizar estos
compuestos sin afectar su crecimiento.
3.2 Determinación de la actividad enzimática
3.2.1 Actividad Enzimática de Versátil Peroxidasa
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La actividad de versátil peroxidasa en presencia de MnSO4 se muestra en la figura 2. El
mayor pico de actividad de versátil peroxidasa se observó a las 187 h con un valor de 703.8
UmL-1 dentro de la fase de adaptación en presencia de colorante AYG en comparación con
la fermentación basal en la cual la actividad máxima fue de 448 Uml-1 a la 175 h.
Figura 2. Actividad enzimática versátil peroxidasas en presencia de MnSO4 bajo dos condiciones
basal y colorante AYG.
En la figura 3 se muestran los resultados de actividad de versátil peroxidasa para la
fermentación en presencia del colorante azul remazol. La actividad de VP fue mayor en
presencia del colorante, obteniéndose una actividad máxima de 1515 UmL-1 a las 384 h en
comparación con 276 UL-1 en la fermentación basal al mismo tiempo de la fermentación.
Cabe resaltar que la máxima actividad obtenida en la fermentación basal fue de 492 UmL-1
en el tiempo 175 h.
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Figura 3. Actividad enzimática versátil peroxidasas en presencia de MnSO4 bajo dos condiciones
basal y colorante RBBR
3.3 Perfil de expresión
3.3.1 Ensayos de RT-PCR
En las figuras 4 y 5 se muestra la comparación del perfil de expresión de los genes
estudiados en las condiciones, basal, y con la adición de colorantes.
El gen gdp se utilizó como control interno y presentó niveles de expresión contantes en las
tres condiciones evaluadas.
La expresión del gen vp1 fue estable en todos los tiempos evaluados, sin embargo se
observa una mayor expresión en la condición con colorante amarillo, misma que se
mantuvo constante hasta el tiempo 247 h en el cual se observó una ligera disminución. La
expresión del gen vp3 se vio claramente inducida en presencia del colorante azul remazol
mostrando niveles de expresión más elevados y dependientes del tiempo de la
fermentación. Sin embargo en la condición basal la expresión observada fue mayor que en
la condición en presencia del colorante amarillo azo. En el caso del gen vp4 el patrón de
expresión fue muy similar al patrón observado para vp3, la expresión fue mayor en la
condición con colorante azul remazol y al igual que para vp3, en la condición basal se
observó una mayor expresión que en la condición con colorante amarillo.
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Figura 4. Comparación del perfil de expresión de los genes de las isoformas de verstil peroxidasas
de P. ostreatus en fermentación basal y en presencia del colorante AYG
Figura 5. Comparación del perfil de expresión de los genes de las isoformas de verstil peroxidasas
de P. ostreatus en fermentación basal y en fermentación con presencia del colorante ARBR
DISCUSIÓN
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Los hongos que producen podredumbre blanca entre ellos el género Pleurotus, son capaces
de degradar moléculas complejas como la lignina además de una gran diversidad de
compuestos xenobióticos como los colorantes, lo cual les confiere interés en diferentes
aplicaciones biotecnológicas, entre ellas la biorremediación. En este trabajo se
determinaron los patrones de producción y expresión de la enzima modificadora de lignina
versátil peroxidasa en presencia de los colorantes sintéticos amarillo azo (AYG) y azul
remazol brillante (ARBR) con el objetivo de conocer la participación de dicha enzima en la
decoloración y posible mineralización de dicho compuesto.
Para poder conocer más sobre los procesos involucrados en la degradación de los
colorantes AYG y ARBR, se realizaron fermentaciones sumergidas de P. ostreatus
empleando un medio basal con un pH inicial de desarrollo del hongo de 6.5 en ausencia y
presencia de los colorantes antes mencionados, determinando la actividad enzimática
extracelular y el nivel de expresión relativa de los genes de las enzimas oxidasas bajo
estudio, con lo cual se observó la participación coordinada y regulada de esta enzimas.
Primeramente se evaluó el efecto de los colorantes sobre los parámetros cinéticos de
crecimiento, la velocidad especifica de crecimiento (µ), biomas máxima producida (Xmax)
obtenidas para cada una de las fermentaciones no mostraron diferencia significativa
obteniéndose valores promedio de µ de 0.0176 h-1, Xmax de 5.53 gL-1, sin embargo para las
diferentes fases de crecimiento (adaptación, exponencial y estacionaria) en presencia de
colorantes, principalmente la fase exponencial se vio modificada abarcando el periodo de
120 a 456 h para las fermentaciones con colorante en comparación con 168 a 384 h para la
fermentación sin colorante. Los resultados obtenidos son comparables con lo reportado por
Tellez-Tellez et al (2008) y (Pérez, 2013) quienes obtuvieron una Xmax en fermentación
basal de 5.6 g/L y 5.71 g/L respectivamente.
Asgher (2008), reporta que los hongos de la pudrición blanca son organismos versátiles y
robustos los cuales tiene un enorme potencial para la bioremediación oxidativa de una gran
variedad de contaminantes de origen químico. En diversos estudios se ha demostrado que
Pleurotus ostreatus es capaz de utilizar como fuente de carbono un gran número de
compuestos tóxicos, lo anterior como resultado de su sistema oxidativos multienzimático
no especifico. (Eichlerova, 2002; Rodríguez, 2004).
En relación al actividad enzimática se obtuvieron actividades máximas en las
fermentaciones con el colorante amarillo y azul de 703.8 UL-1 y 1515 UL-1 respectivamente
en comparación en la fermentación basal en la cual se obtuvo una actividad máxima de 448
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UL-1. Diversos trabajos han reportado la influencia de diferentes factores sobre la actividad
enzimática de VP. Susla & Novotny, (2007) reportó que una de las razones por las cuales se
incrementa la actividad en presencia de inductores (en este caso la presencia de colorantes),
es el papel que desempeña en la protección contra el estrés oxidativo causado por los
radicales libres que se originan bajo la presencia de compuestos aromáticos, entre ellos el
AYG o ARBR; aunque el patrón de inducción indicaría que solo ciertas isoenzimas son
producidas para la protección del hongo bajo estas condiciones. Ruiz-Dueñas et al., 2009
reportó que la enzima VP de P. chrysosporium presenta un alto potencial de oxidación con
compuestos fenólicos y no fenólicos así como con el colorante negro reactivo 5. FernándezFueyo et al., 2014, postuló que la VP desempeña en P. ostreatus y probablemente en otras
especies del orden Agaricales, en cuyos cultivos y genomas no se han encontrado nunca
evidencias de presencia de LiP (Floudas et al., 2012), el papel desempeñado por las LiPs en
P. chrysosporium y otras especies de Poliporales.
Salame et al. (2013) encontró que en la VP había ligeras diferencias en sus constantes
catalíticas frente a cinco sustratos representativos. En tanto que Fernández-Fueyo et al.,
2014, caracterizó bioquímicamente tres isoenzimas de VP de P. ostreatus obteniendo
grandes diferencias en su estabilidad a la temperatura (con valores de T50 de 43-63 ºC, tras
10 min a pH 5) y al pH (con actividades residuales de 0-96 % a pH 3 y de 0-57 % a pH 9,
en ambos casos tras 4 h a 4 ºC).
Con respecto a los patrones de expresión génica, se observaron diferencias entre isoformas
y condiciones evaluadas. El patrón de expresión de los colorantes evaluados (AYG y
ARBR.) se vio modificado en los genes vp1, vp3 y vp4. El gen vp1 presentó la mayor
inducción en presencia del colorante amarillo azo, y los genes vp3 y vp4, su inducción
fueron mayores en presencia del colorante azul remazol. Los resultados obtenidos indicaron
que la presencia de los colorantes AYG y ARBR actúan como inductores de la actividad
enzimática y expresión génica, modificaron el perfil de expresión de los genes de las
oxidasas lo cual nos permite sugerir la presencia de mecanismos de regulación altamente
sensibles debido a múltiples factores presentes, como lo fueron, el medio de cultivo
empleado, las diferencias químicas y estructurales de cada colorante. Por lo tanto, la
inducción de la expresión génica en presencia de ambos colorantes representa la respuesta
desarrollada por los hongos para contrarrestar estos compuestos tóxicos.
Una característica en la evolución de las enzimas que componen el sistema oxidativo de los
hongos, es la existencia de duplicaciones recientes codificando diferentes isoformas. Dichas
isoenzimas difieren escasamente en su secuencia y, a pesar de que existen pocos datos al
respecto, deben poseer características diferentes de forma que su expresión confiera al
hongo una ventaja evolutiva en determinados hábitats o sustratos. Las condiciones óptimas
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de cultivo coinciden con el máximo de actividad y con el mayor nivel de expresión de los
genes. Salame et al., 2012; 2013 observó que en condiciones óptimas se expresan dos genes
principalmente, MnP3 seguida de VP1. Aunque no se ha encontrado una correlación entre
el secretoma y la transcripción de la isoenzima más expresada, Ruíz-Dueñas 2012, analizó
el proteoma intracelular detectándose la presencia de esta proteína y demostrándose que su
baja secreción era el factor limitante. Sin embargo, sí se observó que la proteína codificada
por el segundo gen que más se transcribía era la más abundante en el secretoma. Por otra
parte expresión de los genes de estas peroxidasas se ve más afectada por los cambios de
pH, temperatura. Existiendo una correlación entre el nivel de expresión y la actividad
peroxidasa (Fernández-Fueyo et al., 2014c).
CONCLUSIONES
Los colorantes evaluados (AYG y ARBR.) modificaron el patrón de expresión de los genes
vp1, vp3 y vp4. El gen vp1 presentó la mayor inducción en presencia del colorante amarillo
azo, y los genes vp3 y vp4, su inducción fue mayor en presencia del colorante azul remazol.
Estas diferencias de expresión en los colorantes pueden asociarse a la diferencia en la
estructura química de los mismos.
Con respecto a la actividad, se vio claramente inducida en presencia de ambos colorantes y
el patrón de producción fue significativamente diferente en cada una de las etapas de la
fermentación. Los valores máximos de actividad para las fermentaciones en presencia de
colorantes fueron de 703 UL-1 y 1515 UL-1 para la fermentación con amarillo y azul
respectivamente. La actividad máxima obtenida en la fermentación sin colorante fue de 448
UL-1 a las 175 h.
Los resultados obtenidos indican la participación primaria de la enzima versátil peroxidasa
en la oxidación y posible mineralización de los colorantes estudiados. La selección de
genes que sean principalmente inducidos en presencia de estos compuestos, representa una
aplicación potencial para el desarrollo de métodos de biorremediación enzimáticos que
favorezcan la oxidación de compuestos recalcitrantes, los cuales puedan emplearse en la
remediación de efluentes de la industria textil y de otras industrias generadoras de
compuestos recalcitrantes.
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