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PROCEDIMIENTO DE LABORATORIO PARA LA PRUEBA DE GENOTIPIFICACIÓN DEL VIH Blga. Gisely Hijar Guerra Coordinación del Laboratorio de Biotecnología y Biología Molecular. Responsable de los Procesos de la Prueba de Genotipificación de VIH – Centro Nacional de Salud Publca ¿COMO MONITOREAR RESISTENCIA? GENOTIPO CODIGO GENETICO ALTERADO DE LA PROTEINA BLANCO DE LA DROGA FENOTIPO SUSCEPTIBILIDAD ALTERADA A LA DROGA HIV DNA DEL PACIENTE PATIENT HIV DEFINICIONES • Genotipo : Secuencia de nucleótidos del virus de la cual se deduce la secuencia de aminoácido de una proteína (En el caso del HIV, la RT y PV) • Mutaciones : cambios en la secuencia de AA deducida de la secuencia de nucleótidos con respecto a la secuencia de una cepa de referencia (sensible o salvaje) Ejemplo: Met184Val . Mutaciones específicas se identifican como causantes de resistencia genotípica • Fenotipo : Deriva del genotipo. En el ejemplo, el cambio Met184Val se traduce fenotípicamente como resistencia a 3TC, ddC y Abacavir. Regiones de PR y RT Evaluadas por test de Resistencia Gag Cleavage Sites p7NC p1 PR p6 RNase H RT IN 242 Genotipificación VIH-INS 360 320 305 483 9 DE LA MUESTRA A LOS RESULTADOS Pre-Analitica Analitica Post-Analitica Colecta de la muestra Envío y Pre-Analítica Almacenamiento Edición de Secuencia Codificación de muestra Ensamblaje de Secuencia Post-Analítica Alineamiento de Secuencia Determinación de mutaciones Reporte de resultados Extracción de Ac. Nucleico Amplificación de Analítica Ac. Nucleico Secuenciamiento Automático MUESTRA : Sangre Total CONSIDERACIONES DE LA MUESTRA • PACIENTE : EN AYUNAS • TIPO DE MUESTRA: • TIPO DE TUBO : TUBO AL VACIO CON EDTA DE 5 – 7 CC. • TEMP. TRANSPORTE :AMBIENTE • TIEMPO DESDE QUE SE TOMA LA MUESTRA HASTA QUE SE SEPARA EL PLASMA : 24 HORAS. SANGRE SEPARACIÓN DEL PLASMA Y EXTRACCIÓN DEL MATERIAL GENETICO (ARN ) Controles de la Prueba Controles Mutantes Controles Silvestres TRANSCRIPCIÓN REVERSA (RT) Y REACCIÓN DE LA CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) RT-PCR (Reverse Transcription PCR) RNA è c DNA ELECTROFORESIS PURIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE PRODUCTOS DE PCR ÁREA SEGUNDA AMPLIFICACIÓN SEGUNDO PCR SECUENCIAMIENTO DE PRODUCTOS DE PCR (Equipo : Analizador Genético) ANÁLISIS DE SECUENCIAS DE ADN DEL VIH SOFTWARE Sequencing Analysis SOFTWARE : SeqScape La secuencia de ADN del virus obtenido es ingresado en la base de datos de la Universidad de Stanford empleando para ello el Programa HIVdb. Este programa analiza las secuencias y determina si están presentes las mutaciones del virus relacionadas a la resistencia antiretroviral. INFORMES DE RESISTENCIAS COLECTA /TOMA DE MUESTRA FLUJOGRAMA DE LA PRUEBA DE GENOTIPIFICACIÓN DE VIH SEPARACIÓN DEL PLASMA TUBO N° 1 EXTRACCIÓN DE ARN RT - PCR ELECTROFORESIS ELECTROFORESIS No amplifica Si amplifica SEGUNDO PCR (Primers alternativos) No amplifica 1a vez No amplifica 2da vez INDETERMINADO PURIFICACION Y CUANTIFICACIÓN DE PRODUCTOS DE PCR Si amplifica SECUENCIAMIENTO DE PRODUCTOS DE PCR No hay secuencia 1a vez Hay secuencia SECUENCIAMIENTO CON PRIMERS ALTERNATIVOS ANÁLISIS DE SECUENCIAS No hay secuencia 2da vez REPORTE DE RESULTADO Hay secuencia INFORME DE RESULTADO Electroforesis Extracción de ARN Muestra / Separación de Plasma RT-PCR http://hivdb.stanford.edu/pages/algs/HIVdb.html Reporte Análisis de Datos Análisis de Datos Por qué son útiles y necesarios los ensayos de Resistencia • • • Asiste al médico en la toma de decisiones terapéuticas en distintos escenarios: – Clarifica los tratamientos disponibles – Selecciona los regímenes mas activos – Mejora el resultado clínico – Clarifica la etiología de los aumentos de carga viral – Reduce el uso de drogas inactivas. Provee beneficios a nivel de salud pública – Clarifica la epidemiología de la resistencia al HIV – reduce transmisión de virus resistentes – Permite mejorar las guías de tratamiento Asiste en el desarrollo de nuevas drogas terapéuticas AGRADECIMIENTOS § § § § § Dr Robert Grant Robert Hance Maribel Acuña Carlos Yabar Equipo del laboratorio de VIH y del Laboratorio de Biología Molecular