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2º Congreso Nacional de Química Médica
Ortiz-López y col.
EVALUACIÓN MOLECULAR DEL GEN PAX-4 EN
PACIENTES CON DIABETES MELLITUS TIPO 2 DE
INICIO TEMPRANO.
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Ortiz López Ma.Guadalupe, Montúfar Robles Isela, Menjívar Iraheta Marta. Laboratorio de
Endocrinología Molecular, Hospital Juárez de México; 2 Departamento de Biología, Facultad de
Química, Universidad Nacional Autónoma de México. [email protected]
RESUMEN
La diabetes mellitas tipo 2 (DMt2) es un grave problema de salud en México
debido a la alta frecuencia que presenta (10.9% ENSA), las complicaciones que
genera y aparece a edades cada vez más tempranas de la población. Dentro del
metabolismo de la glucosa el páncreas es un órgano crucial ya que produce la
insulina. Para la formación del páncreas se requiere de complejas combinaciones de
factores transcripcionales para el control de la organogénesis y diferenciación celular,
de tal forma que la presencia de mutaciones en estos factores puede resultar en
defectos durante la formación de células β-pancreáticas por lo tanto generar diabetes.
Particularmente PAX-4 es un factor transcripcional que contribuye al desarrollo de los
islotes pancreáticos en etapas tempranas de su formación, posteriormente su
presencia se restringe solo a células β-pancreáticas maduras. Estudios moleculares en
pacientes con DMt2 han asociado mutaciones en el gen PAX-4 con la enfermedad. En
este contexto el objetivo de este trabajo fue evaluar el gen de PAX-4 en pacientes con
DMt2 de inicio temprano. Se evaluaron 50 familias con DMt2 (propósito < 35 años) y
50 personas no diabéticas (> 50 años), mediante análisis por PCR-SSCP y
secuenciación. Los resultados revelaron una mutación de sentido equivocado que
cambia Arginina por Triptofáno en el codón 133 (R133W) en una familia con DMt2. Los
datos bioquímicos del propósito mostraron ligera disminución en la secreción de
insulina (7.7uU/ml) y leve hiperglucagonemia (187.8pg/ml). La mutación R133W
provoca disminución del 37% en la actividad represora de PAX-4 insinuando su
participación al desarrollo de DMt2. En conclusión: La mutación R133W en el gen
PAX-4 cosegregacon el fenotipo diabético en una familia con DMt2 de inicio temprano
sugiriendo su contribución como causante de la enfermedad.
Palabras clave: páncreas, PAX-4, diabetes.
INTRODUCCIÓN
La diabetes mellitus (DM) es un desorden metabólico complejo caracterizado
por defectos en el metabolismo de la glucosa, resultado de alteraciones en la acción o
secreción de la insulina. En México la diabetes mellitus tipo 2 representa un grave
problema de salud, de acuerdo a la ENEC (Encuesta Nacional de Enfermedades
Crónicas) y a la ENSA (Encuesta Nacional de Salud) la diabetes ha incrementado en
forma alarmante en nuestro país, teniendo una prevalencia del 12.9% del cual
aproximadamente el 50% de los casos son diagnosticados a edades tempranas.
La predisposición genética constituye uno de los principales factores de riesgo
asociados a diabetes mellitus tipo 2. A través de la evaluación de un subtipo
monogénico de diabetes denominado MODY (Maturity-onset diabetes of the young) se
han identificado variantes polimórficas de distintos genes que contribuyen a la
susceptibilidad de desarrollar diabetes mellitus tipo 2, las cuales difieren entre las
diversas poblaciones del mundo. Sin embargo, estos genes no responden por el
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mayor porcentaje de diabetes tipo 2, por lo que es predecible que existan otros genes
involucrados en la patogénesis de la diabetes.
Uno de los órganos más importantes dentro del metabolismo de la glucosa, es
el páncreas, sin embargo los mecanismos moleculares para el desarrollo de este
órgano no son completamente conocidos, no obstante varios factores de
diferenciación y factores transcripcionales han sido identificados como cruciales para
la organogénesis y diferenciación pancreática, tal es el caso de Pax4. El gen Pax4 es
un miembro de la familia Pax los cuales contienen un homeodominio. Pax4 se expresa
selectivamente durante el desarrollo del páncreas y la espina dorsal. La expresión de
Pax4 se inicia en las primeras etapas de la diferenciación celular y posteriormente su
expresión se restringe a la célula ß y persiste así hasta la edad adulta. La deleción
homocigota para Pax4 en ratones da por resultado ausencia de células ß y δ, así como
muerte dentro de los 3 días posteriores al nacimiento. Se ha reportado en forma muy
reciente mutaciones para este gen en pacientes diabéticos tipo 2 en población
japonesa.
Así, la presencia de mutaciones en factores de transcripción clave para la
diferenciación y regulación de células pancreáticas podría conferir predisposición al
desarrollo de diabetes de aparición temprana en México. La gran variabilidad genética
reportada en los llamados diabetogenes en diferentes partes del mundo, nos obliga a
evaluar la genética de nuestra población, pues solo así podremos entender mejor las
bases moleculares de la diabetes y contribuir al desarrollo de nuevas tratamientos en
México.
OBJETIVO
Evaluar molecularmente el gen Pax4 en 2 grupos de estudio: 50 controles
sanos y 50 familias con DMt2 de inicio temprano en población mexicana.
METODOLOGÍA
Este protocolo fue aprobado por el Comité Ético del Hospital Juárez de México.
Los estudios bioquímicos y moleculares se realizaron para cada grupo de estudio.
Estudios bioquímicos. Se determinó Glucosa, Colesterol, Triglicéridos, Insulina,
Glucágon y Péptido C.
Determinaciones Hormonales. Las concentraciones de insulina, glucagon y
péptido c se determinaron mediante estuches de radioinmunoanálisis comercialmente
disponibles. El coeficiente de variación intra ensayo para la insulina fue de 8.25% a
nivel de 122µUI/ml, para el péptido c de 8.17% a nivel de 6.0 ng/ml y para el glucágon
6.63% a nivel de 209 pg/ml.
Extracción de DNA. El DNA se extrajo a partir de leucocitos de sangre
periférica mediante una técnica estándar. El gen estudiado fue amplificado por PCR
utilizando oligonucleótidos específicos que flanquearon cada uno de los exones (tabla
1).
PCR se utilizó 1 µgr de ADN genómico, desoxi-nucleotrifosfatos (dNTPs) 25µM,
DMSO (dimetil sulfóxido), Buffer 10X (500mM KCl, 100mM Tris-HCl pH 9.0, 1% Triton
X.100), Mg2Cl 15mM, Oligonucleótidos específicos 20µM, 5µCi [α32P]d CTP
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(Amersham) y 0.7 U de Taq DNA Polymerasa (Bioselec S.A. de C.V.) en un volumen
de 25 µl para cada muestra.
Tabla 1. Secuencia de Oligonucleótidos para amplificar el gen Pax4.
Exón
E1
E2
E3
E4
E5
E6
E7
E8
E9
5’-3’
AGGTGGTGTGTGGATACCTC
CCATCATGCCTCACCTGTC
CCTGAGTCTGAGCACCATCTC
CTGACCAGAGGAATCACCATC
GAGACCCATGCCTTGCTCCTC
GATCAGCAGGTGACAGGCAGC
AGTGGCTGACTTTCCTAGAAC
CTCTACAGGAGGCATCACTG
GTCCCCACAGGCCACTTGC
3’-5’
CAGGCTCTTTGCCTTCAGAG
GCCTCTTTTCCAGCCCCAGTG
GATTTGGCTGTGATTAGCCC
CCCTGTGTCACACTGAGGAC
GGCCCAGACTCTTCCTCCTTG
GATGACTGAGCGGGCAGATG
GAGCCCATGAGCCCTTCAGTC
GAGGTTGAGTCAGTCGACCCT
TGGGCAGGATGGTATTAGATCTTCTCTATG
pb
TA
241
298
165
233
194
173
226
259
205
62
62
58
58
58
58
58
58
58
Secuenciación. Se realizó mediante un secuenciador automático ABI Prism 3100.
De acuerdo a los resultados del análisis por SSCP, se escogieron aquellas muestras
de DNA que presentaron un corrimiento electroforético diferente.
RFLP.- Se utilizó la endonucleasas de restricción Hsp92II (Haemophilus influenzae
92. Promega) para la mutación R133W en el exón 3 de Pax4. Así a partir del producto
de PCR de un tamaño específico se generarón dos fragmentos más pequeños visibles
al efectuar una electroforesis en un gel de agarosa al 3% en Buffer TBE 1X.
Análisis estadístico. Los análisis estadísticos fueron realizados usando el programa
GraphPad Prism 4 (San Diego CA. USA) y SPSS versión 10.0
(Chicago IL). Un
valor de p menor a 0.05 fue considerado como significativo.
RESULTADOS
Las determinaciones bioquímicas del grupo control vs el grupo con diabetes
fueron: Glucosa 96±15mg/dl vs 212±73mg/dl (p<0.0001), Colesterol 205±32mg/dl vs
204±52mg/dl, Triglicéridos 178±86mg/dl vs 253±174mg/dl (p=0.0094), Insulina
6.5±4.4mUI/ml vs 16±17mUI/ml (p=0.0005), Glucágon 72±38pg/ml vs 68±50pg/ml y
PéptidoC 2.1±1.4ng/ml vs 1±0.76ng/ml (p<0.0001). Las medidas antropométricas
reportadas como IMC, ICC e ICE no tuvieron diferencias significativas entre los dos
grupos estudiados.
Los resultados del análisis molecular revelaron una variante presente en el
exón 3 (R133W) detectada en un paciente diabético.
Pax 4
exón 3
Figura 1. SSCP de muestras de pacientes diabéticos, la flecha indica un patrón de migración
diferente en un gel de archilamida al 5.4 %.
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TGG
R133W
Triptofano
Figura 2.Secuenciación automática de la muestra de un sujeto diabético (D33).
CGG
R133W
Arginina
(silvestre)
Figura 3. Secuenciación de la muestra de un sujeto no diabético. Los recuadros en los paneles
B y C indican el cambio de base, las flechas indican la variante y aminoácido producido
M
C1
D33
194 pb
165 pb
118 pb
109 pb
72 pb
56 pb
M: marcador ΦX174,
C:control, D:diabético
Figura 4. RFLP mediante la enzima Hsp92 II generado por la variante R133W, las flechas
indican los fragmentos en pares de bases (pb) del marcador (flechas izquierdas) y de las
muestras (flechas derechas), D33 paciente diabético, C1 control no diabético.
Los resultados bioquímicos indican que la DMt2 es una enfermedad compleja,
por lo que el control de la glucémia en los pacientes es difícil de alcanzar. Más del
30% de los pacientes fueron tratados con insulina, por tanto las concentraciones
séricas de ésta hormona se encuentran incrementadas, sin embargo los niveles de
Péptido C revelan la existencia de un defecto secretor de insulina por parte de la célula
β. En este estudio se encontró la variante R133W en un paciente con DM (2%) esta
variante no fue encontrada en ningún sujeto control.
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CONCLUSIÓN
El estudio molecular del gen Pax4 reveló la presencia de una variante de
secuencia en la población estudiada. La mutación R133W puede ser parte del fondo
genético diabetogénico de la población mexicana, su baja frecuencia indica que esta
mutación no es una causa común de diabetes tipo 2 en México.
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