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El gen humano MBNL, implicado en la distrofia
miotónica, y su homólogo en la mosca del vinagre
Drosophila melanogaster son intercambiables
funcionalmente
Amparo García López, Carmen Llobell Martínez
([email protected], [email protected])
Departamento de Genética, Universidad de Valencia
Tutor: Rubén Artero Allepuz
INTRODUCCIÓN
La Distrofia Miotónica (DM) es el tipo de distrofia muscular más común en
adultos, con una frecuencia de 13.5/100000 nacidos vivos en Occidente, pero no tiene
ningún tipo de tratamiento eficaz. Es una enfermedad con una presentación clínica muy
variable, pues afecta de un modo u otro a múltiples órganos y sistemas. Síntomas
característicos son miotonía (incapacidad para relajar los músculos), debilidad
muscular, cataratas y degeneración de la retina, aparición de resistencia a tratamientos
con insulina, hipogonadismo, arritmias cardiacas y calvicie frontal en varones entre
otras manifestaciones patológicas. Se distinguen a nivel clínico dos tipos: La DM1
(distrofia miotónica clásica, tipo I o de Steinert; OMIM 160900), caracterizada por el
inicio distal de la miotonía en las extremidades y DM2/PROMM (distrofia miotónica
tipo II; OMIM 602668 /miopatía miotónica proximal; OMIM 600109), con un inicio
proximal y una manifestación más ligera de los síntomas que en la DM1. En ambos
casos, la mutación sigue una herencia autosómica dominante y de una generación a la
siguiente se da el fenómeno de la anticipación genética, es decir, la enfermedad se
agrava y los síntomas aparecen más pronto en generaciones sucesivas. La esperanza de
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vida media para un paciente con la forma adulta de DM1 es de 53 años de edad mientras
que esta esperanza de vida es de apenas 35 años para los casos de DM congénita, la
forma más grave de la enfermedad. Al estudiar la base genética de la DM se han
encontrado mutaciones dinámicas en regiones no codificantes del genoma: una
expansión del triplete CTG en la región 3’UTR (región no traducida del transcrito) del
gen Proteína Kinasa de la DM (DMPK) para pacientes con DM1 o de la secuencia
CCTG en el primer intrón del gen ZNF9 en pacientes con DM2. Para el caso de los
tripletes CTG, la población normal es polimórfica dentro de un rango entre 5 y 37
copias. En los pacientes con DM1, sin embargo, se da una expansión enorme, que puede
llegar a las 3000 copias. El grado de expansión de los trinucleótidos se correlaciona con
la gravedad de la enfermedad y, de hecho, el grado de expansión aumenta en cada
generación lo cual proporciona una explicación molecular para la anticipación genética
(para una compilación de información clínica y una revisión -hasta el 2001- de la
patogénesis molecular de la enfermedad, véase Harper, 2001).
Se han propuesto tres hipótesis para explicar cómo esas mutaciones dinámicas
en regiones no codificantes de un gen pueden causar la DM. En primer lugar, se
propone que puede existir haploinsuficiencia de DMPK debido a la presencia de las
expansiones. Se ha observado que las expansiones de tripletes en el gen DMPK
conducen a una alteración en la maduración de los transcritos DMPK así como a la
retención de estos transcritos en el núcleo. Los knock-outs de DMPK en ratón, sin
embargo, sólo manifiestan debilidad muscular leve y conducción cardiaca anormal, pero
no miotonía. Se concluye, por tanto, que la falta de proteína DMPK puede contribuir a
la patología DM1, pero no es su desencadenante principal. También se ha propuesto que
las expansiones del trinucleótido CTG en el gen DMPK podrían alterar la estructura
regional de la cromatina (ver Fig.2). De hecho, varios estudios muestran que la
expresión de los genes adyacentes a DMPK en el genoma, DMWD y SIX5, está
reducida en pacientes con DM1 (Frisch y col. 2001). El cierre local de la cromatina
alrededor del gen DMPK podría explicar bien la presencia de cataratas e hipogonadismo
en pacientes con DM1. El knock-out en ratón de SIX5 provoca cataratas en los ratones
mientras que el homólogo en Drosophila de esta proteína, Dsix4, conduce a
hipogonadismo en los mutantes nulos para este gen. Finalmente, la hipótesis de la
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dominancia del RNA (ver Fig.2) propone que las repeticiones CUG en el RNA de
DMPK interaccionan con proteínas de unión al RNA de tal modo que su secuestro en
las expansiones bloquea su función normal. Un apoyo decisivo para esta hipótesis
procede del trabajo de Mankodi y col. (2000) los cuales, expresando una expansión de
trinucleótidos CUG en un mRNA heterólogo (gen de la actina de músculo) en ratones
transgénicos consiguen que éstos animales desarrollen miotonía y miopatía musculares.
Por tanto, los transcritos con repeticiones CUG son suficiente para producir un fenotipo
similar a DM1 independientemente del gen DMPK.
Aunque la DM1 se debe, probablemente, a una combinación de todas las
hipótesis presentadas arriba, existe cierto consenso en que el origen de la característica
más definitoria de la DM1, la miotonía, se explica mejor con el modelo de la
dominancia del RNA. De hecho, se han aislado varias proteínas en virtud de su
capacidad para unir específicamente repeticiones CUG de doble cadena, entre ellas, la
proteína humana de la familia Muscleblind (Mbl) denominada MBNL (Fig.1). Se ha
demostrado que esta proteína se une a las repeticiones CUG a partir de un umbral de
unas 50 repeticiones, probablemente debido a un cambio conformacional en estas
repeticiones que pasan de disponerse preferentemente como RNA de cadena sencilla a
RNA de doble cadena. La unión de la proteína MBNL a los trinucleótidos CUG es
directa y además específica de secuencia, de modo que una proteína recombinante, por
sí sola, es capaz de unir un RNA que contiene repeticiones CUG. Este resultado
descarta que exista una proteína adicional que actúe como puente en esta unión. La
interacción ocurre también in vivo, y tanto la proteína nuclear MBNL como sus
parálogos MBLL y MBXL colocalizan con inclusiones nucleares de repeticiones CUG.
Resultados muy similares se obtienen con las expansiones CCUG, responsables de la
DM2. Estas observaciones sugieren, pues, que el secuestro de esta familia de proteínas
Mbl es una de las rutas principales de patogénesis de ambas enfermedades (Miller y col.
2000; Fardaei y col. 2002). Un apoyo adicional a esta hipótesis es la regulación de la
expresión de estas proteínas durante la diferenciación de los mioblastos en mamíferos.
Mientras la expresión de la proteína MBNL se activa en los mioblastos cuando éstos
entran en diferenciación (Miller y col. 2000), la expresión de MBXL se inhibe y su
expresión constitutiva consigue inhibir marcadores de diferenciación terminal como la
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miosina sarcomérica (Squillace y col. 2002). Estos datos son congruentes con una
función de estas proteínas durante la miogénesis. Además, el homólogo de estas
proteínas en Drosophila, la proteína fundadora de la familia, Muscleblind, tiene una
localización nuclear y se activa durante la miogénesis. La expresión de Mbl depende del
regulador miogénico general Dmef2 y se ha implicado en la diferenciación terminal de
la musculatura (Artero y col. 1998).
Figura 1. La proteína MBNL
humana se une específicamente
a
las
repeticiones
(CUG)
expandidas. A la izquierda se
representa que las repeticiones
mayores de 20 copias se pliegan
espontáneamente en horquillas
de RNA de doble cadena mientras que las repeticiones de menos de 10 copias son
principalmente de cadena sencilla. A la derecha se muestra un gel con el resultado de
un ensayo de entrecruzamiento con luz ultravioleta (“UV croslinking”) en el que se
demuestra que la proteína MBNL (marcada como EXP) se une a la secuencia CUG y
que esta unión es proporcional al número de repeticiones CUG (corchete).
Recientemente se ha empezado a aclarar la base molecular de algunos de los
síntomas de la enfermedad DM1 siendo en todos los casos el común denominador una
alteración en la maduración alternativa de genes específicos (Fig.2). La miotonía parece
tener su origen en la maduración anormal del transcrito que codifica para un canal de
cloro específico de músculo (Charlet-B y col. 2002; Mankodi y col. 2002). Una
maduración alterada, desviada hacia una variante poco señalizadora, explica la
resistencia a insulina que presentan los pacientes con DM1 (Savkur y col. 2001). Otras
alteraciones en la maduración de genes específicos son las que afectan a los genes de la
Troponina T cardiaca (Philips y col. 1998), y del gen relacionado con la Miotubularina
(MTMR1; Buj-Bello y col. 2002). Para la maduración del canal de cloro, la Troponina
T Cardiaca y receptor de la insulina se ha demostrado que la alteración en la
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maduración es debida a un aumento de la actividad del factor de maduración CUG-BP.
La relación causal entre el secuestro de Mbl por las expansiones y la alteración en la
actividad de CUG-BP, sin embargo, no se ha aclarado.
Figura 2. Modelo de la base
(CTG)n
DMWD
DMPK
DMPK
la Distrofia Miotónica. Las flechas
CUG-BP
AAA
Muscleblind
molecular de algunos síntomas de
SIX5
ClC-1
IR
cTNT
tau
MTMR1
curvas indican el efecto inhibidor de
Miotonía
Resistencia a insulina
Problemas cardíacos ¿?
las expansiones CTG en el locus
Retraso mental ¿?
?
DMPK sobre la expresión de los
genes cercanos. Las proteínas Mbl
se unen a expansiones CUG quedando aberrantemente secuestradas de su función
normal. Como consecuencia de la presencia de las expansiones, se produce un
incremento en la concentración de la proteína CUG-BP, un factor de maduración de
los transcritos, que provoca una serie de alteraciones en el procesado de ciertos
mensajeros, entre ellos un canal de cloro específico de músculo y un receptor de
insulina.
La proteína Mbl fue identificada y caracterizada molecular y genéticamente por
dos equipos (Artero, 1995; Begemann y col. 1997; Artero y col. 1998). Los embriones
mutantes homocigotos para este gen mueren en el último estadio embrionario no
llegando a eclosionar del huevo en forma de larva (ver Fig.3). Los mutantes mbl
presentan un fenotipo en el que algunas características de la diferenciación terminal de
la musculatura están afectadas, como son la estructura de los sarcómeros y los anclajes
de los músculos a la epidermis de la larva. Los músculos de los embriones mutantes
para
mbl
presentan
características
ultraestructurales
de
hipercontracción
y
desorganización de las bandas Z en los sarcómeros, un defecto también encontrado en
pacientes con DM (Ludatscher y col. 1978). El defecto homólogo a la ausencia de
matriz extracelular en los lugares de anclaje de los músculos a la epidermis podría estar
relacionado con la flexión permanente de las articulaciones (artrogriposis) que se da en
casos congénitos de DM1. Por otra parte, los clones mutantes mbl en ojo de moscas
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adultas muestran defectos en la diferenciación terminal de los fotorreceptores. Estos
fotorreceptores no diferencian la estructura captadora de luz denominada rabdómero
donde se acumulan las rodopsinas. De modo semejante, se han descrito pacientes de
DM1 con pérdidas de fotorreceptores y degeneración de la retina (Harper, 2001). Así
pues, se encuentra una correlación directa entre el fenotipo de los mutantes mbl en
Drosophila y los síntomas de los pacientes con DM1. Esto apoya la hipótesis de que la
ruta de patogénesis en este último caso sea un secuestro aberrante de MBNL, y
probablemente de sus parálogos MBLL y MBXL, lo cual les impide realizar su función
normalmente. Debe tenerse en cuenta en estas comparaciones, además, que el mutante
mbl en Drosophila es completamente nulo para esta función mientras que en los
pacientes con DM1 adultos el secuestro de estas proteínas es probablemente
incompleto.
♀
♂
embrión
mutantes
mbl
pupa
Larva de
er
1 estadio
prepupa
Larva de
o
2 estadio
Larva de 3er estadio
Figura 3. Ciclo de vida de Drosophila. Las
mutaciones en el gen mbl son recesivas y
letales en homocigosis. La letalidad se
produce en las últimas fases del estadio
embrionario de manera que no nacen
larvas mutantes para este gen (X).
El análisis de la unidad de transcripción mbl en Drosophila revela una
organización genómica compleja, con varios exones distribuidos sobre unas 150 kb de
DNA genómico y separados en ocasiones por intrones de hasta 80 kb (Fig.4). El
transcrito mbl primario sigue un patrón de maduración complejo, dando lugar al menos
a cuatro mRNAs por procesado alternativo. Estos cuatro mRNAs, denominados mblA,
mblB, mblC y mblD comparten la secuencia 5´-UTR y los primeros dos exones
(incluyendo el ATG y el extremo N-terminal de las proteínas codificadas) pero se
diferencian en sus porciones 3´ dando lugar a cuatro ORFs de diferentes longitudes y
extremos C-terminales. Aunque se desconoce la expresión específica de tejido de cada
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una de estas isoformas proteicas, si que se han producido anticuerpos que reconocen la
región común a todas ellas mostrando que la proteína Mbl se expresa en toda la
musculatura somática del embrión así como en el sistema nervioso central (SNC) (ver
Fig.5). Existen distintas inserciones de elementos P en el locus mbl que han servido para
generar mutantes nulos de este gen (ver Fig.4). Una de estas mutaciones nulas, el alelo
mblE27 consiste en una pequeña deleción que elimina completamente el primer y
segundo exón del locus mbl (Fig.4).
Figura 4. Locus genómico
de mbl. La línea horizontal
representa, en el extremo
superior, el DNA genómico
con la distancia expresada
en kilobases. En la parte
superior se representan dos
tipos
de
elementos
genéticos, por una parte inserciones de elementos P (triángulos) y por otra, una
deleción generada por escisión imprecisa del elemento P 55/7 (deleción E27 cuya
extensión se representa con barras horizontales). En la parte inferior se representa la
estructura exón-intrón del locus mbl con los cuatro transcritos primarios generados
mediante procesado alternativo del transcrito primario.
Figura 5. Patrón de expresión de la
proteína
Mbl.
Tinción
de
embriones
silvestres en distintos estadios de desarrollo
con anticuerpo anti-Mbl. La proteína Mbl es
nuclear y se expresa en grandes cantidades
en los últimos estadios del desarrollo
embrionario (11-16). Para cada una de las
fotografías se indica el estadio embrionario
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y los tejidos teñidos. (A) estadio 11, mesodermo cefálico (flecha) y suave señal en el
resto del mesodermo. (B,C) estadio 13, mesodermo visceral (flecha) y somática (flecha
curva). (D) estadio 15, mesodermo somático y visceral y SNC. (E) estadio 16, no hay
expresión en el corazón (flecha). (F) estadio 16, visión lateral. (G) estadio 16, sistema
nervioso central. (H) estadio 16, musculatura faríngea (asterisco) y el órgano de
Bolwig (flecha). (I) detalle que muestra la expresión en Mbl en núcleos celulares
individuales. Figura tomada de Artero et al (1998).
El análisis de las secuencias de la proteína humana y de Drosophila revela una
homología estructural clara (ver Fig.6). La proteína Mbl contiene dos copias de un dedo
de zinc del tipo Cys3His con un espaciado típico de CX7CX6CX3H mientras que todas
las isoformas de la proteína humana, incluida KIAA0248, contiene cuatro copias de
dicho motivo. El origen de los dos últimos dedos de zinc de la proteína humana parece
ser debido a una duplicación de los dos primeros. Este tipo de dedos de zinc se
encuentra también en las proteínas TTP de ratón y PIE-1 en C. elegans. En ambos casos
se ha demostrado que estas proteínas utilizan estos motivos proteicos para unirse a
transcritos específicos y controlar su estabilidad. La conservación estructural de los
dedos de zinc entre estos y otros miembros de esta familia proteica indica que Mbl
puede tener una función molecular relacionada con la estabilidad de transcritos
específicos y que esta función depende de la unión de Mbl a secuencias específicas
semejantes a las ya descritas para otros miembros de la familia.
Figura 6.
MBNL y
Mbl
son
homólogo
s
estructura
les. Análisis de la secuencia primaria de las proteínas Muscleblind. La proteína
humana parece ser el resultado de una duplicación de la proteína completa de la
8
mosca. La primera pareja de dedos de Zinc en la proteína humana tiene un 66% de
aminoácidos idénticos a los de la mosca mientras que la segunda pareja tiene una
identidad del 50%. Las proteínas son mas divergentes en secuencia en su región Cterminal, sin embargo, ambas se caracterizan por poseer regiones altamente
hidrofóbicas. ZF, motivo Zinc-finger; A, región rica en alaninas; TM región predicha
transmembrana; F, región rica en Fenilalaninas; CK2 y PKC, sitios de fosforilación
para los enzimas caseína kinasa 2 y proteína kinasa C respectivamente.
Las limitaciones éticas que impone la experimentación en humanos hacen
necesario el uso de organismos modelo en los que estudiar enfermedades tales como la
Distrofia Miotónica. Estos organismos modelo han de combinar la facilidad de
manipulación con la relevancia de los descubrimientos que se realicen en ellos.
Drosophila combina idealmente bien ambos criterios ya que posee un ciclo de vida
corto (12 días, ver Fig.3) y produce gran cantidad de descendencia. Además, por ser el
organismo modelo objeto de estudio de Genétistas durante mas de 70 años se han
desarrollado una amplia variedad técnicas y herramientas de estudio que ofrecen
enormes ventajas para la experimentación. Drosophila también posee un genoma que es
una versión simplificada del genoma humano lo que se traduce en una menor
redundancia genética. Así, por ejemplo, existen 3 genes mbl humanos y solo uno en
Drosophila. Estas ventajas experimentales no impiden que los descubrimientos en
Drosophila sean relevantes en biomedicina. Todas las rutas de señalización importantes
están conservadas entre Drosophila y humanos y también lo están muchos procesos
biológicos que van desde el aprendizaje al sueño. En nuestro caso, para demostrar que
Drosophila es un modelo adecuado para estudiar la ruta de patogénesis de la DM,
decidimos evaluar el grado de conservación funcional entre Mbl y sus homólogos
estructurales humanos. Si la proteína humana es capaz de sustituir a la de insecto en
algunas o todas las funciones podemos concluir que ambas proteínas están ejerciendo
un papel molecular equivalente y nuestros descubrimientos en Drosophila serán
extrapolables a humanos. El test más estricto para demostrar dicha conservación
funcional consiste en la sustitución del gen de la mosca por el gen humano
comprobando que se produce una recuperación en el fenotipo mutante para mbl (ver
Fig.7)
9
normal
mutante
mutante
Figura
MBNL
7.
Estrategia
experimento
de
para
un
de
un
rescate
fenotipo mutante. Las mutaciones en
el locus mbl han sido descritas como
recesivas
y
letales
en
estadio
embrionario tardío de manera que los
embriones mutantes mbl no llegan a eclosionar del huevo en forma de larva (columna
central). Para comprobar el grado en el que la proteína humana MBNL puede
funcionar in vivo en Drosophila, nos servimos de técnicas genéticas para expresar
artificialmente este gen en embriones mutantes para el locus mbl (columna derecha,
producto del gen MBNL representado en verde). Si la proteína humana es funcional
veremos que hay rescate, esto es, una mejoría en el fenotipo mutante (columna
izquierda, el rescate se representa por la llegada hasta el estadio de larva), si no es
funcional en absoluto, no veremos ningun cambio (no representado).
OBJETIVOS
Un primer objetivo del trabajo de investigación que aquí se presenta es
demostrar que el gen mbl de Drosophila y el gen MBNL humano, son también
homólogos funcionales, es decir, a pesar de ser tan distantes evolutivamente, ambas
proteínas son intercambiables de manera que, en ausencia de una de ellas, la otra puede
sustituirle en su función. La confirmación de la homología funcional entre la proteína de
la mosca y la humana abriría un abanico de posibilidades para el estudio de la Distrofia
miotónica, ya que demostraría que la información molecular y genética que se obtenga a
partir de los estudios de mbl en la mosca podrían ser directamente exportables a
humanos. Hay que destacar una vez más, el hecho de que en la mosca exista una sola
copia del gen muscleblind y no tres, como en humanos, simplificando la obtención y el
análisis de los resultados tanto genéticos como bioquímicos.
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En segundo lugar, nos proponemos averiguar la causa primaria de la letalidad de
los mutantes mbl, es decir, identificaremos en qué tejido la falta de función de mbl es
responsable de la muerte de los mutantes ya que, la expresión del gen humano dirigida
exclusivamente hacia ese tejido será capaz de rescatar el fenotipo mientras que la
expresión exclusiva en otros tejidos no lo hará. Por ejemplo, si la expresión de la
proteína MBNL en el músculo es capaz de rescatar el fenotipo pero no lo hace la
expresión en el SNC podemos concluir que mbl es requerido en el tejido muscular para
la supervivencia hasta el estadio de larva.
METODOLOGÍA
1. SISTEMA GAL4/UAS
El sistema GAL4/UAS (Brand y Perrimon, 1993; ver Fig. 8) permite dirigir la
expresión de una proteína de interés bajo un patrón de expresión deseado. Este sistema
hace uso del factor de transcripción de levadura GAL4 y de su unión a las secuencias
reguladoras llamadas UAS de manera que, por un lado, se construye una línea de
moscas transgénicas que contenga en su genoma una construcción donde la región
codificante de la proteína GAL4 este bajo el control de las regiones reguladoras de
interés (Enhancer Z) y que reciben el nombre de drivers. Por otro lado, se construye otra
línea de moscas que contengan en su genoma una construcción donde la región
codificante del gen de interés (gen X) quede bajo el control de las secuencias
reguladoras de la transcripción UAS. Al cruzar estas dos líneas de moscas se obtienen
descendientes que contienen ambas construcciones (GAL4 y UAS) de manera que, el
enhancer Z dirigirá la expresión de la proteína GAL4 según su propio patrón y esta
proteína GAL4 se unirá a las secuencias reguladoras UAS que dirigirán a su vez la
expresión del gen X. De esta forma, lo que finalmente conseguimos es que el gen X se
exprese bajo el control del enhancer Z. Nótese que debido a la natulareza binaria del
sistema (línea UAS y línea GAL) la expresión de un mismo gen de interés puede ser
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dirigida a distintas tejidos sin necesidad de generar nuevas moscas por transformación
de la línea germinal
Línea GAL4
Línea UAS
Figura 8. Sistema de expresión
dirigida GAL4/UAS. La línea
GAL4 expresa constitutivamente
la proteína GAL4 bajo el patrón
de expresión de la región
GAL4
enhancer Z
GAL4
Expresión específica de tejido de Gal4
UAS
gen X
Activación transcripcional del gen X
reguladora elegida. La línea
UAS solo expresará el gen X
cuando exista proteína GAL4 en la célula y esto solo ocurrirá en la descendencia
resultante del cruce entre ambas líneas de moscas.
2. CRUCES GENÉTICOS
Para comprobar si MBNL es el homólogo funcional del gen muscleblind
haremos uso del sistema GAL4/UAS. Necesitamos disponer, por un lado, de una cepa
de moscas que contenga una construcción UAS con el gen humano a testar, en nuestro
caso el de la isoforma kiaa0428 del gen MBNL (línea UAS). Esta construcción incluye
como marcador fenotípico para identificar a los transformantes una copia silvestre del
gen white (w+). Por cruces genéticos se hace homocigota en un fondo genético mutante
mbl en heterocigosis (stock 3, Fig. 9). Por otro lado, necesitamos una cepa de moscas
que contenga una construcción GAL4 con el promotor adecuado (línea GAL4). En
nuestro caso nos decidimos por una línea Gal4 que sigue el patrón de expresión del gen
Dmef2 debido a que este gen se expresa en toda la musculatura del embrión solapando
su expresión con la de mbl. Esta línea también está marcada fenotípicamente con w+ , y
de igual manera, la haremos homocigota en un fondo genético mutante mbl en
heterocigosis (stock 4 Fig. 9)
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Al cruzar estas dos cepas de moscas se van a generar, entre otros, embriones
mutantes mbl homocigotos en los que ocurre expresión del gen humano MBNL en el
sistema muscular. En caso de que ocurra rescate, una posibilidad es que los embriones
mutantes lleguen a nacer como larvas de primer estadio. Necesitamos pues, un marcador
fenotípico en estadio larvario que nos permita identificar a estos embriones mbl
homocigotos que superan el estadio embrionario y que emergen del huevo. Si partimos
de cepas con un fondo genético yellow – white y con la mutación mbl equilibrada con
un cromosoma CyO que contenga una copia salvaje del gen yellow (CyO - y+),
conseguimos dicho sistema ya que, la mutación yellow, que en adultos genera un
fenotipo característico de cuerpo amarillo, puede visualizarse en las mandíbulas y
dentículos de las larvas, de manera que, solo las larvas con dos copias mutantes de mbl
(y que por tanto no tienen el cromosoma equilibrador marcado con y+ ) tendrán las
mandíbulas amarillas (ver Fig. 9).
Figura 9. Esquema de trabajo para la obtención de las cepas para el experimento de
rescate fenotípico
Los cromosomas quedan separados por puntos y comas (;) y por líneas verticales
cuando se indica el genotipo de la descendencia (½). El cromosoma Y se indica
mediante el símbolo ( p ) . Cuando los dos cromosomas están en homocigosis solo se
escribe una copia. El símbolo (+) indica la versión silvestre del cromosoma al que se
opone. Las cruces (X) representan el cruzamiento entre machos y hembras de las dos
cepas implicadas. Las flechas verticales (â) indican la descendencia de dicho cruce y
las flechas curvas (Q) un cruce entre los machos y las hembras seleccionados que
queda indicado por el globo sombreado en verde. Las hembras vírgenes son indicadas
como (
). Para facilitar el seguimiento de la estrategia empleada en el diseño de los
cruces indicamos a continuación las características fenotípicas de los marcadores
génicos utilizados y su tipo de herencia. Para todos ellos hemos seguido las
indicaciones de nomenclatura recomendadas en la base de datos Flybase
(http://www.flybase.org) : y (yellow), mutación recesiva cuerpo amarillo; w (white),
mutación recesiva ojos blancos; Gla (Glazed), mutación dominante ojos cristalinos;
mblE27 (muscleblind), alelo recesivo de muscleblind; wgsp1 (wingless), alelo dominante
quetas axila; Ki (kinked), mutación dominante quetas ángulo recto; Sb (Stubble),
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mutación dominante quetas cortas; ryrk (rosy), mutación dominante ojos rosa fuerte;
CyO, cromosoma equilibrador con mutación dominante alas curvas (Cy); TM3,
cromosoma balanceador con mutación dominante quetas cortas (Sb); UAS –
MBNLkiaa , construcción UAS con el cDNA Kiaa de MBNLkiaa ; twi - Gal4,
construcción Gal4 con el enhancer del gen twist ; Dmef2 - Gal4, construcción Gal4 con
el enhancer del gen Dmef2.
Construcción de la línea UAS-MBNLkiaa para el rescate
En el laboratorio partíamos de una cepa muscleblind balanceada con CyO en un
fondo mutante white. El primer paso era, pues, obtener una cepa muscleblind
equilibrada con un cromosoma CyO que contuviese una copia silvestre del gen yellow
(y+) y que estuviera en un fondo mutante yellow – white [stock 1].
Por otro lado, teníamos una línea UAS-MBNLkiaa localizada en el cromosoma
3 del genoma. Esta línea fue generada mediante transformación de la línea germinal
(Sprandling, 1982) en un fondo white y estaba equilibrada con el cromosoma TM3. En
este caso debíamos hacer dos cosas, conseguir introducir el cromosoma UASMBNLkiaa en un fondo yellow-white y marcar el cromosoma 2 equilibrando una
mutación dominante con un cromosoma CyO - y+ [stock 2]. De este modo, el cruce
entre hembras del stock 1 y machos del stock 2 nos permite obtener moscas que
contienen la construcción UAS-MBNLkiaa en heterocigosis, en el fondo yellow-white
adecuado y con una copia de mbl mutada frente al cromosoma equilibrador CyO - y+.
Por autocruzamiento entre estos machos y hembras podemos establecer una línea UASMBNLkiaa homocigota [stock 3]
Construcción de la línea Dmef2-GAL4 para el rescate
Partíamos de una línea con dos construcciones GAL4 diferentes aunque sólo una
de ellas nos interesaba. El cromosoma 2 contenía twi-GAL4 y el cromosoma 3, Dmef2GAL4, la de nuestro interés, todo ello en un fondo genético yellow-white. Disponíamos
de una línea doblemente marcada con dos mutaciones dominantes y equilibrada en los
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cromosomas 2 y 3 que utilizamos para poner las construcciones GAL4 sobre
mutaciones dominantes de modo que pudiéramos seleccionar Dmef2-GAL4 y perder
twi-GAL4. Por autocruzamiento de estos machos y hembras conseguimos establecer
una línea Dmef2-GAL4 homocigota [stock 4]
3. EXPERIMENTO DE RESCATE
Para llevar a cabo el experimento de rescate procedimos a realizar el cruce entre
hembras vírgenes del stock 3 y machos del stock 4 de la siguiente manera (ver Fig.10).
Aproximadamente 40 hembras vírgenes y 20 machos fueron puestos en un sistema de
recogida de huevos. Tras un periodo de habituamiento de 24 horas se procedió a un
cambio de placa cada 20 horas aproximadamente. Los huevos de cada placa retirada (de
edad comprendida entre 0 y 20 horas) eran dispuestos en una nueva placa en pequeños
grupos de entre 4-6 huevos para facilitar posteriormente el contaje. Pasadas
aproximadamente 24 horas desde que una placa había sido puesta se empezó el contaje
de las larvas nacidas (larvas primer estadio) clasificándolas como normales si poseían
mandíbulas negras (fenotipo silvestre) o como rescatadas si poseían mandíbulas
amarillas (fenotipo yellow). El número de larvas emergidas se anotó diariamente. Las
larvas silvestres se sacan de la placa y se sacrifican y las rescatadas se pasan a una placa
nueva para hacer un seguimiento del periodo de supervivencia.
Figura 10. Procedimiento del
experimento de rescate. El
sistema de recogida de huevos
consiste en un recipiente al que
se acopla una placa con un
medio sobre el que las moscas
tienen
preferencia
para
depositar los huevos. La placa
pueden ser retirada tras una ventana de tiempo determinada, en nuestro caso, 20 horas
15
aproximadamente, de manera que bajo el microscopio puede hacerse un seguimiento
del desarrollo de los huevos hasta su eclosión como larvas de primer estadio. Se van
contando las larvas nacidas de mandíbulas negras y amarillas, estas últimas son
trasladadas a una nueva placa donde se hace un seguimiento del número de horas que
sobreviven.
4. PREPARACIONES DE CUTíCULA
Para evaluar el abdomen contraído de los mutantes mblE27 y de los embriones
rescatados se hicieron preparaciones de cutícula siguiendo protocolos estándar (ver
Stern y Sucena, 2000)
RESULTADOS
Los stocks 3 y 4 descritos en el apartado de metodología fueron cruzados para
generar embriones mutantes homocigotos mblE27 que al mismo tiempo expresan la
proteína humana MBNL con un patrón general de musculatura (Dmef2). Con el fin de
evaluar el grado de rescate de estos embriones, decidimos centrarnos en dos criterios: a)
la viabilidad de los embriones, y en concreto, el % de embriones que superaban la
letalidad embrionaria típica de mblE27 y b) la mejora en un carácter morfológico; el
abdomen característicamente contraído de estos mutantes.
La expresión de MBNL en la musculatura de embriones homocigotos mblE27 mejora
notablemente su viabilidad
La mutación mblE27 ha sido descrita como letal en fase embrionaria tardía (ver
material suplementario, video 1 y 2). Nuestro primer experimento se dirigió a confirmar
estas observaciones y ha establecer el porcentaje de mutantes mbl que superaban la
letalidad en la fase embrionaria según nuestras condiciones experimentales. En un
primer estudio piloto en el que se contaron un total de 238 larvas nacidas se obtuvo un
porcentaje sobre el número de larvas mutantes esperadas (mblE27/mblE27) del 1.3%. En
un segundo experimento control se analizaron 543 larvas y se obtuvo un porcentaje del
16
1.4%. En paralelo a estos dos experimentos control se realizaron sendos experimentos
para determinar el porcentaje de larvas mutantes rescatadas con el gen humano
(genotipo mblE27/mblE27; Dmef2-Gal4>UAS-MBNL). En el experimento piloto
(experimento 1) se contaron un total de 74 larvas de primer estadio de las cuales 67 eran
normales (mandíbulas oscuras) y 7 rescatadas (mandíbulas amarillas). Esto supone un
10% de larvas rescatadas sobre el total de larvas nacidas. Expresando este porcentaje
sobre el número de larvas mutantes esperadas (33%, ver descendencia del cruce de
rescate, Fig.9) el porcentaje es del 29.0% (ver grafico 1). Se realizó un segundo
experimento (experimento 2) de rescate en el que se contaron un total de 730 larvas
nacidas, de las cuales, 618 eran normales y 112 rescatadas. El porcentaje de larvas
mutantes rescatadas expresado sobre el número de larvas mutantes esperadas fue
sensiblemente superior, el 46.5% (ver material suplementario, video 3).
Material suplementario. A) Video 1. Larva silvestre de primer estadio.
Obsérvese el color oscuro de las mandíbulas (3 puntos en la parte anterior
de la larva). B) Video 2. Embrión mutante homocigoto para mbl en el último estadio
embrionario. A menudo se puede observar a estos embriones realizando movimientos
para salir del huevo, sin embargo, estos movimientos son menos enérgicos y frecuentes
de lo habitual y los mutante mbl mueren antes de conseguir eclosionar. C) Video 3.
Larva mbl rescatada de primer estadio. Estas larvas presentan por lo general cierta
dificultad para moverse sin embargo, gracias al aporte de proteína Mbl humana,
consiguen sobrevivir más de
20 horas. Obsérvese el color amarillento de las
mandíbulas.
Las larvas rescatadas fueron mantenidas en placas con comida para evaluar su
grado de rescate. En todos los casos, estas larvas mostraron una supervivencia de hasta
un día (12-24), pero no se observó ninguna muda a larva de segundo estadio
probablemente porque no se recuperó totalmente la funcionalidad de los músculos que
ayudan a la larva a alimentarse o mudar o, probablemente, debido a un requerimiento de
mbl en el SNC donde también se expresa.
17
La interpretación de estos datos demuestra que MBNL puede sustituir, al menos
parcialmente, a mbl en su función, ya que el porcentaje de larvas mbl homocigotas
nacidas se incrementa significativamente cuando les aportamos MBNL. Por otra parte,
estos resultados indican que no existe una segunda mutación responsable de la letalidad
embrionaria en la línea mblE27 empleada, esto es, que no existe otra mutación letal
embrionaria sobre el mismo cromosoma que la mutación mblE27, ya que si la hubiera
aunque la función de mbl fuera rescatada por la proteína humana, esta segunda mutación
impediría el nacimiento de los embriones.
Gráfico
1.
Datos
del
rescate
del
fenotipo
muscleblind por
el gen humano
MBNL.
Se
representa
el
porcentaje de larvas mutantes rescatadas cuyo genotipo se indica como y w;
mblE27/mblE27; UAS- MBNL/Dmef2-Gal4 sobre el número de larvas mutantes
esperadas. También se representa un control (mblE27/mblE27) que consiste en un contaje
en paralelo del número de larvas emergidas en la misma cepa mutante para mbl sin
ningún aporte de proteína MBNL exógeno.
En los embriones mutantes mblE27rescatados se reduce una contracción del abdomen
característica
La cutícula de los embriones de Drosophila diferencia un patrón de bandas
ventrales de unas estructuras quitinosas llamadas dentículos. Estos dentículos nos sirven
como marcadores morfológicos del grado de contracción del abdomen, lo que, a su vez,
resulta un indicador del grado de contracción de la musculatura subyacente. Se ha
18
descrito que los mutantes mblE27/ mblE27presentan un fenotipo de abdomen contraído.
Con el fin de encontrar evidencias morfológicas del rescate producido por el gen
humano se hicieron preparaciones de cutícula de embriones en el último estadio del
desarrollo (ver métodos). La comparación entre los embriones mutantes mblE27y los
embriones mutantes rescatados ( y,w; mblE27/ mblE27: UAS-MBNL/Dmef2-Gal4)
muestra que, efectivamente, los embriones rescatados presentan un abdomen menos
contraído que el del mutante no rescatado (ver Fig.11).
Figura
A
B
C
Preparaciones
mblE27; UAS-MBNLkiaa<Dmef2-GAL4
11.
de
cutícula. (A) visión
ventral de un embrión
silvestre, (B) visión ventral de un embrión mutante mbl, se observa un abdomen
contraído que hace que la separación entre los dentículos (regiones oscuras) se
acorten, (C) visión ventro-lateral de un embrión mutante mbl rescatado con el gen
humano, se observa un abdomen menos contraído que en el mutante mbl de manera
que se parece más al embrión silvestre.
En su conjunto, los resultados obtenidos permiten concluir que se ha demostrado
que la proteína humana y su homólogo en la mosca son homólogos funcionales y, por
tanto, las observaciones y estudios en Drosophila son relevantes y extrapolables a la
función de MBNL en humanos. El hecho de que Dmef2, el driver elegido para dirigir la
expresión del gen humano, sólo se exprese en el sistema muscular indica que la causa
primaria de la letalidad embrionaria de los mutantes mbl esta en el defecto muscular ya
que cuando la función de mbl en el músculo es rescatada (en este caso por la proteína
humana) desaparece la letalidad en ese estadio. Nótese que, aunque mbl se expresa
también en el SNC (ver Fig.8), nuestros resultados demuestran que mbl no es requerido
en este tejido para la viabilidad de la larva de primer estadio.
19
DISCUSION
En este proyecto nos planteamos el uso de Drosophila como organismo modelo
para el estudio de la Distrofia miotónica. Como una primera aproximación para
establecer la validez de Drosophila en estos estudios nos propusimos demostrar que la
proteína humana MBNL y la proteína Mbl de Drosophila eran homólogas
funcionalmente y por tanto intercambiables in vivo. Para ello utilizamos el sistema
UAS/GAL4 que nos permitió expresar la isoforma proteica MBNLkiaa en moscas
mutantes muscleblind. De esta manera, si la proteína humana era capaz de hacer la
función de la proteína Mbl, los mutantes para esta proteína, que normalmente mueren en
estadio embrionario, serian capaces de proseguir su desarrollo hasta larvas. Así pues
dirigimos la expresión de la isoforma proteica MBNLkiaa a toda la musculatura
somática (Dmef2-MBNLkiaa). Los resultados obtenidos en los experimentos de rescate
muestran un aumento significativo del número de embriones mutantes muscleblind que
llegan a larva de primer estadio cuando se les aporta proteína humana MBNL exógena.
Además, utilizando un criterio independiente para medir el rescate comprobamos una
reducción en el fenotipo de abdomen contraído. En su conjunto, estos datos demuestran
la homología funcional entre estas dos proteínas.
Aunque en nuestros experimentos encontramos un rescate de la letalidad
embrionaria este rescate es parcial en cuanto a la "cantidad" del rescate, esto es, el
porcentaje de individuos rescatados no llega al 100%. En cuanto a la "calidad" del
rescate, ya que los embriones rescatados no son capaces de completar el ciclo de vida.
Este rescate parcial, en sus dos variantes, puede deberse a varias causas. En primer lugar
hay que tener en cuenta que cada gen posee un patrón espacio-temporal de expresión, es
decir, cada gen se expresa de forma natural, en unos tejidos y en un momento del
desarrollo determinados y no en otros. Este patrón de expresión viene determinado para
cada gen, principalmente, por las regiones reguladoras de la transcripción. En los
experimentos de rescate la situación ideal sería expresar el gen humano con el patrón
endógeno exacto y observar entonces el grado de rescate. Sin embargo, no siempre se
conocen las regiones reguladoras de un gen, como en el caso de mbl, por esta razón, en
20
nuestro experimento hemos tenido que utilizar las regiones reguladoras del gen Dmef2
que dirige la expresión a toda la musculatura. Por tanto, en nuestro experimento no
esperábamos un rescate total del fenotipo de las moscas mutantes mbl puesto que no se
ha podido reproducir el patrón espacio-temporal de expresión.
Por otro lado, también hay que tener en cuenta que, como se ha comentado
anteriormente (ver introducción), existen distintas isoformas proteicas para Mbl . Estas
isoformas podrían tener funciones específicas en determinados tejidos y estar sujetas
cada una de ellas a un patrón espacio-temporal de expresión ligeramente diferente. Los
tres genes humanos de muscleblind también presentan un completo procesado
alternativo de manera que podría existir alguna conservación funcional especifica de
isoforma entre las proteínas humanas y de Drosophila. En este experimento de rescate
se ha trabajado con uno de los genes humanos, MBNL y en concreto con una de sus
cinco isoformas, KIAA2048 de manera que podría estar siendo expresada en lugares y
momentos del desarrollo donde su isoforma homóloga no lo hace. Además y en
cualquier caso, faltaría en esos embriones la función específica desarrollada por el resto
de isoformas.
Por último, también hay que tener en consideración que podrían existir aspectos
de la función mbl que son propios de la proteína de la mosca de manera que la humana
no puede sustituirla. Si esto ocurriese tampoco podríamos conseguir un rescate total del
fenotipo mutante mbl.
Algunas de las razones por las que ocurre este rescate parcial se pueden
comprobar experimentalmente y para ello nos planteamos una serie de experimentos
futuros. Actualmente estamos realizando los cruces genéticos necesarios para realizar
experimentos de rescate dirigiendo la expresión de la proteína humana a otros tejidos
(elav-GAL4, expresión en el SNC; da-GAL4, expresión general en todo el embrión). De
este modo, podremos determinar en qué tejidos se conserva la función de las dos
proteínas y en cuales no. Además, nos proponemos realizar experimentos similares de
rescate pero utilizando los otros genes humanos homólogos a mbl (MBLL y MBXL) ya
que, aunque la conservación estructural es ligeramente inferior, podríamos obtener
21
grados de rescate superiores en determinados tejidos, dependiendo de la especificidad
de función de estos tres parálogos humanos. Por otro lado, para investigar en qué
aspectos y en qué medida se produce el rescate del fenotipo mbl por la proteína humana
pueden realizarse diferentes pruebas sobre los embriones y larvas rescatadas. Por
ejemplo, sería interesante ver si los defectos ultraestructurales de la musculatura de los
mutantes mbl, como la desorganización de las bandas Z, están rescatados. De igual
manera, sería interesante comprobar si se ha producido alguna mejoría en los anclajes
de los músculos a la epidermis (ver introducción).
BIBLIOGRAFIA
Artero, R. (1995). Caracterización molecular de la región 54A de Drosophila
melanogaster. Tesis Doctoral. Dept Genética. Univ. Valencia.
Artero, R., Prokop, A., Paricio, N., Begemann, G., Pueyo, I., Mlodzik, M., PérezAlonso, M. and Baylies, M. K. (1998). The muscleblind gene participates in the
organization of Z-bands and epidermal attachments of Drosophila muscles and is
regulated by Dmef2. Developmental Biology 195, 131-143.
Begemann, G., Paricio, N., Artero, R., Kiss, I., Pérez-Alonso, M. and Mlodzik, M.
(1997). muscleblind, a gene required for photoreceptor differentiation in
Drosophila, encodes novel nuclear Cys3His-type zinc-finger-containing proteins.
Development 124, 4321-4331.
Brand, A.H and Perrimon, N. (1993). Targeted gene expression as a means of altering
cell fates and generating fominant phenotypes. Development 118. 401-415
Buj-Bello, A., Furling, D., Tronchere, H., Laporte, J., Lerouge, T., Butler-Browne, G. S.
and Mandel, J. L. (2002). Muscle-specific alternative splicing of myotubularinrelated 1 gene is impaired in DM1 muscle cells. Human Molecular Genetics 11,
2297-2307.
Charlet-B, N., Savkur, R. S., Singh, G., Philips, A. V., Grice, E. A. and Cooper, T. A.
(2002). Loss of the muscle-specific chloride channel in type 1 Myotonic Dystrophy
due to misregulated alternative splicing. Molecular Cell 10, 45-53.
22
Fardaei, M., Rogers, M. T., Thorpe, H. M., Larkin, K., Hamshere, M. G., Harper, P. S.
and Brook, J. D. (2002). Three proteins, MBNL, MBLL and MBXL, co-localize in
vivo with nuclear foci of expanded-repeat transcripts in DM1 and DM2 cells. Hum
Mol Genet 11, 805-814.
Frisch, R., Singleton, K. R., Moses, P. A., Gonzalez, I. L., Carango, P., Marks, H. G.
and Funanage, V. L. (2001). Effect of triplet repeat expansion on chromatin
structure and expression of DMPK and neighboring genes, SIX5 and DMWD, in
Myotonic Dystrophy. Molecular Genetics and Metabolism 74, 281-291.
Harper, P. S. (2001). Myotonic Dystrophy: Harcourt Publishers.
Lai, W.S., Kennington, E.A. y Blackshear, P.J. (2002). Interactions of CCCH zinc
finger proteins with mRNA. The Journal of Biological Chemistry 277: 9606-9613.
Ludatscher, R. M., Kerner, H., Amikam, S. and Gellei, B. (1978). Myotonia dystrophica
with heart involvement: an electron microscopic study of skeletal, cardiac, and
smooth muscle. Journal of Clinical Pathology 31, 1057-1064.
Mankodi, A., Masanori, P., Takahashi, H. J., Beck, C. L., Bowers, W. J., Moxley, R. T.,
Cannon, S. C. and Thornton, C. A. (2002). Expanded CUG repeats trigger aberrant
splicing of ClC-1 chloride channel pre-mRNA and hyperexcitability of skeletal
muscle in Myotonic Dystrophy. Molecular Cell 10, 35-44.
Miller, J. W., Urbinati, C. R., Teng-umnuay, P., Stenberg, M. G., Byrne, B. J.,
Thornton, C. A. and Swanson, M. S. (2000). Recruitment of human muscleblind
proteins to (CUG)n expansions associated with myotonic dystrophy. The EMBO
Journal 19, 4439-4448.
Philips, A. V., Timchenko, L. T. and Cooper, T. A. (1998). Disruption of splicing
regulated by a CUG-binding protein in myotonic dystrophy. Science 280, 737-741.
Savkur, R. S., Philips, A. V. and Cooper, T. A. (2001). Aberrant regulation of insulin
receptor alternative splicing is associated with insulin resistance in myotonic
dystrophy. Nature Genetics 29, 40-47.
Sprandling, A. and Rubin, G. (1982). Transposition of clone P elements into Drosophila
germ line chromosomes. Science 218, 341- 447
Squillace, R.M., Chenault, D.M. y Wang, E.H. (2002). Inhibition of muscle
differentiation by the novel Muscleblind-related protein CHCR
23
Stern, D.L and Sucena, E. 2000. Preparation of Larval and Adult Cuticles for light
Microscopy. In Drosophila Protocols. (ed. Sullivan, W. Ashburner, M. and Hawley,
R.S.), pp.601-615. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New
York.
24