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Facultad de Ciencias Veterinarias -UNCPBA- Influencia del Hipoclorito de Sodio en biofilms formados por Escherichia coli Velez, María Victoria - Etcheverría, Analía Inés - Padola, Nora Lía. Agosto, 2016 Tandil Influencia del Hipoclorito de Sodio en biofilms formados por Escherichia coli Tesina de la carrera Licenciatura en Tecnología de los Alimentos presentada como parte de los requisitos para optar al grado de Licenciado del estudiante: Velez, María Victoria. Director: Dra. Nora L. Padola Codirector: Dra Analía I. Etcheverría Evaluador: Tabera, Anahí Agradecimientos: En primer lugar quiero expresar mi agradecimiento a mis directores de tesis: Dra. Analia I. Etcheverría y Dra. Nora L Padola del Departamento de Sanimal y Medicina Preventiva, Facultad de Ciencias Veterinarias, UNCPBA donde se llevó a cabo el presente trabajo. A la Lic. María Emilia Cáceres por confiar en mí, apoyarme y acompañarme a lo largo de toda esta investigación. A mi hermosa familia, tíos y tías, primos y amigas que siempre se preocuparon por mi durante estos años… a Flor, Toyi y Anto por ser incondicionales a lo largo de este camino, y a mi amigo Mauri, afectado de dicha bacteria quien no solo fue fuente de inspiración para este trabajo, sino que lo es día a día para mi vida por su valentía… A mi hermano (y Kala) con quien recorrí todo este camino, por hacerme reír hasta dolerme la cara, por acompañarme, por apoyarme, por aconsejarme durante todos estos años de convivencia que jamás voy a olvidar… Principalmente quiero agradecerles a papa y mama quienes fueron el motor principal de esta meta alcanzada, fuente inspiradora y pilar de cada paso dado no solo profesionalmente sino en la vida misma. Me demostraron que en la superación personal no me encuentro sola. RESUMEN DE TESIS Argentina es el país con mayor incidencia de Síndrome Urémico Hemolítico a nivel mundial. El principal agente causal es la bacteria Escherichia coli, productor de toxinas shiga o verotoxinas (STEC o VTEC), y se las considera como un agente causal de este tipo de patología. Sus víctimas fatales son niños e inmunodeprimidos, por ello como sociedad se debe plantear esta problemática y saber que se puede prevenir. Considerando que a pesar de las prevenciones siguen apareciendo casos, se estudia la posibilidad de la evolución de la bacteria a nivel resistencia. Sabiendo que uno de los mecanismos de defensa es el biofilm, y que éste les permite colonizar gran cantidad y diversidad de ambientes, con el riesgo de contaminar alimentos, lo consideramos un importante punto de estudio. En este trabajo final se plantea como objetivo determinar la capacidad de formar biofilms de siete cepas STEC provenientes de hamburguesas de origen bovino y avícola sobre diferentes superficies inertes y evaluar los efectos que produce el uso de hipoclorito de sodio como desinfectante sobre el biofilm. En primer lugar se analizó genotípicamente la presencia de fimbrias y adhesinas involucradas en la formación de biofilm y luego se evaluó la efectividad del hipoclorito de sodio a diferentes concentraciones y tiempos de exposición sobre la biopelícula en acero inoxidable y poliestireno. Los resultados obtenidos permitieron determinar que las cepas STEC produjeron biofilm en mayor medida sobre poliestireno que sobre acero inoxidable en condiciones óptimas de cultivo y que el hipoclorito no fue efectivo sobre la biopelícula en las condiciones empleadas. Teniendo en cuenta estos resultados destacamos la importancia de prevenir la deposición de residuos orgánicos sobre las superficies y las buenas prácticas de manufactura para disminuir la presencia de STEC y evitar la formación del biofilm. PALABRAS CLAVE: Escherichia coli, biofilm, hipoclorito de sodio, acero inoxidable, polietireno. INDICE INTRODUCCION…………………………………………………………………………….1 CAPITULO 1…………………………………………………………………………............4 MARCO TEORICO………………………………………………………………………….4 Escherichia coli……………………………………………………………………………4 Escherichia coli productor de verotoxinas (STEC) ……………………....5 Otros factores de virulencia y factores de colonización de STEC….8 Vías de transmisión y reservorios de STEC…………………………………..9 Enfermedades transmitidas por los alimentos:……………………….....12 Legislación alimentaria nacional ………………………………………………12 BIOFILM:……………………………………………………………………………………15 Estructura y etapas de la formación de biofilms……………………….15 Importancia de su estudio………………………………………………………...17 Biofilm en industria alimentaria ……………………………………………..18 CAPITULO 2………………………………………………………………………………19 MATERIALES Y METODOS………………………….…………………………………………………….…….20 CARACTERIZACIÓN GENÉTICA DE LAS CEPAS STEC………………….........20 Población de estudio ……………………………………………………………...…….20 Detección de adhesinas por PCR …………………………………………………..20 CARACTERIZACION FENOTIPICA ………………………………………………….22 EXPRESION DE FIMBRIA CURLI …………………………………………………..22 FORMACION DE BIOFILM: ………………………………………..…………………23 ENSAYO PRELIMINAR 1:………………………………………….…………….. 23 ENSAYO PRELIMINAR 2:…………………………………………………………………24 EFECTO DEL HIPOCLORITO DE SODIO SOBRE LA FORMACIÓN DE BIOFILM EN LAS DISTINTAS SUPERFICIES:……………………………….. 1) POLIESTIRENO 25 …………………………………………………………………..26 2) ACERO INOXIDABLE …………………………………………………………28 CAPITULO 3 ………………………………………………………………………….29 RESULTADOS CARACTERIZACIÓN GENÉTICA DE LAS CEPAS STEC… 28 Detección de adhesinas por PCR: …………………………………………...28 RESULADOS DE CARACTERIZACION FENOTIPICA……………………29 EXPRESION DE FIMBRIA CURLI………………………………………………29 ENSAYO PRELIMINAR 1………………………………………………………….33 ENSAYO PRELIMINAR 2………………………………………………………….33 EFECTO DEL HIPOCLORITO DE SODIO SOBRE LA FORMACION DE BIOFILM EN LAS DISTINTAS SUPERFICIES: …………………………34 DISCUSIÓN:…………………………………………………………………………….43 CONCLUSIONES …………………………………………………………………….46 Bibliografía:…………………………………………………………………………...47 INTRODUCCION Las enfermedades transmitidas por los alimentos (ETA) son en su mayoría consecuencias socioculturales debido a que la mayor proporción de sus afectados están directamente relacionados con los bajos recursos sociales (como la falta de agua potable) y la falta de educación higiénican sin embargo, países desarrollados y en vías de desarrollo son afectados por las mismas (Brusa, V 2015). Argentina es el país con mayor incidencia de Síndrome Urémico Hemolítico a nivel mundial. El principal agente causal es Escherichia coli productor de toxina Shiga (STEC) que agrupa a serotipos aislados de casos de colitis hemorrágica (CH) y síndrome urémico hemolítico (SUH) en humanos (Rivas et al. 2006). La ingesta de alimentos contaminados con STEC ha producido víctimas fatales. La población más afectada son niños y niñas menores de 5 años mayormente inmunodeprimidos (Brusa, V 2015). Teniendo en cuenta que los huéspedes suceptibles son seres indefensos, los conocimientos adquiridos en la carrera Tecnología de los Alimentos pueden ser herramientas válidas para aportar a la prevención, y asi disminuir los casos de esta enfermedad que termina siendo un problema social. Este trabajo se basa en que la prevención juega un papel muy importante, aunque se identifica que las muertes de víctimas inocentes persisten. Frente a esta situación, se plantean las siguientes preguntas de investigación que guiarán el trabajo: ¿Por qué las medidas de prevención no alcanzan y siguen apareciendo casos de SUH? ¿Por qué, a pesar del aumento del control, siguen apareciendo afectados? Las técnicas para prevenir la bacteria ¿son eficaces? Se estima que el 99% de las bacterias crecen formando biofilms, y la presencia del mismo ejerce un enorme impacto en diversos aspectos de la vida (Donlan y Costerton, 2002). Los biofilms o biopelículas se definen como comunidades complejas de microorganismos que crecen embebidos en una matriz orgánica 1 polimérica autoproducida y adherida a una superficie viva o inerte, y que pueden presentar una única especie microbiana o un abanico de especies diferentes Esta organización les permite colonizar gran cantidad y diversidad de ambientes, con el riesgo de contaminar alimentos, y generar infecciones severas para el ser humano haciéndolas resistentes a las condiciones adversas que constituyen factores de estrés asociados con la manipulación, higiene, conservación y composición de materiales y alimentos, como las temperaturas y pH extremos. El biofilm puede incrementar sus capacidades de supervivencia y como consecuencia, los métodos habituales de desinfección o el uso de antibióticos se muestran, a menudo, ineficaces contra las bacterias que habitan en el mismo (Costerton y Greenberg ,1999). El contacto de un alimento con un biofilm puede generar la contaminación del mismo y en caso de ser ingerido es posible la existencia de daños en la salud del consumidor. La hipótesis de este trabajo es que el hipoclorito de sodio produce un efecto inhibitorio sobre la formación de biofilm de STEC en distintas superficies. Para ello se plantearon los siguientes objetivos: Determinar la capacidad de formar biofilm de cepas STEC sobre distintas superficies inertes (poliestireno y acero inoxidable) Evaluar los efectos que produce sobre el biofilm el uso de hipoclorito de sodio como desinfectante en distintas concentraciones. Se seleccionaron al azar 7 cepas STEC, aisladas previamente de hamburguesas de origen bovino y avícola y de carne bovina picada. Se detectaron características genotípicas como la presencia de distintas fimbrias y adhesinas involucradas en la formación de biofilm; y luego se tuvieron en cuenta los siguientes puntos a investigar: Qué medio utilizar para el ensayo Cómo evaluar el desarrollo de biofilm Qué efectividad tiene el hipoclorito ante una E. coli a diferentes concentraciones y tiempos de exposición 2 Qué efecto produce el hipoclorito de sodio sobre el biofilm en acero inoxidable. Qué efecto produce el hipoclorito de sodio sobre poliestireno Los resultados obtenidos permitieron determinar que las cepas STEC produjeron biofilm en mayor medida sobre poliestireno que sobre acero inoxidable en condiciones óptimas de cultivo. Sin embargo hay que tener en cuenta la posibilidad de formación de biofilm existe, y saber que esta sería eliminada con una buena desinfección diaria, no sólo a nivel industrial, sino también a nivel doméstico. Por último, se comprobó que el uso del hipoclorito de sodio como desinfectante afectó la viabilidad de STEC a concentraciones mayores de 5%, por lo que se sugiere esta concentración como solución de uso habitual para disminuir la presencia de STEC y evitar la formación de biofilm. A menor concentración la solución puede ser efectiva pero al requerir un extenso tiempo de contacto con la superficie a desinfectar, puede evaporarse antes de finalizar su actividad como desinfectante. CAPITULO 1 MARCO TEORICO Escherichia coli E. coli es una de las especies bacterianas que forma parte de la familia Enterobacteriaceae; es un bacilo Gram negativo no esporulado, móvil con flagelos periticos o inmóviles, aerobio-anaerobio facultativo, capaz de crecer en medios simples con o sin agregado de cloruro de sodio (NaCl). Como características bioquímicas se pueden mencionar que es fermentadora y oxidativa en medios con glucosa u otros carbohidratos, catalasa positivo, oxidasa negativa y reductora de nitratos a nitritos. Se trata de bacterias de rápido crecimiento y amplia distribución 3 en el suelo, el agua, vegetales y gran variedad de animales, especialmente como flora normal del intestino (Brusa V, 2015; Polifroni R, 2012). En el ser humano dicha bacteria coloniza el tracto gastrointestinal a las pocas horas de vida, y establece con el huésped una relación estable de mutuo beneficio siendo parte de la flora natural. En caso de estar presente en el ambiente, el agua o los alimentos se lo toma como un indicador de contaminación fecal, junto con otro conjunto de bacterias con las que forman el grupo llamado coliformes (Polifroni R, 2012). E. coli se ha clasificado en más de 170 serogrupos. Los aislamientos se pueden determinar serológicamente determinando los antígenos O (porción polisacárido del lipopolisacárido somático o LPS) y H (proteínas flagelares), y se han identificado más de 10000 combinaciones posibles entre éstos (Brusa, V. 2015). Hasta el momento se reconocen seis virotipos de E. coli asociados a infecciones gastrointestinales tanto en animales como en humanos, por lo que se la denomina E. coli diarreagénica, y se distinguen entre ellos por los factores de virulencia: Enterotoxigénica (ETEC) Enteropatogénica (EPEC) Enteroagregativa (EAggEC) Enterohemorrágica (EHEC) Enteroinvasiva (EIEC) De adherencia difusa (DAEC) (Polifroni R 2012). (Figura1. Imagen de E. coli extraída de Centers for Disease control and Prevention http://www.cdc.gov/ecoli/) 4 Escherichia coli productor de verotoxinas (STEC) Este virotipo de E. coli se distingue de los demás por la secreción de toxinas que tienen actividad citotóxica sobre la línea celular Vero. Están codificadas por los genes vt1 y vt2 presentes en fagos lisogénicos insertos en el cromosoma bacteriano (Sandvig, 2001). STEC es un agente causal de patologías graves como la colitis hemorrágica (CH) y el Síndrome Urémico Hemolítico (SUH) (Karmali, 2004). El SUH está definido por la tríada: anemia hemolítica, trombocitopenia y falla renal aguda, precedidas habitualmente por diarrea con sangre. Es una enfermedad que afecta sobre todo a niños (hasta 5 años), ancianos, y personas con inmunidad deprimida. En Argentina, el SUH es una enfermedad endémica que reporta de 450 a 500 casos por año, siendo el país con mayor incidencia de esta patología a nivel mundial. (Angel Villegas, 2014). El reconocimiento de STEC como una clase diferente dentro de los E. coli patógenos entéricos resultó de 2 observaciones epidemiológicas claves. La primera ocurrió en 1982 durante la investigación de brotes de enfermedad intestinal caracterizados por dolor abdominal severo y diarrea acuosa seguida por diarrea con sangre asociada al consumo de hamburguesas poco cocidas en casas de comida rápida. La segunda observación fue informada en 1985, cuando se publicó la asociación de casos esporádicos de SUH con la presencia de citotoxinas libres en materia fecal y aislamiento de STEC de las heces de estos pacientes (Karmali et al., 1985). Si bien las verotoxinas constituyen uno de los factores de virulencia de STEC, ciertas cepas producen un proteína denominada Intimina que está codificada por el gen eae y se encuentra en la isla de patogenicidad LEE (del inglés, “locus for enterocyte effacement”). Este locus está asociado con la adherencia íntima de la bacteria a la célula epitelial, la iniciación de las señales de transducción y la desorganización de las microvellosidades con la formación de la lesión A/E (adherencia y borrado del enterocito). La presencia de LEE le confiere a las cepas STEC mayor virulencia, sin embargo, la presencia de LEE no es esencial para la 5 patogénesis, pues se han notificado casos de enfermedad humana severa, incluyendo casos esporádicos de SUH y brotes, asociados a STEC-LEE-negativas (Rivas, et al. 2006). El serotipo más implicado en brotes de SUH es el O157:H7 que es el que registra la tasa de mortalidad más alta de todo el mundo. Sin embargo, más de cien serotipos, entre ellos no-O157 poseen un potencial patogénico similar, y han sido asociados a casos esporádicos de CH y SUH, por ejemplo: O26:H11, O103:H2 O111:NM, O121:H19, O145:NM, O113:H21, O130:H11 y O178:H19 (Rivas, et al. 2006). La dosis infectante de STEC es reducida, se estima que 50-100 unidades formadoras de colonias (UFC) son suficientes para causar la enfermedad en individuos sanos (Ángel Villegas, N. 2012). Dada la alta tasa de SUH, la carencia de un tratamiento específico, y la alta morbilidad, la prevención primaria de este tipo de infecciones es fundamental para disminuir el impacto sanitario. Otros factores de virulencia y factores de colonización de STEC Como se mencionó anteriormente no solo las cepas productoras de Intimina han sido involucradas en enfermedades en humanos, por lo que se han propuesto y estudiado otras proteínas y factores de colonización que permiten la adherencia tanto a superficies bióticas como abióticas. Otros factores de virulencia de estas cepas son un megaplásmido que codifica para una hemolisina enterohemorrágica (EhxA), una catalasa-peroxidasa (KatP), una serin-proteasa extracelular (EspP), una zinc-metaloproteasa (StcE) y una citotoxinasubtilasa (SubAB). EhxA fue el primer factor de virulencia descripto del plásmido pO157 de la cepa EDL933 O157:H7 y su secuencia es utilizada para el diagnóstico de E. coli O157:H7 y para otras STEC, KatP ayudaría a colonizar el intestino reduciendo el estrés oxidativo, EspP tiene la capacidad de romper la pepsina A y el factor de coagulación humana con lo cual contribuye a la hemorragia de las mucosas en el caso de CH, 6 además favorece la colonización y adherencia en el intestino del bovino. StcE contribuye a la íntima adherencia de esta bacteria a las células huésped. SubAB se ha descripto como un factor de virulencia importante en cepas STEC especialmente LEE-negativas y muestra una actividad citotóxica. En cepas STEC eae-negativas, el megaplásmido posee una adhesina autoaglutinante (Saa) y una nueva proteína propia de STEC perteneciente a la familia de proteínas autotransportadas, que contribuye a la formación de biofilms: Sab (Paton et al., 2001; Herold et al., 2009). Entre los factores considerados importantes para la formación de biofilm en STEC se encuentran la fimbria Curli que es la que está involucrada en la agregación celular y también en la adhesión e invasión en células eucariotas (Barnhart y Chapman, 2006). La expresión de esta fimbria junto con la producción de celulosa, analizados mediante la técnica de Rojo Congo, le confiere a la bacteria un fenotipo llamado “rojo, seco y rugoso” -rdar- (de las siglas en inglés: red, dry and rough) que está asociado a la producción de biofilm en superficies de vidrio y poliestireno, además de promover la formación de una película en la interface aire-líquido. Cuando la bacteria no produce la fimbria curli ni celulosa, las colonias aparecen “blancas y lisas” -saw- (de las siglas en ingles soft and withe) y si sólo producen curli las colonias aparecen “rosadas y lisas” -sar- (Costerton et al., 1999). Otras fimbrias y proteínas que han sido descriptas como factores colonizantes y de adherencia son: Fimbria tipo I (fim), Antígeno 43 (agn 43) (Cookson et al., 2002; Schembri et al., 2002), Iha (Tarr et al, 2000), Fimbria larga polar (lpf) (Torres et al., 2002), Fimbria F9 (Dziva et al., 2004; Low et al., 2006), Efa1 (Nicholls et al., 2000), y pertenecientes a la familia de las AT (proteínas autotransportadoras) EhaABCD y EhaJ encontrados en la cepa O157:H7 EDL 933, que constituye un papel importante en la colonización de las cepas STEC (Wells et al.,2009). 7 Vías de transmisión y reservorios de STEC (Figura 2. Imagen extraída de Fernández D y Padola NL (2012). Escherichia coli verocitotoxigénico: Varias cuestiones... y los tambos también. Revista Argentina de Microbiología 44, 312-323) Los rumiantes, en especial el ganado bovino, son considerados actualmente el principal reservorio de STEC. Pero varias investigaciones han demostrado que no son los únicos focos a los cuales hay que prestarle atención. Los alimentos o subproductos animales como la carne mal cocida, agua, leche o jugos contaminados, yogurt, quesos, mayonesa y vegetales frescos, son los vehículos de transmisión al ser humano más frecuentes. La información precisa sobre la distribución y características de las infecciones humanas por STEC y sobre las 8 variantes regionalmente prevalentes son de gran valor como guía para el control de calidad de los alimentos. En la Argentina, se detectó STEC no-O157 en el 8.4% de hamburguesas supercongeladas y STEC O157 en el 3.9% de productos cárnicos a nivel de boca de expendio (Brusa V. 2015). En el marco del Proyecto Carnicerías Saludables (UNLP, UNCPBA, UNL), se determinó la presencia de STEC O157:H7 y no-O157 en carne picada fresca, picadoras de carne, manipuladores, mesadas y utensilios en 66 comercios minoristas a boca de expendio y se encontró una prevalencia de 36,36%. Respecto de STEC O157:H7 se detectó un 12,12% en carne picada fresca, 7,57% en picadora, 6,06% en mesada y 3,03% en cuchilla y manos del manipulador, mientras que para las cepas STEC no-O157:H7, se obtuvo un 15,15% en carne picada fresca, 12,12% en mesada, 10,6% en picadora, 9,09% en manos y 7,57% en cuchilla (Ruiz et al., 2013). Estos resultados resaltan el riesgo de la influencia de la colonización de superficies abióticas en la contaminación de los alimentos. La mayoría de los estudios realizados en pollos se han orientado a la búsqueda selectiva del serotipo O157:H7, reportando prevalencias entre 1,7% y 9%. Además, varios autores han demostrado que los pollos pueden ser fácil y persistentemente infectados por este microorganismo. En carcasas, la contaminación con STEC se observó en bajas proporciones. Se detectó contaminación con STEC en la superficie externa, interna de diferentes carcasas de pollo. Se considera notable la baja prevalencia de STEC en pollos vivos, pero la contaminación con STEC aumenta con el procesamiento y la manipulación de los productos, especialmente en las hamburguesas de pollo provenientes de carnicerías, sugiriendo la posible contaminación cruzada con carnes de diferentes orígenes (Alonso, MZ. 2012) 9 (Figura 3. Imagen extraída de Alonso, MZ. (2012). Caracterización genotípica de Escherichia coli verocitotoxigénico y Escherichia coli enteropatogénico aisladas de pollo y sus productos. Tesis Doctoral) Enfermedades transmitidas por los alimentos: Según la Constitución de la OMS: "La salud es un estado de completo bienestar físico, mental y social, y no solamente la ausencia de afecciones o enfermedades". Dado que la mitad de los patógenos que afectan al ser humano provienen de los animales, desde el año 2010 la FAO (Food and Agriculture Organization) la Organización mundial de sanidad animal y la Organización mundial de la salud (OMS) se han unido bajo el concepto de “una sola salud” con el objetivo de gestionar los riesgos sanitarios en la interfaz hombre – animal – medio ambiente siguiendo de esta forma el alimento desde el comienzo de su producción hasta su consumo (OIE, 2013). 10 Los principales microorganismos responsables de estas afecciones son Salmonella, Listeria monocytogenes, Campylobacter, Clostridium perfingens, Yersinia enterocolitica y Escherichia coli (Brusa V, 2015). Para lograr disminuir las ETA son importantes las buenas prácticas de manufactura (BPM) y los procedimientos operativos estandarizados de sanitización (POES), con el fin de detectar y controlar focos de posible contaminación durante la cadena de elaboración de alimentos (Brusa, V. 2015) Según la OMS cada año se producen 1700 millones de episodios de diarrea que ocasionan 76 millones de personas enfermas y de éstas, 3 millones de muertes en niños menores de 5 años (OMS, 2015). (Figura 4. Imagen extraída de Fernández D y Padola NL (2012). Escherichia coli verocitotoxigénico: Varias cuestiones... y los tambos también. Revista Argentina de Microbiología 44, 312-323) Legislación alimentaria nacional Teniendo en cuenta que el SUH en Argentina es una de las principales causas pediátricas de insuficiencias renales, en Mayo del 2004 se modificaron algunos artículos que refieren a especificaciones microbiológicas que deben cumplir las 11 carnes picadas frescas, la comida preparada lista para consumo, salazones cocidas, chacinados frescos, y las frutas y hortalizas, respectivamente. Dentro de los criterios microbiológicos especificados se encuentras: AUSENCIA de E. coli O157:H7 en 5 muestras de 65 gr. cada una o AUSENCIA en muestras de 25gr. cada una. Para el análisis de los mismos se usan técnicas como USDA/ISO y BAM/FDA que son específicos para O157:H7 (Brusa V, 2015). En cuanto a aquellas que no son O157:H7 no se realiza en forma generalizada, debido a que no existe reglamentación que incluya la búsqueda de STEC noO:157 en alimentos. Con frecuentes modificaciones las autoridades sanitarias aplicaron el criterio tolerancia cero para STEC en productos como hamburguesas congeladas (Brusa V, 2015). La limpieza y desinfección ocupa uno pilares más importantes para evitar la contaminación biológica en alimentos. Dentro de los desinfectantes más utilizados se encuentra el hipoclorito de sodio (concentración 55 gramos de Cloro activo/Litro), comúnmente llamado lavandina, el cual se utiliza no solo en la industria sino también a nivel doméstico. Para el uso del mismo se tienen en cuenta las siguientes pautas presentadas dentro del Programa Carnicerías Saludables (Leotta, et al., 2014): MODO DE USO: Dilución 10% para material sucio. 30 minutos. En 1lt de Agua 70ml de lavandina cc (1 pocillo) En 2lt de Agua 140ml de lavandina cc (1 taza) En 5lt de Agua 350ml de lavandina cc (2 tazas) En 10lt de Agua 700ml de lavandina cc (4 tazas) Dilución 1% para pisos y mesadas. 10 minutos. En 1lt de Agua 20ml de lavandina cc (1 pocillo) En 2lt de Agua 40ml de lavandina cc (1 taza) 12 En 5lt de Agua 100ml de lavandina cc (2 tazas) En 10lt de Agua 200ml de lavandina cc (4 tazas) BIOFILM: Los biofilms o biopelículas se definen como comunidades complejas de microorganismos que crecen embebidos en una matriz orgánica polimérica autoproducida y adherida a una superficie viva o inerte, y que pueden presentar una única especie microbiana o un abanico de especies diferentes. Las bacterias que forman el biofilm se hallan en lo que se denomina forma sésil, exhibiendo un fenotipo diferente al de esas mismas células en forma unicelular o libre (forma planctónica) con respecto a la tasa de crecimiento y a la transcripción de genes. La formación de biofilms es una estrategia adaptativa de los microorganismos, ya que el crecimiento en biofilm ofrece cuatro ventajas importantes: (I) protege a los microorganismos de la acción de los agentes adversos, (II) incrementa la disponibilidad de nutrientes para su crecimiento, (III) facilita el aprovechamiento del agua, reduciendo la posibilidad de deshidratación y (IV) posibilita la transferencia de material genético (ADN). Todas estas circunstancias pueden incrementar sus capacidades de supervivencia. Como consecuencia, los métodos habituales de desinfección o el uso de antibióticos se muestran a menudo ineficaces contra las bacterias del biofilm (Costerton et al., 1999; Donlan, 2002). Se pueden encontrar biofilms en todos los medios donde existan bacterias: en el medio natural, clínico o industrial. Solo se requiere la presencia de un entorno hidratado y una mínima cantidad de nutrientes, ya que pueden desarrollarse sobre todo tipo de superficies (hidrófobas o hidrófilas, bióticas o abióticas) En la actualidad se considera que, en condiciones ambientales adecuadas, la mayoría los microorganismos son capaces de formar biofilms (Tellez Peña, 2010). Estructura y etapas de la formación de biofilms A pesar que la composición del biofilm es variable en función del sistema de estudio, en general, el componente mayoritario es el agua, que puede representar hasta un 97% del contenido total. La matriz del biofilm es un complejo que está 13 formado principalmente por exopolisacáridos (EPS) y en menor cantidad en el caso de E. coli se encuentran otras macromoléculas como proteínas, ADN y diversos productos procedentes de la lisis de las bacterias (sustancias poliméricas extracelulares). Además, se caracteriza por tener estructuras tridimensionales con canales que facilitan el flujo de agua y nutrientes hasta las zonas más profundas del biofilm (Angel Villegas, 2014). La existencia de estos canales no evita sin embargo, que dentro del biofilm se puedan encontrar diferentes ambientes en los que la concentración de nutrientes, pH u oxígeno sea distinta (Lasa et al., 2009). Esta circunstancia aumenta la heterogeneidad del estado fisiológico en el que se encuentra la bacteria dentro del biofilm, dificultando su estudio y generando un microambiente que le da protección (Angel Villegas, N. 2014). La formación de biofilm es un proceso dinámico y complejo que conlleva la adhesión, colonización y crecimiento de los microorganismos. En él podemos identificar hasta cinco fases (Fig. 5): 1. Adsorción primaria o acondicionamiento de la superficie. Los residuos orgánicos se depositan sobre una superficie creando condiciones propicias para la colonización de microorganismos. 2. Adhesión reversible. Los microorganismos buscan la adhesión a la superficie, la cual se verá afectada por factores como la rugosidad, la temperatura y la carga superficial, y químicos, como la composición del sustrato y del medio, el pH, el oxígeno disuelto, entre otros. 3. Adhesión irreversible. El cambio desde la adhesión reversible a irreversible se produce por la transición desde una interacción débil de la célula con el sustrato hasta un enlace permanente, frecuentemente mediado por la presencia de polímeros y apéndices extracelulares. El crecimiento está limitado por la disponibilidad de nutrientes y la capacidad de las células sésiles para eliminar los residuos propios del metabolismo. 4. Maduración del biofilm. Se establece una arquitectura compleja, con canales, poros y redistribución de bacterias en el sustrato. 14 5. Desprendimiento de bacterias. Se puede dar por distintos procesos (erosión, abrasión, oleaje, siembra) y se puede producir por la escasez de nutrientes o por la presencia de sustancias tóxicas, permitiendo a las células colonizar nuevos ambientes. Otro punto a tener en cuenta es que una microcolonia en división continua libera residuos y nutrientes que podrán utilizarse para acondicionar las superficies desnudas y para alimentar a otras células. (Figura 5. SEDICI: Descripción de biofilms, desarrollo e importancia de su estudio. Impacto de las técnicas de micronanofabricación en sistemas biológicos. http://sedici.unlp.edu.ar) Importancia de su estudio La presencia de biofilms en una gran diversidad de ambientes trae como consecuencia una importante variedad de problemas relacionados tanto con la medicina (infecciones), la industria en general (biocorrosión, pérdida de 15 rendimiento), la industria alimentaria en particular (contaminación microbiana de alimentos), entre otros (Tellez Peña, S. 2010). La mayor parte de las enfermedades infecciosas del siglo pasado eran causadas por bacterias dotadas de mecanismos patogénicos específicos: difteria, tuberculosis, cólera, coqueluche, etc. Los antibióticos y vacunas desarrollados para estas bacterias lograron una notable eficacia en su control. En la actualidad, la frecuencia y gravedad de las infecciones de estas bacterias han sido desplazadas del primer plano por microorganismos ubicuos, capaces de producir infecciones de tipo crónico, que responden pobremente a los tratamientos antibióticos y no pueden prevenirse mediante inmunización. Se ha señalado que por lo menos el 65% de todos los procesos infecciosos bacterianos humanos podrían involucrar la formación de biofilms los que han sido reconocidos progresivamente como factores importantes en la patogenia de muchas infecciones humanas persistentes (Angel Villegas, N. 2014). Biofilm en industria alimentaria En la industria alimentaria es muy común la presencia de biofilms en tuberías, equipos y materiales, ya que pueden formarse en cualquier tipo de superficie, incluyendo plástico, cristal, madera, metal y sobre los alimentos (Chmielewsky y Frank, 2003). Dado que dichas formaciones pueden contener microorganismos patógenos y que los mismos presentan una mayor resistencia a la desinfección, se incrementan las probabilidades de contaminación del producto y de provocar tanto pérdidas económicas (sea por decomiso, deterioro de los alimentos etc.) como infecciones alimentarias. Esta es la razón por la que se considera que la presencia de biofilms en las superficies de contacto de la industria alimentaria constituye un evidente riesgo para la salud. Además del riesgo de contaminación, el desarrollo de biofilms puede interferir en diferentes procesos y causar daños en los equipos, en sistemas de agua potable, obstruir las cañerías o filtros de membranas. En intercambiadores de calor y torres de refrigeración puede reducir la transferencia de calor y como consecuencia su eficiencia en el proceso (Tellez Peña S. 2010). 16 Para la prevención de los riesgos y del costo de los daños que causan los biofilms son necesarios procedimientos de limpieza y desinfección efectivos que prevengan la acumulación de residuos orgánicos en las superficies y espacios reducidos que favorezcan la deposición y colonización bacteriana (Tellez Peña, S. 2010). Por lo anteriormente expuesto, en este estudio se buscará caracterizar genéticamente un grupo de cepas STEC, conocer su capacidad de formar biofilm en condiciones óptimas y evaluar la efectividad del hipoclorito de sodio como sustancia desinfectante contra las biopelículas sobre poliestireno y acero inoxidable. 17 CAPITULO 2 MATERIALES Y METODOS CARACTERIZACIÓN GENÉTICA DE LAS CEPAS STEC Población de estudio: Se trabajó con 7 cepas STEC aisladas de hamburguesas de carne bovina, hamburguesas de pollo y carne bovina picada, pertenecientes al cepario del Laboratorio de Inmunoquímica y Biotecnología de la Facultad de Cs. Veterinarias (Tabla 1). TABLA 1. Cepas STEC utilizadas en esta tesis. N° CEPA Alimento Serotipo Factores de virulencia 1 HT1-6 HAMB* CARNE O20:H19 stx1, stx2, ehxA, saa 2 HT1-14 HAMB CARNE O117:H7 stx2 3 52-1-1 HAMB POLLO O130:H11 stx1, stx2, ehxA, saa 4 170-4-2r HAMB POLLO O113:H21 vt2, ehxA, saa 5 180-3-4r HAMB POLLO O178:H19 vt2 6 HW1-15 HAMB CARNE O22:H8 stx1, stx2, ehxA, saa 7 C23 CARNE PICADA O157:H7 stx2, eae, ehxA * HAMB: Hamburguesa Detección de adhesinas por PCR Se analizó la presencia de 5 genes codificantes de adhesinas y fimbrias: agn43EDL933, aida1, agn43, fimCD y ehaA, mediante la técnica de PCR. Los primers utilizados se detallan en la tabla 2. Los productos de PCR se observaron mediante electroforesis en geles de agarosa al 2% teñidos con Bromuro de etidio. 18 EXTRACCIÓN DEL ADN: De cada cepa conservada a -70ºC se tomó una anzada y se agregó a 500µl de agua bidestilada estéril, se obtuvo ADN por lisis celular en caliente durante 10 min. PCR Se realizaron 2 PCR multiplex con las siguientes composiciones de mix: COKTAIL MULTIPLEX 1: agn43EDL933-aida1-agn43 (vol. final: 25µl) Se utilizaron 2,5 µl de extracto de ADN crudo de cada cepa, 0,2 mM de desoxinucleósidos trifosfatos (dNTPs) (INBIO, HighWay), 0,5 µM de primers para aida1 y agn43EDL933, 0,06 µM de primer para agn43 y 1U de Taq ADN polimerasa (INBIO, HighWay) en 2,5 µl de Buffer de reacción 10X y 20 mM de MgCl2 (INBIO, HighWay). COKTAIL MULTIPLEX 2 : ehaA-fimCD (vol. final: 25µl) Se utilizaron las mismas condiciones que en el anterior, pero con diferentes concentraciones para los primers de: 25 pM para fimCD y para ehaA. Los programas del termociclado fueron los siguientes: PROGRAMA DE TERMOCICLADO 1: PROGRAMA DE TERMOCICLADO 2: Tºi: 95ºC - 1 min Tºi : 95ºC - 2 min 30 ciclos: 30 ciclos: Desnaturalización: 95ºC1 min Desnaturalización: 95ºC45 seg Hibridación: 58ºC1 min Hibridación: 55ºC45 seg Extensión: 72ºC1 min: 20 seg Extensión: 72ºC1 min: 30seg Tºf: 72ºC - 10 min Tºf: 72ºC - 7 min Nombre del programa en el T17: multi.Restieri Nombre de programa en T17: fimCDehaA 19 Tabla 2. Características de los primers utilizados en este estudio. Primers Secuencia 5’ 3’ ehaA F AGGCATGAGACACGATC ehaA R AAGTCGTGCCATTGAGC Amplicón Referencia 500 pb Wu et al. 2010 TCGTTAGGATTCAACAGGAACAGGACAGT fimCD F GAG fimCD R TGCCAGAAGCTTGCAGGGAACAATCCCTT 1154 pb Cookson, et al. (2002) GTT agn43EDL933 F CGTATCGCTGTGCCCGATAAC agn43EDL933 R CCGTATACGAGTTGTCAGAATCA aidaI F ACAGTATCATATGGAGCCACTC aidaI R TGTGCGCCAGAACTATTAATGG agn43 F CTGGAAACCGGTCTGCCCTT agn43 R CCTGAACGCCCAGGGTGATA 707 pb 587 pb 433 pb Restieri et al., 2007 Restieri et al., 2007 Restieri et al., 2007 Se tomaron como controles positivos las siguientes cepas: - E. coli EDL 933 (EHEC O157:H7; stxt1, vt2, eae, ehxA, agn43 EDL933, agn43, fimCD, ehaA). - E coli. 445 (ETEC O157:H19 , aida1) CARACTERIZACION FENOTIPICA EXPRESION DE FIMBRIA CURLI La caracterización fenotípica de la expresión de la fimbria curli se realizó según un método descripto por Polifroni, R (2012), con algunas modificaciones metodológicas con el fin de observar si habría expresión de curli en las cepas de estudio. 20 Se sembró por estría de cada cepa congelada, en una placa de Mac Conckey (24h de incubación 37ºC) Se preparó un cultivo over nigth (ON) en caldo Luria Bertani LB (18h de incubación 37ºC 130 rpm) Se sembró por estría directo de congelado. De cada preparado se sembró por estría en placas de agar rojo Congo (ARC) (Agar LB modificado sin ClNa, suplementado con rojo Congo -40mg/lt y azul brillante G de Coomassie -20mg/L-) por triplicado. Se incubó a 37ºC, 24 y 48h. El ensayo se realizó en dos eventos independientes (A y B). FORMACION DE BIOFILM: ENSAYO PRELIMINAR 1: Debido a que STEC puede crecer en numerosos medios de cultivo, se buscó mediante pruebas preliminares el medio que favorezca el desarrollo de biofilm. 21 Para ello se decidió utilizar caldo (LB) que contiene peptona de caseína y extracto de levadura que proporcionan al medio los nutrientes necesarios para el desarrollo óptimo de la mayoría de los microorganismos y ClNa que ayuda a mantener el equilibrio osmótico (http://www.probiotek.com/) en dos variantes, con o sin el agregado de glucosa. Se seleccionaron al azar 4 de las cepas elegidas para esta Tesis, y se ajustó la metodología descripta por Polifroni (2012) para la formación de biofilm en las condiciones deseadas. ENSAYO PRELIMINAR 2: El objetivo de este ensayo fue observar el comportamiento de la bacteria ante la exposición del hipoclorito de sodio analizando diferentes concentraciones (10%, 5%, 1% y 0,5%) y tiempos de exposición (0, 15 min, 30 min, 1 h, y 6 h) para determinar las condiciones que se utilizarían en la formación de biofilm. Para ello se utilizó una cepa seleccionada al azar de las elegidas para este estudio. Se realizó un ON en 3ml de LB (18h. 37ºC), lo llamamos cultivo madre de la cual se hicieron cinco diluciones agregando las distintas concentraciones de hipoclorito de sodio, dejando uno de ellos como testigo control (Tabla 3). En todos los casos el volumen final fue de 3 ml. Tabla 3. Diagrama de volúmenes utilizados para cada concentración. Concentraciones de Hipoclorito de Sodio Testigo LB Hipoclorito de sodio Sc Madre 2700µl - 300µl 10% 2400µl 300µl 300µl 5% 2550µl 150µl 300µl 1% 2700µl 30µl 300µl 0,5% 2700µl 15µl 300µl 22 Se sembraron dichas diluciones en placas de petri con LB agar y se incubaron a 37ºC en los distintos tiempos de exposición mencionados. EFECTO DEL HIPOCLORITO DE SODIO SOBRE LA FORMACIÓN DE BIOFILM EN LAS DISTINTAS SUPERFICIES: De acuerdo a los resultados obtenidos en el ensayo preliminar se decidió utilizar las concentraciones 2,5% y 5% de hipoclorito de sodio, para evaluar el efecto de la exposición de los biofilms a dichas soluciones. Se emplearon 9 pocillos por cepa por cada concentración utilizada y se realizaron dos placas: PLACA 1: 24 h de formación de biofilm 20 min de exposición al hipoclorito (3 pocillos) PLACA 2: Con una incubación final de 72 h obtenemos los siguientes datos: A partir del recambio de medio hecho a las 24 h, se expuso al biofilm a la solución de hipoclorito de sodio por las siguientes 48 h. (3 pocillos). Al cabo de las 72 h de incubación, se sometió a los biofilms formados a 20 min de exposición al hipoclorito de sodio (3 pocillos). Se utilizó el siguiente protocolo de formación de biofilm en dos etapas: 1. Ensayo en superficie de poliestireno 2. Ensayo en superficie de acero inoxidable. Ambos ensayos para la formación de biofilm estuvieron basados en la técnica descripta por Polifroni, R (2012) con algunas modificaciones: Para el crecimiento de las bacterias se realizó un cultivo ON en caldo LB. Se dejó en estufa con agitación leve (120 rpm) 18h a 37ºC. Desde un cultivo ON se estandarizó la masa bacteriana de cada una de las cepas en cada ensayo, para lograr diluciones de igual concentración bacteriana. 23 Para ello se tomaron 100µl del cultivo ON y 900µl de medio LB. Se leyó la densidad óptica (DO) a 600 nm mediante espectrofotometría y con los datos obtenidos se realizaron diluciones de cada cepa ajustando la concentración a una DO conocida (DO= 0,5) realizando los siguientes cálculos: 50/ DO: A Al valor “A” se lo resta por el volumen final de la dilución A-1000µl = B A será el volumen de caldo ON B será el volumen de LB A partir de dicha dilución preparada por cepa se realizaron los ensayos en distintas superficies. 1) POLIESTIRENO Se utilizaron microplacas de 96 pocillos, en los cuales: Se sembraron 100 µl de medio LB estéril y 100µl de cultivo en cada pocillo, por triplicado. Se dejaron pocillos “blanco” sólo con medio estéril para realizar cálculos posteriores. Se incubó la placa a 37 ºC por 24 h al cabo de las cuales se retiraron los sobrenadantes y se realizó un recambio de medio. Se incubaron 48 h más, y finalmente se reveló la placa. Para el revelado se retiraron los sobrenadantes de cada pocillo, se lavó cada uno con agua bidestilada estéril. Se fijó con metanol (200 µl) durante 20 min. Se retiró el metanol, y se tiñó con Cristal Violeta 0,1% (200 µl; 30 min). Una vez finalizada la tinción, se lavó con agua destilada dos veces. Finalmente, se eluyó el colorante adherido con 200µl de alcohol 96%, por agitación 10 min a 150 rpm. 24 Se midió la Densidad optica (DO) de los pocillos para determinar la biomasa total de los biofilms formados a una longitud de onda de 570 nm mediante lector de micropalcas Labsystem Multiskan EX. Con los datos obtenidos se realizaron los cálculos necesarios para clasificar las cepas de acuerdo a su capacidad de formar biofilm según lo descripto por Gómez et al. (2013). Para ello, se estableció una DO de corte con las DO obtenidas de los pocillos blanco con el fin de corregir las densidades ópticas de las cepas eliminando lo correspondiente al colorante absorbido por el medio y la superficie y de este modo conocer lo que realmente corresponde a la formación del biofilm de cada cepa. Una vez obtenida la DO se corrigieron las DO promedio de cada cepa obteniendo una DO ajustada que sirvió para la clasificación de las cepas según la formación de biofilm que hayan presentado según lo reflejado en la tabla 4. DO ajustada (DOa) = DO cepa - DOc Tabla 4. Regla de clasificación. NFB (No Formadora de Biofilm) DO cepa < DO corte DFB (Débil Formadora de Biofilm) DO corte ≤ DO cepa < 2DO corte MFB (Moderada Formadora de Biofilm) 2DO corte ≤ DO cepa < 4DO corte FFB (Fuerte Formadora de Biofilm) DO cepa > 4 DO corte 25 2) ACERO INOXIDABLE Se utilizaron placas de poliestireno de doce pocillos, en las cuales se sumergieron laminillas de acero inoxidable de 1cm². Las mismas se trataron previamente con el siguiente protocolo de limpieza y desinfección (Krolasok, et al. 2010): 1. Limpieza con acetona para remover grasas e impurezas. 2. Se las sumergió en HCL (ácido clorhídrico) 5N 15min. 3. Lavado con detergente. 4. Enjuague con agua destilada. 5. Secado a temperatura ambiente. 6. Autoclavado a 121ºC por 15´. Para el desarrollo del biofilm se empleó el mismo protocolo que para el poliestireno, modificando solo dos parámetros: los volúmenes utilizados (1 ml de medio estéril y 1 ml de cultivo), y en la etapa de revelado se cambió la laminilla de acero inoxidable del pocillo original a un pocillo estéril para obtener el valor neto de formación de biofilm en dicha superficie. Para la lectura de los resultados se tomaron 200 µl de la elución del colorante obtenida para cada pocillo y se colocaron en placas estériles de 96 pocillos para medir la DO en el lector de microplacas. El análisis de las DO obtenidas se realizó según lo descrito anteriormente. 26 CAPITULO 3 RESULTADOS CARACTERIZACIÓN GENÉTICA DE LAS CEPAS STEC Detección de adhesinas por PCR: Los resultados obtenidos a partir de la técnica PCR se exponen en la TABLA 5: TABLA 5: CEPA SEROTIPO Agn43EDL 933 AIDA 1 Agn 43 fimCD ehaA + + + 1 O20:H19 - 2 O117:H7 - - + + + 3 O130:H11 - - + + + 4 O113:H21 - - + + + 5 O178:H19 - - + + + 6 O22:H8 - - + + + 7 O157:H7 + - + + + A continuación, se presentan imágenes tomadas de la lectura de uno de los geles. En orden se presentan las cepas del ensayo desde la cepa uno a la cepa siete. 27 Se pudo observar que todas las cepas analizadas presentaron todos los genes estudiados con excepción del agn43EDL933 que sólo lo portó la cepa O157:H7 de carne bovina. Ninguna de ellas presentó el gen aida1 que es propia de cepas enterotoxigénicas (Moredo F et al, 2015). RESULADOS DE CARACTERIZACION FENOTIPICA EXPRESION DE FIMBRIA CURLI Teniendo en cuanta los dos ensayos A y B se exponen los resultados obtenidos a partir de la lectura de las placas de Rojo Congo (Tabla 6). Se identificaron de la siguiente manera: Resultado positivo: producción de fimbria curli - las colonias de coloración roja y con superficie rugosa (fenotipo rdar) o rosa (sar). Resultado negativo: producción de fimbria curli - las colonias de coloración blanca y lisa (fenotipo saw) y que no sintetizan celulosa. (Polifroni, R. 2012) COLOR “++”= Rojo / “+”= Rosa / “-“= Blanco. TEXTURA “-“= Liso / “+”= Rugoso Por cepa se considera “Placa” al resultado obtenido de las placas de rojo congo sembradas desde las placas de petri con agar Mac. Conkey. “Congelado” al resultado de rojo congo realizado a partir del cultivo congelado a -70ºC. “ON” al resultado obtenido a partir de la lectura de las placas de rojo congo desde un caldo overnight de la cepa. 28 Tabla 6. Resultados obtenidos del análisis de la expresión de la fimbria curli. A CEPA B COLOR TEXTURA COLOR TEXTURA 1 Placa ++ - ++ - 1 Congelado ++ + ++ - 1 ON ++ + ++ - 2 Placa ++ - ++ - 2 Congelado ++ - ++ - 2 ON ++ - ++ - 3 Placa + - + + 3 Congelado + - + + 3 ON ++ - + + 4 Placa + - + - 4 Congelado + - + - 4 ON + - + + 5 Placa + - ++ - 5 Congelado ++ - ++ - 5 ON ++ - ++ 29 6 Placa + - ++ - 6 Congelado ++ - + + 6 ON ++ - ++ + 7 Placa ++ +/- ++/- + 7 Congelado ++/- - ++/- - 7 ON ++ - ++/- - Se puede observar en la tabla de resultados que existieron algunas variantes entre los dos ensayos (A y B). También en cepas que no comparten las mismas características variando el origen de siembra, como es en la cepa 1 que en la siembra proveniente de placa de Mc. Conkey no desarrolló textura al contrario de las sembradas de ON o Congelado. Solo se expone la aparición de una sola colonia blanca (presente en la cepa 7) que se encontraba a su vez con colonias rojas, por lo que consideramos que sea posible una contaminación de la fuente de siembra o que exprese los dos fenotipos. La siguiente imagen se presenta de modo ilustrativo, mostrando una de las placas que se realizaron. La cepa utilizada fue 1(HT1-6) proviene directamente del cultivo congelado (siembra directa). 30 La mayoría de las cepas desarrollaron colonias de color rojo o rosado lo que indica la expresión de la fimbria curli en las cepas de estudio. EXPRESAN FIMBRIA CURLI si 87,5% no 12,5% 31 ENSAYO PRELIMINAR 1 Los resultados obtenidos a partir del desarrollo de biofilm con ambos medios fueron los siguientes: CEPA LB común LB glucosa 52-1-1 MFB FFB 170-4-2r MFB DFB 180-3-4r FFB MFB C23- o157 MFB MFB Referencias: NFB: No formadora de biofilm. DFB: Débil formadora de biofilm. MFF: Moderada formadora de biofilm. FFB: Fuerte formadora de biofilm. Al no observar cambios significativos entre los medios se optó por utilizar LB sin el agregado de glucosa. ENSAYO PRELIMINAR 2 Para este ensayo se eligió al azar la cepa 52-1-1 (4). A continuación se presentan los resultados de viabilidad de la cepa, teniendo en cuenta sobre el eje horizontal las concentraciones y sobre el eje vertical los tiempos de exposición (Tabla 7): Referencias: + = Hasta 200 UFC ++ = Incontable pero más dispersas +++ = incontables (césped). 32 Tabla 7. Efecto del hipoclorito de sodio sobre la viabilidad de STEC. Tiempo Testigo 10% 5% 1% 0,5% +++ - - +++ +++ 15 min +++/+++* -/- -/- ++/++ +++/+++ 30 min +++/+++ -/- -/- + +++/+++ 1h +++/+++ -/- -/- + +++/+++ 6h +++ - - - +++ 0h *Las separaciones con barra significa que el ensayo se realizó por duplicado EFECTO DEL HIPOCLORITO DE SODIO SOBRE LA FORMACION DE BIOFILM EN LAS DISTINTAS SUPERFICIES: A continuación se exponen los resultados obtenidos a partir del estudio realizado con las bacterias de estudio, sometiendo las mismas a las concentraciones previamente establecidas (2,5% y 5%) durante su formación de biofilm a las 24 h junto con un recambio de medio (generando así un estrés químico en el mismo), y a las 72 h de desarrollo del cultivo para observar si una vez que ya se formó el biofilm, este desinfectante es capaz de generar alguna alteración benéfica para la sanidad alimentaria. I: ENSAYO POLIESTIRENO: PLACA 1: Se exponen los resultados obtenidos a partir de la formación de biofilm durante 24 h con 20 min de exposición al hipoclorito de sodio (Gráfico 1). 33 Grafico 1: 1,000 Control 2,5% 20` 0,750 5% 20` 0,500 0,250 0,000 HT 1-6 HT 1-14 HW 1-15 52-1-1 170-4-2 180-3.4r C23 DO corte: 0,111 Tabla de clasificación del grafico 1 CEPA ENSAYO CLASIFICACIÓN HT 1-6 Control MFB 2,5% 20` DFB 5% 20` DFB Control MFB 2,5% 20` MFB 5% 20` DFB Control MFB 2,5% 20` DFB 5% 20` MFB HT 1-14 HW 1-15 34 52-1-1 170-4-2 180-3.4r C23 Control FFB 2,5% 20` DFB 5% 20` DFB Control MFB 2,5% 20` DFB 5% 20` DFB Control MFB 2,5% 20` DFB 5% 20` DFB Control MFB 2,5% 20` DFB 5% 20` DFB Imagen capturada del biofilm de la cepa HT1-6 por microscopia óptica de contraste 10X PLACA 2: Exposición de ambas concentraciones durante la formación de biofilm (agregado a las 24 h con recambio de medio, 48 h de exposición al desinfectante) y con el 35 biofilm ya desarrollado (a las 72 h de desarrollo, 20 min de exposición al desinfectante). Los resultados se exponen en el grafico 2. Grafico 2: 1,000 Control 5% 48hs 2,5% 48hs 5% 20` 2,5% 20` 0,750 0,500 0,250 0,000 HT 1-6 HT 1-14 HW 1-15 52-1-1 170-4-2 180-3.4r C23 DO corte: 0,198 Tabla de clasificación del gráfico 2: CEPA ENSAYO CLASIFICACIÓN HT 1-6 Control DFB 5% 48hs DFB 2,5% 48hs DFB 5% 20` DFB 2,5% 20` DFB Control FFB HT 1-14 36 HW 1-15 52-1-1 170-4-2 180-3.4r C23 5% 48hs MFB 2,5% 48hs DFB 5% 20` MFB 2,5% 20` MFB Control DFB 5% 48hs DFB 2,5% 48hs DFB 5% 20` MFB 2,5% 20` MFB Control DFB 5% 48hs DFB 2,5% 48hs DFB 5% 20` DFB 2,5% 20` DFB Control DFB 5% 48hs DFB 2,5% 48hs DFB 5% 20` DFB 2,5% 20` DFB Control MFB 5% 48hs MFB 2,5% 48hs DFB 5% 20` MFB 2,5% 20` DFB Control DFB 5% 48hs DFB 2,5% 48hs DFB 5% 20` DFB 2,5% 20` DFB 37 Imagen tomada de una de las placas del ensayo de poliestireno. II ENSAYO ACERO INOXIDABLE Teniendo en cuenta que la tinción para la posterior lectura de las laminillas de acero inoxidable se realizó en pocillos diferentes a los que se desarrolló el biofilm, se decidió tomar lectura de los dos pocillos por cepa, es decir, del pocillo en el cuál se desarrolló el biofilm y al pocillo donde se ubica la laminilla. Se recolectaron resultados por cepa de la formación de biofilm tanto en poliestireno como en acero inoxidable. PLACA 1: Se exponen los resultados obtenidos a partir de la formación de biofilm durante 24 h con 20 min de exposición al hipoclorito de sodio (Gráfico 3). 38 Gráfico 3. 3,0 2,8 2,5 2,3 CONTROL poliestireno 5% poliestireno 2,0 1,8 1,5 2,5% poliestireno 1,3 Control ACERO 1,0 5% ACERO 0,8 2,5%ACERO 0,5 0,3 0,0 HT 1-6 HT 1-14 HW 1-15 52-1-1 170-4-2 180-3.4r C23 Do corte poliestireno: 0,29 Do corte Acero: 2,99 PLACA 2: Exposición de ambas concentraciones de hipoclorito durante la formación de biofilm (agregado a las 24 h hipoclorito de sodio con recambio de medio, son 48 h de exposición al desinfectante) y con el biofilm ya desarrollado (a las 72 h de desarrollo, 20 min de exposición al desinfectante) presentado en el Gráfico 4: 39 Gráfico 4: 3,00 2,75 2,50 2,25 Control 2,00 1,75 5% 48hs 1,50 2,5% 48hs 1,25 Control 1,00 5%20`(48hsBF) 0,75 2,5%20`(48hsBF) 0,50 0,25 0,00 HT 1-6 HT 1-14 HW 1-15 52-1-1 170-4-2 180-3.4r C23 Do corte poliestireno: 1,70 Do corte Acero: 5,43 Imagen tomada en uno de los ensayos que muestra las placas de acero inoxidable listas para revelar 40 En los casos de ensayos de poliestireno se observó un notable efecto del hipoclorito de sodio siendo proporcional este efecto a la mayor exposición y mayor concentración. Se observaron variaciones en cada ensayo con cada cepa por lo que se considera que no solo influyen las características de la bacteria en la formación de esta estructura sino también condiciones externas independientes de la metodología. Es importante destacar que a pesar de exponer a lavandina el biofilm, ya sea durante su formación como una vez formado, no termina de eliminar el mismo. Por lo que es de suma importancia evitar la presencia de STEC y así no permitir la formación de biofilm. En los ensayos de desarrollo de biofilm en las placas de acero inoxidable no se presentan tablas de clasificación debido a que todas las cepas se agruparon como NO FORMADORAS DE BIOFILM. Cabe destacar que la clasificación sufrió una importante variación dada por el alto valor de la DO de corte que ofrecieron los resultados de los ensayos (debido a los altos valores de los pocillos blanco). A la hora de teñir las placas de acero inoxidable a pesar de la falta de cultivo bateriano, retenían una importante cantidad de cristal violeta lo cual alteró toda la clasificación. Desde ya se considera menos conveniente para el biofilm desarrollarse en superficie de acero inoxidable que el poliestireno, lo que apoya en cierta forma el requerimiento establecido por el CAA del uso de utensilios, mesadas y equipos de acero inoxidable en la industria alimentaria. Es notable la diferencia en el desarrollo de biofilm que existe entre las cepas. Sin embargo, pocas se demuestran FUERTES FORMADORAS DE BIOFILM lo que es un gran beneficio para la sanidad alimentaria. 41 DISCUSIÓN: Los biofilm son una mezcla de bacterias y productos extracelulares secretados por células bacterianas que generan una gran preocupación para la industria alimentaria debido a que le confieren protección física, mecánica y biológica a bacterias patógenas como E. coli (Park y Chen, 2015). Actualmente no existe gran cantidad de investigaciones acerca del desarrollo de biofilms por STEC, por lo que se planteó estudiar este mecanismo de resistencia que generan las bacterias y analizar su comportamiento ante un agente desinfectante de uso masivo como el hipoclorito de sodio. En cuanto a la clasificación genotípica realizada se observó que no hubo diferencias en cuanto al origen respecto de las cepas no-O157 ya que todas presentaron un mismo perfil de adhesinas (agn43, fimCD, ehaA) excepto por la O157 que fue positiva a agn43EDL933, el cual fue descripto e identificado en la cepa de referencia aislada de humanos O157:H7 EDL933. Otros autores han encontrado resultados similares en cepas provenientes de animales para consumo humano como bovino y porcino (Colello, et al. 2016). Con respecto a la expresión de la fimbria curli, se observó un alto porcentaje de expresión (78% fenotipo rdar y sar) de manera similar a los resultados obtenidos por Polifroni (2012). Es notable la relación en que las cepas O157:H7 expresan el fenotipo saw y las no-O157 expresan rdar/sar, de igual manera a lo expuesto en la investigación realizada por Angel Villegas (2014). Sin embargo, otros autores han encontrado una menor proporción de expresión de cepas no-O157 curli positivas (38%) (Cookson, et al. 2002). Por lo expuesto, no se encontró una relación entre la expresión de curli y la formación de biofilm, ya que la mayoría de las cepas STEC que presentan esta misma expresión no son FUERTE formadoras de biofilm. Por lo tanto al igual que Polifroni (2012) y Angel Villegas (2014) la formación de biofilm, parece no depender sólo de la información genética, sino también del ecosistema y las condiciones que rodean a la bacteria. En cuanto al desarrollo de biofilm, de acuerdo a los resultados obtenidos, se determinó que las bacterias STEC son MODERADAS o DEBILES formadoras 42 sobre poliestireno. Esta investigación coincide con los resultados de Park YJ, Chen J (2015), que indican que las células STEC expresan una mayor cantidad de masa biofilm y tienen una mayor masa residual después de la desinfección en poliestireno que en el acero inoxidable, por lo que se considera más propenso el desarrollo de biofilm sobre superficies de poliestireno. Se demostró la importancia del uso de materiales de acero inoxidable para la elaboración de alimentos en conjunto con una buena desinfección evitaría el desarrollo de biopelículas. Es importante tener en cuenta esta característica de las bacterias, no sólo por los mecanismos de desinfección, sino también por los posibles focos de contaminación y así trabajar sobre ellos. Se investigó el comportamiento de un desinfectante sobre bacterias y luego sobre biofilm. Se decidió el uso del hipoclorito de sodio debido a su uso masivo tanto en la industria como a nivel doméstico ya sea por su alcance económico como por su efectividad. En este trabajo se evidenció que el uso de hipoclorito como desinfectante es efectivo si su uso es correcto, refiriéndonos a la concentración y tiempo de exposición, en base a lo cual se considera que se debe utilizar en concentraciones mayores o iguales al 5% por un tiempo mínimo de 20 min, cuatro veces superior a lo expuesto por el programa de Carnicerías Saludables que contaba con una concentración al 1% - 10min para pisos y mesadas (Leotta, et al. 2014). En cuanto a su efecto sobre el biofilm se evaluó el uso del hipoclorito tanto en la etapa de desarrollo (a las 24 h de incubación) como al final del período de incubación (72 h, con una exposición de 20 min). En la etapa de poliestireno no se observó una total efectividad, todas las cepas fueron al menos débiles formadoras de biofilm. Y en la etapa de acero inoxidable no se observó formación de biofilm tanto en los pocillos de control como en los expuestos a lavandina, por lo que se relaciona la menor capacidad de formar biofilm en dicho material más que por el uso del desinfectante. La prevención de la formación de biofilms en la industria de los alimentos reviste una vital importancia debido a que STEC puede liberar las toxinas desde los 43 biofilms y esta liberación difiere según las condiciones de cultivo a las cuales son expuestas las células confirmando el riesgo de contaminación e infección (Angel Villegas, 2014). Se ha demostrado que el medio ambiente cumple un rol como intermediario en la cadena de contaminación y que la exposición a reiteradas condiciones de estrés genera en las bacterias mejores respuestas de adaptación a nuevas condiciones (Polifroni, 2012), lo que de alguna forma apoya la hipótesis de esta tesis referida a la resistencia que le puede conferir el biofilm a los desinfectantes, representando un riesgo para la salud pública. Considerando a las cepas STEC patógenos asociados directamente al SUH, se fortalece la importancia en la prevención de la contaminación de cualquier alimento. Cabe destacar que no existe una terapia específica para el tratamiento de las infecciones por STEC (Angel Villegas, 2014). Tal como fue demostrado en la investigación de Telez Peña (2010), el desarrollo de biofilms en ámbitos relacionados a la producción de alimentos, tanto a nivel doméstico como industrial, puede suponer un importante problema de Salud Pública. Las características propias de estas estructuras bacterianas implican un comportamiento diferente ante los procesos de desinfección, por lo tanto, la dificultad existente para eliminar estas formaciones una vez instauradas hace que la prevención sea, una vez más, la estrategia elegida a la hora de controlar este problema. Estos resultados proporcionan, al igual que otras investigaciones como (Park y Chen, 2015) información relevante para el control de la formación de biofilms. 44 CONCLUSIONES A modo de conclusión se expone que: El agregado de glucosa en el medio de cultivo no mostró cambios significativos en el desarrollo de biofilm. No se pudo establecer una relación directa entre la expresión de fimbria curli con la formación de biofilm. STEC no es fuerte formadora de biofilm, aunque sobre poliestireno forma biopelículas en forma moderada o débil, lo que puede afectar de forma indirecta a la salud pública. El desarrollo de biofilm sobre poliestireno es mucho mayor al desarrollo sobre acero inoxidable. La concentración de 5% de hipoclorito de sodio a 20 min de exposición fue efectiva contra el crecimiento de STEC. El uso de hipoclorito de sodio sobre biofilms ya desarrollados no aseguró su eliminación. 45 Bibliografía: 1. Angel Villegas, N. (2014). Estrés celular y acción de antibióticos sobre bacterias productoras de Toxinas. Tesis Doctoral. IMBIV-CONICET Departamento de Farmacia-Facultad de Ciencias Químicas Universidad nacional de Córdoba 2. Alonso, M. Z. (2012). Caracterización genotípica de Escherichia coli verocitotoxigénico y Escherichia coli enteropatogénico aisladas de pollo y sus productos. Tesis Doctoral. Facultad de Ciencias Veterinarias U.N.C.P.B.A. 3. ANMAT RENAPRA (2011). Enfermedades Transmitidas por Alimentos Ficha Tecnica Nº 8. 4. Barnhart, M. M. y Chapman M. R. (2006). Curli Biogenesis and Function. Annu Rev Microbiol. 60: 131-147. 5. Brusa, V. (2015). 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