Download Influencia del Hipoclorito de Sodio en biofilms

Facultad de Ciencias Veterinarias
-UNCPBA-
Influencia del Hipoclorito de Sodio en biofilms
formados por Escherichia coli
Velez, María Victoria - Etcheverría, Analía Inés - Padola, Nora Lía.
Agosto, 2016
Tandil
Influencia del Hipoclorito de Sodio en biofilms formados por
Escherichia coli
Tesina de la carrera Licenciatura en Tecnología de los Alimentos presentada como parte
de los requisitos para optar al grado de Licenciado del estudiante: Velez, María Victoria.
Director: Dra. Nora L. Padola
Codirector: Dra Analía I. Etcheverría
Evaluador: Tabera, Anahí
Agradecimientos:
En primer lugar quiero expresar mi agradecimiento a mis directores de tesis: Dra.
Analia I. Etcheverría y Dra. Nora L Padola del Departamento de Sanimal y
Medicina Preventiva, Facultad de Ciencias Veterinarias, UNCPBA donde se llevó a
cabo el presente trabajo.
A la Lic. María Emilia Cáceres por confiar en mí, apoyarme y acompañarme a lo
largo de toda esta investigación.
A mi hermosa familia, tíos y tías, primos y amigas que siempre se preocuparon por
mi durante estos años… a Flor, Toyi y Anto por ser incondicionales a lo largo de
este camino, y a mi amigo Mauri, afectado de dicha bacteria quien no solo fue
fuente de inspiración para este trabajo, sino que lo es día a día para mi vida por su
valentía…
A mi hermano (y Kala) con quien recorrí todo este camino, por hacerme reír hasta
dolerme la cara, por acompañarme, por apoyarme, por aconsejarme durante todos
estos años de convivencia que jamás voy a olvidar…
Principalmente quiero agradecerles a papa y mama quienes fueron el motor
principal de esta meta alcanzada, fuente inspiradora y pilar de cada paso dado no
solo profesionalmente sino en la vida misma. Me demostraron que en la
superación personal no me encuentro sola.
RESUMEN DE TESIS
Argentina es el país con mayor incidencia de Síndrome Urémico Hemolítico a nivel
mundial. El principal agente causal es la bacteria Escherichia coli, productor de
toxinas shiga o verotoxinas (STEC o VTEC), y se las considera como un agente
causal de este tipo de patología.
Sus víctimas fatales son
niños e
inmunodeprimidos, por ello como sociedad se debe plantear esta problemática y
saber que se puede prevenir. Considerando que a pesar de las prevenciones
siguen apareciendo casos, se estudia la posibilidad de la evolución de la bacteria
a nivel resistencia. Sabiendo que uno de los mecanismos de defensa es el biofilm,
y que éste les permite colonizar gran cantidad y diversidad de ambientes, con el
riesgo de contaminar alimentos, lo consideramos un importante punto de estudio.
En este trabajo final se plantea como objetivo determinar la capacidad de formar
biofilms de siete cepas STEC provenientes de hamburguesas de origen bovino y
avícola sobre diferentes superficies inertes y evaluar los efectos que produce el
uso de hipoclorito de sodio como desinfectante sobre el biofilm. En primer lugar
se analizó genotípicamente la presencia de fimbrias y adhesinas involucradas en
la formación de biofilm y luego se evaluó la efectividad del hipoclorito de sodio a
diferentes concentraciones y tiempos de exposición sobre la biopelícula en acero
inoxidable y poliestireno. Los resultados obtenidos permitieron determinar que las
cepas STEC produjeron biofilm en mayor medida sobre poliestireno que sobre
acero inoxidable en condiciones óptimas de cultivo y que el hipoclorito no fue
efectivo sobre la biopelícula en las condiciones empleadas. Teniendo en cuenta
estos resultados destacamos la importancia de prevenir la deposición de residuos
orgánicos sobre las superficies y las buenas prácticas de manufactura para
disminuir la presencia de STEC y evitar la formación del biofilm.
PALABRAS CLAVE: Escherichia coli, biofilm, hipoclorito de sodio, acero
inoxidable, polietireno.
INDICE
INTRODUCCION…………………………………………………………………………….1
CAPITULO 1…………………………………………………………………………............4
MARCO TEORICO………………………………………………………………………….4
Escherichia coli……………………………………………………………………………4
Escherichia coli productor de verotoxinas (STEC) ……………………....5
Otros factores de virulencia y factores de colonización de STEC….8
Vías de transmisión y reservorios de STEC…………………………………..9
Enfermedades transmitidas por los alimentos:……………………….....12
Legislación alimentaria nacional ………………………………………………12
BIOFILM:……………………………………………………………………………………15
Estructura y etapas de la formación de biofilms……………………….15
Importancia de su estudio………………………………………………………...17
Biofilm en industria alimentaria ……………………………………………..18
CAPITULO 2………………………………………………………………………………19
MATERIALES Y
METODOS………………………….…………………………………………………….…….20
CARACTERIZACIÓN GENÉTICA DE LAS CEPAS STEC………………….........20
Población de estudio ……………………………………………………………...…….20
Detección de adhesinas por PCR …………………………………………………..20
CARACTERIZACION FENOTIPICA ………………………………………………….22
EXPRESION DE FIMBRIA CURLI
…………………………………………………..22
FORMACION DE BIOFILM: ………………………………………..…………………23
ENSAYO PRELIMINAR 1:………………………………………….……………..
23
ENSAYO PRELIMINAR 2:…………………………………………………………………24
EFECTO DEL HIPOCLORITO DE SODIO SOBRE LA FORMACIÓN DE
BIOFILM EN LAS DISTINTAS SUPERFICIES:………………………………..
1) POLIESTIRENO
25
…………………………………………………………………..26
2) ACERO INOXIDABLE
…………………………………………………………28
CAPITULO 3
………………………………………………………………………….29
RESULTADOS CARACTERIZACIÓN GENÉTICA DE LAS CEPAS STEC… 28
Detección de adhesinas por PCR: …………………………………………...28
RESULADOS DE CARACTERIZACION FENOTIPICA……………………29
EXPRESION DE FIMBRIA CURLI………………………………………………29
ENSAYO PRELIMINAR 1………………………………………………………….33
ENSAYO PRELIMINAR 2………………………………………………………….33
EFECTO DEL HIPOCLORITO DE SODIO SOBRE LA FORMACION DE
BIOFILM EN LAS DISTINTAS SUPERFICIES: …………………………34
DISCUSIÓN:…………………………………………………………………………….43
CONCLUSIONES …………………………………………………………………….46
Bibliografía:…………………………………………………………………………...47
INTRODUCCION
Las enfermedades transmitidas por los alimentos (ETA) son en su mayoría
consecuencias socioculturales debido a que la mayor proporción de sus afectados
están directamente relacionados con los bajos recursos sociales (como la falta de
agua potable) y la falta de educación higiénican sin embargo, países desarrollados
y en vías de desarrollo son afectados por las mismas (Brusa, V 2015).
Argentina es el país con mayor incidencia de Síndrome Urémico Hemolítico a nivel
mundial. El principal agente causal es Escherichia coli productor de toxina Shiga
(STEC) que agrupa a serotipos aislados de casos de colitis hemorrágica (CH) y
síndrome urémico hemolítico (SUH) en humanos (Rivas et al. 2006).
La ingesta de alimentos contaminados con STEC ha producido víctimas fatales. La
población más afectada son niños y niñas menores de 5 años mayormente
inmunodeprimidos (Brusa, V 2015).
Teniendo en cuenta que los huéspedes suceptibles son seres indefensos, los
conocimientos adquiridos en la carrera Tecnología de los Alimentos pueden ser
herramientas válidas para aportar a la prevención, y asi disminuir los casos de
esta enfermedad que termina siendo un problema social.
Este trabajo se basa en que la prevención juega un papel muy importante, aunque
se identifica que las muertes de víctimas inocentes persisten. Frente a esta
situación, se plantean las siguientes preguntas de investigación que guiarán el
trabajo:
¿Por qué las medidas de prevención no alcanzan y siguen apareciendo casos de
SUH? ¿Por qué, a pesar del aumento del control, siguen apareciendo afectados?
Las técnicas para prevenir la bacteria ¿son eficaces?
Se estima que el 99% de las bacterias crecen formando biofilms, y la presencia del
mismo ejerce un enorme impacto en diversos aspectos de la vida (Donlan y
Costerton, 2002). Los biofilms o biopelículas se definen como comunidades
complejas de microorganismos que crecen embebidos en una matriz orgánica
1
polimérica autoproducida y adherida a una superficie viva o inerte, y que pueden
presentar una única especie microbiana o un abanico de especies diferentes
Esta organización les permite colonizar gran cantidad y diversidad de ambientes,
con el riesgo de contaminar alimentos, y generar infecciones severas para el ser
humano haciéndolas resistentes a las condiciones adversas que constituyen
factores de estrés asociados con la manipulación, higiene, conservación y
composición de materiales y alimentos, como las temperaturas y pH extremos. El
biofilm
puede
incrementar
sus
capacidades
de
supervivencia
y
como
consecuencia, los métodos habituales de desinfección o el uso de antibióticos se
muestran, a menudo, ineficaces contra las bacterias que habitan en el mismo
(Costerton y Greenberg ,1999). El contacto de un alimento con un biofilm puede
generar la contaminación del mismo y en caso de ser ingerido es posible la
existencia de daños en la salud del consumidor.
La hipótesis de este trabajo es que el hipoclorito de sodio produce un efecto
inhibitorio sobre la formación de biofilm de STEC en distintas superficies.
Para ello se plantearon los siguientes objetivos:
 Determinar la capacidad de formar biofilm de cepas STEC sobre distintas
superficies inertes (poliestireno y acero inoxidable)
 Evaluar los efectos que produce sobre el biofilm el uso de hipoclorito de
sodio como desinfectante en distintas concentraciones.
Se seleccionaron al azar 7 cepas STEC, aisladas previamente de hamburguesas
de origen bovino y avícola y de carne bovina picada. Se detectaron características
genotípicas como la presencia de distintas fimbrias y adhesinas involucradas en la
formación de biofilm; y luego se tuvieron en cuenta los siguientes puntos a
investigar:

Qué medio utilizar para el ensayo

Cómo evaluar el desarrollo de biofilm

Qué efectividad tiene el hipoclorito ante una E. coli a diferentes
concentraciones y tiempos de exposición
2

Qué efecto produce el hipoclorito de sodio sobre el biofilm en acero
inoxidable.

Qué efecto produce el hipoclorito de sodio sobre poliestireno
Los resultados obtenidos permitieron determinar que las cepas STEC produjeron
biofilm en mayor medida sobre poliestireno que sobre acero inoxidable en
condiciones óptimas de cultivo. Sin embargo hay que tener en cuenta la
posibilidad de formación de biofilm existe, y saber que esta sería eliminada con
una buena desinfección diaria, no sólo a nivel industrial, sino también a nivel
doméstico.
Por último, se comprobó que el uso del hipoclorito de sodio como desinfectante
afectó la viabilidad de STEC a concentraciones mayores de 5%, por lo que se
sugiere esta concentración como solución de uso habitual para disminuir la
presencia de STEC y evitar la formación de biofilm. A menor concentración la
solución puede ser efectiva pero al requerir un extenso tiempo de contacto con la
superficie a desinfectar, puede evaporarse antes de finalizar su actividad como
desinfectante.
CAPITULO 1
MARCO TEORICO
Escherichia coli
E. coli es una de las especies bacterianas que forma parte de la familia
Enterobacteriaceae; es un bacilo Gram negativo no esporulado, móvil con flagelos
periticos o inmóviles, aerobio-anaerobio facultativo, capaz de crecer en medios
simples con o sin agregado de cloruro de sodio (NaCl). Como características
bioquímicas se pueden mencionar que es fermentadora y oxidativa en medios con
glucosa u otros carbohidratos, catalasa positivo, oxidasa negativa y reductora de
nitratos a nitritos. Se trata de bacterias de rápido crecimiento y amplia distribución
3
en el suelo, el agua, vegetales y gran variedad de animales, especialmente como
flora normal del intestino (Brusa V, 2015; Polifroni R, 2012).
En el ser humano dicha bacteria coloniza el tracto gastrointestinal a las pocas
horas de vida, y establece con el huésped una relación estable de mutuo beneficio
siendo parte de la flora natural. En caso de estar presente en el ambiente, el agua
o los alimentos se lo toma como un indicador de contaminación fecal, junto con
otro conjunto de bacterias con las que forman el grupo llamado coliformes
(Polifroni R, 2012).
E. coli se ha clasificado en más de 170 serogrupos. Los aislamientos se pueden
determinar serológicamente determinando los antígenos O (porción polisacárido
del lipopolisacárido somático o LPS) y H (proteínas flagelares), y se han
identificado más de 10000 combinaciones posibles entre éstos (Brusa, V. 2015).
Hasta el momento se reconocen seis virotipos de E. coli asociados a infecciones
gastrointestinales tanto en animales como en humanos, por lo que se la denomina
E. coli diarreagénica, y se distinguen entre ellos por los factores de virulencia:

Enterotoxigénica (ETEC)

Enteropatogénica (EPEC)

Enteroagregativa (EAggEC)

Enterohemorrágica (EHEC)

Enteroinvasiva (EIEC)

De adherencia difusa (DAEC) (Polifroni R 2012).
(Figura1. Imagen de E. coli
extraída de Centers for Disease control and
Prevention http://www.cdc.gov/ecoli/)
4
Escherichia coli productor de verotoxinas (STEC)
Este virotipo de E. coli se distingue de los demás por la secreción de toxinas que
tienen actividad citotóxica sobre la línea celular Vero. Están codificadas por los
genes vt1 y vt2 presentes en fagos lisogénicos insertos en el cromosoma
bacteriano (Sandvig, 2001).
STEC es un agente causal de patologías graves como la colitis hemorrágica (CH)
y el Síndrome Urémico Hemolítico (SUH) (Karmali, 2004). El SUH está definido
por la tríada: anemia hemolítica, trombocitopenia y falla renal aguda, precedidas
habitualmente por diarrea con sangre. Es una enfermedad que afecta sobre todo a
niños (hasta 5 años), ancianos, y personas con inmunidad deprimida. En
Argentina, el SUH es una enfermedad endémica que reporta de 450 a 500 casos
por año, siendo el país con mayor incidencia de esta patología a nivel mundial.
(Angel Villegas, 2014).
El reconocimiento de STEC como una clase diferente dentro de los E. coli
patógenos entéricos resultó de 2 observaciones epidemiológicas claves. La
primera ocurrió en 1982 durante la investigación de brotes de enfermedad
intestinal caracterizados por dolor abdominal severo y diarrea acuosa seguida por
diarrea con sangre asociada al consumo de hamburguesas poco cocidas en casas
de comida rápida. La segunda observación fue informada en 1985, cuando se
publicó la asociación de casos esporádicos de SUH con la presencia de
citotoxinas libres en materia fecal y aislamiento de STEC de las heces de estos
pacientes (Karmali et al., 1985).
Si bien las verotoxinas constituyen uno de los factores de virulencia de STEC,
ciertas cepas producen un proteína denominada Intimina que está codificada por
el gen eae y se encuentra en la isla de patogenicidad LEE (del inglés, “locus for
enterocyte effacement”). Este locus está asociado con la adherencia íntima de la
bacteria a la célula epitelial, la iniciación de las señales de transducción y la
desorganización de las microvellosidades con la formación de la lesión A/E
(adherencia y borrado del enterocito). La presencia de LEE le confiere a las cepas
STEC mayor virulencia, sin embargo, la presencia de LEE no es esencial para la
5
patogénesis, pues se han notificado casos de enfermedad humana severa,
incluyendo casos esporádicos de SUH y brotes, asociados a STEC-LEE-negativas
(Rivas, et al. 2006).
El serotipo más implicado en brotes de SUH es el O157:H7 que es el que registra
la tasa de mortalidad más alta de todo el mundo. Sin embargo, más de cien
serotipos, entre ellos no-O157 poseen un potencial patogénico similar, y han sido
asociados a casos esporádicos de CH y SUH, por ejemplo: O26:H11, O103:H2
O111:NM, O121:H19, O145:NM, O113:H21, O130:H11 y O178:H19 (Rivas, et al.
2006).
La dosis infectante de STEC es reducida, se estima que 50-100 unidades
formadoras de colonias (UFC) son suficientes para causar la enfermedad en
individuos sanos (Ángel Villegas, N. 2012).
Dada la alta tasa de SUH, la carencia de un tratamiento específico, y la alta
morbilidad, la prevención primaria de este tipo de infecciones es fundamental para
disminuir el impacto sanitario.
Otros factores de virulencia y factores de colonización de STEC
Como se mencionó anteriormente no solo las cepas productoras de Intimina han
sido involucradas en enfermedades en humanos, por lo que se han propuesto y
estudiado otras proteínas y factores de colonización que permiten la adherencia
tanto a superficies bióticas como abióticas. Otros factores de virulencia de estas
cepas son un megaplásmido que codifica para una hemolisina enterohemorrágica
(EhxA), una catalasa-peroxidasa (KatP), una serin-proteasa extracelular (EspP),
una zinc-metaloproteasa (StcE) y una citotoxinasubtilasa (SubAB). EhxA fue el
primer factor de virulencia descripto del plásmido pO157 de la cepa EDL933
O157:H7 y su secuencia es utilizada para el diagnóstico de E. coli O157:H7 y para
otras STEC, KatP ayudaría a colonizar el intestino reduciendo el estrés oxidativo,
EspP tiene la capacidad de romper la pepsina A y el factor de coagulación
humana con lo cual contribuye a la hemorragia de las mucosas en el caso de CH,
6
además favorece la colonización y adherencia en el intestino del bovino. StcE
contribuye a la íntima adherencia de esta bacteria a las células huésped. SubAB
se ha descripto como un factor de virulencia importante en cepas STEC
especialmente LEE-negativas y muestra una actividad citotóxica. En cepas STEC
eae-negativas, el megaplásmido posee una adhesina autoaglutinante (Saa) y una
nueva proteína propia de STEC perteneciente a la familia de proteínas
autotransportadas, que contribuye a la formación de biofilms: Sab (Paton et al.,
2001; Herold et al., 2009).
Entre los factores considerados importantes para la formación de biofilm en STEC
se encuentran la fimbria Curli que es la que está involucrada en la agregación
celular y también en la adhesión e invasión en células eucariotas (Barnhart y
Chapman, 2006). La expresión de esta fimbria junto con la producción de celulosa,
analizados mediante la técnica de Rojo Congo, le confiere a la bacteria un fenotipo
llamado “rojo, seco y rugoso” -rdar- (de las siglas en inglés: red, dry and rough)
que está asociado a la producción de biofilm en superficies de vidrio y poliestireno,
además de promover la formación de una película en la interface aire-líquido.
Cuando la bacteria no produce la fimbria curli ni celulosa, las colonias aparecen
“blancas y lisas” -saw- (de las siglas en ingles soft and withe) y si sólo producen
curli las colonias aparecen “rosadas y lisas” -sar- (Costerton et al., 1999).
Otras fimbrias y proteínas que han sido descriptas como factores colonizantes y
de adherencia son: Fimbria tipo I (fim), Antígeno 43 (agn 43) (Cookson et al.,
2002; Schembri et al., 2002), Iha (Tarr et al, 2000), Fimbria larga polar (lpf) (Torres
et al., 2002), Fimbria F9 (Dziva et al., 2004; Low et al., 2006), Efa1 (Nicholls et al.,
2000), y pertenecientes a la familia de las AT (proteínas autotransportadoras)
EhaABCD y EhaJ encontrados en la cepa O157:H7 EDL 933, que constituye un
papel importante en la colonización de las cepas STEC (Wells et al.,2009).
7
Vías de transmisión y reservorios de STEC
(Figura 2. Imagen extraída de Fernández D y Padola NL (2012). Escherichia
coli verocitotoxigénico: Varias cuestiones... y los tambos también. Revista
Argentina de Microbiología 44, 312-323)
Los rumiantes, en especial el ganado bovino, son considerados actualmente el
principal reservorio de STEC. Pero varias investigaciones han demostrado que no
son los únicos focos a los cuales hay que prestarle atención. Los alimentos o
subproductos animales como la carne mal cocida, agua, leche o jugos
contaminados, yogurt, quesos, mayonesa y vegetales frescos, son los vehículos
de transmisión al ser humano más frecuentes. La información precisa sobre la
distribución y características de las infecciones humanas por STEC y sobre las
8
variantes regionalmente prevalentes son de gran valor como guía para el control
de calidad de los alimentos. En la Argentina, se detectó STEC no-O157 en el
8.4% de hamburguesas supercongeladas y STEC O157 en el 3.9% de productos
cárnicos a nivel de boca de expendio (Brusa V. 2015).
En el marco del Proyecto Carnicerías Saludables (UNLP, UNCPBA, UNL), se
determinó la presencia de STEC O157:H7 y no-O157 en carne picada fresca,
picadoras de carne, manipuladores, mesadas y utensilios en 66 comercios
minoristas a boca de expendio y se encontró una prevalencia de 36,36%.
Respecto de STEC O157:H7 se detectó un 12,12% en carne picada fresca, 7,57%
en picadora, 6,06% en mesada y 3,03% en cuchilla y manos del manipulador,
mientras que para las cepas STEC no-O157:H7, se obtuvo un 15,15% en carne
picada fresca, 12,12% en mesada, 10,6% en picadora, 9,09% en manos y 7,57%
en cuchilla (Ruiz et al., 2013). Estos resultados resaltan el riesgo de la influencia
de la colonización de superficies abióticas en la contaminación de los alimentos.
La mayoría de los estudios realizados en pollos se han orientado a la búsqueda
selectiva del serotipo O157:H7, reportando prevalencias entre 1,7% y 9%.
Además, varios autores han demostrado que los pollos pueden ser fácil y
persistentemente
infectados
por
este
microorganismo.
En
carcasas,
la
contaminación con STEC se observó en bajas proporciones. Se detectó
contaminación con STEC en la superficie externa, interna de diferentes carcasas
de pollo. Se considera notable la baja prevalencia de STEC en pollos vivos, pero
la contaminación con STEC aumenta con el procesamiento y la manipulación de
los productos, especialmente en las hamburguesas de pollo provenientes de
carnicerías, sugiriendo la posible contaminación cruzada con carnes de diferentes
orígenes (Alonso, MZ. 2012)
9
(Figura 3. Imagen extraída de Alonso, MZ. (2012). Caracterización genotípica de
Escherichia coli verocitotoxigénico y Escherichia coli enteropatogénico aisladas de
pollo y sus productos. Tesis Doctoral)
Enfermedades transmitidas por los alimentos:
Según la Constitución de la OMS:
"La salud es un estado de completo bienestar físico, mental y social, y no
solamente la ausencia de afecciones o enfermedades".
Dado que la mitad de los patógenos que afectan al ser humano provienen de los
animales, desde el año 2010 la FAO (Food and Agriculture Organization) la
Organización mundial de sanidad animal y la Organización mundial de la salud
(OMS) se han unido bajo el concepto de “una sola salud” con el objetivo de
gestionar los riesgos sanitarios en la interfaz hombre – animal – medio ambiente
siguiendo de esta forma el alimento desde el comienzo de su producción hasta su
consumo (OIE, 2013).
10
Los principales microorganismos responsables de estas afecciones son
Salmonella, Listeria monocytogenes, Campylobacter, Clostridium perfingens,
Yersinia enterocolitica y Escherichia coli (Brusa V, 2015).
Para lograr disminuir las ETA son importantes las buenas prácticas de
manufactura
(BPM)
y
los
procedimientos
operativos
estandarizados
de
sanitización (POES), con el fin de detectar y controlar focos de posible
contaminación durante la cadena de elaboración de alimentos (Brusa, V. 2015)
Según la OMS cada año se producen 1700 millones de episodios de diarrea que
ocasionan 76 millones de personas enfermas y de éstas, 3 millones de muertes en
niños menores de 5 años (OMS, 2015).
(Figura 4. Imagen extraída de Fernández D y Padola NL (2012). Escherichia
coli verocitotoxigénico: Varias cuestiones... y los tambos también. Revista
Argentina de Microbiología 44, 312-323)
Legislación alimentaria nacional
Teniendo en cuenta que el SUH en Argentina es una de las principales causas
pediátricas de insuficiencias renales, en Mayo del 2004 se modificaron algunos
artículos que refieren a especificaciones microbiológicas que deben cumplir las
11
carnes picadas frescas, la comida preparada lista para consumo, salazones
cocidas, chacinados frescos, y las frutas y hortalizas, respectivamente. Dentro de
los criterios microbiológicos especificados se encuentras: AUSENCIA de E. coli
O157:H7 en 5 muestras de 65 gr. cada una o AUSENCIA en muestras de 25gr.
cada una. Para el análisis de los mismos se usan técnicas como USDA/ISO y
BAM/FDA que son específicos para O157:H7 (Brusa V, 2015).
En cuanto a aquellas que no son O157:H7 no se realiza en forma generalizada,
debido a que no existe reglamentación que incluya la búsqueda de STEC noO:157 en alimentos.
Con frecuentes modificaciones las autoridades sanitarias aplicaron el criterio
tolerancia cero para STEC en productos como hamburguesas congeladas (Brusa
V, 2015). La limpieza y desinfección ocupa uno pilares más importantes para
evitar la contaminación biológica en alimentos. Dentro de los desinfectantes más
utilizados se encuentra el hipoclorito de sodio (concentración 55 gramos de Cloro
activo/Litro), comúnmente llamado lavandina, el cual se utiliza no solo en la
industria sino también a nivel doméstico. Para el uso del mismo se tienen en
cuenta las siguientes pautas presentadas dentro del Programa Carnicerías
Saludables (Leotta, et al., 2014):
MODO DE USO:
Dilución 10% para material sucio. 30 minutos.
En 1lt de Agua
70ml de lavandina cc (1 pocillo)
En 2lt de Agua
140ml de lavandina cc (1 taza)
En 5lt de Agua
350ml de lavandina cc (2 tazas)
En 10lt de Agua
700ml de lavandina cc (4 tazas)
Dilución 1% para pisos y mesadas. 10 minutos.
En 1lt de Agua
20ml de lavandina cc (1 pocillo)
En 2lt de Agua
40ml de lavandina cc (1 taza)
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En 5lt de Agua
100ml de lavandina cc (2 tazas)
En 10lt de Agua
200ml de lavandina cc (4 tazas)
BIOFILM:
Los biofilms o biopelículas se definen como comunidades complejas de
microorganismos que crecen embebidos en una matriz orgánica polimérica
autoproducida y adherida a una superficie viva o inerte, y que pueden presentar
una única especie microbiana o un abanico de especies diferentes. Las bacterias
que forman el biofilm se hallan en lo que se denomina forma sésil, exhibiendo un
fenotipo diferente al de esas mismas células en forma unicelular o libre (forma
planctónica) con respecto a la tasa de crecimiento y a la transcripción de genes.
La formación de biofilms es una estrategia adaptativa de los microorganismos, ya
que el crecimiento en biofilm ofrece cuatro ventajas importantes: (I) protege a los
microorganismos de la acción de los agentes adversos, (II) incrementa la
disponibilidad de nutrientes para su crecimiento, (III) facilita el aprovechamiento
del agua, reduciendo la posibilidad de deshidratación y (IV) posibilita la
transferencia de material genético (ADN). Todas estas circunstancias pueden
incrementar sus capacidades de supervivencia. Como consecuencia, los métodos
habituales de desinfección o el uso de antibióticos se muestran a menudo
ineficaces contra las bacterias del biofilm (Costerton et al., 1999; Donlan, 2002).
Se pueden encontrar biofilms en todos los medios donde existan bacterias: en el
medio natural, clínico o industrial. Solo se requiere la presencia de un entorno
hidratado y una mínima cantidad de nutrientes, ya que pueden desarrollarse sobre
todo tipo de superficies (hidrófobas o hidrófilas, bióticas o abióticas) En la
actualidad se considera que, en condiciones ambientales adecuadas, la mayoría
los microorganismos son capaces de formar biofilms (Tellez Peña, 2010).
Estructura y etapas de la formación de biofilms
A pesar que la composición del biofilm es variable en función del sistema de
estudio, en general, el componente mayoritario es el agua, que puede representar
hasta un 97% del contenido total. La matriz del biofilm es un complejo que está
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formado principalmente por exopolisacáridos (EPS) y en menor cantidad en el
caso de E. coli se encuentran otras macromoléculas como proteínas, ADN y
diversos productos procedentes de la lisis de las bacterias (sustancias poliméricas
extracelulares). Además, se caracteriza por tener estructuras tridimensionales con
canales que facilitan el flujo de agua y nutrientes hasta las zonas más profundas
del biofilm (Angel Villegas, 2014).
La existencia de estos canales no evita sin embargo, que dentro del biofilm se
puedan encontrar diferentes ambientes en los que la concentración de nutrientes,
pH u oxígeno sea distinta (Lasa et al., 2009). Esta circunstancia aumenta la
heterogeneidad del estado fisiológico en el que se encuentra la bacteria dentro del
biofilm, dificultando su estudio y generando un microambiente que le da protección
(Angel Villegas, N. 2014).
La formación de biofilm es un proceso dinámico y complejo que conlleva la
adhesión, colonización y crecimiento de los microorganismos. En él podemos
identificar hasta cinco fases (Fig. 5):
1. Adsorción primaria o acondicionamiento de la superficie. Los residuos
orgánicos se depositan sobre una superficie creando condiciones propicias para la
colonización de microorganismos.
2. Adhesión reversible. Los microorganismos buscan la adhesión a la superficie,
la cual se verá afectada por factores como la rugosidad, la temperatura y la carga
superficial, y químicos, como la composición del sustrato y del medio, el pH, el
oxígeno disuelto, entre otros.
3. Adhesión irreversible. El cambio desde la adhesión reversible a irreversible se
produce por la transición desde una interacción débil de la célula con el sustrato
hasta un enlace permanente, frecuentemente mediado por la presencia de
polímeros y apéndices extracelulares. El crecimiento está limitado por la
disponibilidad de nutrientes y la capacidad de las células sésiles para eliminar los
residuos propios del metabolismo.
4. Maduración del biofilm. Se establece una arquitectura compleja, con canales,
poros y redistribución de bacterias en el sustrato.
14
5. Desprendimiento de bacterias. Se puede dar por distintos procesos (erosión,
abrasión, oleaje, siembra) y se puede producir por la escasez de nutrientes o por
la presencia de sustancias tóxicas, permitiendo a las células colonizar nuevos
ambientes. Otro punto a tener en cuenta es que una microcolonia en división
continua libera residuos y nutrientes que podrán utilizarse para acondicionar las
superficies desnudas y para alimentar a otras células.
(Figura 5. SEDICI: Descripción de biofilms, desarrollo e importancia de su estudio.
Impacto de las técnicas de micronanofabricación en sistemas biológicos.
http://sedici.unlp.edu.ar)
Importancia de su estudio
La presencia de biofilms en una gran diversidad de ambientes trae como
consecuencia una importante variedad de problemas relacionados tanto con la
medicina (infecciones), la industria en general (biocorrosión, pérdida de
15
rendimiento), la industria alimentaria en particular (contaminación microbiana de
alimentos), entre otros (Tellez Peña, S. 2010).
La mayor parte de las enfermedades infecciosas del siglo pasado eran causadas
por
bacterias
dotadas
de
mecanismos patogénicos
específicos:
difteria,
tuberculosis, cólera, coqueluche, etc. Los antibióticos y vacunas desarrollados
para estas bacterias lograron una notable eficacia en su control. En la actualidad,
la frecuencia y gravedad de las infecciones de estas bacterias han sido
desplazadas del primer plano por microorganismos ubicuos, capaces de producir
infecciones de tipo crónico, que responden pobremente a los tratamientos
antibióticos y no pueden prevenirse mediante inmunización. Se ha señalado que
por lo menos el 65% de todos los procesos infecciosos bacterianos humanos
podrían involucrar la formación de biofilms los que han sido reconocidos
progresivamente como factores importantes en la patogenia de muchas
infecciones humanas persistentes (Angel Villegas, N. 2014).
Biofilm en industria alimentaria
En la industria alimentaria es muy común la presencia de biofilms en tuberías,
equipos y materiales, ya que pueden formarse en cualquier tipo de superficie,
incluyendo plástico, cristal, madera, metal y sobre los alimentos (Chmielewsky y
Frank, 2003).
Dado que dichas formaciones pueden contener microorganismos patógenos y que
los mismos presentan una mayor resistencia a la desinfección, se incrementan las
probabilidades de contaminación del producto y de provocar tanto pérdidas
económicas (sea por decomiso, deterioro de los alimentos etc.) como infecciones
alimentarias. Esta es la razón por la que se considera que la presencia de biofilms
en las superficies de contacto de la industria alimentaria constituye un evidente
riesgo para la salud. Además del riesgo de contaminación, el desarrollo de biofilms
puede interferir en diferentes procesos y causar daños en los equipos, en sistemas
de
agua
potable,
obstruir
las
cañerías
o
filtros
de
membranas.
En
intercambiadores de calor y torres de refrigeración puede reducir la transferencia
de calor y como consecuencia su eficiencia en el proceso (Tellez Peña S. 2010).
16
Para la prevención de los riesgos y del costo de los daños que causan los biofilms
son necesarios procedimientos de limpieza y desinfección efectivos que
prevengan la acumulación de residuos orgánicos en las superficies y espacios
reducidos que favorezcan la deposición y colonización bacteriana (Tellez Peña, S.
2010).
Por lo anteriormente expuesto, en este estudio se buscará caracterizar
genéticamente un grupo de cepas STEC, conocer su capacidad de formar biofilm
en condiciones óptimas y evaluar la efectividad del hipoclorito de sodio como
sustancia desinfectante contra las biopelículas sobre poliestireno y acero
inoxidable.
17
CAPITULO 2
MATERIALES Y METODOS
CARACTERIZACIÓN GENÉTICA DE LAS CEPAS STEC
Población de estudio:
Se trabajó con 7 cepas STEC aisladas de hamburguesas de carne bovina,
hamburguesas de pollo y carne bovina picada, pertenecientes al cepario del
Laboratorio de Inmunoquímica y Biotecnología de la Facultad de Cs. Veterinarias
(Tabla 1).
TABLA 1. Cepas STEC utilizadas en esta tesis.
N°
CEPA
Alimento
Serotipo
Factores de virulencia
1
HT1-6
HAMB* CARNE
O20:H19
stx1, stx2, ehxA, saa
2
HT1-14
HAMB CARNE
O117:H7
stx2
3
52-1-1
HAMB POLLO
O130:H11 stx1, stx2, ehxA, saa
4
170-4-2r
HAMB POLLO
O113:H21 vt2, ehxA, saa
5
180-3-4r
HAMB POLLO
O178:H19 vt2
6
HW1-15
HAMB CARNE
O22:H8
stx1, stx2, ehxA, saa
7
C23
CARNE PICADA
O157:H7
stx2, eae, ehxA
* HAMB: Hamburguesa
Detección de adhesinas por PCR
Se analizó la presencia de 5 genes codificantes de adhesinas y fimbrias:
agn43EDL933, aida1, agn43, fimCD y ehaA, mediante la técnica de PCR. Los
primers utilizados se detallan en la tabla 2. Los productos de PCR se observaron
mediante electroforesis en geles de agarosa al 2% teñidos con Bromuro de etidio.
18
EXTRACCIÓN DEL ADN: De cada cepa conservada a -70ºC se tomó una anzada
y se agregó a 500µl de agua bidestilada estéril, se obtuvo ADN por lisis celular en
caliente durante 10 min.
PCR
Se realizaron 2 PCR multiplex con las siguientes composiciones de mix:
COKTAIL MULTIPLEX 1: agn43EDL933-aida1-agn43 (vol. final: 25µl)
Se utilizaron 2,5 µl de extracto de ADN crudo de cada cepa, 0,2 mM de
desoxinucleósidos trifosfatos (dNTPs) (INBIO, HighWay), 0,5 µM de primers
para aida1 y agn43EDL933, 0,06 µM de primer para agn43 y 1U de Taq ADN
polimerasa (INBIO, HighWay) en 2,5 µl de Buffer de reacción 10X y 20 mM de
MgCl2 (INBIO, HighWay).
COKTAIL MULTIPLEX 2 : ehaA-fimCD (vol. final: 25µl)
Se utilizaron las mismas condiciones que en el anterior, pero con diferentes
concentraciones para los primers de: 25 pM para fimCD y para ehaA.
Los programas del termociclado fueron los siguientes:
PROGRAMA DE TERMOCICLADO 1:
PROGRAMA DE TERMOCICLADO 2:
Tºi: 95ºC - 1 min
Tºi : 95ºC - 2 min
30 ciclos:
30 ciclos:
Desnaturalización: 95ºC1 min
Desnaturalización: 95ºC45 seg
Hibridación: 58ºC1 min
Hibridación: 55ºC45 seg
Extensión: 72ºC1 min: 20 seg
Extensión: 72ºC1 min: 30seg
Tºf: 72ºC - 10 min
Tºf: 72ºC - 7 min
Nombre del programa en el T17:
multi.Restieri
Nombre de programa en T17: fimCDehaA
19
Tabla 2. Características de los primers utilizados en este estudio.
Primers
Secuencia 5’
3’
ehaA F
AGGCATGAGACACGATC
ehaA R
AAGTCGTGCCATTGAGC
Amplicón
Referencia
500 pb
Wu et al. 2010
TCGTTAGGATTCAACAGGAACAGGACAGT
fimCD F
GAG
fimCD R
TGCCAGAAGCTTGCAGGGAACAATCCCTT
1154 pb
Cookson, et al.
(2002)
GTT
agn43EDL933 F
CGTATCGCTGTGCCCGATAAC
agn43EDL933 R
CCGTATACGAGTTGTCAGAATCA
aidaI F
ACAGTATCATATGGAGCCACTC
aidaI R
TGTGCGCCAGAACTATTAATGG
agn43 F
CTGGAAACCGGTCTGCCCTT
agn43 R
CCTGAACGCCCAGGGTGATA
707 pb
587 pb
433 pb
Restieri et al.,
2007
Restieri et al.,
2007
Restieri et al.,
2007
Se tomaron como controles positivos las siguientes cepas:
-
E. coli EDL 933 (EHEC O157:H7; stxt1, vt2, eae, ehxA, agn43 EDL933, agn43,
fimCD, ehaA).
-
E coli. 445 (ETEC O157:H19 , aida1)
CARACTERIZACION FENOTIPICA
EXPRESION DE FIMBRIA CURLI
La caracterización fenotípica de la expresión de la fimbria curli se realizó según un
método
descripto
por
Polifroni,
R
(2012),
con
algunas
modificaciones
metodológicas con el fin de observar si habría expresión de curli en las cepas de
estudio.
20

Se sembró por estría de cada cepa congelada, en una placa de Mac
Conckey (24h de incubación 37ºC)

Se preparó un cultivo over nigth (ON) en caldo Luria Bertani LB (18h de
incubación 37ºC 130 rpm)

Se sembró por estría directo de congelado.
De cada preparado se sembró por estría en placas de agar rojo Congo (ARC)
(Agar LB modificado sin ClNa, suplementado con rojo Congo -40mg/lt y azul
brillante G de Coomassie -20mg/L-) por triplicado. Se incubó a 37ºC, 24 y 48h.
El ensayo se realizó en dos eventos independientes (A y B).
FORMACION DE BIOFILM:
ENSAYO PRELIMINAR 1:
Debido a que STEC puede crecer en numerosos medios de cultivo, se buscó
mediante pruebas preliminares el medio que favorezca el desarrollo de biofilm.
21
Para ello se decidió utilizar caldo (LB) que contiene peptona de caseína y extracto
de levadura que proporcionan al medio los nutrientes necesarios para el desarrollo
óptimo de la mayoría de los microorganismos y ClNa que ayuda a mantener el
equilibrio osmótico (http://www.probiotek.com/) en dos variantes, con o sin el
agregado de glucosa. Se seleccionaron al azar 4 de las cepas elegidas para esta
Tesis, y se ajustó la metodología descripta por Polifroni (2012) para la formación
de biofilm en las condiciones deseadas.
ENSAYO PRELIMINAR 2:
El objetivo de este ensayo fue observar el comportamiento de la bacteria ante la
exposición del hipoclorito de sodio analizando diferentes concentraciones (10%,
5%, 1% y 0,5%) y tiempos de exposición (0, 15 min, 30 min, 1 h, y 6 h) para
determinar las condiciones que se utilizarían en la formación de biofilm.
Para ello se utilizó una cepa seleccionada al azar de las elegidas para este
estudio. Se realizó un ON en 3ml de LB (18h. 37ºC), lo llamamos cultivo madre
de la cual se hicieron cinco diluciones agregando las distintas concentraciones de
hipoclorito de sodio, dejando uno de ellos como testigo control (Tabla 3). En todos
los casos el volumen final fue de 3 ml.
Tabla 3. Diagrama de volúmenes utilizados para cada concentración.
Concentraciones
de Hipoclorito de
Sodio
Testigo
LB
Hipoclorito
de sodio
Sc Madre
2700µl
-
300µl
10%
2400µl
300µl
300µl
5%
2550µl
150µl
300µl
1%
2700µl
30µl
300µl
0,5%
2700µl
15µl
300µl
22
Se sembraron dichas diluciones en placas de petri con LB agar y se incubaron a
37ºC en los distintos tiempos de exposición mencionados.
EFECTO DEL HIPOCLORITO DE SODIO SOBRE LA FORMACIÓN DE
BIOFILM EN LAS DISTINTAS SUPERFICIES:
De acuerdo a los resultados obtenidos en el ensayo preliminar se decidió utilizar
las concentraciones 2,5% y 5% de hipoclorito de sodio, para evaluar el efecto de
la exposición de los biofilms a dichas soluciones.
Se emplearon 9 pocillos por cepa por cada concentración utilizada y se realizaron
dos placas:
PLACA 1:

24 h de formación de biofilm 20 min de exposición al hipoclorito (3 pocillos)
PLACA 2: Con una incubación final de 72 h obtenemos los siguientes datos:

A partir del recambio de medio hecho a las 24 h, se expuso al biofilm a la
solución de hipoclorito de sodio por las siguientes 48 h. (3 pocillos).

Al cabo de las 72 h de incubación, se sometió a los biofilms formados a 20
min de exposición al hipoclorito de sodio (3 pocillos).
Se utilizó el siguiente protocolo de formación de biofilm en dos etapas:
1. Ensayo en superficie de poliestireno
2. Ensayo en superficie de acero inoxidable.
Ambos ensayos para la formación de biofilm estuvieron basados en la técnica
descripta por Polifroni, R (2012) con algunas modificaciones:
 Para el crecimiento de las bacterias se realizó un cultivo ON en caldo LB.
Se dejó en estufa con agitación leve (120 rpm) 18h a 37ºC.
 Desde un cultivo ON se estandarizó la masa bacteriana de cada una de las
cepas en cada ensayo, para lograr diluciones de igual concentración bacteriana.
23
 Para ello se tomaron 100µl del cultivo ON y 900µl de medio LB. Se leyó la
densidad óptica (DO) a 600 nm mediante espectrofotometría y con los datos
obtenidos se realizaron diluciones de cada cepa ajustando la concentración a
una DO conocida (DO= 0,5) realizando los siguientes cálculos:
 50/ DO: A
Al valor “A” se lo resta por el volumen final de la dilución
A-1000µl = B
A será el volumen de caldo ON
B será el volumen de LB
A partir de dicha dilución preparada por cepa se realizaron los ensayos en
distintas superficies.
1) POLIESTIRENO
Se utilizaron microplacas de 96 pocillos, en los cuales:

Se sembraron 100 µl de medio LB estéril y 100µl de cultivo en cada pocillo,
por triplicado. Se dejaron pocillos “blanco” sólo con medio estéril para
realizar cálculos posteriores.

Se incubó la placa a 37 ºC por 24 h al cabo de las cuales se retiraron los
sobrenadantes y se realizó un recambio de medio. Se incubaron 48 h más,
y finalmente se reveló la placa.

Para el revelado se retiraron los sobrenadantes de cada pocillo, se lavó
cada uno con agua bidestilada estéril.

Se fijó con metanol (200 µl) durante 20 min.

Se retiró el metanol, y se tiñó con Cristal Violeta 0,1% (200 µl; 30 min).

Una vez finalizada la tinción, se lavó con agua destilada dos veces.

Finalmente, se eluyó el colorante adherido con 200µl de alcohol 96%, por
agitación 10 min a 150 rpm.
24

Se midió la Densidad optica (DO) de los pocillos para determinar la
biomasa total de los biofilms formados a una longitud de onda de 570 nm
mediante lector de micropalcas Labsystem Multiskan EX.
Con los datos obtenidos se realizaron los cálculos necesarios para clasificar las
cepas de acuerdo a su capacidad de formar biofilm según lo descripto por Gómez
et al. (2013). Para ello, se estableció una DO de corte con las DO obtenidas de los
pocillos blanco con el fin de corregir las densidades ópticas de las cepas
eliminando lo correspondiente al colorante absorbido por el medio y la superficie y
de este modo conocer lo que realmente corresponde a la formación del biofilm de
cada cepa.
Una vez obtenida la DO se corrigieron las DO promedio de cada cepa obteniendo
una DO ajustada que sirvió para la clasificación de las cepas según la formación
de biofilm que hayan presentado según lo reflejado en la tabla 4.
DO ajustada (DOa) = DO cepa - DOc
Tabla 4. Regla de clasificación.
NFB (No Formadora de Biofilm)
DO cepa < DO corte
DFB (Débil Formadora de Biofilm)
DO corte ≤ DO cepa < 2DO corte
MFB (Moderada Formadora de Biofilm)
2DO corte ≤ DO cepa < 4DO corte
FFB (Fuerte Formadora de Biofilm)
DO cepa > 4 DO corte
25
2) ACERO INOXIDABLE
Se utilizaron placas de poliestireno de doce pocillos, en las cuales se sumergieron
laminillas de acero inoxidable de 1cm². Las mismas se trataron previamente con el
siguiente protocolo de limpieza y desinfección (Krolasok, et al. 2010):
1. Limpieza con acetona para remover grasas e impurezas.
2. Se las sumergió en HCL (ácido clorhídrico) 5N 15min.
3. Lavado con detergente.
4. Enjuague con agua destilada.
5. Secado a temperatura ambiente.
6. Autoclavado a 121ºC por 15´.
Para el desarrollo del biofilm se empleó el mismo protocolo que para el
poliestireno, modificando solo dos parámetros: los volúmenes utilizados (1 ml de
medio estéril y 1 ml de cultivo), y en la etapa de revelado se cambió la laminilla de
acero inoxidable del pocillo original a un pocillo estéril para obtener el valor neto
de formación de biofilm en dicha superficie.
Para la lectura de los resultados se tomaron 200 µl de la elución del colorante
obtenida para cada pocillo y se colocaron en placas estériles de 96 pocillos para
medir la DO en el lector de microplacas.
El análisis de las DO obtenidas se realizó según lo descrito anteriormente.
26
CAPITULO 3
RESULTADOS CARACTERIZACIÓN GENÉTICA DE LAS CEPAS STEC
Detección de adhesinas por PCR:
Los resultados obtenidos a partir de la técnica PCR se exponen en la TABLA 5:
TABLA 5:
CEPA SEROTIPO
Agn43EDL 933
AIDA 1
Agn 43
fimCD
ehaA
+
+
+
1
O20:H19
-
2
O117:H7
-
-
+
+
+
3
O130:H11
-
-
+
+
+
4
O113:H21
-
-
+
+
+
5
O178:H19
-
-
+
+
+
6
O22:H8
-
-
+
+
+
7
O157:H7
+
-
+
+
+
A continuación, se presentan imágenes tomadas de la lectura de uno de los geles.
En orden se presentan las cepas del ensayo desde la cepa uno a la cepa siete.
27
Se pudo observar que todas las cepas analizadas presentaron todos los genes
estudiados con excepción del agn43EDL933 que sólo lo portó la cepa O157:H7 de
carne bovina. Ninguna de ellas presentó el gen aida1 que es propia de cepas
enterotoxigénicas (Moredo F et al, 2015).
RESULADOS DE CARACTERIZACION FENOTIPICA
EXPRESION DE FIMBRIA CURLI
Teniendo en cuanta los dos ensayos A y B se exponen los resultados obtenidos a
partir de la lectura de las placas de Rojo Congo (Tabla 6). Se identificaron de la
siguiente manera:
Resultado positivo: producción de fimbria curli - las colonias de coloración roja y
con superficie rugosa (fenotipo rdar) o rosa (sar).
Resultado negativo: producción de fimbria curli - las colonias de coloración blanca
y lisa (fenotipo saw) y que no sintetizan celulosa. (Polifroni, R. 2012)
 COLOR “++”= Rojo / “+”= Rosa / “-“= Blanco.
 TEXTURA “-“= Liso / “+”= Rugoso
Por cepa se considera
 “Placa” al resultado obtenido de las placas de rojo congo sembradas
desde las placas de petri con agar Mac. Conkey.
 “Congelado” al resultado de rojo congo realizado a partir del cultivo
congelado a -70ºC.
 “ON” al resultado obtenido a partir de la lectura de las placas de rojo congo
desde un caldo overnight de la cepa.
28
Tabla 6. Resultados obtenidos del análisis de la expresión de la fimbria curli.
A
CEPA
B
COLOR
TEXTURA
COLOR
TEXTURA
1 Placa
++
-
++
-
1 Congelado
++
+
++
-
1 ON
++
+
++
-
2 Placa
++
-
++
-
2 Congelado
++
-
++
-
2 ON
++
-
++
-
3 Placa
+
-
+
+
3 Congelado
+
-
+
+
3 ON
++
-
+
+
4 Placa
+
-
+
-
4 Congelado
+
-
+
-
4 ON
+
-
+
+
5 Placa
+
-
++
-
5 Congelado
++
-
++
-
5 ON
++
-
++
29
6 Placa
+
-
++
-
6 Congelado
++
-
+
+
6 ON
++
-
++
+
7 Placa
++
+/-
++/-
+
7 Congelado
++/-
-
++/-
-
7 ON
++
-
++/-
-
Se puede observar en la tabla de resultados que existieron algunas variantes entre
los dos ensayos (A y B). También en cepas que no comparten las mismas
características variando el origen de siembra, como es en la cepa 1 que en la
siembra proveniente de placa de Mc. Conkey no desarrolló textura al contrario de
las sembradas de ON o Congelado.
Solo se expone la aparición de una sola colonia blanca (presente en la cepa 7)
que se encontraba a su vez con colonias rojas, por lo que consideramos que sea
posible una contaminación de la fuente de siembra o que exprese los dos
fenotipos.
La siguiente imagen se presenta de modo ilustrativo, mostrando una de las placas
que se realizaron. La cepa utilizada fue 1(HT1-6) proviene directamente del cultivo
congelado (siembra directa).
30
La mayoría de las cepas desarrollaron colonias de color rojo o rosado lo que indica
la expresión de la fimbria curli en las cepas de estudio.
EXPRESAN FIMBRIA CURLI
si 87,5%
no 12,5%
31
ENSAYO PRELIMINAR 1
Los resultados obtenidos a partir del desarrollo de biofilm con ambos medios
fueron los siguientes:
CEPA
LB común
LB glucosa
52-1-1
MFB
FFB
170-4-2r
MFB
DFB
180-3-4r
FFB
MFB
C23- o157
MFB
MFB
Referencias:

NFB: No formadora de biofilm.

DFB: Débil formadora de biofilm.

MFF: Moderada formadora de biofilm.

FFB: Fuerte formadora de biofilm.
Al no observar cambios significativos entre los medios se optó por utilizar LB sin el
agregado de glucosa.
ENSAYO PRELIMINAR 2
Para este ensayo se eligió al azar la cepa 52-1-1 (4). A continuación se presentan
los resultados de viabilidad de la cepa, teniendo en cuenta sobre el eje horizontal
las concentraciones y sobre el eje vertical los tiempos de exposición (Tabla 7):
Referencias:
 + = Hasta 200 UFC
 ++ = Incontable pero más dispersas
 +++ = incontables (césped).
32
Tabla 7. Efecto del hipoclorito de sodio sobre la viabilidad de STEC.
Tiempo
Testigo
10%
5%
1%
0,5%
+++
-
-
+++
+++
15 min
+++/+++*
-/-
-/-
++/++
+++/+++
30 min
+++/+++
-/-
-/-
+
+++/+++
1h
+++/+++
-/-
-/-
+
+++/+++
6h
+++
-
-
-
+++
0h
*Las separaciones con barra significa que el ensayo se realizó por duplicado
EFECTO DEL HIPOCLORITO DE SODIO SOBRE LA FORMACION DE
BIOFILM EN LAS DISTINTAS SUPERFICIES:
A continuación se exponen los resultados obtenidos a partir del estudio realizado
con las bacterias de estudio, sometiendo las mismas a las concentraciones
previamente establecidas (2,5% y 5%) durante su formación de biofilm a las 24 h
junto con un recambio de medio (generando así un estrés químico en el mismo), y
a las 72 h de desarrollo del cultivo para observar si una vez que ya se formó el
biofilm, este desinfectante es capaz de generar alguna alteración benéfica para la
sanidad alimentaria.
I: ENSAYO POLIESTIRENO:
PLACA 1:
Se exponen los resultados obtenidos a partir de la formación de biofilm durante 24
h con 20 min de exposición al hipoclorito de sodio (Gráfico 1).
33
Grafico 1:
1,000
Control
2,5% 20`
0,750
5% 20`
0,500
0,250
0,000
HT 1-6
HT 1-14
HW 1-15
52-1-1
170-4-2
180-3.4r
C23
DO corte: 0,111
Tabla de clasificación del grafico 1
CEPA
ENSAYO CLASIFICACIÓN
HT 1-6
Control
MFB
2,5% 20`
DFB
5% 20`
DFB
Control
MFB
2,5% 20`
MFB
5% 20`
DFB
Control
MFB
2,5% 20`
DFB
5% 20`
MFB
HT 1-14
HW 1-15
34
52-1-1
170-4-2
180-3.4r
C23
Control
FFB
2,5% 20`
DFB
5% 20`
DFB
Control
MFB
2,5% 20`
DFB
5% 20`
DFB
Control
MFB
2,5% 20`
DFB
5% 20`
DFB
Control
MFB
2,5% 20`
DFB
5% 20`
DFB
Imagen capturada del biofilm de la cepa HT1-6 por microscopia óptica de
contraste 10X
PLACA 2:
Exposición de ambas concentraciones durante la formación de biofilm (agregado a
las 24 h con recambio de medio, 48 h de exposición al desinfectante) y con el
35
biofilm ya desarrollado (a las 72 h de desarrollo, 20 min de exposición al
desinfectante). Los resultados se exponen en el grafico 2.
Grafico 2:
1,000
Control
5% 48hs
2,5% 48hs
5% 20`
2,5% 20`
0,750
0,500
0,250
0,000
HT 1-6
HT 1-14
HW 1-15
52-1-1
170-4-2
180-3.4r
C23
DO corte: 0,198
Tabla de clasificación del gráfico 2:
CEPA
ENSAYO
CLASIFICACIÓN
HT 1-6
Control
DFB
5% 48hs
DFB
2,5% 48hs
DFB
5% 20`
DFB
2,5% 20`
DFB
Control
FFB
HT 1-14
36
HW 1-15
52-1-1
170-4-2
180-3.4r
C23
5% 48hs
MFB
2,5% 48hs
DFB
5% 20`
MFB
2,5% 20`
MFB
Control
DFB
5% 48hs
DFB
2,5% 48hs
DFB
5% 20`
MFB
2,5% 20`
MFB
Control
DFB
5% 48hs
DFB
2,5% 48hs
DFB
5% 20`
DFB
2,5% 20`
DFB
Control
DFB
5% 48hs
DFB
2,5% 48hs
DFB
5% 20`
DFB
2,5% 20`
DFB
Control
MFB
5% 48hs
MFB
2,5% 48hs
DFB
5% 20`
MFB
2,5% 20`
DFB
Control
DFB
5% 48hs
DFB
2,5% 48hs
DFB
5% 20`
DFB
2,5% 20`
DFB
37
Imagen tomada de una de las placas del ensayo de poliestireno.
II ENSAYO ACERO INOXIDABLE
Teniendo en cuenta que la tinción para la posterior lectura de las laminillas de
acero inoxidable se realizó en pocillos diferentes a los que se desarrolló el biofilm,
se decidió tomar lectura de los dos pocillos por cepa, es decir, del pocillo en el
cuál se desarrolló el biofilm y al pocillo donde se ubica la laminilla. Se recolectaron
resultados por cepa de la formación de biofilm tanto en poliestireno como en acero
inoxidable.
PLACA 1: Se exponen los resultados obtenidos a partir de la formación de biofilm
durante 24 h con 20 min de exposición al hipoclorito de sodio (Gráfico 3).
38
Gráfico 3.
3,0
2,8
2,5
2,3
CONTROL
poliestireno
5% poliestireno
2,0
1,8
1,5
2,5% poliestireno
1,3
Control ACERO
1,0
5% ACERO
0,8
2,5%ACERO
0,5
0,3
0,0
HT 1-6
HT 1-14
HW 1-15
52-1-1
170-4-2
180-3.4r
C23
Do corte poliestireno: 0,29
Do corte Acero: 2,99
PLACA 2:
Exposición de ambas concentraciones de hipoclorito durante la formación de
biofilm (agregado a las 24 h hipoclorito de sodio con recambio de medio, son 48 h
de exposición al desinfectante) y con el biofilm ya desarrollado (a las 72 h de
desarrollo, 20 min de exposición al desinfectante) presentado en el Gráfico 4:
39
Gráfico 4:
3,00
2,75
2,50
2,25
Control
2,00
1,75
5% 48hs
1,50
2,5% 48hs
1,25
Control
1,00
5%20`(48hsBF)
0,75
2,5%20`(48hsBF)
0,50
0,25
0,00
HT 1-6
HT 1-14
HW 1-15
52-1-1
170-4-2
180-3.4r
C23
Do corte poliestireno: 1,70
Do corte Acero: 5,43
Imagen tomada en uno de los ensayos que muestra las placas de acero inoxidable
listas para revelar
40
En los casos de ensayos de poliestireno se observó un notable efecto del
hipoclorito de sodio siendo proporcional este efecto a la mayor exposición y mayor
concentración. Se observaron variaciones en cada ensayo con cada cepa por lo
que se considera que no solo influyen las características de la bacteria en la
formación de esta estructura sino también condiciones externas independientes de
la metodología. Es importante destacar que a pesar de exponer a lavandina el
biofilm, ya sea durante su formación como una vez formado, no termina de
eliminar el mismo. Por lo que es de suma importancia evitar la presencia de STEC
y así no permitir la formación de biofilm.
En los ensayos de desarrollo de biofilm en las placas de acero inoxidable no se
presentan tablas de clasificación debido a que todas las cepas se agruparon como
NO FORMADORAS DE BIOFILM. Cabe destacar que la clasificación sufrió una
importante variación dada por el alto valor de la DO de corte que ofrecieron los
resultados de los ensayos (debido a los altos valores de los pocillos blanco). A la
hora de teñir las placas de acero inoxidable a pesar de la falta de cultivo bateriano,
retenían una importante cantidad de cristal violeta lo cual alteró toda la
clasificación. Desde ya se considera menos conveniente para el biofilm
desarrollarse en superficie de acero inoxidable que el poliestireno, lo que apoya en
cierta forma el requerimiento establecido por el CAA del uso de utensilios,
mesadas y equipos de acero inoxidable en la industria alimentaria.
Es notable la diferencia en el desarrollo de biofilm que existe entre las cepas. Sin
embargo, pocas se demuestran FUERTES FORMADORAS DE BIOFILM lo que es
un gran beneficio para la sanidad alimentaria.
41
DISCUSIÓN:
Los biofilm son una mezcla de bacterias y productos extracelulares secretados por
células bacterianas que generan una gran preocupación para la industria
alimentaria debido a que le confieren protección física, mecánica y biológica a
bacterias patógenas como E. coli (Park y Chen, 2015).
Actualmente no existe gran cantidad de investigaciones acerca del desarrollo de
biofilms por STEC, por lo que se planteó estudiar este mecanismo de resistencia
que generan las bacterias y analizar su comportamiento ante un agente
desinfectante de uso masivo como el hipoclorito de sodio.
En cuanto a la clasificación genotípica realizada se observó que no hubo
diferencias en cuanto al origen respecto de las cepas no-O157 ya que todas
presentaron un mismo perfil de adhesinas (agn43, fimCD, ehaA) excepto por la
O157 que fue positiva a agn43EDL933, el cual fue descripto e identificado en la cepa
de referencia aislada de humanos O157:H7 EDL933. Otros autores han
encontrado resultados similares en cepas provenientes de animales para consumo
humano como bovino y porcino (Colello, et al. 2016).
Con respecto a la expresión de la fimbria curli, se observó un alto porcentaje de
expresión (78% fenotipo rdar y sar) de manera similar a los resultados obtenidos
por Polifroni (2012). Es notable la relación en que las cepas O157:H7 expresan el
fenotipo saw y las no-O157 expresan rdar/sar, de igual manera a lo expuesto en la
investigación realizada por Angel Villegas (2014). Sin embargo, otros autores han
encontrado una menor proporción de expresión de cepas no-O157 curli positivas
(38%) (Cookson, et al. 2002). Por lo expuesto, no se encontró una relación entre la
expresión de curli y la formación de biofilm, ya que la mayoría de las cepas STEC
que presentan esta misma expresión no son FUERTE formadoras de biofilm.
Por lo tanto al igual que Polifroni (2012) y Angel Villegas (2014) la formación de
biofilm, parece no depender sólo de la información genética, sino también del
ecosistema y las condiciones que rodean a la bacteria.
En cuanto al desarrollo de biofilm, de acuerdo a los resultados obtenidos, se
determinó que las bacterias STEC son MODERADAS o DEBILES formadoras
42
sobre poliestireno. Esta investigación coincide con los resultados de Park YJ,
Chen J (2015), que indican que las células STEC expresan una mayor cantidad de
masa biofilm y tienen una mayor masa residual después de la desinfección en
poliestireno que en el acero inoxidable, por lo que se considera más propenso el
desarrollo de biofilm sobre superficies de poliestireno. Se demostró la importancia
del uso de materiales de acero inoxidable para la elaboración de alimentos en
conjunto con una buena desinfección evitaría el desarrollo de biopelículas.
Es importante tener en cuenta esta característica de las bacterias, no sólo por los
mecanismos de
desinfección,
sino también por los posibles focos de
contaminación y así trabajar sobre ellos.
Se investigó el comportamiento de un desinfectante sobre bacterias y luego sobre
biofilm. Se decidió el uso del hipoclorito de sodio debido a su uso masivo tanto en
la industria como a nivel doméstico ya sea por su alcance económico como por su
efectividad. En este trabajo se evidenció que el uso de hipoclorito como
desinfectante es efectivo si su uso es correcto, refiriéndonos a la concentración y
tiempo de exposición, en base a lo cual se considera que se debe utilizar en
concentraciones mayores o iguales al 5% por un tiempo mínimo de 20 min, cuatro
veces superior a lo expuesto por el programa de Carnicerías Saludables que
contaba con una concentración al 1% - 10min para pisos y mesadas (Leotta, et al.
2014).
En cuanto a su efecto sobre el biofilm se evaluó el uso del hipoclorito tanto en la
etapa de desarrollo (a las 24 h de incubación) como al final del período de
incubación (72 h, con una exposición de 20 min). En la etapa de poliestireno no se
observó una total efectividad, todas las cepas fueron al menos débiles formadoras
de biofilm. Y en la etapa de acero inoxidable no se observó formación de biofilm
tanto en los pocillos de control como en los expuestos a lavandina, por lo que se
relaciona la menor capacidad de formar biofilm en dicho material más que por el
uso del desinfectante.
La prevención de la formación de biofilms en la industria de los alimentos reviste
una vital importancia debido a que STEC puede liberar las toxinas desde los
43
biofilms y esta liberación difiere según las condiciones de cultivo a las cuales son
expuestas las células confirmando el riesgo de contaminación e infección (Angel
Villegas, 2014). Se ha demostrado que el medio ambiente cumple un rol como
intermediario en la cadena de contaminación y que la exposición a reiteradas
condiciones de estrés genera en las bacterias mejores respuestas de adaptación a
nuevas condiciones (Polifroni, 2012), lo que de alguna forma apoya la hipótesis de
esta tesis referida a la resistencia que le puede conferir el biofilm a los
desinfectantes, representando un riesgo para la salud pública.
Considerando a las cepas STEC patógenos asociados directamente al SUH, se
fortalece la importancia en la prevención de la contaminación de cualquier
alimento. Cabe destacar que no existe una terapia específica para el tratamiento
de las infecciones por STEC (Angel Villegas, 2014).
Tal como fue demostrado en la investigación de Telez Peña (2010), el desarrollo
de biofilms en ámbitos relacionados a la producción de alimentos, tanto a nivel
doméstico como industrial, puede suponer un importante problema de Salud
Pública. Las características propias de estas estructuras bacterianas implican un
comportamiento diferente ante los procesos de desinfección, por lo tanto, la
dificultad existente para eliminar estas formaciones una vez instauradas hace que
la prevención sea, una vez más, la estrategia elegida a la hora de controlar este
problema. Estos resultados proporcionan, al igual que otras investigaciones como
(Park y Chen, 2015) información relevante para el control de la formación de
biofilms.
44
CONCLUSIONES
A modo de conclusión se expone que:
 El agregado de glucosa en el medio de cultivo no mostró cambios
significativos en el desarrollo de biofilm.
 No se pudo establecer una relación directa entre la expresión de fimbria
curli con la formación de biofilm.
 STEC no es fuerte formadora de biofilm, aunque sobre poliestireno forma
biopelículas en forma moderada o débil, lo que puede afectar de forma
indirecta a la salud pública.
 El desarrollo de biofilm sobre poliestireno es mucho mayor al desarrollo
sobre acero inoxidable.
 La concentración de 5% de hipoclorito de sodio a 20 min de exposición fue
efectiva contra el crecimiento de STEC.
 El uso de hipoclorito de sodio sobre biofilms ya desarrollados no aseguró su
eliminación.
45
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