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“Detección y caracterización de Escherichia
coli productora de toxina Shiga, Salmonella
spp., y cepas de Yersinia desde muestras
humanas, animales y alimentos en San Luis,
Argentina”
Gabriela Isabel Favier, Cecilia Lucero Estrada,
Teresa Inés Cortiñas y María Esther Escudero
Microbiología General, Facultad de Química, Bioquímica y Farmacia, Universidad Nacional de
San Luis (UNSL).
Publicada el 7 de agosto de 2014.
Revista Internacional de Microbiología Hindawi Publishing Corporation.
Detección y caracterización
STEC
Salmonella spp.
Yersinia enterocolitica
Relevantes para la salud pública
Transmisión a través de agua potable y alimentos contaminados
Manifestaciones clínicas intestinales y extraintestinales
STEC está asociada con la colitis hemorrágica y el SUH; su patogenicidad se
atribuye a factores de virulencia que facilitan la colonización eficaz del tracto
gastrointestinal humano y la liberación subsiguiente de toxina Shiga. (TI)
Argentina presenta la mayor incidencia de SUH en el mundo, siendo E. coli
O157:H7 el agente etiológico primario.
Salmonella spp. puede entrar en la cadena alimentaria, y por lo tanto desencadenar
casos esporádicos o brotes de salmonelosis humana.
Los cerdos son los portadores más importantes de Y. enterocolitica. Las cepas
patógenas por lo general llevan un plásmido de virulencia con los genes yadA,
yops, y virF; y marcadores de virulencia cromosómicos como los genes ail, yst,
myfA, e inv.
 Detectar STEC, Salmonella spp. y Yersinia enterocolitica en las
heces humanas y animales, y en los alimentos de origen animal
destinados al consumo humano.
 Evaluar el potencial patógeno de las cepas de Y. enterocolitica a
través de marcadores fenotípicos y moleculares de virulencia.
 Probar la sensibilidad a los antimicrobianos de todas las cepas.
 Determinar las posibles relaciones genéticas entre los aislados
de cada especie por subtipificación mediante electroforesis en
gel de campo pulsado (PFGE).
2.1. Cepas bacterianas.
 Yersinia enterocolitica (Bélgica, Canadá, Noruega y Argentina). Controles +
 Escherichia coli O157:H7. Control +
 Salmonella Braenderup. Marcador de PM (PFGE).
2.2. Muestras.
Total: 453 (Junio de 2008 - Noviembre de 2011)
 70 muestras de pacientes humanos con síntomas de enterocolitis.
 167 muestras de heces obtenidas de:
Bovinos de engorde intensivo (𝑛 = 61)
Bovinos de pastoreo (𝑛 = 68)
Porcinos (𝑛 = 20)
Ovinos (𝑛 = 10)
Cabras (𝑛 = 6)
Equinos (𝑛 = 2)
 216 muestras de origen animal destinados al consumo humano:
Carcasas de pollo (𝑛 = 80)
Piel de cerdo y huesos (𝑛 = 10)
Quesos de cabra (𝑛 = 30)
Salchichas frescas "chorizos" (𝑛 = 90)
6 muestras de tres jabalíes: lenguas (𝑛 = 3) y amígdalas (𝑛 = 3).
2.3. Coliformes totales.
 Muestras de origen animal destinados al consumo humano, con excepción de las amígdalas y
las lenguas de los jabalíes (Agar VLRB, PV, UFC/g).
2.4. Investigación de STEC, Salmonella spp., y Y. enterocolitica.
2.4.1. STEC.
 Enriquecimento caldo EC, aislamiento en agar SMAC.
 Extracción de ADN para la detección de los genes stx1/stx2 por PCR, Gram y biotipificacion de
cada colonia, prueba de aglutinación en Malbrán (antisuero O157-colonias NF de sorbitol).
2.4.2. Salmonella spp.
 Caldo lactosa (LB), caldo tetrationato y caldo RV, agar SS (colonias NF de lactosa), Gram,
pruebas bioquímicas, tipificación serológica (Malbrán).
2.4.3. Y. enterocolitica.
 Enriquecimiento en fosfato tamponado salino añadido con sorbitol y sales biliares, 21 días a 4 ºC.
Aislamiento en agar MC 48 h a 25 ºC, tinción de Gram y pruebas bioquímicas. La caracterización
final en biotipos y serotipos fue realizado en el Centro Nacional de Referencia de Yersinia,
Instituto Pasteur, París, Francia.
2.5. PCR dirigida a los genes stx1 y stx2 de STEC (E. coli).
2.6. PFGE (Electroforesis en gel de campo pulsado).
 ADN en bloques de agarosa, enzima de restricción Xbal, gel de agarosa, 20 horas, GelRed,
transiluminador UV.
2.7. Ensayos fenotípicos de virulencia de cepas de Y. enterocolitica.
2.7.1. Autoaglutinación. (P)
 Tubos con caldo RM-VP (2), 25 ºC (turbidez) y 37 ºC (aglutinación).
2.7.2. Dependencia de calcio a 37 ºC y Rojo Congo.
 Agar Rojo Congo-Oxalato de Sodio y Magnesio (CR-MOX), siembra por extensión.
 Colonias presuntivas de Y. enterocolitica portadora de plásmido: pequeñas, redondas,
convexas, de color rojo, y opacas; colonias de Y. enterocolitica sin plásmido: grandes,
irregulares, planas y translúcidas.
2.7.3. Hidrólisis de Esculina.
 Agar esculina.
2.7.4. Producción de pirazinamidasa.
 Agar pirazinamida inclinado, 25 ºC 48 h, sulfato de amonio ferroso, color rosa + (Formación de
ácido pirazinoico).
2.8. PCR para marcadores moleculares de virulencia de Y. enterocolitica (Genes yadA y ystB).
2.8.1. PCR Nested yadA.
2.8.2. PCR Simple ystB.
2.9. Susceptibilidad antimicrobiana.
 Método de difusión en disco en agar Mueller Hinton, discos de antibióticos.
2.10. Análisis estadístico.
Recuento de coliformes totales en muestras de origen animal destinados al
consumo humano.
STEC, Salmonella spp., y Y. enterocolitica.
Una muestra se consideró "STEC positivo" cuando colonias de E. coli que llevan genes stx1/stx2
podían ser recuperados por cultivo, o "STEC presuntamente positiva" cuando sólo los genes
stx1/stx2 fueron detectados por PCR sobre el ADN extraído del crecimiento confluente en SMAC.
Ensayos fenotípicos y moleculares de virulencia de cepas de Y. enterocolitica.
PCR dirigida a los genes yadA dio resultados negativos en todos los casos (PV).
Y. enterocolitica B1A O:7,8-8-8,19 fue positiva para el gen ystB (aislada de piel y
huesos de cerdo) por PCR.
Susceptibilidad antimicrobiana.
 La cepa STEC aislada de heces humana era susceptible a todos los
antimicrobianos ensayados excepto ampicilina y rifampicina.
 Las cepas de Salmonella fueron susceptibles a todos los
antimicrobianos excepto cefalotina.
 Todas las cepas de Y. enterocolitica mostraron resistencia a la
ampicilina, una cepa de Y. enterocolitica B1A O:12,25-12,26 fue
susceptible a cefalotina, y dos cepas de Y. enterocolitica B1A O:7,88-8,19 mostraron resistencia a cefalotina y eritromicina.
Salmonella
S. Newport
65 %
S. Gaminara
S. Typhimurium
68 %
Figura 1: Las huellas dactilares y dendrograma obtenidos por PFGE de 12 cepas de Salmonella en este estudio. GT, tipo genómico.
Seis S. Newport (127A, B, G, H, I y P), y uno S. Gaminara (127Q) aislados de una amígdala, y cuatro S. Gaminara (128B, I, O y P)
aisladas de la lengua del mismo jabalí. La cepa de S. typhimurium de origen humano (OSA).
Yersinia
Y. enterocolitica B1A O:12,25-12,26
B1A O: 7,8-8-8,19
63 %
B6 O:17
86 %
Y. intermedia B4 O:40
Figura 2: Las huellas dactilares y el dendrograma obtenido por PFGE de 15 cepas de Yersinia. GT, tipo genómico. Y. enterocolitica
B1A O:12,25-12,26 (182Ap, 182Bp, 182Cp, 182Dp, 184Ep) aisladas de 2 carcasas de pollo; Y. enterocolitica B1A O: 7,8-8-8,19
aisladas de 3 muestras de piel y huesos de cerdo (196Ac, 195Ec, 195Ec bis, 197Bc, 197Bc bis) y 2 muestras (246Ap, 246Bp,
247Bp) de carcasas de pollo; cepa de referencia Y. enterocolitica W1024 (W); Y. intermedia B6 O:17 (234p) y Y. intermedia B4 O:40
(236p).
 Los coliformes totales se consideran indicadores de calidad de higiene y su presencia en
los alimentos puede correlacionarse con la presencia de bacterias patógenas.
 Los recuentos de coliformes totales bajos observados en piel y huesos de cerdo, y en los
quesos de cabra podrían atribuirse a los efectos de los tratamientos térmicos aplicados a
los cerdos durante el sacrificio, y a la pasteurización y la conservación de los productos
lácteos, respectivamente.
 El recuento bajo de coliformes totales en los quesos de cabra sería compatible con las
buenas prácticas de fabricación.
 Los recuentos de coliformes totales elevados en las carcasas de pollo indican que la
contaminación es posible en cualquier etapa del proceso de producción, desde el
desplumado, la evisceración, y en el lavado para el almacenamiento por enfriamiento o
congelación.
 E. coli O157:H7 (origen humano) fue aislada por cultivo y se caracterizó como stx2 +
por PCR. Por el contrario, ninguna cepa STEC pudo ser aislada de heces de ganado
stx1/stx2 +, probablemente porque eran viables pero no cultivables.
 Otras técnicas se han recomendado para mejorar la sensibilidad de los métodos de
detección.
 La separación inmunomagnética (IMS) se puede utilizar después de enriquecimiento y
antes del aislamiento selectivo de células STEC, y está bien establecido para la
detección de E. coli O157 en alimentos, produciendo límites de detección tan bajos
como 1-2 UFC/25 g.
 Los métodos moleculares como la PCR convencional y PCR en tiempo real son muy
sensibles y proporcionan resultados en tiempos más cortos que los cultivos.
 Los métodos basados ​en inmunoensayos, tales como un EIA (Enzimoinmunoanálisis),
disponibles para la prueba de toxinas Shiga 1 y 2 se han utilizado en la detección de
STEC en heces humanas.
 El aislamiento de Salmonella Typhimurium de las heces de un paciente fue
consistente con estudios que informan éste como el serotipo más frecuentemente
aislado de los seres humanos en Argentina desde el año 2006.
 Se observa el aislamiento de S. Newport y S. Gaminara de jabalíes por primera vez
en nuestra región.
 Los factores ambientales y las variaciones estacionales, así como diferentes fuentes
de suministro de muestras podrían haber influido en la baja recuperación de
Salmonella a partir de muestras de animales en nuestro estudio.
 La prevalencia de Yersinia observada en este trabajo fue inferior a lo obtenido en
otros estudios en nuestra región. El CAA no establece límites en relación a Y.
enterocolitica en cualquiera de los alimentos analizados aquí, pero la ausencia de
este patógeno es deseable. Aunque Y. enterocolitica no se detectó en las heces
humanas y animales, este microorganismo se ha aislado de heces diarreicas de
humanos y animales en nuestro país.
 En este estudio, las pruebas fenotípicas para la virulencia de cepas de Y. enterocolitica
B1A producen resultados negativos excepto la autoaglutinación a 37 ºC; sin embargo, el
gen yadA no fue detectado por PCR.
 La falta de correlación entre los marcadores de virulencia fenotípicos y genotípicos de Y.
enterocolitica ha sido reportado por otros autores, los cuáles encontraron que algunas
cepas de Y. enterocolitica contienen otros marcadores de virulencia desconocidos que
interactúan entre sí y juegan un papel importante en la patogénesis. El gen ystB había
estado estrechamente vinculado a la producción de diarrea por cepas B1A.
 En este estudio, el gen ystB se demostró en una cepa Y. enterocolitica B1A O:7,8-8- 8,19
aislada a partir de piel y huesos de cerdo.
 La presencia de Y. enterocolitica y Y. intermedia en las carcasas de pollo y piel y huesos
de cerdo podría ser el resultado de una contaminación cruzada durante el procesamiento
de estos productos o en el transporte de los cerdos sacrificados, respectivamente.
 En relación con la sensibilidad a los
antimicrobianos de STEC, se debe
tener en cuenta que los agentes
antimicrobianos pueden dañar la
membrana bacteriana causando la
liberación aguda de la toxina Shiga,
por lo tanto el tratamiento adecuado
del síndrome urémico hemolítico
(SUH) en pacientes consiste en la
hidratación corporal y mantenimiento
de electrolitos, el control de las
complicaciones hematológicas, uso de
antihipertensivos y terapia analgésica,
ventilación mecánica, y la diálisis
cuando sea necesario, evitando la
administración de antibióticos.
 Se observó una baja prevalencia de STEC, Salmonella spp., y especies de Yersinia en
muestras de alimentos, humanos y animales en esta región de Argentina.
 El bajo número de STEC que se encontró en este estudio en comparación con otros
trabajos, podría ser atribuida a los métodos de detección utilizados. De lo contrario, la
detección de genes stx1/stx2 en las heces de ganado pone de manifiesto el riesgo de
exposición a animales portadores de STEC y por lo tanto las buenas prácticas de higiene
durante el sacrificio y procesamiento de carne son indispensables.
 La alta frecuencia de Salmonella observada en el pequeño número de muestras de jabalí
hace hincapié en la necesidad de nuevos estudios en estos animales cuyos subproductos se
fabrican y comercializan al por menor.
 Los bioserotipos y rasgos de virulencia que caracterizan nuestra cepa de Y. enterocolitica se
relacionaron con una baja patogenicidad para los humanos; sin embargo, un amplio campo
de conocimiento permanece sin explorar acerca de la virulencia de Y. enterocolitica B1A.
 Nuestros resultados sugieren que una estrecha vigilancia microbiológica podría contribuir al
conocimiento de la prevalencia y distribución de estos enteropatógenos en los pacientes, los
presuntos reservorios animales y alimentos en nuestra región, lo que permitiría a los
servicios de salud pública tomar medidas preventivas.