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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
MAESTRÍA EN TECNOLOGÍA Y CONTROL DE MEDICAMENTOS
“EVALUACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA DE LOS EXTRACTOS
HIDROALCOHÓLICOS OBTENIDOS A PARTIR DE LA HOJA, TALLO Y RAÍZ DE
PETIVERIA ALLIACEA L. SOBRE STAPHYLOCOCCUS AUREUS, STAPHYLOCOCCUS
EPIDERMIDIS, PSEUDOMONAS AERUGINOSA Y CANDIDA ALBICANS”
Tesis de Investigación Científica para optar por el título de Magíster en Tecnología y Control de
Medicamentos.
Autor:
Paulo César Tello Navarrete
Email:
[email protected]
Tutor:
BQF. Dayana Paulina Borja Espín M. Sc.
Quito, Junio de 2015
Tello Navarrete, Paulo César (2015). Evaluación de la
Concentración
Mínima
Inhibitoria
de
los
extractos
hidroalcohólicos obtenidos a partir de la hoja, tallo y raíz de
Petiveria alliacea L. sobre Staphylococcus aureus, Staphylococcus
epidermidis, Pseudomonas aeruginosa y Candida albicans .Trabajo
de investigación para optar por el grado de Magister en Tecnología y
Control de Medicamentos. Instituto de Investigación y Posgrado.
Facultad de Ciencias Químicas. Quito: UCE. 118 p.
ii
DEDICATORIA
A mi madre Martha Cecilia Navarrete Olmos y mi abuelita Ángela Olmos por su apoyo constante y
desinteresado, ejemplo a seguir para el resto de mi vida.
A mi Tía Alba Navarrete Olmos, mi padre y hermanos.
A todas las personas quienes con su colaboración me apoyaron a culminar esta investigación.
iii
AGRADECIMIENTO
A todos quienes contribuyeron a la elaboración de esta investigación:
A la BQF. Dayana Paulina Borja Espín M. Sc. por su guía en su calidad de tutora.
A los egresados de la Facultad de Ciencias Químicas por su participación en algunas de las fases
experimentales.
A la Universidad Central del Ecuador, a la Facultad de Ciencias Químicas y al Instituto de
Investigación y Posgrado, por la organización, apoyo y seguimiento de la Maestría.
iv
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS
INSTITUTO DE INVESTIGACION Y POSGRADO
MAESTRIA EN TECNOLOGIA Y CONTROL DE MEDICAMENTOS
AUTORIZACIÓN DEL AUTOR
Yo, Paulo César Tello Navarrete, en calidad de autor del trabajo de investigación realizada sobre
“Evaluación de la Concentración Mínima Inhibitoria de los extractos hidroalcohólicos obtenidos a
partir de la hoja, tallo y raíz de Petiveria alliacea L. sobre Staphylococcus aureus, Staphylococcus
epidermidis, Pseudomonas aeruginosa y Candida albicans” por la presente autorizo a la
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR, hacer uso de todos los contenidos que me pertenecen o
de parte de los que contienen esta obra, con fines estrictamente académicos o de investigación.
Los derechos que como autor me corresponden, con excepción de la presente autorización, seguirán
vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en los artículos 5, 6, 8, 19 y demás pertinentes
de la Ley de Propiedad Intelectual y su Reglamento.
En la ciudad de Quito a los, 22 días del mes de Junio de 2015
C.C. 1713702403
v
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS
INSTITUTO DE INVESTIGACION Y POSGRADO
MAESTRIA EN TECNOLOGIA Y CONTROL DE MEDICAMENTOS
CONSTANCIA DE APROBACIÓN DEL TUTOR
Por la presente, dejo constancia que he leído el trabajo de Tesis de Investigación Científica de Maestría
presentado por el señor Paulo César Tello Navarrete para optar por el título de Máster en Tecnología y
Control de Medicamentos cuyo título es “Evaluación de la Concentración Mínima Inhibitoria de
los extractos hidroalcohólicos obtenidos a partir de la hoja, tallo y raíz de Petiveria alliacea L.
sobre Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Pseudomona aeruginosa y Candida
albicans”, el mismo que reúne los requisitos y méritos suficientes para ser sometido a evaluación por
el Tribunal Examinador.
En la ciudad de Quito a los, 22 días del mes de Junio de 2015
----------------------------------------------BQF. Dayana Paulina Borja Espín M. Sc.
C.C 1710993849
vi
CONTENIDO
DEDICATORIA ........................................................................................................................ iii
CONTENIDO ........................................................................................................................... vii
LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................. xiv
LISTADE TABLAS .............................................................................................................. xviii
RESUMEN .............................................................................................................................. xix
SUMMARY ............................................................................................................................. xx
CAPITULO I .............................................................................................................................. 1
1.1.
DESCRIPCIÓN DEL TEMA DE INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA ......................... 1
1.1.1.
1.2.
INTRODUCCION ........................................................................................................... 1
FORMULACIÓN DEL PROBLEMA.......................................................................... 3
1.2.1.
CONTEXTUALIZACIÓN. .............................................................................................. 3
1.2.2.
ANÁLISIS CRÍTICO ....................................................................................................... 3
1.2.3.
PROGNOSIS .................................................................................................................... 4
1.2.4.
FORMULACIÓN............................................................................................................. 4
1.2.5.
DELIMITACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN. ............................................................... 5
1.2.6.
DELIMITACIÓN DE CONTENIDO .............................................................................. 5
1.2.6.1.
Delimitación Espacial .................................................................................... 5
1.2.6.2.
Delimitación Temporal .................................................................................. 5
1.3.
HIPÓTESIS .................................................................................................................. 5
1.4.
OBJETIVOS ................................................................................................................. 6
1.4.1.
OBJETIVO GENERAL ................................................................................................... 6
1.4.2.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................................... 6
CAPITULO II ............................................................................................................................. 7
MARCO TEORICO ................................................................................................................... 7
2.1.
ANTECEDENTES ....................................................................................................... 7
2.2.
FUNDAMENTACIÓN LEGAL................................................................................... 8
2.3.
CARACTERÍZACIÓN BOTÁNICA DE “Petiveria alliacea L.” .............................. 9
2.3.1
DESCRIPCIÓN .............................................................................................................. 10
2.3.2
DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA ................................................................................. 11
2.3.3
PARTE UTILIZADA ..................................................................................................... 11
2.3.4
COMPONENTES QUÍMICOS AISLADOS ................................................................. 11
vii
2.3.5
2.4.
USOS Y PROPIEDADES .............................................................................................. 12
MARCHA FITOQUÍMICA, PERFIL CROMATOGRÁFICO .................................. 12
2.4.1.
MARCHA FITOQUÍMICA ........................................................................................... 12
2.4.1.1
Triterpenos y esteroides ............................................................................... 12
2.4.1.2
Flavonoides y antocianidinas ....................................................................... 13
2.4.1.3
Lactonas y cumarinas ................................................................................... 14
2.4.1.4
Saponinas ..................................................................................................... 14
2.4.1.5
Taninos ......................................................................................................... 14
2.4.1.6
Aminoácidos................................................................................................. 15
2.4.1.6.1. Efectos de los aminoácidos en las plantas ........................................................... 16
2.4.1.6.2. Aminoácidos Azufrados ...................................................................................... 16
2.4.1.6.2.1. Cisteína ......................................................................................................... 16
2.4.1.6.2.2. Metionina ..................................................................................................... 16
2.4.2.
PERFIL CROMATOGRÁFICO .................................................................................... 17
2.4.2.1
Fundamento de la cromatografía de capa fina ............................................. 17
2.4.2.2
Adsorbente ................................................................................................... 17
2.4.2.2.1. Sílica .................................................................................................................... 17
2.4.2.3
Identificación por cromatografía en capa fina.............................................. 17
2.5. ACTIVIDAD
ANTIMICROBIANA:
CONCENTRACIÓN
MÍNIMA
INHIBITORIA. ..................................................................................................................... 18
2.6.
MICROORGANISMOS UTILIZADOS .................................................................... 19
2.6.1.
BACTERIAS .................................................................................................................. 19
2.6.1.1.
Staphylococcus aureus: ............................................................................... 19
2.6.1.2.
Staphylococcus epidermidis ......................................................................... 20
2.6.1.3.
Pseudomonas aeruginosa o Pseudomonas pyocyanea ................................. 20
2.6.2.
LEVADURA: ................................................................................................................. 22
2.6.2.1.
2.7.
Candida albicans .......................................................................................... 22
ESTADISTICA NO PARAMETRICA ...................................................................... 22
2.7.1.
Prueba de Kruskal-Wallis............................................................................................... 23
2.7.2.
Prueba de rangos con signos de Wilcoxon ..................................................................... 23
2.7.3.
Prueba de U Mann-Whitney ........................................................................................... 23
2.7.4.
Pruebas de normalidad ................................................................................................... 24
2.7.4.1.
Prueba de contraste de Kolmogorov-Smirnov ............................................. 24
2.7.4.2.
Prueba de contraste de Shapiro y Wilk ........................................................ 24
viii
CAPÍTULO III ......................................................................................................................... 25
METODOLOGÍA..................................................................................................................... 25
3.1.
ENFOQUE DE LA INVESTIGACIÓN ..................................................................... 25
3.2.
MODALIDAD DE LA INVESTIGACIÓN ............................................................... 25
3.3.
NIVELES DE INVESTIGACIÓN ............................................................................. 25
3.4.
IDENTIFICACIÓN DE VARIABLES ...................................................................... 25
3.5.
DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN ......................................................................... 26
3.5.1.
Caracterización botánica de la especie en estudio .......................................................... 26
3.5.2.
Obtención de extractos hidroalcohólicos hojas, tallo y raíz ........................................... 26
3.5.3.
Análisis Fitoquímico de los extractos ............................................................................ 26
3.5.4.
Concentración mínima inhibitoria por el método de Difusión en agar (Adaptación
método del método Kirby-Bauer)................................................................................................... 27
3.6.
POBLACIÓN Y MUESTRA...................................................................................... 27
3.6.1.
Población ........................................................................................................................ 27
3.6.2.
Muestra ........................................................................................................................... 28
3.7.
OPERACIONALIZACIÓN DE LAS VARIABLES DE LA HIPÓTESIS. ............... 28
3.8.
MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................... 28
3.8.1.
Recolección .................................................................................................................... 28
3.8.2.
Caracterización botánica de la especie. .......................................................................... 29
3.8.3.
Obtención de extractos hidroalcohólicos ....................................................................... 29
3.8.4.
Medición de las características físicas de los extractos .................................................. 30
3.8.4.1.
Determinación del pH .................................................................................. 30
3.8.4.2.
Determinación del peso específico. .............................................................. 31
3.8.4.3.
Determinación del índice de refracción ....................................................... 31
3.8.5.
Tamizaje fitoquímico ..................................................................................................... 32
3.8.5.1.
Extracto Etéreo ............................................................................................. 33
3.8.5.1.1. Ensayo de Dragendorff........................................................................................ 34
3.8.5.1.2. Ensayo de Mayer ................................................................................................. 34
3.8.5.1.3. Ensayo de Wagner ............................................................................................... 34
3.8.5.1.4. Ensayo de Baljet .................................................................................................. 35
3.8.5.1.5. Ensayo de Liebermann-Burchard ........................................................................ 35
3.8.5.2.
Extracto Etanólico ........................................................................................ 35
3.8.5.2.1. Ensayo de Dragendorff........................................................................................ 35
3.8.5.2.2. Ensayo de Mayer ................................................................................................. 36
ix
3.8.5.2.3. Ensayo de Wagner ............................................................................................... 36
3.8.5.2.4. Ensayo de Catequinas.......................................................................................... 36
3.8.5.2.5. Ensayo de resinas ................................................................................................ 36
3.8.5.2.6. Ensayo de Fehling ............................................................................................... 36
3.8.5.2.7. Ensayo de Baljet .................................................................................................. 37
3.8.5.2.8. Ensayo de Liebermann-Burchard ........................................................................ 37
3.8.5.2.9. Ensayo de la espuma ........................................................................................... 37
3.8.5.2.10. Ensayo del cloruro férrico ................................................................................. 37
3.8.5.2.11. Ensayo de la ninhidrina ..................................................................................... 37
3.8.5.2.12. Ensayo de Borntrager ........................................................................................ 37
3.8.5.2.13. Ensayo de Shinoda ............................................................................................ 38
3.8.5.2.14. Ensayo de Kedde ............................................................................................... 38
3.8.5.2.15. Ensayo de antocianidinas .................................................................................. 38
3.8.5.3.
Extracto Acuoso ........................................................................................... 38
3.8.5.3.1. Ensayo de Dragendorff........................................................................................ 39
3.8.5.3.2. Ensayo de Mayer ................................................................................................. 39
3.8.5.3.3. Ensayo de Wagner ............................................................................................... 39
3.8.5.3.4. Ensayo de Shinoda .............................................................................................. 39
3.8.5.3.5. Ensayo del cloruro férrico ................................................................................... 39
3.8.5.3.6. Ensayo de la espuma ........................................................................................... 39
3.8.5.3.7. Ensayo de Fehling ............................................................................................... 40
3.8.5.3.8. Ensayo de mucílagos ........................................................................................... 40
3.8.6.
Ensayos Complementarios ............................................................................................. 40
3.8.6.1.
Glicósidos cianogenéticos ............................................................................ 40
3.8.6.2.
Aceites, hidrocarburos y carotenos .............................................................. 40
3.8.6.3.
Ensayo de aceite fijo, secante o esencial ...................................................... 40
3.8.6.4.
Ensayo de hidrocarburos .............................................................................. 40
3.8.7.
Perfil cromatográfico...................................................................................................... 41
3.8.7.1.
Alcaloides ..................................................................................................... 42
3.8.7.2.
Aminoácidos................................................................................................. 42
3.8.7.3.
Esteroles ....................................................................................................... 43
3.8.7.4.
Flavonoides .................................................................................................. 43
3.8.7.5.
Naftoquinonas .............................................................................................. 44
x
3.8.7.6.
Antraquinonas .............................................................................................. 44
3.8.7.7.
Saponinas ..................................................................................................... 45
3.8.7.8.
Cardiotónicos ............................................................................................... 45
3.8.8.
Concentración mínima inhibitoria .................................................................................. 45
3.8.8.1.
Preparación de medios de cultivo................................................................. 47
3.8.8.2.
Prueba de determinación de actividad antimicrobiana en extractos fluidos 47
3.8.8.3.
Preparación del inóculo ................................................................................ 48
3.8.8.4. Procedimiento de identificación de la actividad antimicrobiana de los
extractos fluidos............................................................................................................. 48
3.9.
3.8.8.5.
Procedimiento para la preparación del antimicrobiano fluconazol .............. 48
3.8.8.6.
Procedimiento de CMI por Difusión en Agar .............................................. 48
DISEÑO EXPERIMENTAL ...................................................................................... 49
3.9.1.
Comparación de extractos (70:30) ................................................................................. 49
3.9.1.1.
3.9.2.
Comparación de extractos (50:50) ................................................................................. 49
3.9.2.1.
3.9.3.
Pruebas no paramétricas: Prueba de Kruskal-Wallis (70:30)....................... 49
Pruebas no paramétricas: Prueba de Kruskal-Wallis 50:50 ......................... 49
Comparación de órganos vegetativos (70:30) y (50:50) ................................................ 50
3.9.3.1.
Pruebas no paramétricas: Prueba de Prueba de Mann-Whitney: Raíz ......... 50
3.9.3.2.
Pruebas no paramétricas: Prueba de Prueba de Mann-Whitney: Tallo ........ 50
3.9.3.3.
Pruebas no paramétricas: Prueba de Prueba de Mann-Whitney: Hojas ....... 50
3.9.4.
Evaluación de CMI en extractos (70:30) para raíz, hojay tallo ...................................... 50
3.9.4.1.
3.9.5.
Prueba de Wilcoxon con cambios de signos. ............................................... 50
Evaluación de CMI en extractos (50:50) para raíz, hoja y tallo .................................... 50
3.9.5.1.
Prueba de Wilcoxon con cambios de signos. ............................................... 50
CAPITULO IV ......................................................................................................................... 52
RESULTADOS ........................................................................................................................ 52
4.1.
RESULTADOS TAMIZAJE FITOQUÍMICO DE Petiveria alliacea L. ................. 52
4.1.1.
Hojas .............................................................................................................................. 52
4.1.1.1.
Extracto etéreo de hojas ............................................................................... 52
4.1.1.2.
Extracto alcohólico de hojas ........................................................................ 52
4.1.1.3.
Extracto acuoso de hojas. ............................................................................. 55
4.1.1.4.
Ensayos complementarios de hojas. ............................................................. 56
4.1.2.
Tallo ............................................................................................................................... 57
4.1.2.1.
Extracto alcohólico de tallo .......................................................................... 57
xi
4.1.2.2.
Extracto acuoso de tallo. .............................................................................. 59
4.1.2.3.
Ensayos complementarios de tallo. .............................................................. 60
4.1.3.
Raíz ................................................................................................................................ 60
4.1.3.1.
Extracto alcohólico de raíz. .......................................................................... 60
4.1.3.2.
Extracto acuoso de raíz. ............................................................................... 62
4.1.3.3.
Ensayos complementarios de raíz. ............................................................... 63
4.2.
PRUEBAS FÍSICAS................................................................................................... 64
4.3.
PERFIL CROMATOGRÁFICO ................................................................................. 64
4.3.1.
Ensayos para alcaloides .................................................................................................. 65
4.3.2.
Ensayo para aminoácidos ............................................................................................... 68
4.3.3.
Ensayo para esteroles. .................................................................................................... 71
4.3.4.
Ensayos para Flavonoides. ............................................................................................. 73
4.3.5.
Ensayos para Naftoquinonas .......................................................................................... 77
4.3.6.
Ensayo para Antraquinonas. ........................................................................................... 80
4.3.7.
Ensayo para Cardiotónicos ............................................................................................. 81
4.4.
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA .......................................................................... 84
4.5.
CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA ........................................................ 88
4.5.1.
Resultados de evaluación estadística de CMI. ............................................................... 94
4.5.1.1.
Verificación de la Normalidad de los datos ................................................. 94
4.5.1.2.
Análisis de Normalidad ................................................................................ 94
4.5.1.3.
Evaluación de Concentración mínima inhibitoria en Extractos (70:30). ..... 95
4.5.1.3.1. Raíz...................................................................................................................... 95
4.5.1.3.1.1. Prueba de Wilcoxon con cambios de signos. ............................................... 96
4.5.1.3.2. Hojas.................................................................................................................... 97
4.5.1.3.2.1. Prueba de Wilcoxon con cambios de signos. ............................................... 97
4.5.1.3.3. Tallos ................................................................................................................... 98
4.5.1.3.3.1. Prueba de Wilcoxon con cambios de signos. ............................................... 98
4.5.1.4.
Evaluación de CMI en extractos (50:50)...................................................... 99
4.5.1.4.1. Raíz.................................................................................................................... 100
4.5.1.4.1.1. Prueba de Wilcoxon con cambios de signos. ............................................. 100
4.5.1.4.2. Hojas.................................................................................................................. 101
4.5.1.4.2.1. Prueba de Wilcoxon con cambios de signos. ............................................. 101
4.5.1.4.3. Tallo .................................................................................................................. 102
4.5.1.4.3.1. Prueba de Wilcoxon con cambios de signos. ............................................. 103
xii
4.5.1.5.
Comparación de Extractos (70:30) ............................................................. 104
4.5.1.5.1. Prueba de Kruskal-Wallis (70:30). .................................................................... 104
4.5.1.6.
Comparación de Extractos (50:50) ............................................................. 105
4.5.1.6.1. Prueba de Kruskal-Wallis 50:50........................................................................ 105
4.5.1.7.
Comparación de órganos vegetativos (70:30) y (50:50). ........................... 105
4.5.1.7.1. Prueba de Mann-Whitney: Raíz ........................................................................ 105
4.5.1.7.2. Prueba de Mann-Whitney: Tallo ....................................................................... 106
4.5.1.7.3. Prueba de Mann-Whitney: Hojas ...................................................................... 107
CAPITULO V ........................................................................................................................ 109
CONCLUSIONES Y DISCUSIONES ................................................................................... 109
CAPITULO VI ....................................................................................................................... 114
RECOMENDACIONES ........................................................................................................ 114
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................... 115
xiii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Planta Petiveria alliacea L. ...................................................................................... 10
Figura2: Hojas de Petiveria alliacea L. .................................................................................. 10
Figura 3: Raíz de Petiveria alliacea L. ................................................................................... 10
Figura 4:S. aureus, micrografía electrónica de barrido, color artificial. .................................. 19
Figura 5: Imagen de escaneado electrónico de S. epidermidis. ................................................ 20
Figura 6: P. aeruginosa en XLD agar ...................................................................................... 21
Figura 7: Candida albicans ...................................................................................................... 22
Figura 8: Ensayo Liebermann- Burchard positivo para Triterpenos-Esteroides en extracto
etéreo de hojas. .......................................................................................................................... 52
Figura 9: Ensayo de catequinas positivo hojas extracto alcohólico. ........................................ 53
Figura 10: Ensayo de Baljet positivo para Lactonas en extracto alcohólico de hojas ............. 53
Figura 11: Ensayo de Liebermann- Burchard positivo para Triterpenos-Esteroides en extracto
alcohólico de hojas. ................................................................................................................... 53
Figura 12: Ensayo de espuma positivo para Saponinas en extracto alcohólico de hojas. ........ 54
Figura 13: Ensayo de cloruro férrico positivo para Fenoles y Taninos en extracto alcohólico
de hojas. ..................................................................................................................................... 54
Figura 14: Ensayo de ninhidrina positivo para Aminoacidos en extracto alcohólico de hojas.
................................................................................................................................................... 54
Figura 15: Ensayo de shinoda positivo para Flavonoides en extracto alcohólico de hojas. .... 54
Figura 16: Ensayo de antocianidina positivo en extracto alcohólico de hojas. ........................ 54
Figura 17: Ensayo de Dragendorff positivo para Alcaloides en extracto alcohólico de hojas. 55
Figura 18: Ensayo de Wagner positivo para Alcaloides en extracto alcohólico de hojas. ....... 55
Figura 19: Ensayo de Fehling positivo para Azucares Reductores en extracto acuoso hojas. 56
Figura 20: Ensayo de espuma positivo para Saponinas en extracto acuoso hojas. ................. 56
Figura 21: Ensayo de Mayer positivo para Alcaloides en extracto acuoso hojas. ................... 56
Figura 22: Ensayo de Wagner positivo para Alcaloides en extracto acuoso hojas. ................. 56
Figura 23: Ensayo de Resinas positivo en extracto alcohólico de tallo. ................................. 57
Figura 24: Ensayo de Baljet positivo para Lactonas en extracto alcohólico de tallo. ............. 58
Figura 25: Ensayo de Liebermann- Burchard positivo para Triterpenos y Esteroides en
extracto alcohólico de tallo. ....................................................................................................... 58
Figura 26: Ensayo de espuma positivo para Saponinas en extracto alcohólico de tallo. ......... 58
Figura 27: Ensayo de cloruro férrico positivo para Fenoles y Taninos en extracto alcohólico
de tallo. ...................................................................................................................................... 58
Figura 28: Ensayo de ninhidrina positivo para Aminoácidos en extracto alcohólico de tallo.
................................................................................................................................................... 58
Figura 29: Ensayo de antocianidina positivo en extracto alcohólico de tallo. ......................... 59
Figura 30: Ensayo de Dragendorff positivo para Alcaloides en extracto alcohólico de tallo. 59
Figura 31: Ensayo de Fehling positivo para Azucares Reductores en extracto acuoso de tallo.
................................................................................................................................................... 60
Figura 32: Ensayo de espuma positivo para Saponinas en extracto acuoso de tallo. ............... 60
Figura 33: Ensayo de resinas positivo en extracto alcohólico de raíz...................................... 61
Figura 34: Ensayo de Liebermann- Burchard positivo para Triterpenos y Esteroides en
extracto alcohólico de raíz. ........................................................................................................ 61
Figura 35: Ensayo de cloruro férrico positivo para Fenoles y Taninos en extracto alcohólico
de raíz. ....................................................................................................................................... 61
xiv
Figura 36: Ensayo de ninhidrina positivo para Aminoácidos en extracto alcohólico de raíz. 62
Figura 37: Ensayo de antocianidina positivo en extracto alcohólico de raíz. .......................... 62
Figura 38: Ensayo de Dragendorff positivo para Alcaloides en extracto alcohólico de raíz. .. 62
Figura 39: Ensayo de espuma positivo para Saponinas en extracto acuoso de raíz. ................ 63
Figura 40: Ensayo de Dragendorff positivo para Alcaloides en extracto acuoso de raíz. ...... 63
Figura 41: Ensayo de Wagner positivo para Alcaloides en extracto acuoso de raíz. .............. 63
Figura 42:Extractos secos: Orden de siembra .......................................................................... 64
Figura 43: Extractos frescos: Orden de siembra ...................................................................... 65
Figura 44: Ensayo de alcaloides fase móvil 1, placas cromatográficas sin revelador para
extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca. ...................................... 66
Figura 45: Ensayo de alcaloides fase móvil 1, placas cromatográficas con revelador para
extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca ....................................... 66
Figura 46: Ensayo de alcaloides fase móvil 2, placas cromatográficas sin revelador para
extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca. ...................................... 67
Figura 47: Ensayo de alcaloides fase móvil 2, placas cromatográficas con revelador para
extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca. ...................................... 67
Figura 48: Ensayo de alcaloides fase móvil 3, placas cromatográficas sin revelador para
extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca. ...................................... 67
Figura 49: Ensayo de alcaloides fase móvil 3, placas cromatográficas con revelador para
extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca. ...................................... 68
Figura 50: Ensayo de aminoácidos fase móvil 1, placas cromatográfícas sin revelador para
extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca. ...................................... 69
Figura 51: Ensayo de aminoácidos fase móvil1, placas cromatográficas con revelador para
extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca. ...................................... 69
Figura 52: Ensayo de aminoácidos fase móvil 2, placas cromatografícas sin revelador para
extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca. ...................................... 70
Figura 53: Ensayo de aminoácidos fase móvil2, placas cromatografícas con revelador para
extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca. ...................................... 71
Figura 54: Ensayo de esteroles con una sola fase móvil, placas cromatografías sin revelador
para extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca. .............................. 72
Figura 55: Ensayo de esteroles con una sola fase móvil, placas cromatografícas con revelador
a longitud de onda 365 nm para extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de
planta seca.................................................................................................................................. 72
Figura 56: Ensayo de flavonoides con fase móvil 1, placas cromatografícas sin revelador para
extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca. ...................................... 73
Figura 57: Ensayo de flavonoides con fase móvil 1, placas cromatografícas con revelador a
longitud de onda de 365 nm para extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de
planta seca.................................................................................................................................. 74
Figura 58: Ensayo de flavonoides con fase móvil 2, placas cromatografícas sin revelador para
extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca. ...................................... 75
Figura 59: Ensayo de flavonoides con fase móvil 2, placas cromatografícas con revelador a
longitud de onda de 365 nm para extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de
planta seca.................................................................................................................................. 75
Figura 60: Ensayo de flavonoides con fase móvil 3, placas cromatografícas sin revelador para
extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca. ...................................... 76
xv
Figura 61: Ensayo de flavonoides con fase móvil 3, placas cromatografícas con revelador a
longitud de onda de 365 nm para extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de
planta seca.................................................................................................................................. 77
Figura 62: Ensayo de naftoquinonas con fase móvil 1, placas cromatografías sin revelador
para extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca ............................... 78
Figura 63: Ensayo de naftoquinonas fase móvil1, placas cromatográficas con revelador para
extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca. ...................................... 78
Figura 64: Ensayo de naftoquinonas con fase móvil 2, placas cromatografías sin revelador
para extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca. .............................. 79
Figura 65: Ensayo de naftoquinonas fase móvil 2, placas cromatográficas con revelador para
extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca. ...................................... 79
Figura 66: Ensayo de antraquinonas, placas cromatográficas sin revelador para extractos
obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca. ..................................................... 80
Figura 67: Ensayo de antraquinonas, placas cromatográficas con revelador para extractos
obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca. ..................................................... 81
Figura 68: Ensayo para cardiotónicos, placas cromatográficas sin revelador para extractos
obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca. ..................................................... 82
Figura 69: Ensayo para cardiotónicos, placas cromatográficas con revelador para extractos
obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca. ..................................................... 82
Figura 70: Ensayo para cardiotónicos con fase móvil 2, placas cromatográficas sin revelador
para extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca. .............................. 83
Figura 71: Ensayo para cardiotónicos con fase móvil 2, placas cromatográficas con revelador
para extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca. .............................. 83
Figura 72: Ensayo de actividad antibacteriana para Pseudomonas aeruginosa en los seis
extractos fluidos......................................................................................................................... 84
Figura 73: Ensayo de actividad antibacteriana para
Staphylococcus aureus en los seis
extractos fluidos......................................................................................................................... 85
Figura 74: Ensayo de actividad antibacteriana para Staphylococcus epidermidis en los seis
extractos fluidos......................................................................................................................... 85
Figura 75: Ensayo de actividad antimicótica para Candida albicans en hojas para extractos
fluidos obtenidos a partir de etanol: agua (70:30) y etanol: agua (50:50). ................................ 86
Figura 76: Ensayo de actividad antimicótica para Candida albicans en tallos para extractos
fluidos obtenidos a partir de etanol: agua (70:30) y etanol: agua (50:50). ................................ 87
Figura 77: Ensayo de actividad antimicótica para Candida albicans en raíz para extractos
fluidos obtenidos a partir de etanol: agua (70:30) y etanol: agua (50:50). ................................ 87
Figura 78: Halos de inhibición para Candida albicans en extracto fluido de raíz obtenido a
partir de etanol: agua (70:30) para las concentraciones uno, dos y tres. ................................... 88
Figura 79: Halos de inhibición para Candida albicans en extracto fluido de tallos obtenido a
partir de etanol: agua (70:30) para la concentración uno. ......................................................... 89
Figura 80: Halos de inhibición para Candida albicans en extracto fluido de hojas obtenido a
partir de etanol: agua (70:30) para las concentraciones uno, dos, tres y cuatro. ....................... 90
Figura 81: Halos de inhibición para Candida albicans en extracto fluido de raíz obtenido a
partir de etanol: agua (50:50) para las concentraciones uno, dos. ............................................. 91
Figura 82: Halos de inhibición para Candida albicans en extracto fluido de tallos obtenido a
partir de etanol: agua (50:50) para las concentraciones uno, dos. ............................................. 92
Figura 83: Halos de inhibición para Candida albicans en extracto fluido de hojas obtenido a
partir de etanol: agua (50:50) para las concentraciones tres y cuatro. ....................................... 93
xvi
Figura 84: Halos de inhibición para Candida albicans
con fluconazol para las
concentraciones uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis y siete. ........................................................ 94
Figura85: Prueba de Wilcoxon para raíz (70:30) sistema SPSS 19.0 para Windows. ............. 96
Figura 86: Concentración versus diámetro para raíz (70:30) sistema SPSS 19.0 para
Windows. ................................................................................................................................... 96
Figura 87: Prueba de Wilcoxon para hojas (70:30) sistema SPSS 19.0 para Windows. ......... 97
Figura88: Concentración versus diámetro para hojas (70:30) sistema SPSS 19.0 para
Windows. ................................................................................................................................... 98
Figura 89: Prueba de Wilcoxon para tallos (70:30) sistema SPSS 19.0 para Windows. ......... 98
Figura 90: Concentración versus diámetro para tallos (70:30) sistema SPSS 19.0 para
Windows. ................................................................................................................................... 99
Figura 91: Prueba de Wilcoxon para raíz (50:50) sistema SPSS 19.0 para Windows. .......... 100
Figura 92: Concentración versus diámetro para raíz (50:50) sistema SPSS 19.0 para
Windows. ................................................................................................................................. 101
Figura 93: Prueba de Wilcoxon para hojas (50:50) sistemaSPSS 19.0 para Windows. ........ 101
Figura 94: Concentración versus diámetro para raíz (50:50) sistema SPSS 19.0 para
Windows. ................................................................................................................................. 102
Figura 95: Prueba de Wilcoxon para tallos (50:50) sistema SPSS 19.0 para Windows. ....... 103
Figura 96: Concentración versus diámetro para tallos (50:50) sistema SPSS 19.0 para
Windows. ................................................................................................................................. 103
Figura 97: Prueba de Kruskal-Wallis para extractos (70:30) sistema SPSS 19.0 para
Windows. ................................................................................................................................. 104
Figura 98: Prueba de Kruskal-Wallis para extractos (50:50) sistema SPSS 19.0 para
Windows. ................................................................................................................................. 105
Figura 99: Prueba de Mann-Whitney para extractos de raíz (50:50) y (70:30) sistema SPSS
19.0 para Windows. ................................................................................................................. 106
Figura 100: Prueba de Mann-Whitney para extractos de tallo (50:50) y (70:30) sistema SPSS
19.0 para Windows. ................................................................................................................. 107
Figura 101: Prueba de Mann-Whitney para extractos de hojas (50:50) y (70:30) sistema
SPSS 19.0 para Windows. ....................................................................................................... 108
xvii
LISTA DE TABLAS
Tabla 1: Resultados de tamizaje fitoquímico extracto etéreo de hojas ..................................... 52
Tabla 2: Resultados de tamizaje fitoquímico extracto alcohólico de hojas. ............................. 52
Tabla 3: Resultados de tamizaje fitoquímico extracto acuoso de hojas. .................................. 55
Tabla 4: Resultados de tamizaje fitoquímico ensayos complementarios en hojas. .................. 56
Tabla 5: Resultados de tamizaje fitoquímico extracto alcohólico de tallo. .............................. 57
Tabla 6: Resultados de tamizaje fitoquímico extracto acuoso de tallo. .................................... 59
Tabla 7: Resultados de tamizaje fitoquímico ensayos complementarios de tallo. ................... 60
Tabla 8: Resultados de tamizaje fitoquímico extracto alcohólico de raíz. ............................... 60
Tabla 9: Resultados de tamizaje fitoquímico extracto acuoso de raíz. ..................................... 62
Tabla 10: Resultados de tamizaje fitoquímico ensayos complementarios de raíz.................... 63
Tabla 11: Resultados de pruebas físicas de extractos fluidos. .................................................. 64
Tabla 12: Resultados de ensayos para aminoácidos con fase móvil 1. .................................... 68
Tabla 13: Resultados de ensayos para aminoácidos con fase móvil 2. .................................... 70
Tabla 14: Resultados de ensayos para esteroles. ...................................................................... 71
Tabla 15: Resultados de ensayos para flavonoides fase móvil 1. ............................................. 73
Tabla 16: Resultados de ensayos para flavonoides fase móvil 2. ............................................. 74
Tabla 17: Resultados de ensayos para flavonoides fase móvil 3. ............................................. 76
Tabla 18: Resultados de ensayos para naftoquinonas fase móvil 1. ......................................... 77
Tabla 19: Resultados de ensayos para naftoquinonas fase móvil 2. ......................................... 79
Tabla 20: Resultados de ensayos para antraquinonas. .............................................................. 80
Tabla 21: Resultados de ensayos para cardiotónicos fase móvil 1. .......................................... 81
Tabla 22: Resultados de ensayos para cardiotónicos fase móvil 2. .......................................... 83
Tabla 23: Codificación de bacterias. ........................................................................................ 84
Tabla 24: Resultados de ensayo de actividad antibacteriana en función de la presencia de halo
de inhibición en extractos fluidos. ............................................................................................. 84
Tabla 25: Codificación levadura. .............................................................................................. 86
Tabla 26: Resultados de ensayo de actividad antimicótica para Candida albicans en función
de la presencia de halo de inhibición. ........................................................................................ 86
Tabla 27: Resultados de diámetros de halos de inhibición para Candida albicans en extracto
fluido de raíces obtenido a partir de etanol: agua (70:30). ........................................................ 88
Tabla 28: Resultados de diámetros de halos de inhibición para Candida albicans en extracto
fluido de tallos obtenido a partir de etanol: agua (70:30). ......................................................... 89
Tabla 29: Resultados de diámetros de halos de inhibición para Candida albicans en extracto
fluido de hojas obtenido a partir de etanol: agua (70:30). ......................................................... 89
Tabla 30: Resultados de diámetros de halos de inhibición para Candida albicans en extracto
fluido de raíces obtenido a partir de etanol: agua (50:50). ........................................................ 90
Tabla 31: Resultados de diámetros de halos de inhibición para Candida albicans en extracto
fluido de tallos obtenido a partir de etanol: agua (50:50). ......................................................... 91
Tabla 32: Resultados de diámetros de halos de inhibición para Candida albicans en extracto
fluido de hojas obtenido a partir de etanol: agua (50:50). ......................................................... 92
Tabla 33: Resultados de diámetros de halos de inhibición para Candida albicans con
fluconazol. ................................................................................................................................. 93
Tabla 34: Pruebas de normalidad ............................................................................................. 94
Tabla 35: Resultados del extracto (70:30) ................................................................................ 95
Tabla 36: Resultados del extracto (50:50) ................................................................................ 99
xviii
“Evaluación de la Concentración Mínima Inhibitoria de los extractos hidroalcohólicos obtenidos
a partir de la hoja, tallo y raíz de Petiveria alliacea L. sobre Staphylococcus aureus,
Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa y Candida albicans”
Autor: Paulo César Tello Navarrete
Tutor: Dayana Paulina Borja Espín
RESUMEN
El presente estudio comprende la evaluación de la concentración mínima inhibitoria de los extractos
hidroalcoholicos etanol: agua (50:50) y (70:30) de las hojas, raíz y tallo de Petiveria alliacea L., se
procedió a la obtención de los mismos por el método de maceración y concentración en rotavapor.
A los extractos obtenidos se realizó un tamizaje fitoquímico para determinar en forma cualitativa los
principales metabolitos secundarios presentes en cada uno de ellos.
Mediante el perfil cromatográfico se determinó la presencia de aminoácidos en hojas, raíz y tallo
presentando manchas para todos los extractos utilizando la fase móvil Butanol: Ácido acético: Agua
(4:1:1). Las manchas que presentan mayor intensidad corresponden a los extractos de raíces frescas
etanol: agua (50:50) y raíces frescas etanol: agua (70:30).
Para la evaluación de la actividad antimicrobiana se utilizó una adaptación del método Kirby-Bauer,
los seis extractos preparados presentaron actividad antimicótica frente a Candida albicans y carecen de
actividad antibacteriana.
Los valores de concentración mínima inhibitoria encontrados son para: extracto de raíz (70:30):10,50
mg/200uL, extracto de hoja (70:30):5.25 mg/200uL, extracto de tallo (70:30): 42.0 mg/200uL,
extracto de raíz (50:50):21.0 mg/200uL, extracto de hoja (50:50):5.25 mg/200uL, extracto de tallo
(50:50):21.0 mg/200uL.
PALABRAS CLAVE: PETIVERIA ALLIACEA L, CANDIDA ALBICANS, CONCENTRACIÓN
MÍNIMA INHIBITORIA, AMINOÁCIDOS, TAMIZAJE FITOQUÍMICO.
xix
SUMMARY
The present study contains the evaluation of the minimum inhibitory concentration of the aqueousalcoholic extracts ethanol: water (50:50) and (70:30) from the leaves, roots and stems of Petiveria
alliacea L, its obtainment was performed by the method of maceration and concentration in a
rotavapor.
To the obtained extracts, a phytochemical screening was conducted in order to determine qualitatively
the main secondary metabolites present in each one of them.
By the chromatographic fingerprint it was determined the presence of amino acids in the leaves, roots
and stems, presenting spots for all the extracts, using the mobile phase Butanol: Acetic Acid: Water
(4:1:1). The spots which present higher intensity correspond to the extract of fresh roots Ethanol:
Water (50:50) and fresh roots Ethanol: Water (70:30).
For the assessment of the antimicrobial activity, an adaptation of the Kirby-Bauer method was applied,
the six extracts presented antifungal activity in comparison with Candida albicans, and they lack of
antibacterial activity.
The discovered values of minimum inhibitory concentration are for: root extract (70:30):10,50
mg/200uL, leaf extract (70:30):5.25 mg/200uL, seem extract (70:30): 42.0 mg/200uL, root extract
(50:50):21.0 mg/200uL, leaf extract (50:50):5.25 mg/200uL, seem extract (50:50):21.0 mg/200uL.
KEYWORDS: PETIVERIA ALLIACEA L, CANDIDA ALBICANS, MINIMUM INHIBITORY
CONCENTRATION, AMINO ACIDS, PHYTOCHEMICAL SCREENING.
xx
CAPITULO I
1.1.
DESCRIPCIÓN DEL TEMA DE INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA
1.1.1.
INTRODUCCIÓN
La resistencia a los antimicrobianos es la resistencia de un microorganismo a un medicamento
antimicrobiano al que originalmente era vulnerable. Los organismos resistentes (bacterias, hongos,
virus y algunos parásitos) pueden resistir ataques de medicamentos antimicrobianos tales como
antibióticos, fungicidas, antivirales y antipalúdicos, de tal forma que los tratamientos
convencionales se vuelven ineficaces y las infecciones persisten, lo que incrementa el riesgo de
propagación. La evolución de las cepas resistentes es un fenómeno natural que ocurre cuando los
microorganismos se ven expuestos a fármacos antimicrobianos, y es posible un intercambio de
características de resistencia entre ciertos tipos de bacterias. El uso inapropiado de medicamentos
antimicrobianos acelera ese fenómeno natural. Las prácticas inapropiadas para el control de las
infecciones propician la propagación de la resistencia a los antimicrobianos (World Health
Organization. OMS, 2013).
Los conocimientos y las tecnologías disponibles hoy para descubrir y desarrollar nuevos fármacos
son muy superiores a los que tenían los científicos hace no muchos años. Sin embargo, los
investigadores y los fabricantes de productos farmacéuticos han recortado significativamente los
fondos para la investigación y la realización de estudios clínicos sobre nuevos antimicrobianos. En
consecuencia, el número de nuevos antimicrobianos en fase de desarrollo ha disminuido
notablemente en el último decenio, poniendo en cuestión la disponibilidad de opciones terapéuticas
eficaces en el futuro (Organización Mundial de la Salud, NE)
En este sentido, la Organización Mundial de la Salud (OMS), constantemente incentiva a la
comunidad científica para que continúe la búsqueda de nuevas estrategias, ya sea de origen sintético
o natural, que permitan ampliar el arsenal farmacológico disponible.
Numerosas investigaciones realizadas en distintas regiones del planeta, demuestran que las plantas
medicinales constituyen un importante punto de partida en el descubrimiento de nuevos fármacos,
tanto así, que aproximadamente el 25% de los medicamentos prescritos mundialmente son de origen
vegetal, y de los restantes, un significativo número son obtenidos por síntesis a partir de precursores
naturales (Gurib-Fakim, 2006, Feb)
En años recientes, ha ido creciendo el interés en terapias alternativas y en la terapéutica con
productos naturales, especialmente aquellos derivados de plantas. Este interés en drogas de origen
vegetal es debido a varias razones, entre ellas la medicina convencional puede ser ineficiente (por
ejemplo: efectos adversos o terapia no efectiva), el abuso y/o incorrecto uso de drogas sintéticas
1
resulta en efectos secundarios y otros problemas, un amplio porcentaje de la población mundial no
tiene acceso a un tratamiento farmacológico convencional y la medicina tradicional y la conciencia
ecológica sugieren que los productos naturales son inocuos. Sin embargo, el uso de estas sustancias
no es siempre autorizado por las autoridades regulatorias en relación con procedimientos seguros y
eficaces, muchas publicaciones apuntan a la falta de calidad en la producción, mercado y
prescripción de productos fitomedicinales(Rates, 2001)
La búsqueda de nuevas moléculas, hoy en día, ha tomado una ruta ligeramente diferente, donde la
ciencia de la etnobotánica y etnofarmacognosia están siendo utilizados como guía para dirigir al
químico hacia diferentes fuentes y clases de compuestos. Es en este contexto que la flora del
trópico, en virtud de su diversidad tiene un papel importante que desempeñar al ser capaz de
proporcionar nuevas pistas. No obstante, la cuestión de la soberanía y los derechos de propiedad
también debe abordarse en consonancia con la Convención de la Diversidad Biológica
(CDB)(Gurib-Fakim A. , February 2006)
La selección de especies vegetales para la investigación puede ser realizada al azar, utilizando
criterios quimiotaxonómicos o criterios etnofarmacológicos. Es así como la industria farmacéutica
ha desarrollado líneas de investigación en el campo de la etnofarmacología, de cara a la utilización
de sustancias de uso tradicional, donde las perspectivas de obtención de nuevos productos activos
naturales encuentren nuevos horizontes de futuro. El establecimiento de nuevas técnicas para
determinar metabolitos secundarios de forma precisa y cuantificar los mismos, permiten tener una
idea más clara del tipo de actividad que estos extractos podrían tener. Sin embargo estas técnicas no
están disponibles para todos los extractos de plantas, considerando que pueden tener una muy
variada composición y que es difícil establecer el marcador específico para un determinado
extracto.
En virtud de esto se han adaptado algunas técnicas que pueden funcionar como control de calidad
(perfil cromatográfico y análisis capilar) de extractos y permiten además establecer la presencia de
grupos de metabolitos secundarios y primarios que se menciona debe tener una determinada
especie.
El descubrimiento de nuevas sustancias bioactivas a partir de estudios etnofarmacológicos
(screening dirigido) supone un planteamiento que proporciona grandes éxitos a las compañías
farmacéuticas. Este enfoque implica un programa de recolección de plantas medicinales con
especial énfasis en aquellas especies utilizadas por la población indígena en zonas tropicales del
mundo, lo que supone una vía rápida en el largo y costoso proceso de screening casual, utilizado
por la industria convencional. Lógicamente la selección de las plantas a estudiar está dirigida hacia
la utilización etnomédica con un objetivo claro, la curación o mejora de una determinada
enfermedad. El hecho de que las plantas seleccionadas con este fin hayan sido utilizadas por el
hombre, aumenta la probabilidad de que las sustancias obtenidas sean eficaces en modelos de
experimentación animal, que reproduzcan la patología humana para cual fue seleccionada la planta.
En definitiva, la idea de establecer un proceso rápido y eficaz para el descubrimiento de nuevas
2
sustancias biológicamente activas, pasa por la integración de la etnobotánica, la medicina moderna,
y la química de productos naturales. (Durango, 2009)
En principio cabría suponer que el campo de la investigación de productos naturales debía de estar
agotado a estas alturas, pero nada más lejos de la realidad. Algunos autores afirman que solo se ha
estudiado, desde el punto de vista fitoquímico, algo más del 10% de la flora terrestre y lo realizado
con la flora marítima es, lógicamente, bastante menor, por lo que podríamos decir con relación al
futuro de las plantas medicinales, el 90% restante queda presto al descubrimiento y a la
investigación fitoquímica. Ahora bien, esto con relación alos análisis químicos, pero que hay con
respecto a los análisis de actividad biológica?.Son relativamente pocas hasta el momento las
especies tropicales que han sido estudiadas desde el punto de vista de su potencial de acción
farmacológica, se estima que menos del 1%.(Durango, 2009)
1.2.
FORMULACIÓN DEL PROBLEMA
1.2.1.
CONTEXTUALIZACIÓN.
¿Es posible determinar la concentración mínima inhibitoria en los distintos órganos vegetativos de
Petiveria alliacea L?
¿Tiene el solvente utilizado incidencia en la extracción de activos que indiquen una mejor
concentración mínima inhibitoria de los distintos órganos vegetativos de Petiveria alliacea L?
Las investigaciones previas realizadas sobre Petiveria alliacea L. y que se toman como punto de
partida para la presente investigación mencionan el hecho de que la raíz contiene una concentración
muy alta de activos en relación a hojas y tallos, sin embargo no se ha investigado su acción, debido
especialmente a la premisa de que en plantas nativas se debe preservar la especie, evitando la
recolección de la planta completa (evitar las raíces).
1.2.2.
ANÁLISIS CRÍTICO
De los resultados obtenidos en investigaciones previas es posible apreciar que las hojas son el
órgano vegetativo de la planta más empleado en la elaboración de los extractos, independientemente
de que los escasos estudios realizados con tallos y raíces evidencian resultados más alentadores.
Kubec y Musah (2001) aislaron dos diasteroisómeros del sulfóxido de S-bencil-cisteína (petiverina
A y petiverina B) y plantearon que el contenido total de petiverinas en las hojas, tallos y raíces de
esta planta es muy variable, siendo de 0,07; 0,29 y 2,97 mg/g de peso fresco, respectivamente. En
2002 continuaron con los estudios de Petiveria alliacea L .aislando otros 3 derivados de (R)-S-(2hydroxyethyl) cysteine. El elevado contenido de petiverinas en las raíces (42 veces superior que el
reportado en las hojas y 10 veces superior al reportado en los tallos) de esta especie, sugiere la
utilización de las mismas como el principal órgano de elección durante la elaboración de los
extractos.(Roman Kubec, 2001)
3
Kim et al. (2006) plantearon que las discrepancias y la ausencia de actividad antimicrobiana de esta
planta en los estudios precedentes podían ser el resultado de diferentes procedimientos empleados
durante la preparación de las muestras. Concluyeron además, que la inactivación de enzimas por el
secado del material vegetal y/o la aplicación de calor durante la preparación de los extractos podría
interferir en la formación efectiva del sulfino, los tiosulfinatos, y por consiguiente de otros
compuestos activos antimicrobianos como los trisulfuros.
El índice de polaridad de los solventes es un factor importante a tener en cuenta durante la
elaboración de los extractos. De manera general, los extractos elaborados con etanol al 70 y al 80%
han logrado una elevada efectividad frente a las especies de bacterias y de hongos evaluadas en
estudios de actividad antimicrobiana de esta planta, lo que sugiere que con la utilización de este
solvente a estas concentraciones se incrementa su poder difusivo en las células facilitándose una
mayor extracción de metabolitos bioactivos.
De lo anterior se desprenden las siguientes interrogantes.
¿El órgano vegetativo a utilizar tiene influencia sobre la Concentración mínima inhibitoria?
¿La utilización de diferentes mezclas hidroalcoholicas tiene influencia sobre la Concentración
mínima inhibitoria?
1.2.3.
PROGNOSIS
Si no se toman las respectivas consideraciones relacionadas al proceso de selección del órgano
vegetativo a utilizar, temperatura de secado, temperatura de concentración de extractos, utilización
de mezclas hidroalcoholicas adecuadas, se van a seguir presentando discrepancias en los resultados
publicados entre autores sobre la actividad antimicrobiana de Petiveria aliácea L.
Las plantas medicinales constituyen un importante punto de partida en el descubrimiento de nuevos
fármacos, por lo que si no se determinan las condiciones necesarias para que se demuestre las
propiedades antimicrobianas de Petiveria aliácea L. se desperdiciaría este recurso natural lo cual a
futuro no permitiría ampliar el arsenal farmacológico disponible en función de la resistencia a
antimicrobianos existente.
1.2.4.
FORMULACIÓN
Del análisis anterior se desprende la pregunta fundamental a ser respondida en el presente trabajo:
¿Cuál es el órgano vegetativo de Petiveria aliácea L. al utilizar material fresco y mezclas
hidroalcohólicas apropiadas (etanol-agua 70:30) o (etanol-agua 50:50), que permitirá obtener
extractos con la mejor CMI sobre cepas de Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis,
Pseudomonas aeruginosa y Candida albicans?
4
Se establecen como variables, las siguientes:


Antecedente: Órgano vegetativo.
Consecuente: CMI sobre cepas de Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis,
Pseudomonas aeruginosa y Candida albicans.
¿El órgano vegetativo a utilizar tiene influencia sobre la CMI?
¿La utilización de diferentes mezclas hidroalcoholicas tiene influencia sobre la CMI?
1.2.5.
DELIMITACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN.
Esta investigación se limita al:
Campo: Industria Farmacéutica
Área: Farmacognosia
Aspecto: Productos Naturales
1.2.6.
DELIMITACIÓN DE CONTENIDO
1.2.6.1.
Delimitación Espacial
El presente trabajo se realizara en la Universidad Central del Ecuador, Facultad de Ciencias
Químicas.
1.2.6.2.
Delimitación Temporal
Los antecedentes y estudios previos para la investigación del presente problema se ubican entre los
años 1972 y 2013.
1.3.
HIPÓTESIS
El órgano vegetativo empleado, utilizando material fresco, mezclas hidroalcoholicas (etanol-agua
70:30) y (etanol-agua 50:50) permite obtener extractos con Concentración Mínima Inhibitoria
(CMI) sobre cepas de Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas
aeruginosa y Candida albicans.
Variable Independiente (VI):
 Órgano vegetativo utilizando material fresco,
 Mezclas hidroalcoholicas(etanol-agua 70:30) y (etanol-agua 50:50)
Variable Dependiente (VD): CMI sobre cepas de Staphylococcus aureus, Staphylococcus
epidermidis, Pseudomonas aeruginosa y Candida albicans.
5
1.4.
OBJETIVOS
1.4.1.
OBJETIVO GENERAL
Evaluar los órganos vegetativos (hojas, raíz y tallo) de Petiveria alliacea L. para determinar la
Concentración Mínima Inhibitoria que actúa sobre cepas de
Staphylococcus aureus,
Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa y Candida albicans a partir de extractos
obtenidos de dos diferentes mezclas hidroalcohólicas, y de esta manera presentar otra posible
alternativa para combatir dichos microorganismos.
1.4.2.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1.4.2.1. Determinar la presencia de metabolitos específicos en Petiveria alliacea L.
mediante la realización del tamizaje fitoquímico de los extractos de raíz, hojas y
tallo.
1.4.2.2. Determinar el perfil cromatográfico del extracto total de hojas, raíz y tallo de
Petiveria alliacea L. en función a sus constituyentes principales (CCF)
1.4.2.3. Determinar la influencia del órgano vegetativo (hojas, raíz y tallo) en los resultados
de CMI sobre cepas de Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis,
Pseudomonas aeruginosa y Candida albicans.
1.4.2.4. Determinar la influencia de las mezclas hidroalcoholicas (etanol-agua 70:30) y
(etanol-agua 50:50) en los resultados de CMI sobre cepas de Staphylococcus
aureus, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa y Candida albicans.
1.4.2.5. Establecer la combinación de órgano vegetativo y mezclas hidroalcoholicas que
permita determinar la CMI sobre cepas de Staphylococcus aureus, Staphylococcus
epidermidis, Pseudomonas aeruginosa y Candida albicans.
6
CAPITULO II
MARCO TEÓRICO
2.1.
ANTECEDENTES
Las enfermedades infecciosas constituyen una de las principales causas de morbilidad y mortalidad
a nivel mundial. El uso indiscriminado de antibióticos sintéticos y comerciales ha empeorado el
panorama, pues muchos de los microorganismos causantes de enfermedades comunes, que podían
ser tratados fácilmente, han adquirido gran resistencia. Cuantiosas son las investigaciones enfocadas
en la búsqueda de nuevos compuestos bioactivos a partir de fuentes naturales, dentro de estas, un
gran número han sido dirigidas hacia la evaluación de actividades antimicrobianas en extractos y
aceites esenciales de plantas medicinales y aromáticas. Las plantas ofrecen grandes posibilidades en
el descubrimiento de nuevos fármacos, ya que de ellas se han aislado alrededor de 12 000
metabolitos secundarios, de los cuales un por ciento significativo presentan actividad
antimicrobiana. Petiveria alliacea L., es una planta perenne de la familia Phytolaccaceae,
usualmente conocida como anamú en los países de habla hispana y originaria del sur de Estados
Unidos, de Norteamérica y México. Esta especie tiene una distribución geográfica muy amplia,
desde la Florida, en toda América Central, desde Colombia hasta la Argentina y en África.
(Sariego; Marin; Ochoa; Viera, 2013).
La actividad antimicrobiana de esta especie es una de las propiedades etnobotánicas más difundidas
por países y regiones, razón por la cual ha sido utilizada con fines medicinales y ha sido cultivada
como “planta de la suerte” a la cual se le atribuyen propiedades mágicas en la preservación de la
salud humana, alejando los males y las hechicerías. De manera general, en algunos países entre los
que se encuentran Argentina, Cuba, Brasil, Guatemala, Haití, México, Puerto Rico y Venezuela se
le atribuyen a esta planta propiedades etnobotánicas para el tratamiento de infecciones cutáneas,
urinarias, venéreas y del tracto respiratorio. Se le han otorgado además, propiedades depurativas,
antifúngicas y antisépticas. Lo anterior, ha sugerido la realización de estudios in vitro por
investigadores de estos países para comprobar científicamente su posible efecto antimicrobiano. No
obstante, las investigaciones desarrolladas han evidenciado discrepancias en los resultados
publicados entre autores. Podría pensarse en la alternativa de reevaluar la actividad antimicrobiana
de esta planta frente a los microorganismos seleccionados en estudios anteriores, modificando las
condiciones experimentales durante la preparación de los extractos. (Sariego; Marin; Ochoa;
Viera, 2013).
Los autores mencionados evaluaron un total de 18 artículos en los cuales se publican resultados
obtenidos acerca de la evaluación de la actividad antimicrobiana de Petiveria alliacea L.
provenientes de 6 países distintos y en los cuales se menciona diversas formas de preparación de los
extractos, diferentes órganos vegetativos utilizados, diversas concentraciones evaluadas, así como
varios microorganismos utilizados para la investigación, de este artículo se deduce que varios
7
fueron los factores que pudieron influenciar en los resultados diversos en cuanto a la actividad
antimicrobiana de Petiveria alliacea L.
El principal objetivo de esta investigación es establecer si dos diferentes extractos de tres órganos
vegetativos de la planta (hojas, raíz o tallo) presentan diferente actividad sobre microorganismos
específicos que suelen actuar en infecciones de tipo dermatológico. Los artículos publicados indican
que las concentraciones de los extractos empleadas en estos estudios han sido muy variables. En
este sentido, es válido aclarar que en la actualidad no existe una organización o institución que
legisle o estandarice las concentraciones de extractos vegetales a emplear, por tanto, la selección de
las concentraciones a evaluar es arbitraria aunque deben tenerse en cuenta los niveles de toxicidad
de los extractos frente a los modelos biológicos a los que esté dirigida su aplicación. Bajo esta
premisa es factible hacer una relación entre el antibiótico de elección sobre las bacterias utilizadas y
la concentración de extracto.
Para la evaluación de la Concentración Mínima Inhibitoria se considera la concentración de extracto
crudo (extracto total) puesto que la acción de los fitofármacos suele considerarse con todos sus
constituyentes, el aislamiento de los componentes tiene más bien fines investigativos para verificar
un marcador, pues es muy posible que la acción atribuida tradicionalmente se deba al sinergismo de
todos los constituyentes presente en el extracto.
2.2.
FUNDAMENTACIÓN LEGAL
En base al registro oficial Nº 308 vigente desde el 11 de agosto del 2014 indica:
Que; la Ley Ibídem en el artículo 164, dispone que los productos naturales procesados de uso
medicinal, se producirán, almacenarán, comercializarán e importarán siempre que cuenten con
registro sanitario nacional, de conformidad con la ley y el reglamento correspondiente y bajo las
normas de calidad emitidas por la Autoridad Sanitaria Nacional (Órgano del Gobierno del
Ecuador, 2014)
Que; con Acuerdo Ministerial No. 244 publicado en el Registro Oficial No. 385 de 26 de octubre de
2006, se expidió el “Reglamento para el Registro y Control de Productos Naturales de Uso
Medicinal y de Establecimientos en donde se Fabrican, Almacenan y Comercializan”(Órgano del
Gobierno del Ecuador, 2014)
CAPITULO I: Objetivo y ámbito de aplicación
Art. 2.- Ámbito.- Las disposiciones de este Reglamento se aplicarán a todos los productos naturales
procesados de uso medicinal, que se importan, fabrican, envasan o empacan, transportan,
almacenan, distribuyen y comercializan, en todo el territorio nacional y a los establecimientos que
se dedican a dichas actividades.(Órgano del Gobierno del Ecuador, 2014)
8
Factores ontogenésicos: La época en que se recolecta cada droga tiene generalmente, considerable
importancia, puesto que la cantidad y a veces, la naturaleza de los principios activos, no son
constantes a la largo del año. Ahora bien, la edad de la planta, tiene así mismo, una importancia
considerable e influye no solo en la cantidad total de principios activos producidos, sino también en
las proporciones relativas de los componentes de la mezcla activa, estas variaciones pueden existir
en cualquier planta. Igualmente existe evidencia que la composición de un número de metabolitos
secundarios varia apreciablemente a través del día y la noche.(Osorio E. J., 2014)
Otro de los aspectos que se consideran desde el punto de vista ontogenésico es que los principios
activos se localizan preferentemente en determinadas partes u órganos del vegetal, en lugar de
distribuirse uniformemente por la planta.(Sharapin, MATERIA PRIMAS PARA LA INDUSTRIA
DE PRODUCTOS FITOFARMACÉUTICOS, 2000).
2.3.
CARACTERÍZACIÓN BOTÁNICA DE “Petiveria alliacea L.”
Familia: Fitolacáceas.
Nombre científico: Petiveria alliacea L. syn: P. alliacea B grandiflora (L.) Moq. = P.
paraguayensis Parodi = P. hexandria Sesse et Moq. (herbotecnia, 2004)
Origen del nombre científico: Petiveria por estar dedicado al farmacéutico y botánico inglés,
James Petiver (1665-1718) y, alliacea, por el aroma aliáceo; a ajo, (Alliumsativus L.) de la planta.
(herbotecnia, 2004)
Otros nombres populares: Pipí, calauchín, mikura (aymará y quechua), sunikila (quechua) en
Argentina; guiñé, erva pipí, raíz de guiñé, guiñé, sacha ajo en Brasil; chanvico en Perú; mapurite en
Venezuela; ajillo y zorrillo en Costa Rica; ipasina en Honduras y Nicaragua; apacín en Guatemala;
hierba de las gallinitas y zorrillo en México; epasina, hierva de toro en El Salvador; have en Haití;
ananuí en Puerto Rico; koujuorouk en República Dominicana; anamú en Panamá y el Caribe; namú
en Cuba; guinea henweed en Jamaica. Francés: verveinepuante; inglés: Garlicsentedpetiveria;
zorrilla en Ecuador.(herbotecnia, 2004)
9
Figura 1: Planta Petiveria alliacea L.
Figura2: Hojas de Petiveria alliacea L.
Figura 3: Raíz de Petiveria alliacea L.
2.3.1
DESCRIPCIÓN
Subfrútice erecto de 0,40 a 0,70 m. de altura, con olor a ajo. Raíz profunda, fusiforme, leñosa, de
hasta 2,5 cm de diámetro, irregularmente ramificada, cubierta por una corteza amarillenta, lisa,
carnosa, de aroma aliáceao, fuerte, desagradable y sabor un amargo, un tanto acre. Tallos
10
ramificados, con las ramas viejas rollizas, leñosas, angulosas y los nuevos herbáceos, angulosos, a
veces estriados longitudinalmente. Hojas alternas, pecioladas, elíptico lanceoladas, subglabras,
acuminadas en el ápice. Flores, dispuestas en espigas axilares o terminales de 15-40 cm de largo,
gráciles, pequeñas, hermafroditas, pétalos 4 a veces de color blanco, blanco-verdoso o rosado claro.
Fruto alargado, conservando el perianto en la base. (herbotecnia, 2004)
2.3.2
DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA
Originaria del sur de Estados Unidos de Norteamérica y México; crece, desde la Florida, en toda
América Central y desde Colombia hasta la Argentina. Crece generalmente en lugares húmedos,
algo sombríos y zonas ribereñas. (herbotecnia, 2004)
2.3.3
PARTE UTILIZADA
Principalmente la raíz y, también las hojas frescas. (herbotecnia, 2004)
2.3.4
COMPONENTES QUÍMICOS AISLADOS
Domínguez en Materia Médica Argentina, 1928, menciona que toda la planta contiene un aceite
esencial amarillento de olor fuerte, desagradable, constituido en gran proporción por sulfuro de alilo
(Peckolt, in Apoth. Zeit., 1895, 842; Historia das Plantas Medicinais e Uteis do Brazil, fasc. VII, p.
1133), y petiverina (Matta, Flora Médica brasiliense, Manaos, 1913, 186), cuerpo amorfo
pulverulento, inodoro, de sabor amargo y picante, soluble en éter y alcohol y en soluciones ácidas y
poco soluble en agua a 100° C, y cuyas soluciones precipitan por la solución de tanino y los
cloruros de oro y platino. Menciona además que en los tallos foliáceos-floríferos encontraron
además saponinas y una oxidasa (Invest. Fito-Quím. - Trabajo del Inst. Bot. Farmacol. 1919, N° 40,
16:17.) (herbotecnia, 2004)
Ragonese y Milano en Vegetales y substancias tóxicas de la flora argentina, 1984, citando a
Mendiondo, Rondina y Coussio, 1973, mencionan que contiene alcaloides en la raíz y además, un
aceite esencial de olor nauseabundo, aliáceo y persistente (Domínguez, 1903). (herbotecnia, 2004)
Soraru y Bandoni en "Plantas de la Medicina Popular Argentina", citando a Peckolt, T. y G.
Peckolt (Historia das Plantas Medicinais e Uteis do Brazil, vol 7, p. 1132, 1899) mencionan que la
planta contiene sulfuro de alilo; citando a Matta, F. (Flora Médica brasiliense, p. 186, 1913)
mencionan que contiene petiverina y a Adesogan, E. K. (Chem. Comm., 1974) que
contiene trithiolaniacina, aunque estos dos últimos no indican en que parte de la planta las hallaron;
citando a Sczepanski, V, Ch. P. Zgorzelak y G.A. Hoyer (Arzneim. Forsch, 22:1975) mencionan
que de tallo y raíz aislaron trisulfuro de 2-hidroxietilbencilo.
Diversos autores citan que de la raíz se han aislado esteroides, triterpenoides, saponosidos,
polifenoles, taninos, acetato de isoarbinol, cinamato de isoarbinol, cumarinas; de las raíces y tallos,
11
compuestos de azufre como tritiolaniazina y trisulforo de 2-hidroxietilbencilo, además sulfuro de
alilo, benzaldehído, ácido benzoico y petiverina. (herbotecnia, 2004)
2.3.5
USOS Y PROPIEDADES
Dominguez, J. A.: (1928:89-224 y 338) Cita en p. 89, a P. alliacea L. n.v.: pipí, calauchín, en
Tucumán, Salta, Jujuy, Chaco, Misiones, etc. y a P. alliacea var tetranda (Gómez) Hauman en
Misiones, Corrientes.
Se cita "pipí" (Petiveria sp.) entre las plantas con virtudes curativas o preservativas del "daño" o
gualicho y de las artes de la hechicería, compartiendo el título de payé (talismán) junto con otras
especies, capaz al que lo lleva consigo, no solamente de preservarlo del daño y aún curarlo, sino
más aún, el de conferirle el poder de dominar voluntades, por lo que en las tierras cálidas
Misioneras se dice que "la mujer que sahuma su habitación con contrayerba, pipí y cipó
milhombres, no esperará en vano al que desea". Menciona además que las hojas y sobre todo las
raíces tienen propiedades antiespasmódicas, diaforéticas, diuréticas y emenagogas. Que la raíz,
administrada en dosis elevadas y continuas, puede ocasionar accidentes peligrosos y aun la muerte
en lapsos de tiempo más o menos largos. (herbotecnia, 2004)
Martínez Crovetto, R.: (1981:45) escribe que en el Noroeste de la provincia de Corrientes, la
decocción es utilizada en baños en casos de "pasmos de vientre" y lavajes para "curar granos".
Agrega que su decocción se usa también en mezclas con hojas de naranjo agrio (Citrus aurantium)
en baños y fricciones.
Cita que la hierba es cultivada en las casas por las propiedades mágicas que la gente le atribuye de
preservar a la gente de la casa contra hechicerías o "payé". (herbotecnia, 2004).
2.4.
MARCHA FITOQUÍMICA, PERFIL CROMATOGRÁFICO
2.4.1.
MARCHA FITOQUÍMICA
La marcha Fitoquímica o tamizaje fitoquímico es un proceso en el cual se aplica técnicas de
extracción sobre el material vegetal seco o fresco para separar los posibles constituyentes de la
planta en función a la polaridad del solvente utilizado y la afinidad de los metabolitos presentes con
el solvente aplicado. En cada uno de las fracciones aisladas se aplican reacciones de coloración y/o
precipitación que permiten verificar o desechar la presencia de determinados metabolitos. (Miranda,
2000)
2.4.1.1
Triterpenos y esteroides
La reacción de identificación para estos metabolitos secundarios se realiza mediante el ensayo de
Liebermann-Buchard ya que se fundamenta en el reconocimiento del núcleo androstano,
generalmente insaturado en el anillo B y la posición 5-6.
12
Los triterpenos están formados por seis moléculas de isopreno.
Los limonoides también son triterpenos, las sustancias amargas de los cítricos que actúan como
antiherbívoros. Un limonoide de los más poderosos repelentes de insectos es la azadiractina que se
usa en la industria alimentaria y en agronomía para el control de plagas. Entre los triterpenos se
encuentran también algunos esteroides en forma de glicósidos. Estos glicósidos esteroideos, con
importantes funciones en medicina y en la industria (cardenolípidos y saponinas), se consideran más
adelante en el apartado de glicósidos. (Ávalos García, Pérez, & Carril, 2009)
Es de destacar que los compuestos químicos pertenecientes a la familia de los triterpenos o
esteroles, y alcaloides, son los más abundantes en los extractos de la planta estudiada (ederla
adorata L.), por lo que es posible que estas familias de compuestos químicos sean las principales
responsables de la actividad antiestafilocócica. (Cabrera, Torres, Saavedra, Torres, Tamayo, &
García, 2013)
2.4.1.2
Flavonoides y antocianidinas
La reacción de identificación para estos metabolitos secundarios se realiza mediante el ensayo de
shinoda y el ensayo de catequinas ya que se fundamenta en el reconocimiento de los anillos de la
molécula y la generación de un color fluorescente, respectivamente.
La reacción de identificación para estos metabolitos secundarios (taninos) se realiza mediante el
ensayo de antocianidinas ya que se fundamenta en el reconocimiento la presencia de estructuras de
secuencia C6:C3:C6 de los anillos de la molécula y su conjugación.
Se han identificado más de 5.000 flavonoides, entre los que se pueden destacar:
1. Citroflavonoides: quercitina, hesperidina, rutina, naranjina y limoneno. La quercitina es un
flavonoide amarillo-verdoso presente en cebollas, manzanas, brócoles, cerezas, uvas o repollo rojo.
La hesperidina se encuentra en los hollejos de las naranjas y limones. La naranjina da el sabor
amargo a frutas como la naranja, limón y toronja, y el limoneno se ha aislado del limón y la lima.
2. Flavonoides de la soja o isoflavonoides: están presentes en los alimentos con soja tales como
porotos, tofu, tempeh, leche, proteína vegetal texturizada, harina, miso. Los dos más conocidos son
la genisteína y la daidzeina.
3. Proantocianidinas se localizan en las semillas de uva, vino tinto y extracto de corteza del pino
marino.
4. Antocianidinas: son pigmentos vegetales responsables de los colores rojo y rojo-azulado de las
cerezas.
5. Ácido elágico: es un flavonoide que se encuentra en frutas como la uva y en verduras.
6. Catequina: el té verde y negro son buenas fuentes.
7. Kaemferol: aparece en puerros, brócoles, rábano, endibias y remolacha roja.
13
Acción antioxidante de los flavonoides La capacidad de los polifenoles vegetales para actuar como
antioxidantes en los sistemas biológicos fue ya reconocida en los años treinta; sin embargo, el
mecanismo antioxidante fue ignorado en gran medida hasta hace poco tiempo. El creciente interés
en los flavonoides se debe a la apreciación de su amplia actividad farmacológica. Pueden unirse a
los polímeros biológicos, tales como enzimas, transportadores de hormonas, y ADN; quelar iones
metálicos transitorios, tales como Fe2+, Cu2+, Zn2+, catalizar el transporte de electrones, y depurar
radicales libres. Debido a este hecho se han descrito efectos protectores en patologías tales como
diabetes mellitus, cáncer, cardiopatías, infecciones víricas, úlcera estomacal y duodenal, e
inflamaciones. Otras actividades que merecen ser destacadas sus acciones antivirales y
antialérgicas, así como sus propiedades antitrombóticas y antiinflamatorias. (Martínez-Flórez,
González-Gallego, Culebras, & Tuñón, 2002)
2.4.1.3
Lactonas y cumarinas
La reacción de identificación para estos metabolitos secundarios se realiza mediante el ensayo de
Baljet se fundamenta en el reconocimiento de los compuestos con agrupamiento lactónico, en
particular Cumarinas.
Debido a la gran variedad estructural de estas moléculas son muchas las propiedades
farmacológicas asociadas a dicho anillo, entre otras: antimicrobianas, antiinflamatorias,
antiespasmódicas, antivirales, antihelmínticas, antioxidantes o inhibidoras enzimáticas. Existen
además derivados tricíclicos o tetracíclicos de cumarinas que se comportan como intercalantes del
ADN y, por tanto, tienen interés como antitumorales o bien como agentes fotoquimioterápicos en el
tratamiento de la psoriasis (8-MOP) 18,19 (Serra, 2009)
2.4.1.4
Saponinas
La reacción de identificación para estos metabolitos secundarios se realiza mediante el ensayo de la
espuma se fundamenta en el reconocimiento de las saponinas tanto del tipo esteroidal como
triterpénicas.
Saponinas o Saponósidos, del latín sapo = jabón, son sustancias que tienen poder espumante en
soluciones acuosas, y son tensoactivos naturales. Muchas poseen propiedades hemolíticas
(desintegración de los eritrocitos), resultando muy tóxicas inyectadas en sangre. La toxicidad se
reduce administrándolas vía oral. Son tóxicas para los animales de sangre fría. (López Serrano,
2012)
Las saponinas esteroides son glicósidos esteroides con un núcleo espirostano que tienen la
propiedad de hemolizar los glóbulos rojos y forman espuma abundante y estable al agitar sus
soluciones acuosas. (Martínez Martínez, 2001)
2.4.1.5
Taninos
La reacción de identificación para estos metabolitos secundarios (taninos) se realiza mediante el
ensayo de cloruro férrico ya que se fundamenta en el reconocimiento de los anillos de la molécula y
su conjugación.
14
Las acciones farmacológicas de los taninos están relacionadas con sus propiedades. Sus principales
acciones y usos son:
Antídotos en intoxicación por metales pesados y alcaloides: debido a su capacidad para formar
estructuras complejas con estas sustancias.
Astringentes: debido a su capacidad para precipitar proteínas de la piel, proteínas salivares, etc. Por
sus propiedades astringentes se usan por vía externa como cicatrizantes y por vía interna como
antidiarreicos. El efecto antidiarreico lo ejercen en el intestino, y para evitar los ardores del
estómago que producirían, se administran combinándolos con albúmina o gelatina. De esta forma el
tanino no se libera hasta llegar al intestino, donde hay medio básico.
Antisépticos: tienen una acción bactericida y bacteriostática. También ejercen un efecto antifúngico.
Protectores: los taninos aplicados en pomada de uso externo impermeabilizan la piel y la protegen
de los agentes externos. Si hay una cicatriz favorecen la regeneración y tienen poder analgésico.
Aplicados sobre heridas sangrantes pueden tener una acción antihemorrágica. Los taninos
condensados son protectores de la pared venosa y hemostáticos y se utilizan en supositorios
antihemorroidales.
Antioxidantes: son capaces de captar radicales libres e inhibir la peroxidación lipídica. Inhiben la
autooxidación del ácido ascórbico (vitamina C).
Efecto hipocolesterolémico: disminuyen los niveles de colesterol en sangre y aumentan su
metabolismo.
Son factores antinutrientes: ciertos taninos disminuyen la eficacia de los alimentos porque inhiben
las enzimas endógenas o porque se absorben y ejercen un efecto sistémico de precipitación de las
proteínas de la dieta. (Osorio E. , 2014)
2.4.1.6
Aminoácidos
Son las unidades básicas que forman las proteínas. Su denominación responde a la composición
química general que presentan, en la que un grupo amino (-NH2) y otro carboxilo o ácido (-COOH)
se unen a un carbono α (-C-). Las otras dos valencias de ese carbono quedan saturadas con un
átomo de hidrógeno (-H) y con un grupo químico variable al que se denomina radical (-R).
Los aminoácidos son compuestos sólidos; incoloros; cristalizables; de elevado punto de fusión
(habitualmente por encima de los 200 ºC); solubles en agua; con actividad óptica y con un
comportamiento anfótero.
Debido a su comportamiento anfótero, la solubilidad de los aminoácidos en solución acuosa varía
ya que son capaces de ionizarse, dependiendo del pH, como un ácido (cuando el pH es básico),
como una base (cuando el pH es ácido) o como un ácido y una base a la vez (cuando el pH es
neutro). En este último caso adoptan un estado dipolar iónico conocido como zwitterión.
El pH en el cual un aminoácido tiende a adoptar una forma dipolar neutra (igual número de cargas
positivas que negativas) se denomina Punto Isoeléctrico. La solubilidad en agua de un aminoácido
es mínima en su punto isoeléctrico. (Licata M. , 2013)
Los aminoácidos son de una vital importancia en el metabolismo de los seres vivos, desde su
condición de ser las unidades estructurales de las proteínas. Intervienen en la regulación endógena
del crecimiento y desarrollo vegetal.
15
Los aminoácidos son sintetizados por las plantas a partir del nitrógeno absorbido en forma de
nitrato o en forma de amonio del suelo (las leguminosas además utilizan el nitrógeno atmosférico
como fuente en la síntesis aminoácidos) dicho proceso supone un gasto energético por parte de la
planta, para evitar este gasto se procura una adición directa de aminoácidos.
Los aminoácidos llamados también bioactivadores pueden ser de tres tipos:
 Aminoácido de síntesis.
 Aminoácidos de fermentación enzimática (heparina).
 Aminoácidos de hidrólisis.
Todos estos productos se caracterizan por ser capaces de permitir el torrente circulatorio de la
planta evitando gasto energético y formando parte de los componentes de las plantas. (Suarez,
2008)
2.4.1.6.1. Efectos de los aminoácidos en las plantas
Por medio de los aminoácidos se realiza la síntesis de proteínas, uniéndose los L- aminoácidos.
Proveen resistencia al estrés, las altas temperaturas, enfermedades, heladas, etc.
Tienen efecto directo sobre la fotosíntesis. Ya que la Glicina y el ácido L-Glutámico incrementan la
concentración de clorofila en consecuencia aumenta la fotosíntesis.
Efecto quelante: Algunos aminoácidos como la Glicina y los ácidos L-Glutánico y L-Aspártico
tienen carga negativa por lo tanto son capaces de retener cationes formando quelatos. El resto de
aminoácidos son de carga positiva y neutra, con lo cual no son capaces de quelar.
Efecto sobre la polinización y cuajado de frutos, se ha demostrado que aminoácidos como la
Prolina, Glutámico y la Glicina, aumentan la germinación del grano de polen alargando el tubo
polínico. (Licata N. , 2008)
2.4.1.6.2.
2.4.1.6.2.1.


Aminoácidos Azufrados
Cisteína
Es abundante en defensinas y tioninas, que tienen potente acción antifúngica. Ya que las
defensinas tienen la capacidad de inhibir efectivamente el crecimiento de un amplio rango
de microorganismos fitopatógenos.
Generan resistencia a condiciones abióticas de estrés en plantas. (Noa, 2014)
2.4.1.6.2.2.
Metionina
16



2.4.2.
Precursor del etileno, incrementa calidad y producción del cultivo.
Aplicando al suelo favorece al crecimiento radical
Favorece la asimilación de nitratos. (Noa, 2014)
PERFIL CROMATOGRÁFICO
El perfil cromatográfico permite identificar grupos funcionales que pueden estar presentes en una
muestra de extracto de planta, una vez separada la fracción de interés de la planta en investigación
se procede a correr la muestra en una placa de cromatografía de sílica gel con un eluyente adecuado
para el componente que se necesita investigar, estos componentes pueden tener coloración y se
observarán directamente. Para el caso de componentes no coloreados, es posible la utilización de
reveladores, luz ultravioleta o la combinación de ambas para determinar la presencia de los
metabolitos primarios o secundarios.
2.4.2.1
Fundamento de la cromatografía de capa fina
La cromatografía de capa fina consiste en la separación de dos componentes de una mezcla a través
de migración diferencial sobre una capa delgada de adsorbente colocada sobre una superficie plana.
El proceso de separación está fundamentado principalmente en el fenómeno de adsorción. Sin
embargo, utilizando fases estacionarias tratadas puede ocurrir también por partición o intercambio
iónico, permitiendo su uso tanto en la separación de substancias hidrofóbicas como hidrofílicas.
(Collins, Braga, & Bonato, 2007)
2.4.2.2
Adsorbente
2.4.2.2.1.
Sílica
Ácido silicio amorfo altamente poroso. Presenta carácter débilmente ácido, que puede ser
aumentado por la presencia de impurezas ácidas pudiendo ocurrir como consecuencia fenómenos de
quimiosorción de bases o reacciones ácidas catalizadas por las muestras.
En general, la sílica es utilizada en la separación de compuestos lipofílicos como aldehídos, cetonas,
fenoles, ácidos grasos, aminoácidos, alcaloides, terpenoides y esteroides usando el mecanismo de
adsorción. (Collins, Braga, & Bonato, 2007)
2.4.2.3
Identificación por cromatografía en capa fina.
La cromatografía de capa fina sirve para identificar drogas vegetales, sus extractos y tinturas e
igualmente para que una formulación farmacéutica sea posible identificar la presencia de una droga
o sus extractos. Cuando los principios activos de una droga no son conocidos, la identificación de la
droga puede ser realizada a través de la determinación de sustancias características de las planta en
cuestión, aunque no tengan actividad farmacológica.
17
Estas sustancias denominadas marcadores son seleccionadas entre los compuestos característicos de
la planta. El uso de ellas debe limitarse solamente a la identificación del material vegetal, de los
extractos y de las tinturas. Los marcadores pueden servir, igualmente, para identificar la presencia
de la droga en una formulación farmacéutica. La presencia de manchas o bandas coloreadas con el
mismo Rf de las sustancias de referencia en el cromatograma de la muestra, no es suficiente para
identificar la droga.
La existencia de otras manchas o bandas coloreadas debe ser anotada, así como su posición en
relación a la posición de las sustancias de referencia utilizadas. El uso de sustancias de referencia
que no son constituyentes de la planta es de utilidad para determinar la ocurrencia de
falsificaciones. Estas sustancias reciben la denominación de marcadores negativos. (Sharapin,
Fundamentos de tecnología de Productos Fitoterapéuticos, 2000)
2.5.
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA: CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA.
La Actividad antimicrobiana se evalúa generalmente a través del método conocido como
Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) el mismo que en Microbiología se define como
la concentración más
baja
de
un antimicrobiano que
inhibe
el crecimiento de
un microorganismo después de su incubación. La concentración mínima inhibitoria es importante
en diagnósticos de laboratorio para confirmar la resistencia de microorganismos a un agente
antimicrobiano y además para monitorizar la actividad de los nuevos agentes antimicrobianos.
Las concentraciones mínimas inhibitorias pueden ser determinadas mediante métodos de
microdilución en caldo, normalmente siguiendo las directrices de centros de referencia tales como
el CLSI (Clinical Laboratory Institute Standards), BSAC (British Society for Antimicrobial
Chemotherapy) o EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing).
(Andrews, 2001).
El método de difusión en agar, está apoyado por datos clínicos y de laboratorios; y presenta la
ventaja que sus resultados son altamente reproducibles.
El fundamento de esta determinación es establecer, en forma cuantitativa, el efecto de un conjunto
de sustancias, ensayadas individualmente, sobre las cepas bacterianas que se aíslan de procesos
infecciosos. (Stella Ramirez & Marin Castaño, 2009)
El método se basa en la relación entre la concentración de la sustancia necesaria para inhibir una
cepa bacteriana y el halo de inhibición de crecimiento en la superficie de una placa de agar con un
medio de cultivo adecuado y sembrado homogéneamente con la bacteria a ensayar y sobre la cual se
ha sembrado en pozo impregnado con una cantidad conocida de la sustancia. (Stella Ramirez &
Marin Castaño, 2009)
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La metodología de este método basado en la difusión en agar contiene un reservorio del extracto de
planta en el cual este está en contacto directo con el medio inoculado, y después de su incubación se
mide el diámetro de la zona inhibida alrededor del reservorio (diámetro de inhibición). El límite de
detección mínimo aumenta con el diámetro de inhibición cuando la difusión se mantiene a bajas
temperaturas durante horas antes de la incubación, para permitir la predifusión de los extractos
antes de la incubación. La lectura de los resultados representa la actividad In vitro de la sustancia.
(Dey & Harborne, 1991)
Los reservorio