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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIHUAHUA
FAULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
MAESTRIA EN CIENCIAS EN CIENCIA Y TECNOLOGIA DE ALIMENTOS
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS
Recuento de bacterias mesófilas, psicrófilas y coliformes en Salsa;
Recuento de hongos y levaduras en un alimento preparado;
Aislamiento y conteo de bacterias a partir de productos lácteos
fermentados.
ANA PAULINA FLORES GARCIA
DANIA ARELY QUEZADA QUIROZ
MARÍA EUGENIA ALARCÓN SÁENZ
TUTULAR: Dr. IVAN SALMERÓN OCHOA
Abril 2016
RESUMEN
En el presente estudio se emplearon las técnicas de cuenta en placa y Miles misra. Se realizaron
diluciones de 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10,000, 1:100,000 y se analizaron las siguientes muestras: salsa
comercial (bacterias mesófilas y psicrófilas), salsa casera y agua de grifo (coliformes), un burrito de
bistec (hongos y levaduras), y productos lácteos fermentados (yogurt, chamito y yakult) para recuento
de prebióticos. Se obtuvieron resultados positivos para coliformes y productos lácteos fermentados
(probióticos).
INTRODUCCIÓN
La microbiología en los alimentos es de gran importancia para el control de calidad de industrias y
establecimientos en los que se procesan y manipulan alimentos para consumo humano, ya que la
presencia de microorganismos puede ocasionar la descomposición de los alimentos, de la
transmisión de patógenos o toxinas, y por lo tanto, de enfermedades. El contenido microbiano de una
muestra de alimento puede proporcionar información que refleja el nivel de calidad del alimento, las
condiciones sanitarias bajo las cuales se elaboró y la eficacia del método para su conservación.
Dependiendo de las propiedades químicas de cada alimento, éste puede ser colonizado por un
determinado organismo o grupos de organismos, que aprovechan los nutrientesdisponibles. El
deterioro de los alimentos es probablemente el problema económico más serio en la industria
procesadora de alimentos.
La mayoría de los alimentos son buenos medios de cultivo para el crecimiento de muchas clases de
microorganismos, bajo condiciones favorables. Los grupos predominantes de microorganismos que
se desarrollan en los alimentos incluyen bacterias y hongos (mohos y levaduras).
La técnica más utilizada para determinar el contenido de microorganismos vivos en un alimento, es la
cuenta en placa. Esta técnica se aplica para una gran variedad de microorganismos y su fundamento
consiste en contar las colonias que se desarrollan en el medio de elección, después de cierto tiempo
y temperatura de incubación, presuponiendo que cada colonia proviene de un solo microorganismo
de la muestra en estudio (Olivas, 2004).
Las bacterias con una temperatura de crecimiento óptimo entre 15 y 45C son mesófilas, y las que
prefieren temperaturas por debajo de 20C son psicrófilas. Para su recuento se inoculan en agar para
cuenta estándar (agar triptona-glucosa-extracto de levadura) con la técnica de vertido en placa y el
número de colonias contadas constituyen una estimación de la cifra realmente presente en el
alimento y refleja si el manejo sanitario ha sido el adecuado (Viramontes, 2010)
El grupo coliforme está formado por los géneros: Escherichia, Klebsiella, Enterobacter y Citrobacter.,
bacilos Gram negativos, no esporulados, aerobios o anaerobios facultativos que a 35 ºC fermentan
lactosa con formación de ácido. El uso de coliformes como indicador sanitario se aplica para la
detección de buenas prácticas sanitarias en el manejo y fabricación de alimentos; para la evaluación
de un producto en cuanto a su calidad; la calidad sanitaria del agua y hielo, ya que el hábitat de estos
es el intestino de humanos y animales.
La técnica de diluciones y el recuento en placa según la Norma Oficial Mexicana 113-SSA1-1994
establece utilizar el agar rojo violeta bilis por ser un medio selectivo en el que se desarrollan bacterias
Coliformes, ocasionando el vire del indicador rojo neutro presente en el medio y la precipitación de las
sales biliares, así como la producción de gas.
Las levaduras son microorganismos unicelulares que con frecuencia deterioran mayonesas, salsas,
embutidos, jugos y bebidas no alcohólicas, toleran pH acido, algunas utilizan nitritos como fuente de
nitrógeno afectando procesos cárnicos.
Los mohos, son hongos microscópicos que se caracterizan por su estructura filamentosa con hifas
que forman micelio. Los hongos hidrolizan la pectina y reblandecen las frutas y verduras, toleran
elevadas concentraciones salinas, originan mal olor, alteran sabor y color en la superficie de los
alimentos debido a la metabolización de los carbohidratos, proteínas y lípidos (Rodríguez, 2006).
Para cuantificar los mohos y levaduras en los alimentos según la norma NOM-111-SSAA1-1994 se
inocula en agar papa dextrosa por la técnica de vaciado en placa.
Los probióticos son microorganismos vivos que incorporados en alimentos, y al ser consumidos en
cantidades adecuadas ejercen una acción benéfica sobre la salud del ser humano. Los productos
lácteos son utilizados como vehículo para los microorganismos probióticos, entre los que se pueden
mencionar: leches fermentadas, yogurt, y quesos.
Los microorganismos estrechamente ligados a los productos lácteos son las bacterias acido lácticas
que en los últimos años han despertado gran interés tanto en el sector industrial como en el científico,
debido a que proveen grandes beneficios a la salud. Entre tales beneficios están: mejorar la
inmunidad, reducir el nivel de colesterol en sangre, prevenir el cáncer de colon, mejorar la intolerancia
a la lactosa, reducir los efectos de la diarrea, así como algunas infecciones urinarias. Para poder
llevar a cabo los beneficios a la salud, la bacteria probiótica debe estar viable y disponible en altas
concentraciones, con un límite >106ufc/g en el producto (Hinestroza, 2008).
Para el recuento de bacterias prebióticas en productos lácteos fermentados
se puede utiliza la
técnica de Miles mirsa, que consiste en la preparación de diluciones seriadas de una suspensión
bacteriana. Las placas petri son divididas en sectores separados y se inocula cada sector con una
gota de suspensión. Se incuba 18 – 24 h a 37 C. El número de bacterias viables se obtiene
calculando la media de casa dilución en las repeticiones realizadas (Corrie, 2002).
OBJETIVOS:

Determinar la calidad microbiológica de la Salsa comercial marca “Oriental” mediante el
conteo de bacterias mesófilas y psicrófilas.

Determinar la calidad microbiológica de Salsa roja casera y de agua de grifo mediante el
conteo de bacterias coliformes.

Determinar la calidad microbiológica de productos lácteos fermentados mediante el conteo de
bacterias probióticas viables.
METODOLOGIA

Conteo de bacterias mesófilicas y psicrófilas
-
Se preparo solución fosfato para adicionar 9ml en 5 tubos de ensayo
-
Se esterilizo material, solución de trabajo y agar papa dextrosa en autoclave durante 15 min a
temperatura de 121ºC
-
Se preparo una solución madre adicionando 1 ml del producto a analizar, del cual se hicieron
5 diluciones (1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000, 1:100000)
-
Se agrego en cada caja petri 1 ml de cada dilución junto con agar papa dextrosa, se realizo
por duplicado y paso a ser incubado a condiciones para el crecimiento de bacterias
mesófilicas (35ºC por 48h) y psicrófilas (5h por 7-10 días)

Conteo de coliformes totales
-
Se preparo solución fosfato para adicionar 9ml en 5 tubos de ensayo
-
Se esterilizo material, solución de trabajo y agar rojo bilis violeta en autoclave durante 15 min
a temperatura de 121ºC
-
Se prepararon soluciones madre de agua de grifo y de salsa, se hicieron 5 diluciones (1:10,
1:100, 1:1000, 1:10000, 1:100000)
-
Se agrego 1 ml de las diluciones en cajas petri y se hizo por duplicado agregando el agar
papa dextrosa, se incubo a condiciones para el crecimiento de coliformes a 35ºC de 24 a 48h

Conteo de hongos y levaduras
-
Se pesaron 10g del alimento a analizar y se agrego a una bolsa de plástico estéril, se adiciono
90ml de agua peptonada y se agitó por 2 min a una velocidad media en un Stomacher
-
Se agrego 9ml de solución de fosfato en 5 tubos de ensayo
-
Se esterilizo material, solución de trabajo y agar papa dextrosa en autoclave durante 15 min a
temperatura de 121ºC
-
Se prepararon 5 diluciones (1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000, 1:100000)
-
Se agrego 1 ml de las diluciones en cajas petri y se hizo por duplicado agregando el agar
papa dextrosa, se incubo a 25ºC por 4 a 5 días

Recuento de prebióticos
-
Se esterilizo material necesario, solución de fosfatos y agar M17 durante 15 min a temperatura
121ºC
-
Se prepararon diluciones de los prebióticos a analizar (yogurt, yakult y chamito) en 4
diluciones (1:100, 1:1000, 1:10000, 1:100000), por duplicado
-
Se agrego en las cajas petris preparadas con agar M17, una gota de cada dilución y se dejo
secar
-
Para bacterias aerobias se incubo las cajas petri del control y las 4 diluciones de las diferentes
bebidas con prebióticos a una temperatura de 37ºC por 18 a 24h
-
Para bacterias anaerobias se colocaron las cajas petri del control y las 4 diluciones de las
diferentes bebidas con probióticos en un frasco, se coloco una vela para eliminar el Oxigeno
presente, y se incubo a 37ºC por 18 a 24h
RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Recuento de bacterias mesófilas y psicrófilas
Tabla 1. Resultados de crecimiento en agar estándar para Mesófilos y Psicrófilos para la muestra de
salsa comercial (Oriental).
Dilución
Mesófilos
Psicrófilos
1:10
Negativo
Negativo
1:100
Negativo
Negativo
1:1000
Negativo
Negativo
1:10,000
Negativo
Negativo
1:100,000
Negativo
Negativo
Después del tiempo de incubación especificado en la norma NOM-092-SSA1-1994, se realizó el
conteo de bacterias mesófilas y pscrófilas en la muestra seleccionada, donde se observó crecimiento
menor a 10-1 ufc/ml, para ambos cultivos, como se muestra en la tabla 1. Este resultado refleja la
inocuidad del alimento en cuanto a este tipo de bacterias, al igual de la eficiencia del método de
conservación.

Recuento de Coliformes totales en muestra de Salsa roja de un establecimiento (Cafetería,
FCQ).
Tabla 2. Recuento de Coliformes totales en placas de agar bilis rojo violeta, incubadas
por 24  2 h a 35 C, en salsa roja cacera.
Salsa Roja
Dilución
(Número Colonias)
Control
Negativo
1:10
36
1:10
20
1:100 – 1:100,000
Negativo
Cálculos:
Fórmula para Unidades Formadoras de Colonias (número total de
bacterias viables por muestra):
𝑈𝐹𝐶 =
𝑁𝑜. 𝐶𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠 ∗ 𝐼𝑛𝑣𝑒𝑟𝑠𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛
𝑚𝑙 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎
Sustitución: No. Colonias = promedio de 36 y 20 colonias, en
dilución 10-1
𝑈𝐹𝐶 =
28 𝑥 10
𝑈𝐹𝐶
= 280
1
𝑚𝑙
Fig. 1 Crecimiento en agar bilis violeta de la
muestra de salsa roja (no comercial) en
dilución 1:10.
De acuerdo a la NOM-093-SSA1-1994, establece que las salsas y purés cocidos no deben exceder el
límite de 50 UFC/g para coliformes totales. El resultado obtenido fue de 280 UFC/ml, lo cual es un
alimento no apto para consumo, y refleja prácticas de higiene y sanidad deficientes en la preparación
de alimentos que se ofrecen en establecimientos fijos.

Recuento de hongos y levaduras en un alimento preparado.
Tabla3. Recuento de Coliformes totales en placas de agar bilis rojo violeta, incubadas
por 24  2 h a 35 C, en salsa roja cacera.
Salsa Roja
Dilución
(Número Colonias)
Control
Negativo
1:10
Negativo
1:100
Negativo
1:1000
Negativo
1:10,000
Negativo
1:100,000
Negativo
*Todas las diluciones se realizaron por duplicado
Como se muestra en la tabla 3, se presentaron resultados negativos para el conteo de Hongos y
Levaduras en la muestra sólida, se consideró este alimento (burrito de bistec) por sus características
propicias para el desarrollo de estos microorganismos, sin embargo no se obtuvieron los resultados
esperados. En el medio se observó el desarrollo de burbujas y aglomeraciones, esto debido que el
tiempo que se utilizó para la preparación de los cultivos se excedió y el medio empezó a solidificar.

Recuento de bacterias viables en productos lácteos fermentados
Tabla 4. Numero de colonias presentes en Caldo M17 con agar para las muestras de Yakult,
Chamito y Yogurt para beber, en condiciones aerobias y anaerobias.
Condiciones Aerobias
Dilución
Muestra 1
Muestra 2
Promedio
UFC/ml
9
900,000
7
700,000
Yakult
1:100,000
10
8
Chamito
1:100,000
4
9
Yogurt
1:100,000
40
46
43
4,300,000
Muestra 1
Muestra 2
Promedio
UFC/ml
Condiciones Anaerobias
Dilución
Yakult
1:10,000
92
81
87
870,000
1:100,000
16
13
15
1,500,000
Chamito
1:10,000
31
54
43
430,000
1:100,000
12
12
12
1,200,000
44
4,400,000
Yogurt
1:100,000
38
49
En todas las diluciones se observó un crecimiento abundante de bacterias viables por lo que el
conteo de colonias se realizó para las diluciones de 1:10,000 y 1:100,000.
En general, el Yakult presenta concentraciones apropiadas para considerarse próbiotico por presentar
900,000 UFC/ml, como se muestra en la tabla 4. A pesar de que el Chamito presentó
concentraciones inferiores al Yakult, el conteo obtenido es apropiado para un producto probiótico,
además es un producto diseñado para consumo infantil, lo cual podría justificar su resultado.
El Yogurt presentó un recuento exagerado de UFC/ml que excede el límite de
>106ufc/g para
considerarse probiótico. Debido a que su concentración incremento en condiciones anaerobias, se
sugiere para estudios posteriores realizar un análisis morfológico para la identificación del
microorganismo.
Fig. 2 Cultivos de Yakult, Chamito y yogurt por el método de la gota.
CONCLUSIÓN
En la mayoría de los ensayos realizados se obtuvieron resultados favorables que reflejan un manejo
adecuado de los alimentos, buenas prácticas de higiene y seguridad alimentaria. Sin embargo el
recuento de coliformes totales sugiere una inspección sanitaria al establecimiento con el fin de
mejorar la calidad de los alimentos que en él ofrecen.
Los productos lácteos fermentados comerciales son opciones elegibles como alimentos probióticos ya
que el recuento de bacterias viables fue adecuado.
REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA
Corrie, et., al. (2002). Métodos de Análisis Microbiológicos de los Alimentos. Ediciones Díaz de
Santos, S.A. Madrid España.
Hinestroza-Córdoba,
López.
(2008).
Productos
lácteos
fermentados
como
vehículo
para
microorganismos probióticos. Universidad de las Américas. Temas Selectos de Ingeniería de
Alimentos 2. P 50-57. Puebla, México.
Norma oficial mexicana NOM-092-SSA1-1994, bienes y servicios. Método para la cuenta de bacterias
aerobias en placa.
Norma oficial Mexicana NOM-093-SSA1-1994, Bienes y servicios. Prácticas de higiene y sanidad en
la preparación de alimentos que se ofrecen en establecimientos fijos.
Norma oficial mexicana NOM-111-SSA1-1994, bienes y servicios. Método para la cuenta de mohos y
levaduras en alimentos.
Olivas; Alarcón. (2004). Manual de Prácticas de Microbiología Básica y Microbiología de Alimentos:
Programa de Nutrición. Universidad Autónoma de Ciudad Juárez. Cd. Juárez, México.
Rodríguez, et. al., (2006). Bacteriología General, Principio y prácticas de Laboratorio. Editorial
Universidad de Costa Rica.
Viramontes; Portillo. (2010). Identificación de Microorganismos: actividades prácticas para el
laboratorio. Universidad Autónoma de Chihuahua. México.