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Curso de Enzimología
Facultad de Ciencias
2010
Inhibición por sustrato
Sistema de xantina oxidasa/xantina
Diseño y puesta a punto: Gerardo Ferrer y Beatriz Alvarez
En algunos casos los sistemas enzimáticos son inhibidos por sus
propios sustratos cuando se encuentran en concentraciones muy altas, esto
trae una desviación del comportamiento de Michaelis-Menten de la velocidad
de reacción respecto a la concentración de sustrato.
El sistema xantina oxidasa/xantina es uno de estos casos, para
estudiarlo necesitamos los siguientes reactivos:
• Disolución amortiguadora de pirofosfato 100 mM, pH 8.3
• Disolución de xantina 0.1 mM en pirofosfato 100 mM, pH 8.3 (disolución
A).
• Disolución de xantina 5 mM en pirofosfato 100 mM, pH 8.3 (disolución B).
• Disolución de diclorofenolindofenol (DCFIF) 0.4 mM.
• Disolución de xantina oxidasa.
Para seguir el avance de la reacción se utilizará la desaparición del
color azul de DCFIF a 600 nm (ε600 = 20.5 mM-1 cm-1) en un
espectrofotómetro durante al menos 2 minutos con lecturas cada 20
segundos o menos. Las reacciones se inician por la adición de 0.1 mL de la
enzima a una disolución que contiene amortiguador, DCFIF (0.04 mM) y la
concentración deseada de xantina. Todas las corridas cinéticas se hacen por
duplicado.
Los resultados de velocidad de reacción obtenidos a diferentes
concentraciones de xantina (S) se procesarán para construir los siguientes
gráficos:
Michaelis: v = f([S]);
Lineweaver-Burk:
1/v = f(1/[S]);
Dixon: 1/v = f([S]);
Hill: ln(v/(vmáx-v)) = f(ln[S])
1
Antes de comenzar:
1. Completa la siguiente tabla con los volúmenes y concentraciones de
xantina que quieres estudiar, te sugerimos comenzar con una concentración
mínima de xantina 5 µM y no puedes llegar a más de 4.5 mM.
exp Vol DCFIF Vol buffer Vol xantina Vol xantina Vol Xantina [Xantina]0
(µM)
(dis A)
(dis B)
oxidasa
1
0.3
0.1
2
0.3
0.1
3
0.3
0.1
4
0.3
0.1
5
0.3
0.1
6
0.3
0.1
7
0.3
0.1
8
0.3
0.1
9
0.3
0.1
10
0.3
0.1
Todos los volúmenes en mL y el volumen final debe ser siempre 3 mL
2. ¿De cuál o cuáles gráficos esperas poder obtener los valores de KM, Vmáx y
Ki? ¿Cómo?
3. ¿Se te ocurre alguna secuencia de reacciones que expliquen esta
inhibición? ¿Cómo harías para confirmarla?
Referencias:
• Dixon, M. and Webb, E. C. (1979) Enzymes, Academic Press, New York.
• Rubbo, H, Radi, R. And Prodanov, E. (1991) Substrate inhibition of xantine
oxidase and its influence on superoxide production; Biochimica et
Biophysica Acta; 1074; 386-391
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