Download Detección VIH en Plasma y Glóbulos Blancos

DETECCIÓN DE UN FRAGMENTO DEL GEN ENV
DEL VIH EN PLASMA Y GLÓBULOS BLANCOS
EN PACIENTES CON VIH/sida
Presenta: Fernando I. Puerto
ANTECEDENTES
• En los 80’s, esta pandemia se identificó como peligro para la
seguridad mundial.
• Hoy en día es catalogada como una de las epidemias más
importantes de la historia.
• Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH) que ataca el
sistema de defensas del ser humano y lo deja vulnerable a
enfermedades oportunistas.
Síndrome
Virus de la
De
Inmunodeficiencia
Inmunodeficien
Humana
cia
Adquirida
Estructura del virus
3 genes:
Env: glicoproteinas
Gag: proteinas est
Pol: proteasa,
integrasa, ribonucleasa
y transcriptasa
reversa
CLASIFICACIÓN DEL VIRUS DEL VIH

Pertenece a la familia Retroviridae, género
Lentivirus.

Su genoma es una cadena de ARN
monocatenario
que
debe
copiarse
provisionalmente al ADN para poder
multiplicarse e integrarse en el genoma de
la célula que infecta.

Los antígenos proteicos de la envoltura
exterior se acoplan de forma específica
con proteínas de la membrana de las
células infectables, especialmente de los
linfocitos T CD4.
GENÉTICA DEL VIRUS DEL VIH

La diversidad genética de los subtipos de VIH está dada por acontecimientos
muy importantes que son alto ritmo de replicación, mutación y recombinación.

La enzima viral transcriptasa reversa tiene una frecuencia de error en la síntesis
de ADN de 1 en 1700 a 1 en 4000 nucleótidos polimerizados.
DISTRIBUCIÓN DE LOS SUBTIPOS Y
CFR’s DEL VIH
La gran mayoría de la
asignación de genotipo del
VIH, está basado en las
secuencias de segmentos
subgenómicos
que
comprenden desde el 2 al
30% del genoma.
Las cepas del VIH que circulan alrededor del mundo presentan gran
heterogeneidad de genotipos y de subtipos virales.
Circulating Recombinant Forms
CRF’S
CASOS DE YUCATÁN

Hasta diciembre de 2016 en México han sido notificados
185,902 casos de VIH/SIDA
Yucatán 3,407 casos, Mérida,
Progreso, Tizimín, Kanasín y
Valladolid.
En la mayoría de los casos el
contagio se da en los hombres
que tienen sexo con hombres
en edad productiva entre 20 49 años de edad.
SITUACIÓN ACTUAL DE LA EPIDEMIA

A nivel mundial 36.7 millones de personas
viven con VIH/SIDA

A nivel nacional registrados se

Cerca del 35% de las nuevas infecciones
ocurre en jóvenes de entre 20 y 35 años.

De acuerdo con ONUSIDA, México
tiene una epidemia concentrada en
grupos de riesgo.
encuentran registrados 127,823 Casos
de VIH/SIDA
En México 2016:
Total: 9,257
Sida: 4,112
VIH: 5,145
Yucatán:
15.5 casos por cada 100 mil habitantes
http://www.censida.salud.gob.mx/interior/cifras.html
CASOS DE
VIH/SIDA (1983-2016)
NOTIFICADO 186,655
S
PRUEBAS IMPORTANTES DEL VIH
Usadas generalmente para evaluar la resistencia o susceptibilidad
del paciente a su medicamento.
•
Permite Evaluar mutaciones
“archivadas”.
•
Se puede realizar en pacientes con
una carga viral indetectable.
•
Permite una optimización de los
recursos al proporcionar información
previa al cambio de medicamento.
•
Estudios recientes muestran una
correlación entre los resultados de
genotipo en ADN proviral y ARN de
plasma.
•
La carga viral
debe se entre
500/1000
copias/ml.
•
Segunda vez
con CV menos
a 1000
•
Predice
resistencia,
más no
susceptibilidad
.
PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN

¿Es posible identificar en los glóbulos
blancos de los pacientes con
VIH/SIDA con tratamiento genoma
del VIH?
Objetivo General
Comparar la eficacia en la identificación del VIH en muestras de
plasma y de glóbulos blancos de pacientes con VIH/SIDA con
tratamiento.
Objetivos específicos
•Identificación y sensibilización de los grupos
de estudio.
•Caracterización clínica de cada paciente al
momento de la toma de muestra.
•Detección de una parte del genoma viral en
una muestra de plasma y de glóbulos
blancos.
•Correlacionar la efectividad de cada una de
pruebas utilizadas.
RECOLECCIÓN DE LOS DATOS Y MUESTRA
•
En noviembre de 2016 se hace la invitación para que la
población participe.
•
Participaron 28 hombres y 3 mujeres de entre 24 a 58
años.
•
A los que accedieron a formar parte del estudio se les
aplicó una entrevista y firmaron un consentimiento
informado.
•
A los 5 ml de sangre que se le extrajeron al paciente se
realizó lo siguiente.
DIAGRAMA DE FLUJO DEL TRABAJO
Toma de
muestra
Separación de
las fases
Plasma
Extracción del
ARN
RT - PCR
Electroforesis
Glóbulos
blancos
Glóbulos
rojos
Extracción del
ADN
PCR
Electroforesis
Amplificación de ENV
Transcriptasa reversa (TR)
Con los protocolos para PCR Anidada y secuenciación
usados por el CDC de USA para el diagnóstico de VIH por
RT-PCR
Reactivos y concentración
Volumen
5x Reaction Buffer
4.0 µl
GP40. TCTTAGGAGCAGCAGCGAAGCAACTATGGG
Ribolock RNase Inhibitor (20U/ µl)
1.0 µl
GP41. AACGACAAAGGTGAGTATCCCTGCCTAA
dNTP’s (10 mM)
2.0 µl
GP46. ACAATTATTGTCTGGTATAGTGCACAGCA
GP47. TTAAACCTATCAAGCCTCCTACTATCATTA
ReverAid H Minus M-MulV Reverse Transcriptase (200U/ 1 µl
µl)
Volume total
Temperatura
25°C
42°C
70°C
5
60
5
8 µl
Tiempo (en minutos)
Procedimiento
Alineación
Elongación del cDNA
Inactivación de la TR
RESULTADOS
•
Participaron 28 hombres y 3 mujeres de entre 24
a 58 años.
•
Todos se encontraban en fase de VIH
•
Sólo 3 de los varones no se tenían un
tratamiento antirretroviral (10.8%) y el 100% de
las mujeres si se encontraban con un
tratamiento.
RESULTADOS EN GRÁFICA
Muestra de plasma
No amplifico
89%
Si amplifico
11%
100%
tienen
11%
Muestras en glóbulos blancos
No amplificó
Si amplificó
43%
57%
GELES DE AGAROSA DE PLASMA Y
GLÓBULOS BLANCOS
MM C+ 1
2
3
4
5
C-
MM C+ 1
2
3
4
5
C-
DISCUSIÓN

No hay un estudio que compare la eficacia de la
detección del genoma del VIH en suero y glóbulos
blancos a la vez.

Por lo cual este sería el primero en su tipo y es de suma
importancia seguir con la investigación.

La presencia de virus en los glóbulos blancos, es
probable que sean monocitos que migraron al torrente
sanguíneo provenientes de tejido linfático.

Que es el tejido en donde están los virus mientras están
con tratamiento efectivo.
Gracias