Download Detección de patógenos en alimentos utilizando PCR

Alimentos Analizadas (2005-2010)
Técnica: Detection, Isolation and Identification of Escherichia coli O157:H7
USDA/FSIS - CAA art. 255 / 302
Muestras: 117 Totales. Positivas: 37 %
Porcentajes de muestras positivas en
los distintos alimentos
• Chorizo
71%
• Carne molida 40%
• Hamburguesa 13%
Primers
Secuencia de oligonucleótidos ( 5´- 3´)
Stx 1a
GAAGAGTCCGTGGGATTACG
Stx 1 b
AGCGATGCAGCTATTAATAA
Stx 2 a
TTAACCACACCCCACCGGGCAGT
Stx 2b
GCTCTGGATGCATCTCTGGT
O157F
CGGACATCCATGTGATATAGG
O157R
TTGCCTATGTACAGCTAATCC
Tamaño del fragmento (pb)
130
346
259
Genotipos detectados en Muestras de Alimentos
Aislamiento de Salmonella spp. Por tipo de alimento y
método de aislamiento utilizado.
Fabricantes de estuches comerciales
• BAX (Qualicon, USA). Salmonella. Listeria. Listeria
monocytogenes y E. coli O157:H7
– Reactivos en tabletas y termociclador convencional
– Utiliza un gel de electroforesis
– No requiere extracción de ADN.
– La inclusividad y exclusividad son casi del 100%. Los falsos + y
falsos – son casi cero.
• Probelia (Sanofi, France). Salmonella. Listeria.
– El sistema intenta eliminar la contaminación del producto de
PCR al sustituir timina por uracilo.
• TaqMan (Perkin Elmer, USA). Salmonella. En desarrollo para:
Listeria y E. coli O157.
– Sistema de sondas e incorpora el marcador TaqMan que no es
fluorescente en su forma nativa pero la actividad exonucleasa
de la DNA polimerasa libera un producto fluorescente, el cual es
detectado y cuantificado.
– Cuantifica el microorganismo de interes.
Validación
• (ISO 8402)Es la confirmación mediante la evaluación
y la provisión de evidencia objetiva, de que se
cumplieron los requisitos para un uso pretendido y
específico.
• Las metodologías publicadas deben ser
reproducibles en cualquier laboratorio correctamente
equipado.
• Ej. Validación para Salmonella.
–
–
–
–
–
16 laboratorios
Secuencia blanco Gen invA
Se probaron 364 cepas
Resultados: Inclusividad: 99.6% Exclusividad: 100%
Metodología como Estandar Internacional.
Pruebas de validación.
• Estudio de Viabilidad
– Detección en una gama de concentraciones
• Desarrollo y estandarización del ensayo
– Debe optimizarse:
• Toma, preparación, transporte de muestra y
método de extracción.
• Parámetros, protocolos y reactivos.
– Repetitividad y Reproducibilidad.
– Sensibilidad (limite de detección.)
• Dilución de punto final
– Especificidad analítica
• El ensayo distingue entre el agente diana y otro
agente estrechamente relacionado.
• Frecuencia de validación (1 año).
• Perfil térmco.
Parámetros de validación:
Exactitud, Uniformidad, Heat Rate, Cool Rate,
Undershoots, Overshoots. (huella dactilar).
Uniformidad
Exactitud
Overshoot
Conclusiones
– Alta sensibilidad y especificidad, bajo costo, y la versatilidad
que posee.
– Son cada vez más utilizadas para el diagnostico:
• “Screening” de los serotipos más frecuentes
• Resolución de cepas problemáticas (rugosas, autoaglutinantes)
– Aporta a la Vigilancia Epidemiología:
• Otorga información segura y a tiempo.
• Respuesta en tiempo real, ayudando a Identificar el patógeno,
determinar el origen y la fuente, demostrando que el patógeno
proviene de la fuente, describe la transmisión del patógeno.
• Relaciona casos “aparentemente” esporádicos con brotes.
• Aporta al desarrollo de estrategias de intervención, reducir y controlar
la presencia y diseminación de los patógenos.
“Requieren un cierto nivel de conocimientos en herramientas básicas
de biología molecular y la falta de estandarización”.
Bibliografía
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