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Septiembre‐ Octubre de 2008 Informaciones sobre Análisis Microbiológicos por PCR Inclusividad de los kits de detección de Salmonella
por PCR a tiempo real: ¿están todas las que son?
Introducción “El uso de dianas
inadecuadas expone a un elevado
riesgo de obtener
resultados falsos
negativos”
“Salmofast incorpora dos seguros
contra la obtención
de falsos negativos”
La PCR a tiempo real es una técnica cada vez
más utilizada en el laboratorio de Microbiología
agroalimentaria por su especificidad, su robustez y su rapidez, permitiendo la obtención de
resultados en 18 horas. [1].
La elección de una diana correcta es un paso
critico en el desarrollo de cualquier sistema de
análisis basado en PCR. Hasta la fecha, los
genes de elección para la identificación de bacterias patógenas guardaban relación con alguna
de sus características patogénicas (ver tabla 1).
En el caso particular de Salmonella, el gen de
elección es el llamado invA [2], que codifica
para un factor relacionado con la capacidad de
esta bacteria de invadir el epitelio intestinal [3].
Está claro que estos genes son una buena elección pues se refieren a capacidades o atributos
propios de la bacteria en cuestión. No obstante,
la historia natural de estas bacterias y su constante relación con el "hospedador" y sus mecanismos de defensa hacen que presenten una
fuerte tendencia a las mutaciones [4]. Estas
mutaciones, si son suficientemente numerosas
(variadas) pueden ser una fuente de inespecificidad, pues los “primers” usados son constantes
mientras que la diana es fuertemente variable.
Estas inespecificidades pueden incluso resultar
en falsos negativos.
Tabla 1. Principales patógenos y los genes diana usados más comúnmente en PCR invA, que la mayoría de kits comerciales se
dejen en el tintero algunas otras variedades de
Salmonella, con lo que se añade un factor no
deseable de incertidumbre al análisis por PCR
que contrarresta sus ventajas. Con el gen invA
como diana la posibilidad de ofrecer un resultado falso negativo es más alta.
Figura 1. Fragmento de la alineación de gen invA de distintos aislados de Salmonella entre las posi‐
ciones 1070 y 1140. En azul la parte de la secuencia que está absolutamente conservada. La solución La utilización de la PCR a tiempo real exige
unos niveles de inclusividad máximos para
obtener la plena fiabilidad en el análisis. Salmofast es un kit de detección que incorpora los
dos elementos necesarios para la fiabilidad
máxima de los resultados, es decir, incorpora
dos seguros contra la obtención de falsos negativos. Por un lado se basa en una diana patentada por Microbial SL (EP 06120684.3) con unos
niveles de variabilidad interna prácticamente
nulos en las regiones complementarias a los
primers y la sonda [5]. Por otro lado, incorpora
un control interno de amplificación [6] que nos
informa de la existencia de inhibidores de la
Polimerasa en la reacción de PCR.
“Cuando usamos
herramientas
basadas en PCR
para la detección
de bacterias
patógenas debemos El problema Recientemente se ha comprobado que algunas
conocer la diana
cepas o variedades serológicas de Salmonella Un ejemplo genética, es decir,
no son detectadas por los sistemas de PCR a La cepa Montevideo de Salmonella enterica fue
real basados en el gen invA (figura 1). analizada con varios kits comerciales basados
el gen específico de tiempo
Entre ellas podemos destacar algunos aislados en el gen invA como diana, en distintos termola bacteria a detec- del serogrupo Saint Paul (el sexto por orden de cicladores. Todos ellos ofrecieron resultados
prevalencia en toxiinfecciones alimentarias en negativos, poniendo de manifiesto diferencia en
tar”
el mundo) o el serogrupo Montevideo. Es posi- la secuencia del gen invA complementaria a los
ble, dada la naturaleza poco conservada del gen primers y sondas usados.
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En cambio, el análisis con Salmofast, que usa diana distinta,
más integradora para todas las cepas de Salmonella , resultó
claramente positivo, con valores de Ct por debajo de 20, demostrando que el gen diana elegido está absolutamente conservado en la región de complementariedad con primers y
sondas (figura 2).
plenamente complementarios. Por tanto, el uso de dianas
inadecuadas expone a un elevado riesgo de obtener resultados
falsos negativos. El kit Salmofast, de Microbial, presenta la
mayor inclusividad del mercado, detectando cepas como por
ejemplo Salmonella Saint Paul o Salmonella Montevideo, que
son pasadas por alto por las demás marcas disponibles actualmente en el mercado.
Por tanto, cuando usamos herramientas basadas en PCR para
la detección de bacterias patógenas debemos conocer:
1. La diana genética, es decir el gen específico de la bacteria
a detectar
2. El grado de conservación genética de la región complementaria a los primers y sondas utilizados
3. La inclusividad del sistema utilizado. Debe ser lo más
próximo posible al 100%. Deben estar incluidas en la lista
de positivos todas las cepas conocidas.
4. El sistema de extracción de ADN usado y su eficacia, es
decir, la relación genomas/células obtenida.
Bibliografía [1]. Malorny, B., E. Paccassoni, P. Fach, C. Bunge, A. Martin, and R.
Helmuth. 2004. Diagnostic real-time PCR for detection of Salmonella in food. Appl. Environ. Microbiol. 70:7046-7052.
[2]. Chiu, C. H. and J. T. Ou. 1996. Rapid identification of Salmonella
serovars in feces by specific detection of virulence genes, invA and
spvC, by an enrichment broth culture-multiplex PCR combination
assay. J. Clin. Microbiol. 34:2619-2622.
[3]. Galan, J. E., C. Ginocchio, and P. Costeas. 1992. Molecular and
functional characterization of the Salmonella invasion gene invA:
homology of InvA to members of a new protein family. J. Bacteriol. 174:4338-4349.
Figura 2. Curvas de amplificación de un enriquecimiento de Sal‐
monella Montevideo en APT Conclusiones [4]. Randall, L. P., N. G. Coldham, and M. J. Woodward. 2005. Detection of mutations in Salmonella enterica gyrA, gyrB, parC and
parE genes by denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC) using standard HPLC instrumentation. J. Antimicrob. Chemother. 56:619-623.
[5]. Laia Calvó, L., A. Martínez-Planells, J. Pardos-Bosch and L. Jesús
El desconocimiento de lo que hay en el interior de un kit para
Garcia-Gil. 2008. A new Real-Time PCR assay for the specific
la detección de Salmonella por PCR puede inducirnos a asudetection of Salmonella spp. targeting the bipA gene. Food Anal.
mir que está preparado para detectar todas las subespecies,
Methods 1:236–242
cepas, aislados, serogrupos o variedades. El responsable del [6]. Hoorfar, J., N. Cook, B. Malorny, M. Wagner, D. De Medici, A.
laboratorio debe ser consciente de que esto no es así en la
Abdulmawjood, and P. Fach. 2003. Making internal amplification
control mandatory for diagnostic PCR. J. Clin. Microbiol.
mayoría de casos, pues la diana genética usada presenta varia41:5835.
ciones que hacen que los oligonucleótidos usados no sean
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