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Pastos y Forrajes, Vol. 14, No. 1, 1991 OBTENCION DE BACTERIAS ACIDO LACTICAS DE ENSILAJES DE PASTOS TROPICALES CON FINES INOCULATIVOS Lissette Luis y Marisol Ramírez Estación Experimental de Pastos y Forrajes "Indio Hatuey" Matanzas, Cuba Con el objetivo de obtener bacterias ácido lácticas para ser utilizadas como inoculante biológico, fueron ensilados en silos Cullison tres forrajes tropicales: bermuda 68, guinea likoni y taiwan-144, de donde fueron extraídas en medio MRS, a los 6, 8 y 10 días de conservación, las bacterias ácido lácticas presentes en el material. El 49% de las bacterias resultaron ser homofermentativas; el resto se desechó por ser heterofermentativas o pertenecer a otros grupos bacterianos. Se realizaron las siguientes pruebas: crecimiento a diferentes temperaturas (30, 45 y 50°C) y pH (3,5; 4,0 y 4,5); fermentación de azúcares: glucosa, fructosa y sacarosa; acidez generada en medio MRS líquido. A estos resultados se les aplicó el sistema de clasificación automática, que distribuyó a las bacterias en 7 grupos, de los cuales el grupo II resultó ser el de mejores características. A su vez las cepas más destacadas dentro del grupo fueron la 17 y la 39, que poseían además un crecimiento más rápido que el resto. Estas bacterias se clasificaron por el sistema API Lactobacillus y se obtuvieron los patrones fermentativos correspondientes a las bacterias Lactobacillus plantarum y Pediococcus acidilactici, ambas consideradas eficientes para la conservación de los ensilajes. Palabras claves: Bacterias ácido lácticas, inoculante, ensilaje Three tropical forages (bermudagrass 68, guineagrass cv. Likoni and taiwan-144) were used for silage conservation in order to obtain lactic acid bacteria for using them as biological inoculants. Bacteria were collected from a MRS medium after 6,8 and 10 days of conservation. 49% of bacteria were found to be homofermentative, the rest being heterofermentative or belonging to other bacterial groups were rejected. The following tests were made: growing at different temperatures (30, 45 and 50°C) and pH (3,5; 4,0 and 4,5); fermentation in sugars: glucose fructose and saccharose, acidity generated on MRS liquid medium. Automatical classification system was applied to these results which distributed the bacteria in seven groups where group II resulted to have the best characteristics. The most outstanding strains (17 and 39) within the group had a faster growth than the rest. API Lactobacillus system was used for bacterial classification and fermentative patterns concerning with Lactobacillus plantarum and Pediococcus acidilactici bacteria which are efficient for silage conservation were obtained. Additional index words: Lactic acid bacteria, inoculant, silage 59 Pastos y Forrajes, Vol. 14, No. 1, 1991 Procedimiento. El material a estudiar fue cortado manualmente a 10 cm de altura y troceado en una máquina troceadora estacionaria hasta obtener fracciones de 2 cm. Se introdujo el material en los silos y se apisonó fuertemente con mortero de mano hasta obtener una buena compactación. Los silos fueron almacenados en un lugar fresco y seco hasta su muestreo. Para seleccionar las bacterias ácido lácticas, se confeccionó una solución madre con 30 g del material ensilado que se maceró en 270 ml de solución salina estéril (0,9%) y se agitó vigorosamente durante 2 minutos. Se confeccionaron a partir de aquí diluciones seriadas y se sembró en placas de Petri con medio de cultivo específico: MRS (Oxoid Manual, 1980). Las colonias obtenidas en medio sólido se transfirieron a medio MRS líquido y se purificaron por el método de agotamiento. Las bacterias puras se sometieron a las pruebas fisiológicas y bioquímicas; tinción diferencial de Grant, fermentación de los azúcares fundamentales de los forrajes; producción de gas a partir de la glucosa (Gouet, 1985); pH generado en MRS líquido a 30°C, medido en potenciómetro con electrodo de vidrio; crecimiento a diferentes pH: 3,5; 4,0 y 4,5; crecimiento a diferentes temperaturas: 30°C, 45°C y 50°C y producción de dextrana a partir de la sacarosa. El medio de cultivo utilizado fue el MRS, excepto para la fermentación de azúcares y producción de dextrana. Para la fermentación de azúcares se utilizó el medio base que se describe a continuación (Gouet, Ph., comunicación personal): extracto de levadura, 10 g; Tryptona, 10 g; peptona, 15 g; tween 80, 1 ml; rojo cloro fenol, 0,04 g; azúcar filtrada, 1 ml; agua destilada, 1 000 ml. El pH del medio se ajustó a 7,7 y la esterilización se efectuó durante 15 min. a 1 atm y 120°C. El azúcar fermentable Un objetivo permanente de nuestra ganadería es mejorar cada vez más la calidad de los ensilajes, como una garantía del uso más eficiente de los alimentos disponibles para el consumo animal. Una de las vías utilizadas con este fin en muchos países es el uso de biopreparados como inoculante de los ensilajes, lo que ha mostrado resultados alentadores (Lindgren, Lingwall, Kaspersson, Kartzow y Rydberg, 1983; Gouet, 1985). A pesar de no existir información sobre las técnicas empleadas para la obtención de bacterias ácido lácticas, nos propusimos en este trabajo seleccionar e identificar las bacterias que cumplieran con los requisitos necesarios para ser consideradas aptas como inoculante biológico (Whittenbury, 1961), teniendo en cuenta que las bacterias ácido lácticas son las más importantes durante la conservación en forma de ensilaje y que en el transcurso de la fermentación natural de estos, existen diferentes tipos de microorganismos con una mayor o menor eficiencia desde el punto de vista de la producción de ácido láctico (Henderson y McDonaId, 1984). MATERIALES Y METODOS Se utilizaron los pastos Cynodon dactylon cv. 68 (bermuda 68); Panicum maximum Jacq. (guinea likoni) y Pennisetum purpureum Schum. (taiwan144), fertilizados con 60 kg de N/ha/corte. Los ensilajes se confeccionaron a las 7 y 10 semanas de rebrote, de acuerdo con el tipo de forraje. Como unidad experimental fueron confeccionados silos Cullison de 200-300 g de capacidad, los que se muestrearon a los 6, 8 y 10 días de conservación, período en el que se ha determinado que existe un mayor crecimiento de las bacterias ácido lácticas (Luis, Lissette, inédito). 60 Pastos y Forrajes, Vol. 14, No. 1, 1991 se esterilizó separadamente por filtración. El cambio de coloración del medio indica que la reacción es positiva. Para determinar la producción de dextrana se crecieron los microorganismos en un sustrato conteniendo sacarosa, 50 g; extracto de levadura, 3 g; peptona, 5 g; agar agar, 20 g; agua destilada, 1 000 ml. El pH se ajustó a 6,0 y la esterilización se realizó a 1 atm, 120°C durante 20 minutos. La presencia de un cultivo musilaginoso es la respuesta positiva. Las bacterias con características adecuadas para inoculante biológico fueron seleccionadas a través de un análisis de clasificación automática (Cluster analysis); para ello fue necesario establecer rangos de evaluación de cada carácter estudiado: Indicador Rango Puntuación Temperatura °C 30, 45 y 50° 45 y 50° 30 y 45° 45 ó 50° 30° 5 4 3 2 1 Fermentación de azúcares Glucosa, fructosa y sacarosa Glucosa + fructuosa Fructuosa + sacarosa Sacarosa + glucosa 4 3 Glucosa Fructuosa Sacarosa 2 Ninguna 1 Crecimiento a diferentes pH 3,0; 4,0 y 4,5 3,5 y 4,0 4,0 y 4,4,55 Ninguno Acidez generada en MRS líquido 3,0 - 3,5 5 3,5 - 4,0 4,0 - 4,5 4,5 – 5,0 5,0 o más 4 3 2 1 A las bacterias seleccionadas por esta vía se les realizaron otras pruebas complementarias: crecimiento en MRS líquido con 7% de glucosa, medido como densidad óptica del cultivo, en fotoclorímetro con λ= 650 nm; acidez generada a 35°C y a 48°C, producción de ácido láctico y acción sobre las proteínas en medio leche tornasolada y agar gelatina (Oxoid Manual, 1980); requerimientos de oxígeno. La identificación de las mejores bacterias se realizó 61 Pastos y Forrajes, Vol. 14, No. 1, 1991 formación de 7 grupos de individuos bien diferenciados entre sí (fig. 2, tabla 1). El grupo II (tabla 2) aglutinó a las mejores bacterias, que fueron aquellas que: por el sistema API Lactobacillus (Celanie, 1982), cuyo principio son las características culturales bioquímicas de los microorganismos en medio de cultivo 50 CHL (modificación del medio MRS), con una suspensión de bacterias que posea una densidad óptica entre 0,5 y 0,7 y por el Bergey's Manual (1986). El perfil fermentativo de cada bacteria se obtuvo después de incubadas las placas a 30°C durante 24-48 horas. La termorresistencia y la producción de ácido láctico fueron determinadas por la técnica descrita por Raibaud, Galpin, Ducluzeau, Macquot y Oliver (1973) y el método de Accolas. Bloquel, Didienne y Regnier (1977) respectivamente. Las bacterias se conservaron en medio leche glicerol a -4°C, hasta el momento de su uso. % 1 Homofermentativas 2 Heterofermentativas 3 Gram negativas 4 Sin evaluar 60 50 40 30 20 10 0 1 2 3 4 Fig. 1. Distribución de las bacterias ácido lácticas, aisladas de ensilajes tropicales. RESULTADOS Y DISCUSION Al analizar la distribución de las bacterias ácido lácticas aisladas (fig. 1), se observó que un porcentaje elevado de bacterias resultó ser del grupo de las heterofermentativas, menos eficientes en la producción de ácido láctico (Zeikus, 1980). Este hecho hace que no se consideren dentro del grupo de mayor importancia, si se tiene en cuenta que se trata de obtener bacterias que garanticen una acidificación rápida e intensa, lo que se logra con bacterias que posean una fuerte capacidad acidificante (Whittenberg, Ingalls y Devlin, 1983). Las bacterias ácido lácticas pertenecen al grupo que responde positivamente frente a la tinción diferencial de Gram (Bergey's Manual, 1986), por lo que los microorganismos que dieron una respuesta negativa ante este indicador, no fueron estudiados. El análisis de las bacterias homofermentativas, basado en la respuesta de cada organismo frente a los caracteres estudiados mediante el método de clasificación automática, permitió la - Fermentaron los tres azúcares estudiados. Esta característica de las bacterias es fundamental si tenemos en cuenta que los carbohidratos solubles del forraje constituyen la fuente de energía de ellas para la producción de ácido láctico. - Crecieron a temperatura óptima que se sitúa entre 30 y 40°C (Bergey's Manual, 1986), pero además a temperaturas más elevadas, lo que garantiza su permanencia aun en ensilajes donde la temperatura se eleve por encima de 40°C, como es el caso de muchos ensilajes comerciales. - Mostraron ser ácido tolerantes, si comparamos nuestros resultados con los obtenidos por Grazia y Suzzi (1984), lo que facilita la permanencia de estas bacterias en medios con acidez elevada e inhibe el crecimiento de otros grupos de microorganismos indeseables, objetivo fundamental de la conservación (Gouet, 1985). 62 Pastos y Forrajes, Vol. 14, No. 1, 1991 - Produjeron una acidez elevada, lo que constituye un requisito fundamental de estas bacterias, pues de la velocidad e intensidad de la acidificación dependerá la calidad de la conservación, que no solo limita el creci- miento de microorganismos indeseables, sino que actúa sobre la actividad proteolítica de las enzimas de la planta (Shockey, Dehority y Conrad, 1985). I - 32 individuos II - 9 individuos III - 1 individuo IV - 3 individuos V - 1 individuo VI - 2 individuos VII - 1 individuo Niveles 5 4 3 2 1 0 I II III VII VI IV V Fig. 2. Clasificación automática de las bacterias ácido lácticas. Ninguna de las bacterias estudiadas produjo dextrana. Coincidiendo con los resultados obtenidos dentro del grupo 2, se encontró que las bacterias que presentaron un mayor crecimiento resultaron ser también las cepas 17 y 39 (figs. 3 y 4). Si la preservación del forraje es más eficiente cuando se encuentran mayor cantidad de bacterias homofermentativas involucradas en el proceso (Henderson y McDonald, 1984), se explica fácilmente que las bacterias que se desarrollan rápidamente tienen mayores posibilidades de dominar durante la fermentación, contrarestando el crecimiento de cualquier otro tipo de microorganismo (Ely, Moon y Sudweeks, 1982). Otras características fisiológicas estudiadas reafirmaron las potencialidades de las 63 Pastos y Forrajes, Vol. 14, No. 1, 1991 Las bacterias seleccionadas fueron identificadas como Lactobacillus plantarum y Pediococcus acidilactici, de acuerdo con su metabolismo. Estas produjeron una cantidad de ácido láctico superior a 75,0 ml/kg de leche (tabla 4), que puede considerarse una buena producción de acuerdo con los resultados de Accolas y col. (1977). bacterias seleccionadas (tabla 3); estas fueron la acidificación elevada a diferentes temperaturas (que expresa la estabilidad de las mismas), su poco requerimiento de oxígeno y la no utilización de las proteínas como medida del grado de eficiencia en cuanto a la conservación de los nutrientes del ensilaje. Tabla 1. Promedio y desviación estándar de cada variable en los grupos formados. No. grupo Efectivo I 32 II III IV V VI VII 9 1 3 1 2 1 Variables Temperatura 1,000 pH 4,531 Azúcar 3,344 Acidez 3,063 (0) (0,661) (0,775) (0,171) 3,447 5,000 4,000 4,222 (0,816) (0) (0) (0,629) 3,000 4,000 1,000 1,000 (0) (0) (0) (0) 1,000 1,000 3,333 3,667 (0) (0) (0,943) (0,471) 4,000 1,000 4,000 2,000 (0) (0) (0) (0) 1,000 1,000 3,000 1,000 (0) (0) (0) (0) 4,000 5,000 4,000 1,000 (0) (0) (0) (0) ( ) Desviación estándar Pediococcus acidilactici se ha encontrado siempre involucrado en las fermentaciones de forrajes (Langston y Bouma, 1960; Dellaglio y Santi, 1984), pues tiene altos rendimientos en cuanto a la producción de ácido láctico (Gouet, 1979), por lo que su utilización se ha extendido incluso a la conservación de productos cárnicos debido a que inhibe muy eficientemente el desarrollo de bacterias indeseables (Holley y Millard, 1988) y es utilizado como regulador de la fermentación, porque fermenta activa- Ninguna de las bacterias resistió los 63°C de temperatura. Lactobacillus plantarum ha sido considerado como uno de los microorganismos más utilizados en la inoculación de ensilajes (Lindgren, Pettersson, Jonsson, Lingvall y Kaspersson, 1985), ya que posee una elevada habilidad de fermentación, se desarrolla en diversos sustratos y cuando crece dentro del material ensilado puede transformar del 75 al 80% de los carbohidratos solubles en ácido láctico (Dellaglio, 1985). 64 Pastos y Forrajes, Vol. 14, No. 1, 1991 mente los carbohidratos solubles vegetales (Dellaglio y Santi, 1984). A lo anterior se debe agregar que Lindgren et al. (1983) observaron una cooperación estrecha entre estos dos microorganismos cuando se adicionan juntos. Ambos son altamente resistentes a la acidez, lo que les permite ocupar una posición dominante con relación a otros grupos presentes en el ensilaje (Dulphy, 1985). Henderson y McDonaId (1984) encontraron que al comparar la efectividad de diferentes inoculantes, el mejor fue el que utilizó estos dos microorganismos. 2.000 1.800 K - Cepa 39 M - Cepa 47 Tabla 2. Grupo de bacterias seleccionadas (grupo II) por presentar las mejores características. Bacteria s 04 10 14 15 08 25 57 17 39 Temperatur a 3 3 3 3 3 3 3 5 5 p H 3 3 3 3 3 3 3 5 5 Azúca r 4 4 4 4 4 4 4 4 4 L - Cepa 15 N - Cepa 14 K Acide z 4 4 5 5 4 4 4 5 4 L M N 1.600 Densidad óptica 1.400 1.200 1.000 0.800 0.600 0.400 0.200 0.000 61 122 183 244 305 366 427 488 549 610 t (min) Fig. 3. Crecimiento de bacterias ácido lácticas (cocos). 65 Pastos y Forrajes, Vol. 14, No. 1, 1991 O - Cepa 17 P - Cepa 8 E - Cepa 25 Densidad óptica 2.000 1.800 O 1.600 P 1.400 E 1.200 1.000 0.800 0.600 0.400 0.200 0.000 61 122 183 244 305 366 427 488 549 610 t (min) Fig. 4. Crecimiento de bacterias ácido lácticas (bacilos). Tabla 3. Algunas características fisiológicas de 9 bacterias ácido lácticas. No. de cultivo bacteriano Determinaciones 4 + 8 + 10 + 14 + 15 + 17 + 25 + 39 + 57 + 3,6 4,1 3,8 3,7 3,7 3,5 3,7 3,3 3,7 + + + + + + + + + 4,0 3,8 3,8 3,9 3,8 3,9 3,9 3,9 3,9 Requerimientos de O2 - - + + - - - - - Microaerófilos + + - - + + + + + Anaerobios facultativos + + - - + + + + + Cambio de coloración - - - - + + + + + Cambio parcial + + + + - - - - - Coagulación + + + + + + + + + Acción sobre las proteínas - - - - - - - - - Liquefacción de la gelatina - - - - - - - - - Crecimiento a 35°C pH a 35°C Crecimiento a 48°C pH a 48°C Crecimiento en leche tornasolada 66 Pastos y Forrajes, Vol. 14, No. 1, 1991 Tabla 4. Producción de ácido láctico de las bacterias seleccionadas creciendo en medio de leche. Réplicas Bacteria ml de NaOH consumidos 1 2 3 4 Valor medio ml ácido láctico/kg leche Lactobacillus plantarum 8,1 8,0 7,7 7,6 7,8 78,5 Pediococcus acidilactici 7,5 7,6 7,6 7,8 7,6 76,2 CELANIE, E. 1982. 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Las bacterias del grupo II mostraron las mejores características para ser utilizadas como inoculante biológico y dentro de ellas las cepas 17 y 39, identificadas como Lactobacillus plantarum y Pediococcus acidilactici respectivamente. Las bacterias L. plantarum y P. acidilactici fermentaron los azúcares fundamentales de los forrajes, crecieron a las temperaturas estudiadas, fueron ácido tolerantes y generaron una acidez elevada, lo que unido a su rápido crecimiento, las avala como potencialmente aptas para la inoculación de ensilajes. Por ello se recomienda pasar a la fase de inoculación a escala experimental, con el objetivo de determinar en la práctica, el efecto de su uso sobre la conservación en forma de ensilaje. GOUET, Ph. 1979. C.R.Z..V. Bull. Tech. Theix. 36:25 GOUET, Ph. 1985. Silage. New biological aspects. Symposium Santé Animale. SANOFI, Francia, p. 35 GRAZIA; L. & SUZZI, G. 1984. J. of Applied Bacteriology. 56:272 HENDERSON, A.R. & McDONALD, P. 1984. 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