Download obtencion de bacterias acido lacticas de

Pastos y Forrajes, Vol. 14, No. 1, 1991
OBTENCION DE BACTERIAS ACIDO LACTICAS DE ENSILAJES
DE PASTOS TROPICALES CON FINES INOCULATIVOS
Lissette Luis y Marisol Ramírez
Estación Experimental de Pastos y Forrajes "Indio Hatuey"
Matanzas, Cuba
Con el objetivo de obtener bacterias ácido lácticas para ser utilizadas como inoculante biológico,
fueron ensilados en silos Cullison tres forrajes tropicales: bermuda 68, guinea likoni y taiwan-144, de
donde fueron extraídas en medio MRS, a los 6, 8 y 10 días de conservación, las bacterias ácido
lácticas presentes en el material. El 49% de las bacterias resultaron ser homofermentativas; el resto
se desechó por ser heterofermentativas o pertenecer a otros grupos bacterianos. Se realizaron las
siguientes pruebas: crecimiento a diferentes temperaturas (30, 45 y 50°C) y pH (3,5; 4,0 y 4,5);
fermentación de azúcares: glucosa, fructosa y sacarosa; acidez generada en medio MRS líquido. A
estos resultados se les aplicó el sistema de clasificación automática, que distribuyó a las bacterias en
7 grupos, de los cuales el grupo II resultó ser el de mejores características. A su vez las cepas más
destacadas dentro del grupo fueron la 17 y la 39, que poseían además un crecimiento más rápido
que el resto. Estas bacterias se clasificaron por el sistema API Lactobacillus y se obtuvieron los
patrones fermentativos correspondientes a las bacterias Lactobacillus plantarum y Pediococcus
acidilactici, ambas consideradas eficientes para la conservación de los ensilajes.
Palabras claves: Bacterias ácido lácticas, inoculante, ensilaje
Three tropical forages (bermudagrass 68, guineagrass cv. Likoni and taiwan-144) were used for
silage conservation in order to obtain lactic acid bacteria for using them as biological inoculants.
Bacteria were collected from a MRS medium after 6,8 and 10 days of conservation. 49% of bacteria
were found to be homofermentative, the rest being heterofermentative or belonging to other bacterial
groups were rejected. The following tests were made: growing at different temperatures (30, 45 and
50°C) and pH (3,5; 4,0 and 4,5); fermentation in sugars: glucose fructose and saccharose, acidity
generated on MRS liquid medium. Automatical classification system was applied to these results
which distributed the bacteria in seven groups where group II resulted to have the best
characteristics. The most outstanding strains (17 and 39) within the group had a faster growth than
the rest. API Lactobacillus system was used for bacterial classification and fermentative patterns
concerning with Lactobacillus plantarum and Pediococcus acidilactici bacteria which are efficient for
silage conservation were obtained.
Additional index words: Lactic acid bacteria, inoculant, silage
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Pastos y Forrajes, Vol. 14, No. 1, 1991
Procedimiento. El material a estudiar
fue cortado manualmente a 10 cm de
altura y troceado en una máquina
troceadora estacionaria hasta obtener
fracciones de 2 cm. Se introdujo el
material en los silos y se apisonó
fuertemente con mortero de mano hasta
obtener una buena compactación. Los
silos fueron almacenados en un lugar
fresco y seco hasta su muestreo.
Para seleccionar las bacterias ácido
lácticas, se confeccionó una solución
madre con 30 g del material ensilado que
se maceró en 270 ml de solución salina
estéril (0,9%) y se agitó vigorosamente
durante 2 minutos. Se confeccionaron a
partir de aquí diluciones seriadas y se
sembró en placas de Petri con medio de
cultivo específico: MRS (Oxoid Manual,
1980).
Las colonias obtenidas en medio
sólido se transfirieron a medio MRS
líquido y se purificaron por el método de
agotamiento. Las bacterias puras se
sometieron a las pruebas fisiológicas y
bioquímicas; tinción diferencial de Grant,
fermentación de los azúcares fundamentales de los forrajes; producción de gas a
partir de la glucosa (Gouet, 1985); pH
generado en MRS líquido a 30°C,
medido en potenciómetro con electrodo
de vidrio; crecimiento a diferentes pH:
3,5; 4,0 y 4,5; crecimiento a diferentes
temperaturas: 30°C, 45°C y 50°C y
producción de dextrana a partir de la
sacarosa.
El medio de cultivo utilizado fue el
MRS, excepto para la fermentación de
azúcares y producción de dextrana.
Para la fermentación de azúcares se
utilizó el medio base que se describe a
continuación (Gouet, Ph., comunicación
personal): extracto de levadura, 10 g;
Tryptona, 10 g; peptona, 15 g; tween 80,
1 ml; rojo cloro fenol, 0,04 g; azúcar
filtrada, 1 ml; agua destilada, 1 000 ml. El
pH del medio se ajustó a 7,7 y la
esterilización se efectuó durante 15 min.
a 1 atm y 120°C. El azúcar fermentable
Un objetivo permanente de nuestra
ganadería es mejorar cada vez más la
calidad de los ensilajes, como una
garantía del uso más eficiente de los
alimentos disponibles para el consumo
animal.
Una de las vías utilizadas con este fin
en muchos países es el uso de
biopreparados como inoculante de los
ensilajes, lo que ha mostrado resultados
alentadores (Lindgren, Lingwall, Kaspersson, Kartzow y Rydberg, 1983; Gouet,
1985).
A pesar de no existir información
sobre las técnicas empleadas para la
obtención de bacterias ácido lácticas,
nos propusimos en este trabajo
seleccionar e identificar las bacterias que
cumplieran con los requisitos necesarios
para ser consideradas aptas como
inoculante biológico (Whittenbury, 1961),
teniendo en cuenta que las bacterias
ácido lácticas son las más importantes
durante la conservación en forma de
ensilaje y que en el transcurso de la
fermentación natural de estos, existen
diferentes tipos de microorganismos con
una mayor o menor eficiencia desde el
punto de vista de la producción de ácido
láctico (Henderson y McDonaId, 1984).
MATERIALES Y METODOS
Se utilizaron los pastos Cynodon
dactylon cv. 68 (bermuda 68); Panicum
maximum Jacq. (guinea likoni) y
Pennisetum purpureum Schum. (taiwan144), fertilizados con 60 kg de
N/ha/corte. Los ensilajes se confeccionaron a las 7 y 10 semanas de rebrote,
de acuerdo con el tipo de forraje.
Como unidad experimental fueron
confeccionados silos Cullison de 200-300
g de capacidad, los que se muestrearon
a los 6, 8 y 10 días de conservación,
período en el que se ha determinado que
existe un mayor crecimiento de las
bacterias ácido lácticas (Luis, Lissette,
inédito).
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se esterilizó separadamente por filtración. El cambio de coloración del medio
indica que la reacción es positiva.
Para determinar la producción de
dextrana se crecieron los microorganismos en un sustrato conteniendo
sacarosa, 50 g; extracto de levadura, 3 g;
peptona, 5 g; agar agar, 20 g; agua
destilada, 1 000 ml. El pH se ajustó a 6,0
y la esterilización se realizó a 1 atm,
120°C durante 20 minutos.
La presencia de un cultivo musilaginoso es la respuesta positiva.
Las bacterias con características
adecuadas para inoculante biológico
fueron seleccionadas a través de un
análisis de clasificación automática
(Cluster analysis); para ello fue necesario
establecer rangos de evaluación de cada
carácter estudiado:
Indicador
Rango
Puntuación
Temperatura °C
30, 45 y 50°
45 y 50°
30 y 45°
45 ó 50°
30°
5
4
3
2
1
Fermentación de azúcares
Glucosa, fructosa y sacarosa
Glucosa + fructuosa
Fructuosa + sacarosa
Sacarosa + glucosa
4
3
Glucosa
Fructuosa
Sacarosa
2
Ninguna
1
Crecimiento a diferentes pH
3,0; 4,0 y 4,5
3,5 y 4,0
4,0 y 4,4,55
Ninguno
Acidez generada
en MRS líquido
3,0 - 3,5
5
3,5 - 4,0
4,0 - 4,5
4,5 – 5,0
5,0 o más
4
3
2
1
A las bacterias seleccionadas por esta
vía se les realizaron otras pruebas
complementarias: crecimiento en MRS
líquido con 7% de glucosa, medido como
densidad óptica del cultivo, en fotoclorímetro con λ= 650 nm; acidez
generada a 35°C y a 48°C, producción
de ácido láctico y acción sobre las
proteínas en medio leche tornasolada y
agar gelatina (Oxoid Manual, 1980);
requerimientos de oxígeno. La identificación de las mejores bacterias se realizó
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formación de 7 grupos de individuos bien
diferenciados entre sí (fig. 2, tabla 1). El
grupo II (tabla 2) aglutinó a las mejores
bacterias, que fueron aquellas que:
por el sistema API Lactobacillus (Celanie,
1982), cuyo principio son las características culturales bioquímicas de los
microorganismos en medio de cultivo 50
CHL (modificación del medio MRS), con
una suspensión de bacterias que posea
una densidad óptica entre 0,5 y 0,7 y por
el Bergey's Manual (1986). El perfil
fermentativo de cada bacteria se obtuvo
después de incubadas las placas a 30°C
durante 24-48 horas.
La termorresistencia y la producción
de ácido láctico fueron determinadas por
la técnica descrita por Raibaud, Galpin,
Ducluzeau, Macquot y Oliver (1973) y el
método de Accolas. Bloquel, Didienne y
Regnier (1977) respectivamente.
Las bacterias se conservaron en
medio leche glicerol a -4°C, hasta el
momento de su uso.
%
1 Homofermentativas
2 Heterofermentativas
3 Gram negativas
4 Sin evaluar
60
50
40
30
20
10
0
1
2
3
4
Fig. 1. Distribución de las bacterias ácido
lácticas, aisladas de ensilajes
tropicales.
RESULTADOS Y DISCUSION
Al analizar la distribución de las
bacterias ácido lácticas aisladas (fig. 1),
se observó que un porcentaje elevado de
bacterias resultó ser del grupo de las
heterofermentativas, menos eficientes en
la producción de ácido láctico (Zeikus,
1980). Este hecho hace que no se
consideren dentro del grupo de mayor
importancia, si se tiene en cuenta que se
trata de obtener bacterias que garanticen
una acidificación rápida e intensa, lo que
se logra con bacterias que posean una
fuerte capacidad acidificante (Whittenberg, Ingalls y Devlin, 1983).
Las bacterias ácido lácticas pertenecen al grupo que responde positivamente
frente a la tinción diferencial de Gram
(Bergey's Manual, 1986), por lo que los
microorganismos que dieron una respuesta negativa ante este indicador, no
fueron estudiados.
El análisis de las bacterias homofermentativas, basado en la respuesta de
cada organismo frente a los caracteres
estudiados mediante el método de
clasificación automática, permitió la
- Fermentaron los tres azúcares
estudiados. Esta característica de las
bacterias es fundamental si tenemos
en cuenta que los carbohidratos
solubles del forraje constituyen la
fuente de energía de ellas para la
producción de ácido láctico.
- Crecieron a temperatura óptima que
se sitúa entre 30 y 40°C (Bergey's
Manual, 1986), pero además a
temperaturas más elevadas, lo que
garantiza su permanencia aun en
ensilajes donde la temperatura se
eleve por encima de 40°C, como es el
caso de muchos ensilajes comerciales.
- Mostraron ser ácido tolerantes, si
comparamos nuestros resultados con
los obtenidos por Grazia y Suzzi
(1984), lo que facilita la permanencia
de estas bacterias en medios con
acidez elevada e inhibe el crecimiento
de otros grupos de microorganismos
indeseables, objetivo fundamental de
la conservación (Gouet, 1985).
62
Pastos y Forrajes, Vol. 14, No. 1, 1991
- Produjeron una acidez elevada, lo que
constituye un requisito fundamental de
estas bacterias, pues de la velocidad
e intensidad de la acidificación
dependerá la calidad de la conservación, que no solo limita el creci-
miento de microorganismos indeseables, sino que actúa sobre la actividad
proteolítica de las enzimas de la
planta (Shockey, Dehority y Conrad,
1985).
I - 32 individuos
II - 9 individuos
III - 1 individuo
IV - 3 individuos
V - 1 individuo
VI - 2 individuos
VII - 1 individuo
Niveles
5
4
3
2
1
0
I
II
III
VII
VI
IV
V
Fig. 2. Clasificación automática de las bacterias ácido lácticas.
Ninguna de las bacterias estudiadas
produjo dextrana.
Coincidiendo con los resultados
obtenidos dentro del grupo 2, se
encontró que las bacterias que presentaron un mayor crecimiento resultaron
ser también las cepas 17 y 39 (figs. 3 y
4). Si la preservación del forraje es más
eficiente cuando se encuentran mayor
cantidad de bacterias homofermentativas
involucradas en el proceso (Henderson y
McDonald, 1984), se explica fácilmente
que las bacterias que se desarrollan
rápidamente tienen mayores posibilidades de dominar durante la fermentación,
contrarestando
el
crecimiento
de
cualquier otro tipo de microorganismo
(Ely, Moon y Sudweeks, 1982). Otras
características fisiológicas estudiadas
reafirmaron las potencialidades de las
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Las bacterias seleccionadas fueron
identificadas como Lactobacillus plantarum y Pediococcus acidilactici, de
acuerdo con su metabolismo. Estas
produjeron una cantidad de ácido láctico
superior a 75,0 ml/kg de leche (tabla 4),
que puede considerarse una buena
producción de acuerdo
con
los
resultados de Accolas y col. (1977).
bacterias seleccionadas (tabla 3); estas
fueron la acidificación elevada a
diferentes temperaturas (que expresa la
estabilidad de las mismas), su poco
requerimiento de oxígeno y la no
utilización de las proteínas como medida
del grado de eficiencia en cuanto a la
conservación de los nutrientes del
ensilaje.
Tabla 1. Promedio y desviación estándar de cada variable en los grupos formados.
No. grupo
Efectivo
I
32
II
III
IV
V
VI
VII
9
1
3
1
2
1
Variables
Temperatura
1,000
pH
4,531
Azúcar
3,344
Acidez
3,063
(0)
(0,661)
(0,775)
(0,171)
3,447
5,000
4,000
4,222
(0,816)
(0)
(0)
(0,629)
3,000
4,000
1,000
1,000
(0)
(0)
(0)
(0)
1,000
1,000
3,333
3,667
(0)
(0)
(0,943)
(0,471)
4,000
1,000
4,000
2,000
(0)
(0)
(0)
(0)
1,000
1,000
3,000
1,000
(0)
(0)
(0)
(0)
4,000
5,000
4,000
1,000
(0)
(0)
(0)
(0)
( ) Desviación estándar
Pediococcus
acidilactici
se
ha
encontrado siempre involucrado en las
fermentaciones de forrajes (Langston y
Bouma, 1960; Dellaglio y Santi, 1984),
pues tiene altos rendimientos en cuanto
a la producción de ácido láctico (Gouet,
1979), por lo que su utilización se ha
extendido incluso a la conservación de
productos cárnicos debido a que inhibe
muy eficientemente el desarrollo de
bacterias indeseables (Holley y Millard,
1988) y es utilizado como regulador de la
fermentación, porque fermenta activa-
Ninguna de las bacterias resistió los
63°C de temperatura.
Lactobacillus plantarum ha sido
considerado como uno de los microorganismos más utilizados en la inoculación de ensilajes (Lindgren, Pettersson,
Jonsson, Lingvall y Kaspersson, 1985),
ya que posee una elevada habilidad de
fermentación, se desarrolla en diversos
sustratos y cuando crece dentro del
material ensilado puede transformar del
75 al 80% de los carbohidratos solubles
en ácido láctico (Dellaglio, 1985).
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mente
los
carbohidratos
solubles
vegetales (Dellaglio y Santi, 1984).
A lo anterior se debe agregar que
Lindgren et al. (1983) observaron una
cooperación estrecha entre estos dos
microorganismos cuando se adicionan
juntos. Ambos son altamente resistentes
a la acidez, lo que les permite ocupar
una posición dominante con relación a
otros grupos presentes en el ensilaje
(Dulphy, 1985). Henderson y McDonaId
(1984) encontraron que al comparar la
efectividad de diferentes inoculantes, el
mejor fue el que utilizó estos dos
microorganismos.
2.000
1.800
K - Cepa 39
M - Cepa 47
Tabla 2. Grupo de bacterias seleccionadas
(grupo II) por presentar las mejores
características.
Bacteria
s
04
10
14
15
08
25
57
17
39
Temperatur
a
3
3
3
3
3
3
3
5
5
p
H
3
3
3
3
3
3
3
5
5
Azúca
r
4
4
4
4
4
4
4
4
4
L - Cepa 15
N - Cepa 14
K
Acide
z
4
4
5
5
4
4
4
5
4
L
M
N
1.600
Densidad óptica
1.400
1.200
1.000
0.800
0.600
0.400
0.200
0.000
61
122
183
244
305
366
427
488
549
610
t (min)
Fig. 3. Crecimiento de bacterias ácido lácticas (cocos).
65
Pastos y Forrajes, Vol. 14, No. 1, 1991
O - Cepa 17
P - Cepa 8
E - Cepa 25
Densidad óptica
2.000
1.800
O
1.600
P
1.400
E
1.200
1.000
0.800
0.600
0.400
0.200
0.000
61
122
183
244
305
366
427
488
549
610
t (min)
Fig. 4. Crecimiento de bacterias ácido lácticas (bacilos).
Tabla 3. Algunas características fisiológicas de 9 bacterias ácido lácticas.
No. de cultivo bacteriano
Determinaciones
4
+
8
+
10
+
14
+
15
+
17
+
25
+
39
+
57
+
3,6
4,1
3,8
3,7
3,7
3,5
3,7
3,3
3,7
+
+
+
+
+
+
+
+
+
4,0
3,8
3,8
3,9
3,8
3,9
3,9
3,9
3,9
Requerimientos de O2
-
-
+
+
-
-
-
-
-
Microaerófilos
+
+
-
-
+
+
+
+
+
Anaerobios facultativos
+
+
-
-
+
+
+
+
+
Cambio de coloración
-
-
-
-
+
+
+
+
+
Cambio parcial
+
+
+
+
-
-
-
-
-
Coagulación
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Acción sobre las proteínas
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Liquefacción de la gelatina
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Crecimiento a 35°C
pH a 35°C
Crecimiento a 48°C
pH a 48°C
Crecimiento en leche tornasolada
66
Pastos y Forrajes, Vol. 14, No. 1, 1991
Tabla 4. Producción de ácido láctico de las bacterias seleccionadas creciendo en medio de leche.
Réplicas
Bacteria
ml de NaOH consumidos
1
2
3
4
Valor medio
ml ácido láctico/kg leche
Lactobacillus plantarum
8,1
8,0
7,7
7,6
7,8
78,5
Pediococcus acidilactici
7,5
7,6
7,6
7,8
7,6
76,2
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Los resultados experimentales obteni.dos en este trabajo permiten concluir
que la metodología empleada en la
obtención de bacterias ácido lácticas
permitió realizar un estudio detallado de
un grupo importante de bacterias que
fueron clasificadas matemáticamente,
para definir los grupos con mayores
posibilidades de utilización.
Las bacterias del grupo II mostraron
las mejores características para ser
utilizadas como inoculante biológico y
dentro de ellas las cepas 17 y 39,
identificadas como Lactobacillus plantarum y Pediococcus acidilactici respectivamente.
Las bacterias L. plantarum y P.
acidilactici fermentaron los azúcares
fundamentales de los forrajes, crecieron
a las temperaturas estudiadas, fueron
ácido tolerantes y generaron una acidez
elevada, lo que unido a su rápido
crecimiento, las avala como potencialmente aptas para la inoculación de
ensilajes.
Por ello se recomienda pasar a la fase
de inoculación a escala experimental,
con el objetivo de determinar en la
práctica, el efecto de su uso sobre la
conservación en forma de ensilaje.
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