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UNIVERSIDAD DE COLIMA
MAESTRÍA EN CIENCIAS, ÁREA BIOTECNOLOGÍA
RIZOBACTERIAS Y HONGOS MICORRÍZICOS COMO AGENTES DE
CONTROL BIOLÓGICO DEL DAMPING-OFF EN PLÁNTULAS DE
Carica papaya L.
Tesis que para obtener el grado de
Maestro en Ciencias, Área Biotecnología
Presenta
LUIS GUILLERMO HERNÁNDEZ MONTIEL
Asesor Interno: Dr. Sergio Aguilar Espinosa
Asesor Externo: M.C. Andrés Adolfo Muñoz García
Tecomán, Colima, México
Febrero, 2004
1
ÍNDICE
Página
INDICE DE CUADROS
INDICE DE FIGURAS
RESUMEN......................................................................................................
1
ABSTRACT....................................................................................................
2
I. INTRODUCCIÓN ......................................................................................
3
2.1. Hipótesis ...............................................................................................
5
2.2. Objetivo general ................................................................................
5
2.2.1. Objetivo especifico ................................................................
5
III. REVISIÓN DE LITERATURA ......................................................................
6
3.1. El cultivo de papayo (Carica papaya L) ……………………...........
6
3.1.1. Damping-off, principal enfermedad en semillero ................
7
3.1.1.1. Fusarium sp. causante del damping-off …………….
8
3.1.1.2. Desarrollo de la enfermedad …………………………
10
3.1.1.3. Control de la enfermedad …………………………….
11
3.2. Rizobacterias y hongos micorrízicos con capacidad de
protección en las plantas ..............................................................
12
3.2.1. Mecanismos de protección de las rizobacterias en las
plantas ...................................................................................
12
3.2.1.1. Las rizobacterias y sus metabolitos implicados
en el control biológico de enfermedades ...........
13
3.2.2. Mecanismos de protección de los hongos micorrízicos
en las plantas .......................................................................
17
3.3. Interacción entre PGPR y HMA .........................................................
19
3.3.1. Efecto de las rizobacterias en la fisiología de los HMA ........
19
3.3.2. Efecto de los HMA en poblaciones de rizobacterias ...........
22
3.4. Efecto de la inoculación dual de PGPR y HMA en las plantas ....
23
IV. MATERIALES Y MÉTODOS .....................................................................
27
4.1. Trabajo en laboratorio ......................................................................
27
4.1.1. Aislamiento de Pseudomonas fluorescentes .........................
27
4.1.2. Pruebas para la selección de la mejor cepa de
Pseudomonas fluorescentes ..............................................................
27
2
4.1.2.1. Antibiosis in vitro de Pseudomonas fluorescentes
Vs. hongos fitopatógenos ..........................................
27
4.1.2.2. Identificación de rizobacterias productoras de
4.1.3.
ácido cianhídrico (HCN) ............................................
28
4.1.2.3. Producción e identificación de sideróforos .............
28
Selección
e
identificación
de
la
especie
de
Pseudomonas que logro el mayor rango de inhibición
contra los hongos fitopatógenos ...........................................
4.1.4.
Concentraciones
bacterianas
y
cuantificación
29
de
unidades formadoras de colonias (UFC) ..............................
29
4.1.5. Preparación del inoculo de HMA ...........................................
30
4.1.5.1. Propagación de los HMA .............................................
30
4.1.5.2. Clareo y tinción de raíces ............................................
30
4.1.5.3. Porcentaje de colonización micorrízica ....................
31
4.1.6. Aislamiento de hongos fitopatógenos causantes del
damping-off en plantas de Carica papaya L ......................
31
4.1.6.1. Inducción de la enfermedad ....................................
31
4.1.6.2. Aislamiento e identificación de fitopatógenos
causantes del damping-off .......................................
32
4.2. Trabajo en invernadero .....................................................................
32
4.2.1. Ubicación del área experimental ...........................................
32
4.2.2. Material vegetal ........................................................................
32
4.2.3. Sustrato utilizado .......................................................................
33
4.3. Fase experimental ..............................................................................
33
4.3.1. Experimento 1. Dosis respuesta de plantas de papayo
inoculadas
con
la
mejor
cepa
de
Pseudomonas
fluorescentes .............................................................................
33
4.3.1.1. Variables evaluadas en el experimento dosisrespuesta rizobacteria-papayo .................................
34
I) Altura y numero de hojas ........................................
34
II) Unidades formadoras de colonias (UFC) .............
35
III) Área foliar y biomasa .............................................
35
4.3.2. Experimento 2. Susceptibilidad de plántulas de Carica
3
papaya L al ataque de hongos fitopatógenos causantes
del damping-off .......................................................................
35
4.3.2.1. Variables a evaluar durante el desarrollo del
experimento de la susceptibilidad de Carica
papaya L al ataque de hongos fitopatógenos ......
36
I) Índice de severidad y necrosis ...............................
36
4.3.3. Experimento 3. Efecto de la inoculación dual de
fluorescentes
Pseudomonas
y
HMA
en
el
control
biológico del damping-off en plántulas de Carica
papaya L ...................................................................................
37
4.3.3.1. Variables a evaluar en el experimento sobre
inoculación dual de Pseudomonas fluorescentes y
HMA en el control biológico del damping-off en
plántulas de Carica papaya L ..................................
39
I) Altura y numero de hojas ........................................
39
II) Unidades formadoras de colonias (UFC) .............
39
III) Área foliar y biomasa .............................................
39
IV) índice de severidad y necrosis .............................
40
V) Por ciento de colonización micorrízica ...............
40
V. RESULTADOS ..........................................................................................
41
5.1. Selección de Pseudomonas .............................................................
41
5.1.1.
Aislamiento
de
Pseudomonas
fluorescentes
y
su
capacidad de inhibir el crecimiento de fitopatógenos
del suelo ....................................................................................
5.1.2.
Rizobacterias
con
capacidad
de
producir
41
ácido
cianhídrico ................................................................................
43
5.1.3. Sideroforo producido por la rizobacteria seleccionada ....
43
5.1.4.
Identificación
de
la
especie
de
Pseudomonas
seleccionada ..........................................................................
44
5.2. Identificación de los hongos causantes del damping-off en
plántulas de Carica papaya .............................................................
45
5.3. Respuesta de plántulas de papayo var. Maradol a la
inoculación con diferentes concentraciones de Pseudomonas
4
putida ...................................................................................................
46
5.3.1. Altura y número de hojas .........................................................
46
5.3.2. Área foliar y biomasa fresca y seca .......................................
48
5.3.3. Dinámica poblacional de P. putida y P. fluorescens de la
rizosfera de plántulas de papayo ............................................
49
5.4. Efecto de diferentes concentraciones de Fusarium oxysporum
en la susceptibilidad de plántulas de papayo var. Maradol en
vivero ..................................................................................................
50
5.4.1. Índice de Severidad y necrosis .............................................
50
5.5. Efecto de la inoculación dual de HMA y P.putida en plantas de
papayo para el control biológico del damping-off ....................
52
5.5.1. Altura y número de hojas ......................................................
52
5.5.2. Área foliar y biomasa fresca y seca .....................................
54
5.5.3. Índice de severidad y necrosis ..............................................
55
5.5.4. Evaluación de la colonización de HMA y P. putida en
plántulas de papayo .............................................................
57
VI. DISCUSIÓN .............................................................................................
59
6.1. Pseudomonas fluorescentes y su capacidad de inhibir in vitro el
crecimiento de Fusarium oxysporum y Pythium sp .........................
59
6.2. Efecto de diferentes concentraciones de Pseudomonas putida
y P. fluorescens en el crecimiento y desarrollo de plántulas de
papayo var. Maradol .........................................................................
61
6.3. Respuesta de plántulas de papayo var. Maradol a diferentes
concentraciones de Fusarium oxysporum ....................................
64
6.4. Efecto de la inoculación dual de HMA y P. putida en plantas
de papayo para controlar Fusarium oxysporum agente causal
del damping-off ................................................................................
67
VII. CONCLUSIONES ...................................................................................
74
VIII. LITERATURA CITADA ............................................................................
75
5
ÍNDICE DE CUADROS
Página
Cuadro 1
Participación
de
los
principales
municipios
productores de papaya en el Estado de Veracruz
(SAGARPA, 1999)
Cuadro 2
vida de los HMA (Fitter y Garbaye, 1994)
Cuadro 3
33
Descripción de los tratamientos para el experimento
dosis-respuesta
Cuadro 5
20
Análisis de las propiedades físico-químicas del sustrato
que se empleo en el desarrollo de los experimentos
Cuadro 4
6
Efecto de microorganismos del suelo sobre el ciclo de
34
Descripción de los tratamientos para evaluar que
concentración de conidias de Fusarium oxysporum
enfermaban a plántulas de papayo de damping-off
Cuadro 6
36
Escala propuesta por St-Arnaud et al. (1994) para
evaluar la severidad del damping-off en plantas de
Carica papaya L.
Cuadro 7
37
Escala propuesta por St-Arnaud et al. (1994) para
evaluar necrosis causado por damping-off en plantas
de Carica papaya L.
Cuadro 8
Descripción de los tratamiento para el experimento
final
Cuadro 9
42
Producción de biomasa fresca y seca de plántulas de
papayo inoculadas con rizobacterias
Cuadro 12
42
Halo de inhibición en mm cuantificado en diferentes
medios con rizobacterias y Pythium sp.
Cuadro 11
38
Halo de inhibición en mm cuantificado en diferentes
medios con rizobacterias y F. oxysporum
Cuadro 10
37
49
Producción de biomasa fresca y seca de plántulas de
papayo inoculadas con microorganismos
55
6
Cuadro 13
Porcentaje de colonización micorrizíca evaluado en
plantas de papayo a los 36 y 72 días después de la
inoculación (ddi) con HMA, P. putida y F. oxysporum
57
Cuadro 14
Unidades formadoras de colonias (UFC) cuantificadas
en plantas de papayo inoculadas con HMA, P. putida
y F. oxysporum
58
7
ÍNDICE DE FIGURAS
Página
Figura 1
Características
morfológicas
microscópicas
del
género Fusarium (Nelson et al., 1983)
Figura 2
9
Modelo propuesto sobre la absorción de fierro por
Pseudomonas fluorescentes (Elad y Chet, 1987; Morris
14
et al., 1992)
Figura 3
Espectro de absorción realizado para la identificación
del
sideróforo
producido
por
Pseudomonas
sp.
(rizobacteria número tres), la cual es antagonista a F.
44
oxysporum y Pythium sp.
Figura 4
Cuantificación de altura y número de hojas de
plántulas de papayo inoculadas con diferentes
concentraciones
de
Pseudomonas
putida
y
P.
47
fluorecens
Figura 5
Área foliar de plántulas de papayo cuantificada a los
54 días después de inoculadas las rizobacterias (P.
putida
y
P.
fluorecens)
con
diferentes
concentraciones. Las barras con la misma letra son
estadísticamente iguales (P <0.05)
Figura 6
48
Dinámica poblacional de P.putida y P. fluorecens en
la rizosfera de plántulas de Carica papaya L evaluado
50
durante 54 días
Figura 7
Dinámica de severidad y necrosis evaluadas en
plantas de Carica papaya inoculadas con diferentes
concentraciones de conidios de Fusarium oxysporum
agente causal del damping-off
Figura 8
51
Altura y número de hojas cuantificadas a lo largo de
72 días en plántulas de papayo inoculadas con el
complejo
micorrízico
MTZ-1,
P.
putida
(en
concentraciones de 104 y 109 cel—mL-1) y F. oxysporum
(con 7 conidios/g de suelo seco)
53
8
Figura 9
Área foliar de plántulas de papayo cuantificada a los
72 días después de inoculados los microorganismos
(HMA, P. putida y F. oxysporum). Las barras con la
misma letra son estadísticamente iguales (P <0.05)
Figura 10
54
Dinámica de severidad y necrosis evaluadas durante
72 días en plantas de Carica papaya inoculadas con
HMA, P. putida y Fusarium oxysporum
56
9
RESUMEN
Para evaluar el efecto protector entre rizobacterias (PGPR) y hongos
micorrízicos (HMA) sobre la severidad del damping-off en papayo, se
aislaron 56 rizobacterias nativas. De las cuales se seleccionaron con base a
la producción de pigmento amarillo-verdoso 8, evaluando su capacidad
antagónica in vitro contra Fusarium oxysporum y Pythium sp., sobresaliendo
la rizobacteria número 3 con halos de inhibición de hasta 10 mm,
identificándose como Pseudomonas putida, la cual se inoculo en plántulas
de papayo bajo diferentes dosis (109, 108, 106 y 104 cel—mL) utilizando una P.
fluorescens (A9) de referencia, obteniendo diferencias significativas (Tukey,
P<0.05), cuantificando incrementos con la rizobacteria nativa y la dosis mas
baja en comparación de A9. Otro experimento se realizo para conocer el
número de conidias de F. oxysporum (3, 5 y 7 conidias/g de suelo seco)
con las cuales plantas de papayo se enfermarían de damping-off, el
análisis estadístico mostró diferencias significativas (P<0.05), siendo la dosis
mas alta la que presento mayor tasa de severidad y necrosis,
cuantificando al final una mortandad del 100%. Por último plántulas de
papayo fueron inoculadas con P. putida y HMA (MTZ-1) para conocer su
efecto protector a F. oxysporum, el análisis estadístico mostró diferencias
significativas (Tukey, P<0.05), siendo las plantas más patógeno las que
mayor índice de severidad y necrosis tuvieron, el tratamiento patógeno, P.
putida y HMA tuvo la menor tasa de severidad y necrosis. Por lo que la
protección ejercida por estos dos microorganismos fue tan eficaz, que
posiblemente se deba a un efecto sinérgico entre ellos lo que este
haciendo que sus mecanismos de defensa hacia las plantas se estén
potencializando.
10
ABSTRACT
In order to know the protective effect between rhizobacterial (PGPR) and
mycorrhizal fungi (HMA) on severity damping-off in papaya, 56 native
rhizobacterias were isolated, selecting them bases on the yellow-greenish
pigment production 8, evaluating their antagonistic capacity in vitro
against Fusarium oxysporum and Pythium sp., excelling rhizobacteria 3 with
halos inhibition of up to 10 mm, identifying
Pseudomonas putida,
as
inoculated in plants of papaya under different doses (109, 108, 106 and 104
cel—mL) using P. fluorescens (A9) from reference, obtaining significant
differences (Tukey, P<0.05), quantifying increases with rhizobacteria native
and the low dose in comparison of A9. Another experiment was done in
order to know the number of conidias of F. oxysporum (3, 5 and 7
conidias/g dry ground) with which plants of papayo would become ill of
damping-off, the statistical analysis showed significant differences (P<0.05),
being the highest the dose one that presented display greater rate of
severity and necrosis, quantifying in the end a loss of 100%. Finally plants of
papaya were inoculated with P. putida and HMA (MTZ-1) to know their
protective effect F. oxysporum, the statistical analysis showed significant
differences (Tukey, P<0.05), being the pathogenic most plants those with
greater index of severity and necrosis, the treatment of pathogenic, P.
putida and HMA had the smaller rate of severity and necrosis. That is why
the protection exerted by these two microorganisms was so effective,
maybe because of the sinergic effect among them what is doing that their
mechanisms of defense towards the plants are being elevating.
11
I. INTRODUCCIÓN
En el mercado mundial el cultivo del papayo (Carica papaya L.), se
considera un frutal de importancia económica por su alta rentabilidad y la
gran aceptación de sus frutos (PROFRUTA, 1999). Este cultivo se desarrolla
de manera adecuada en lugares donde la precipitación pluvial oscila
entre 1500 a 2000 mm anuales, siendo las plantas jóvenes (desarrolladas
durante etapa de vivero) las que requieren más agua que las plantas
adultas, sin embargo, este cultivo es muy sensible a contenidos de
humedad altos en el suelo, lo que ocasiona retrasos en el desarrollo
durante las diferentes etapas fenológicas, ocasionando pudrición de raíces
e inclusive la pérdida total (Arrieta y Carrillo, 2002).
De entre los hongos que causan las enfemedades fungosas que originan
importantes pérdidas al nivel de vivero destacan los géneros: Fusarium,
Pythium, Rhizoctonia, Phytophthora, entre otros, los cuales invaden el
sistema radicular de las plantas, obstruyendo principalmente los vasos
vasculares, ocasionando amarillamiento de hojas y estrías necróticas de
color marrón en la base del tallo a nivel del suelo, originado un
ahorcamiento denominado comúnmente “damping-off” ó secadera de
los viveros, el cual trae como consecuencia la muerte de las plantas,
originando pérdidas importantes en esta etapa del cultivo (Nishina et al.,
2000).
Tradicionalmente el control de estos patógenos se lleva a cabo con dos
métodos; el primero de ellos se basa en la utilización de fungicidas (como
benlate, manzate, captan, entre otros), los cuales se aplican en intervalos
de cada siete días durante el lapso que dura la planta en ese estadio,
elevando los costos de producción del cultivo (Latorre, 1999; Yagüe, 1999),
y el segundo que es el más utilizado hasta ahora, sobre todo en tierras más
12
o menos infestadas por estos patógenos, es la desinfección del suelo con
fumigantes de amplio espectro. El bromuro de metilo ha sido el
desinfectante más eficaz pero su aplicación es cara y, como ya es
conocido por todos, por los problemas medio ambientales y de residuos
que produce, tras el protocolo de Montreal, existe el acuerdo de restringir
su utilización progresivamente hasta el año 2005 en que estará prohibido su
uso (Monera, 1999).
Ante tales casos existe el aprovechamiento de ciertas tecnologías con un
alta grado científico que pueden ofrecer soluciones a estos problemas, las
cuales se encuentran íntimamente ligadas a la producción agrícola sin
causar algún daño a la naturaleza (Torres, 1996), es decir, mantiene un
equilibrio entre el suelo, biota y medio ambiente (Vandermeer, 1995). La
biotecnología que se utiliza en estos procesos involucra el manejo de
agentes microbianos capaces de fijar nitrógeno atmosférico, bacterias
promotoras
del
crecimiento
vegetal,
hongos
micorrízicos,
agentes
antagónicos en el control biológico de plagas y enfermedades de las
plantas, siendo factible de esta manera la disminución de agroquímicos y
funguicidas, contribuyendo a la sostenibilidad de los sistemas productivos y
del entorno ecológico (Ferrera-Cerrato, 1995).
El control biológico de enfermedades de las plantas se ha practicado
mediante la inoculación de estos microorganismos en la rizosfera con el fin
de mejorar la sanidad y la productividad de los cultivos, entre los
sintetizados biológicos producidos por estos organismos se encuentran los
sideroforos, ácido cianhídrico y antibióticos, destacando a las bacterias y
hongos,
como
los
dos
grupos
mas
importantes
antagónicos
a
fitopatógenos (Barea, 1998), por lo que su utilización de manera conjunta
posiblemente integren una serie de mecanismos beneficiosos de defensa
13
que repercutirán en la sanidad vegetal de las plantas, por lo que este tipo
de interacciones microbiológicas pueden ser objetivos principales a
abordar en el campo de la investigación agrícola (Azcón, 2000),
basándose en este hecho donde las interacciones entre microorganismos
benéficos del suelo pueden potencializar su acción protegiendo a las
plantas contra patógenos del suelo, se planteo en este trabajo de
investigación la siguiente hipotesis y objetivos:
2.1. Hipotesis
Si las rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPR) y los hongos
micorrízicos arbusculares (HMA) ejercen un papel como agentes de control
biológico de manera individual, entonces la acción conjunta incrementara
su eficiencia, disminuyendo la severidad del damping-off en plántulas de
papayo.
2.2. Objetivo general
Conocer el efecto conjunto entre rizobacterias promotoras del crecimiento
vegetal (PGPR) y hongos micorrízicos arbusculares (HMA) en la disminución
de la severidad del damping-off en plántulas de papayo.
2.2.1. Objetivo específico
Cuantificar
el
efecto
conjunto
entre
rizobacterias
promotoras
del
crecimiento vegetal (PGPR) y hongos micorrízicos arbusculares (HMA) en el
control biologico del damping-off ocasionado por Fusarium oxysporum en
plántulas de papayo.
14
III. REVISIÓN DE LITERATURA
3.1. El cultivo de papayo (Carica papaya L)
Se estima que la producción mundial de frutas tropicales para el año 2000
fue de 61.4 millones de toneladas, de las cuales, la papaya aportó cerca
de 8.4 millones de toneladas, siendo América Latina y el Caribe los
principales productores de esta fruta con cerca de la mitad de la
producción mundial. México es uno de los principales países productores
de esta fruta con mas de 361,274 toneladas, ocupando el Estado de
Veracruz el primer lugar con aproximadamente 239,890 toneladas (66.4%
de la producción nacional) seguido por los estados de Jalisco y
Michoacán con 39,647 y 37,330 toneladas, respectivamente (FAO, 2001).
Los principales municipios productores dentro de la entidad veracruzana
son Paso de Ovejas, Puente Nacional, Manlio F. Altamirano y Soledad de
Doblado, con cerca del 60% de la producción de este estado (Cuadro 1)
(SAGARPA, 1999).
Cuadro 1. Participación de los principales municipios productores de
papaya en el Estado de Veracruz (SAGARPA, 1999).
Municipio
Paso de Ovejas
Tierra Blanca
Puente Nacional
Soledad de Doblado
Manlio F, Altamirano
Cotaxtla
Actopan
Isla
Otros
Superficie
sembrada (ha)
2313
1990
1860
1147
1112
572
549
410
3779
Producción (ton) Participación
(%)
81480
23.24
16377
4.67
65380
18.65
28600
8.16
29650
8.46
14352
4.09
16840
4.80
24600
7.02
73375
20.91
15
Sin embargo y a pesar que la producción de papaya origina importantes
divisas para los principales países productores del mundo en vías de
desarrollo como México, Brasil, Nigeria, Tanzania y Zaire; los niveles de
tecnología para su manejo son inadecuados sobre todo para el control de
plagas y enfermedades, maleza y manejo poscosecha del fruto, los cuales
representan perdidas importantes para el cultivo desde el semillero hasta
campo (Malo y Campbell, 1994; Smith et al., 1995). Por lo que toda
investigación que se pueda realizar en el ámbito regional, estatal y
nacional en nuestro país para coadyuvar en estos problemas importantes
que disminuyen la producción, aumentara notablemente los rendimientos
que ayudarán a lograr un dominio en la producción de esta fruta en el
mercado mundial, trayendo grandes beneficios tanto para Veracruz como
para México (Gheno, 1998).
3.1.1. El damping-off, principal enfermedad en semillero
Unos de los problemas más importantes que atacan al cultivo del papayo
(Carica papaya L) en semillero es la enfermedad conocida como
damping-off, secadera o mal del talluelo, que es causada por patógenos
del suelo como Fusarium sp., Phytophthora sp., Pythium sp., Rhizoctonia sp.,
entre otros, todos ellos ocasionan pudriciones de raíz y tallo, surgiendo
síntomas alarmantes ya que la destrucción de estos órganos es tan rápida
y letal que da como resultado la muerte de las plantas (Saldaña et al.,
1985; Venette y Gross, 1992; Sánchez, 1994).
Estos hongos son parásitos no obligados que viven, se desarrollan y
propagan en el suelo, comúnmente localizados en climas tropicales donde
la humedad del suelo es ideal para su crecimiento y desarrollo,
reproduciéndose por medio de micelio o conidios (Agrios, 1998).
16
3.1.1.1. Fusarium sp. causante del damping-off
El interés de los patólogos por Fusarium sp. empieza en los años 80´s,
debido a su amplio espectro de ataque principalmente en plantas
vasculares de interés agronómico, las cuales destruía en poco tiempo
(Kistler, 1997). Dentro de este tipo de hongo imperfecto, las especies más
importantes que causan marchitamiento vascular, pudriciones a las
semillas, plántulas (ahogamiento), pudriciones de raíz, tallos inferiores,
tubérculos, coronas y bulbos, son Fusarium solani, F. roseum y F. oxysporum,
destacando este ultimo por su gran agresividad, atacando diversos cultivos
como café, plátano, caña de azúcar, papayo, pastos, la mayoría de las
hortalizas anuales y herbáceas perennes de ornato, entre otros (González,
1989; Ocamb y Comedla, 1994; Rekah et al., 1999).
Pertenece a la División Ascomycota, Clase Euascomycetes, Orden
Hypocreales y Familia Hypocreaceae. Se propaga por el suelo en forma de
micelio, en ocasiones por esporas, conidios o esclerocios, los cuales son
llevados por el agua, viento, herramienta agrícola, trasplantes, semillas o
esquejes de plantas infectadas y algunas veces por insectos, sobreviviendo
por meses o incluso años dependiendo del tipo de suelo y de las
condiciones ambientales (Gordon et al. 1992; Freeman et al., 2002).
Su marcada variabilidad en cuanto a sus características fisiológicas y
morfológicas explica su capacidad para colonizar diversos nichos
ecológicos diseminados por todo el mundo, actualmente la mayoría de
estas especies están clasificadas con base a sus características macro y
microscópicas del cultivo como el tipo de clamidosporas, monofialide,
conidias, macroconidias, entre otros (Figura 1), siendo su morfología la
clave para su identificación, debido a que su forma es constante y estable
17
cuando el hongo crece en substratos naturales y/o condiciones estándar
(Monzón y Rodríguez, 1999).
esporodoquia
Monofialide con
microconidias en
masa
polifialides
célula apical
Monofialide con cadena de
microconidias
macroconidias
microconidias
clamidosporas
célula basal
Figura 1. Características morfológicas microscópicas del género Fusarium
(Nelson et al., 1983)
De las diversas especies de Fusarium, la especie oxysporum es la mas
común debido a que su distribución es universal, se aísla como saprófito
del suelo y de numerosas plantas (cereales, soja, algodón, papayo,
plátano, cebolla, papa, manzana, etc.), como fitopatógeno causa
grandes pérdidas económicas, sus microconidias son ovoides o en forma
de riñón, con un tamaño de 5-12 x 2,3-3,5 µm y, ocasionalmente, con uno o
dos tabiques. Nacen de monofiálides laterales, cortas y anchas, afiladas
hacia la punta, con collaretes poco definidos, solitarias o ramificadas. Las
microconidias pueden formar masas (simulan cabezas) pero nunca
cadenas. Las macroconidias tienen de uno a cinco septos. Su tamaño es
de 23-54 x 3-4,5 µm. Tienen forma de media luna, ligeramente curvadas,
18
con pared fina y delicada. Su célula apical es afilada y la célula basal con
forma de pie pero pueden tener ambos extremos afilados. En la mayoría
de los cultivos las clamidosporas son abundantes. Son grandes, hialinas, de
pared lisa o rugosa y pueden observarse aisladas o en parejas, intercalares
o terminales (Nelson et al., 1994; Monzón y Rodríguez, 1999).
Este hongo se presenta en regiones templadas y cálidas, ya sea en los
trópicos y subtrópicos, principalmente en suelos arcillosos, con pobre
aireación, mal drenaje y una humedad muy alta, llegando a ser menos
dañinos o raros en climas fríos, puede sobrevivir en el suelo por tiempo
indefinido, haciendo su control casi imposible o ineficiente, siendo la forma
más efectiva el uso de variedades vegetales resistentes las cuales se
pueden mantienen por un periodo largo de tiempo sin ser afectadas por
este tipo de patógenos del suelo (Smiley y Uddin, 1992; Gracia-Garza y
Fravel, 1998; Baird y Carling, 1998).
3.1.1.2. Desarrollo de la enfermedad
La forma de invadir de este fitopatógeno empieza cuando los tubos
germinales de las esporas o el micelio existente en el suelo penetra por la
raíz o por alguna herida al nivel de las raíces de las plantas, propagándose
dentro de la corteza de la raíz, llegando a los vasos xilémicos, donde se
mantiene en ese sitio viajando a través de ellos de forma ascendente
hacia toda la planta. El micelio se ramifica y produce microconidios, los
cuales causan una obstrucción de los vasos, dando como resultado una
alteración en un volumen mínimo de agua disponible para las hojas y
funcionamiento de la planta, trayendo como consecuencia cierre de los
estomas, hojas marchitas y la muerte del resto de la planta (Smith et al.,
1992; Skovgaard et al., 2001).
19
3.1.1.3. Control de la enfermedad
Los problemas causados por este tipo de enfermedades del suelo en el
cultivo de papayo ha sido siempre una de las limitaciones más importantes
en
su
manejo,
tradicionalmente
el
control
de
estos
organismos
fitopatógenos se ha basado en la utilización de plaguicidas sumamente
tóxicos, los cuales a través de los años permanecen activos por tiempos
indefinidos en el suelo, trayendo como consecuencia un problema de
contaminación ambiental en perjuicio tanto para el agroecosistema como
para la salud del hombre (Rodríguez-Kabana, 1990; Lloyd, 1992; Hamm,
2001).
Actualmente existen alternativas de manejo de los cultivos mediante la
biotecnología aplicada la cual ofrece soluciones a estos problemas
mediante el aprovechamiento de ciertas tecnologías con un alto grado
científico, las cuales se encuentran íntimamente ligadas a la producción
agrícola sin causar algún daño a la naturaleza (Torres, 1996), manteniendo
un equilibrio entre el suelo, biota y medio ambiente (Vandermeer, 1995).
Involucrando en estos procesos el manejo de agentes microbianos
capaces
de
fijar nitrógeno atmosférico, bacterias
promotoras del
crecimiento vegetal, hongos micorrízicos, agentes antagónicos en el
control biológico de plagas y enfermedades de las plantas, producción de
compostas y vermicompostas, siendo factible de esta manera la
disminución
de
agroquímicos
y
plaguicidas,
contribuyendo
a
la
sostenibilidad de los sistemas productivos y del entorno ecológico (FerreraCerrato, 1995; Jonson y Dileone, 1999). Aunque en México es poco el uso
de agentes microbianos contra patógenos de plantas (Zavaleta-Mejía,
1996), el control biológico se ha practicado mediante el empleo de
20
bacterias y hongos los cuales han demostrado ser altamente eficientes en
el control de estos organismos (Barea, 1998).
3.2. Rizobacterias y hongos micorrízicos con capacidad de protección en
las plantas
Dentro de la gama de microorganismos que habitan en el suelo e
interactúan con las plantas existen algunos grupos con capacidad para
controlar e inhibir a fitopatógenos, destacando a las rizobacterias (PGPR) y
los
hongos
micorrízicos
arbusculares
(HMA)
como
los
organismos
antagónicos más importantes encontrados en el suelo, ya que a través de
los años se ha reportado que estos organismos son capaces de proteger a
las plantas mediante contra diversos patógenos del suelo como Phytium
sp., Phytophthora sp., Rhizoctonia sp., Fusarium sp., entre otros (AzcónAguilar y Barea, 1996a; Rosales et al., 1995; Wei et al., 1996; Barea, 1998;
Raupach y Kloepper, 1998).
Sin embargo generalmente el uso de rizobacterias y hongos micorrízicos en
las plantas como agentes de control biológico ha sido de manera
individual por lo que si se llegaran a inocular de manera simultánea estos
dos microorganismos en las plantas probablemente se pudieran generar
una serie de mecanismos beneficiosos que repercutirían en la sanidad
vegetal,
considerando
estas
interacciones
objetivos
principales
de
investigación a abordar en ambientes naturales y agrícolas (Hamel, 1996;
Larkin et al., 1998; Azcón, 2000; Mar et al., 2000).
3.2.1. Mecanismos de protección de las rizobacterias en las plantas
Kloepper y Schroth (1978) clasificaron a las rizobacterias como PGPR (plant
growth promoting rhizobacteria, por sus siglas en ingles) o rizobacterias
21
promotoras del crecimiento vegetal, la cual según Schroth y Hancock
(1982) definieron como un organismo con alta agresividad para colonizar a
las raíces de las plantas, siendo este proceso de colonización el que
desplazaba eficientemente a otros microorganismos del suelo ejerciendo
un control de fitopatógenos del suelo.
Sin embargo a través de los años las investigaciones han demostrado que
estos no solo desplazan de manera eficiente a otros organismos sino que
también pueden generar diferentes vías de protección para las plantas
mediante la producción de metabolitos como los sideróforos, ácido
cianhídrico (HCN), antibióticos (como el 2,4-Diacetilfloroglucinol) e incluso
reportes recientes indican que las rizobacterias inducen un sistema de
resistencia (ISR) en las plantas, que hace que estas puedan sobrevivir al
ataque de diversos patógenos del suelo (Bagnasco et al., 1998; Zehnder et
al., 2000; Park y Kloepper, 2000; Mavrodi et al., 2001; Whipps, 2001).
3.2.1.1. Las rizobacterias y sus metabolitos implicados en el control
biológico de enfermedades
Ambrosi et al. (2000) y Mercado-Blanco et al. (2001), mencionan que la
eliminación principalmente de patógenos por las rizobacterias se debe a la
producción de sideróforos que estos microorganismos sintetizan cuando
existe una baja cantidad de fierro en el suelo, estos metabolitos son
compuestos de bajo peso molecular afines al ion Fe³+ (Telford y Raymond,
1997) que permite atraparlo y absorberlo a través de una membrana
receptora, esta producción esta regulada por tres genes; el sid B que se
encarga de bio-sintetizar el sideroforo, el sid U que lo absorbe y el sid R el
que regula la entrada y salida del compuesto (O´Sullivan y O´Gara, 1992)
(Figura 2).
22
Cromosoma
Activador
+
sid B
sid U
sid R
Represor
__
+
Fe2+
Sideroforo
fluorescente
Membrana receptora
sideroforo-fierro
Fe3+
Figura 2. Modelo propuesto sobre la absorción de fierro por Pseudomonas
fluorescentes (Eland y Chet, 1987; Morris et al., 1992)
Una vez que el fierro ingresa a la bacteria este es convertido de ion Fe³+ a
Fe2+ por medio de una reacción enzimática de óxido-reducción, el cual
una vez reducido lo utiliza para su crecimiento y desarrollo (Kloepper,
1993). Al atrapar (quelar) la rizobacteria a este micronutrimento del suelo
hace que este elemento no este disponible para otros microorganismos
que carezcan del sistema de asimilación, o bien que su sideroforo posea
una menor afinidad por el fierro, lo que asegura que la rizobacteria sea la
única capaz de asimilarlo limitando así el crecimiento de otros organismos,
ejerciendo de esta manera el control biológico de enfermedades
importantes como Fusarium sp. (Duijff et al., 1999; Landa et al., 2001),
Pythium sp., Rhizoctonia sp. (Mahaffee y Backman, 1993; Rankin y Paulitz,
1994), y Phytophthora sp., (Liu et al., 1995). Siendo las Pseudomonas
fluorescentes las que particularmente expresan un potencial como
23
agentes de control biológico al ser productoras de diversos sideróforos
como pseudobactinas, ferribactinas, pioverdinas, pioquelinas, tioforminas,
entre otros (Andriollo et al., 1992; Cook, 1993; Raaijmakers et al., 1995;
Moënne-Lloccoz et al., 1996; Duffy y Défago, 1999; Boer et al., 1999).
Otro de los compuestos microbianos que producen las rizobacterias es el
ácido cianhídrico (HCN) (Schippers, 1988), el cual juega un papel muy
importante como supresor de fitopatógenos del suelo, sin embargo esta
inhibición de otros microorganismos también afecta el crecimiento de las
raíces de las plantas (Bakker y Schipper, 1987; Voisard et al., 1989; Ästrom,
1991; Kunz et al., 1998).
Sin embargo este efecto negativo algunas veces puede ser beneficioso
para las plantas, debido a que el HCN inhibe la oxidación del citocromo
en el proceso de respiración, el cual a su vez retrasa la oxidación de
electrones NADH en la mitocondria reduciendo los niveles de respiración,
haciendo que las plantas sufran de estrés lo que hace modificar su
metabolismo permitiéndole generar mecanismos de resistencia sistemica
que la ayudan indirectamente a tolerar el ataque de fitopatogenos del
suelo (Wei et al., 1991; Kloepper et al., 1997 y Pieterse et al., 2001).
Las rizobacterias pueden inducir alteraciones en la fisiología de la planta,
haciendo que se incrementen las defensas induciendo un sistema de
resistencia en las plantas (Leeman et al., 1995; Hoffland et al., 1996; Han et
al., 2000). Las diferencias de la resistencia sistémica inducida (RSI) como
antagonista en comparación con un mecanismo de control biológico son
los siguientes:
24
a) La acción de la RSI esta basada en el mecanismo de defensa de la
planta que puede ser activada o inducida por agentes externos, mientras
que los antagonistas tienen una función directa en el control biológico de
agentes patógenos por medio de antibióticos, sideroforos y ácido
cianhídrico (HCN) o como competidores de nutrientes (Wei et al., 1996;
Chen et al., 1999a)
b) La RSI una vez expresada, activa un potencial múltiple de mecanismos
de defensa como lo es el incremento de la actividad de citocininas,
proteínas, ácido salicílico, producción de sustancias antimicrobianas de
bajo peso molecular (ejemplo las fitoalexinas) (Rosales et al., 1995; Chen et
al., 1999b) y la formación de biopolímeros de protección (ejemplo la
lignina, celulosa y glicoproteínas) (Bloemberg y Lugtenberg, 2001) y,
c) Un aspecto importante de la RSI es el amplio espectro de patógenos
que puede controlar con solo inducir este sistema, en pepino controlaron
trece patógenos (entre hongos, bacterias y virus) que ocasionaban
necrosis
en
las
hojas,
mientras
que
un
organismo
antagonista
generalmente no puede disminuir el ataque de diversos patógenos
(Kloepper et al., 1992; Pieterse et al., 2001).
Finalmente algunas rizobacterias principalmente del género Pseudomonas
sp. tienen la capacidad de producir antibióticos los cuales están
involucrados directamente con la inhibición de otros microorganismos del
suelo, como ejemplo de estos compuestos tenemos al poliquetido 2,4Diacetilfloroglucinol (DAPG), omicina, fenazina, pirrolnitrina, pioluteorina,
entre otros, los cuales han mostrado ser altamente eficiente en el control
biológico de fitopatógenos (Handelsman y Stabb, 1996; Raaijmakers et al.,
25
1999; Schnider-Keel et al., 2000; Mavrodi et al., 2001; Moënne-Loccoz et al.,
2001; Notz et al., 2001).
3.2.2. Mecanismos de protección de los hongos micorrizicos en las plantas
Los hongos micorrízicos arbusculares (HMA) han sido reportados como
microorganismos que ejercen un efecto supresivo contra patógenos que
causan enfermedades en las raíces de las plantas (Azcon-Aguilar y Barea,
1996b; Trotta et al., 1996, Larsen y Bodker, 2001). Algunos autores
mencionan que estos mecanismos de control biológico están relacionados
con cambios en la morfología, fisiología y bioquímica del hospedero, las
alteraciones morfológicas se reportan que están relacionadas con la
lignificación de la pared celular de las plantas, donde resulta difícil la
penetración del tejido por los patógenos del suelo (Cordier et al., 1998),
fisiológicamente el incremento en la concentración de fósforo y potasio en
los tejidos de las plantas, haciéndolas menos susceptibles
a las
enfermedades del suelo (Graham, 1983) y finalmente bioquímicamente,
por que la asociación micorrízica eleva los contenidos de aminoácidos
(como la arginina y fenilaminas), fenoles, ligninas, flavonoides (fitoalexinas)
y enzimas como la quitinasa, encontrados algunos de ellos tanto en el área
foliar como en el sistema radical desencadenan con esto un sistema de
resistencia en las plantas lo que les permite resistir el ataque de los
patógenos del suelo (Sieverding, 1991; Scharff et al., 1997; Benabdellah et
al., 1998; Dais et al., 1998; Fusconi et al., 1999; Slezack et al., 1999).
Al respecto Young y Hwang (1994), reportan que la resistencia de las
plantas hacia el ataque de los fitopatógenos se debe en gran medida a la
presencia de proteínas dentro del hospedero, las cuales tienen un papel
importante en el impedimento del desarrollo de la enfermedad hacia los
tejidos vegetales de las plantas. Sin embargo Gianinazzi-Pearson et al.,
26
(1996) y David et al. (1998), encontraron que los hongos micorrizicos
pueden suprimir la presencia de proteínas dentro del hospedero. Por su
parte Shaul et al. (1999), analizan si esta interferencia en la activación de
proteínas se restringe solo a la zona infectada o colonizada, por lo que es
importante conocer si estos endófitos inducen o suprimen la expresión de
los mecanismos asociados a la resistencia de las plantas.
En los últimos años los investigadores se han enfocado en la búsqueda de
los genes que estan íntimamente ligados con la expresión de la defensa de
las plantas micorrizadas hacia el ataque de los fitopatógenos, incluyendo
los genes que codifican enzimas hidrolíticas como las quitinasas y β-1,3glucanasas (Lambais y Mehdy, 1995; Blee y Anderson, 1996; Pozo et al.,
1999). La inducción de estas enzimas por los HMA han tomado mayor
atención debido a su posible implicación en la regulación de la simbiosis
hongo-hospedero y a la protección de las plantas (Azcon-Aguilar y Barea,
1996c; Dumas-Gaudot et al., 1996; Lambais y Medí, 1996; Pozo et al., 1998).
Ambas, quitinasas y β-1,3-glucanasas son compuestos biológicos con
diferentes formas y características químicas, actividades enzimaticas,
localización celular y propiedades antifúngicas las cuales pueden estar
expresadas en diferentes órganos y tejidos de las plantas, estas enzimas
juegan un papel importante en la hidrólisis de la pared celular de los
hongos fitopatógenos, considerándose importantes en los mecanismos de
defensas de las plantas contra estos hongos (Simmons, 1994; Kim y Hwang,
1997).
Caron (1989) y Cordier et al., (1996), señalan que otro de los mecanismos
por el cual los HMA pudiera ejercer una influencia en los patógenos del
suelo, es debido a que al penetrar a las raíces de la planta hospedera
otorga una protección contra la penetración de las hifas o micelio de otros
hongos especialmente los fitopatógenos, obstaculizando sus procesos de
27
infección hacia la raíz inhibiendo su crecimiento y por consecuencia
disminuyendo su capacidad de invasión hacia la planta. Otro mecanismo
indirecto que pudiera beneficiar a las plantas micorrizadas contra el
ataque de los patógenos es su mejora en la nutrición, ya que una vez que
las plantas están colonizadas por estos microorganismos estas presentan un
mayor crecimiento y desarrollo que aquellas no inoculadas, debiéndose
principalmente a que esta simbiosis incrementa la capacidad de las raíces
para absorber fósforo y otros iones poco móviles del suelo como el cobre,
zinc, magnesio, azufre, manganeso, cloro, hierro, calcio, nitrógeno, boro y
molibdeno (Cooper, 1984; Chen et al., 1999; Hawkins et al., 1999; Jakobsen
et al., 2001).
3.3. Interacción entre PGPR y HMA
3.3.1. Efecto de las rizobacterias en la fisiología de los HMA
En años recientes se ha encontrado que las rizobacterias juegan un papel
muy importante en el desarrollo y crecimiento de los HMA, influyendo de
manera directa en la germinación de espora (Mayo et al., 1986; Paulitz y
Linderman, 1989; Wilson et al., 1989), estimulación del crecimiento del
micelio externo, incremento en el establecimiento de los HMA en el
hospedero, entre otros, sin embargo también pueden inhibir o aumentar el
número de estos propágulos infectivos en la rizosfera y el porciento de
colonización de las plantas (Daniels y trappe, 1980; Gryndler y Vosátka,
1996; Toro et al., 1997; Budi et al., 1999; Vosátka y Gryndler, 1999).
Linderman
(1988)
y
Frey-Klett
et
al.,
(1999),
comentan
que
el
establecimiento y colonización de los HMA sobre el hospedero aumenta
significativamente cuando estos dos microorganismos son inoculados de
manera dual en las plantas, incrementando la eficiencia de estos endofitos
28
en las plantas. Por su parte Azcon (1987), reporta resultados parecidos al
mencionar que las rizobacterias tienen un efecto directo en el incremento
de la colonización del hospedero y germinación de las esporas, un ejemplo
de esto es lo encontrado por Fester et al., (1999) cuando la colonización
micorrízica alcanzada solo con Glomus intraradices fue de 20%, mientras
que
la
co-inoculación
con
Pseudomonas
fluorescens,
Rhizobium
leguminosarum y Agrobacterium rhizogenes aumentó la colonización en un
40%, 50% y 60%, respectivamente.
Singh y Kapoor (1999), encontraron resultados similares cuando los
porcentajes de colonización aumentaron en plantas de trigo que fueron
inoculadas
en
forma
conjunta
con
PGPR
y
HMA
(Glomus
sp.),
incrementándose también los contenidos de nitrógeno, fósforo y biomasa
total en las plantas. Por su parte Fitter y Garbaye (1994), explican que el
efecto principalmente de las rizobacterias sobre los HMA está en el ciclo
de vida de estos últimos (Cuadro 2).
Cuadro 2. Efecto de microorganismos del suelo sobre el ciclo de vida de
los HMA (Fitter y Garbaye, 1994)
Fase
Proceso
Efecto
Microorganismo
Germinación de Químico
Inhibitorio
Bacteria
esporas
Colonización
Interacción
Estimulación
Bacteria
Cobertura hifal
Incierto
Inhibitorio
Hongos y nematodos
Crecimiento hifal Incierto
Desconocido Invertebrados
Esporulación
Desconocido Estimulación
Bacteria
Azcon y Barea (1985) y Gryndler et al., (1995), reportan que el uso de
esporas desinfectadas de HMA dan como resultado un desarrollo nulo por
parte de estos endófitos, lo que sugiere que la microflora bacteriana
contenida en la superficie de la espora es importante para el desarrollo del
29
hongo tanto en el suelo como en la raíz. Resultados que concuerdan con
los reportados por Schreiner y Koide (1993), quienes desinfectaron esporas
de Glomus etunicatum con el antibiótico estreptomicina, las cuales fueron
inoculadas en plantas de lechuga, encontrando que el efecto de la
desinfección de la espora trajo como consecuencia una disminución en el
crecimiento del hospedero, baja absorción de fósforo y poca colonización
de este endofito, lo que sugiere que al eliminar los microorganismos
(principalmente bacterias) adheridos a la superficie de la espora disminuye
la respuesta de los HMA en sus procesos de colonización de la raíz.
Bianciotto et al., (1996), revelan que existen bacterias que habitan
intercelularmente dentro de las esporas de los HMA, las cuales viven, se
reproducen y se mueven desde el interior de las esporas hasta el micelio
cuando estas llegan a germinar, por lo que estos organismos son
considerados importantes como componentes del citoplasma de los HMA
y para el establecimiento de estos endófitos en las plantas.
Sin embargo algunas veces estas interacciones no funcionan como lo cita
Marschner y Crowley (1996b), donde encontraron que la interacción entre
cepas de Pseudomonas fluorescens, Glomus deserticola y Glomus
intraradices disminuyó el porcentaje de colonización para la primera
especie de HMA, así mismo la interacción entre estos microorganismos
redujo la población de rizobacterias hasta en un 50%. Hodge (2000), por su
parte comenta que se puede reducir la germinación de esporas, la
producción de micelio y el porcentaje de colonización. Lo que sugiere que
el antagonismo o sinergismo de esta interacción entre HMA y PGPR esta
dado por el contacto físico de estos microorganismos en la rizosfera de las
plantas y por el tipo de especie que acompaña esta interacción (McAllister
et al., 1994; Requena et al., 1997; Ravnskov et al., 1999a).
30
3.3.2. Efecto de los HMA en poblaciones de rizobacterias
Olsson et al. (1996) y Andrade et al., (1998) proponen que las interacciones
entre rizobacterias y HMA en la rizosfera pueden tener efectos de inhibición
hasta estimulación de la esporulación para el caso de los hongos
micorrizicos y mayor cantidad de unidades formadoras de colonias (UFC)
para el caso de las rizobacterias. No obstante los hongos micorrizicos no
solo influyen en la cantidad de rizobacterias que existen en el suelo, sino
que también tienen un efecto directo en el establecimiento y colonización
de estos microorganismos en las raíces de las plantas (Azcón y Barea,
1996).
Por su parte Krishna et al., (1982), Paulitz y Linderman (1989), Christensen y
Jakobsen (1993), Amora-Lozano et al., (1998), encontraron que la
presencia de estos hongos endófitos asociados a las rizobacterias tuvo un
impacto importante en el aumento y actividad de las poblaciones. Sin
embargo, el número de ellas puede disminuir considerablemente debido a
la afinidad entre los HMA y la(s) especie(s) que compongan las
poblaciones bacterianas en la rizosfera, pueden verse afectadas si existe
un retraso en el proceso de colonización de los HMA como también la
etapa de inoculación de los microorganismos en las plantas. Por ejemplo
algunas
poblaciones
de
Pseudomonas
sp.
generalmente
se
ven
disminuidas por la colonización de los hongos micorrizicos, debido a que las
raíces micorrizadas disminuyen la cantidad y composición de los exudados
radicales, influyendo en la densidad poblacional y en el estado fisiológico
de la bacteria en la rizosfera (Dixon et al., 1989; Posta et al., 1994;
Marschner y Crowley, 1996).
Meyer y Linderman (1986) observaron una mayor población de bacterias
anaerobias facultativas en la rizosfera de plantas de trébol colonizadas
31
con el hongo micorrízico Glomus fasciculatum en comparación con
plantas de maíz micorrizadas con el mismo hongo. Por su parte Schreiner et
al. (1997), aislaron y cuantificaron diferentes grupos bacterianos (gramnegativos y gram-positivos) en plantas de soya cuando estas fueron
inoculadas con diferentes hongos micorrízicos (Glomus etunicatum, G.
mosseae y Gigaspora rosea), estos resultados parecen indicar que la
hifosfera de estos hongos (definida como elvolumen de suelo que se
encuentra influenciado por el micelio externo de los hongos micorrízicos)
influye sobre ciertos grupos de bacterias, cuantificando mayor población
cuando el micelio era menos extenso (caso particular de G. etunicatum) e
incrementando estos niveles poblacionales para las gram-positivas cuando
los niveles de fósforo en el suelo eran bajos.
Los efectos donde se benefician estos dos microorganismos pudieran
deberse a la competencia de carbono en la rizosfera (Jonson et al., 1997),
aunque también pudiera existir otros mecanismos por los que la inhibición
entre HMA y rizobacterias se puede dar, por ejemplo: (1) la influencia de los
hongos sobre la cantidad de carbono que las plantas pueden derivar y
que pueden ser utilizadas por las comunidades microbianas (Garland,
1996), (2) competencia por espacio (Ames et al., 1984), (3) las condiciones
desfavorables físicas y químicas del suelo y (4) las poblaciones predadoras
del suelo (Andrade et al., 1998).
3.4. Efecto de la inoculación dual de PGPR y HMA en las plantas
Subba et al. (1985), encontraron que la doble inoculación de HMA y PGPR,
incrementó significativamente el porciento de colonización de estos
endófitos en plantas de cebada, al mismo tiempo que se aumentó de
manera significativa la biomasa y el grano total en un 132% y 125%,
respectivamente en comparación con las plantas no inoculadas.
32
Singh y Kapoor (1998), encontraron incrementos significativos cuando
inocularon plantas de Vigna radiata con rizobacterias solubilizadoras de
fósforo (Bacillus circulans) y HMA (G. fasciculatum), incrementando la
entrada de fósforo y nitrógeno en los tejidos de la planta, mejorando
significativamente la nutrición en las plantas inoculadas con estos dos
microorganismos en comparación a las demás plantas, además los valores
mas altos de colonización micorrízica (88%) se encontraron en las plantas
inoculadas de manera dual con estos dos microorganismos.
Azcon (1989), reporta un efecto benéfico cuando plantas de jitomate
fueron inoculadas con PGPR y HMA, incrementándose el peso aéreo (88%)
y el contenido de nitrógeno (47%), fósforo (70%) y potasio (47%), con
relación a las plantas sin inocular, además de aumentar el porcentaje de
colonización micorrizica hasta en un 50% mas en comparación a la
inoculación con solo HMA. Resultados similares fueron reportados por
Gryndler y Hrselová (1998), donde plantas de maíz inoculadas con
bacterias diazotróficas y Glomus fistulosum incrementaron su contenido de
fósforo en un 16%, por su parte Singh y Kapoor (1999), obtuvieron
incrementos del 68% en la concentración de fósforo y nitrógeno en plantas
de trigo inoculadas con Bacillus circulans y Glomus sp. 88 con relación a las
plantas sin inocular.
En otro estudio realizado por Bopaiah y Khader (1989), encontraron que los
niveles de peso seco y húmedo en pimienta negra se incrementaron tras su
inoculación con Azospirillum sp. y HMA, llegando a tener un incremento en
altura de hasta 63 cm en relación a las plantas testigo, resultados que
comprueban que puede ser mejor utilizar una mezcla de microorganismos
capaces de interrelacionarse entre sí, que utilizarlos por separado.
Resultados similares fueron reportados por Pandwar (1991), encontrando
33
que al inocular trigo con PGPR y HMA, incrementó el peso, tamaño y
rendimiento de grano (hasta en 16%) en comparación con las plantas
testigo.
Höflich et al., (1994), señalan que la inoculación de manera conjunta con
HMA y rizobacterias como Rhizobium sp. y Pseudomonas sp. tienen un
efecto positivo en el crecimiento de las plantas, lo cual hace necesario
analizar a fondo las interacciones entre microorganismos-planta y sus
efectos en la producción de hormonas, competencia por espacio en la
raíz, factores climáticos, químicos y físicos del suelo y clima y su importancia
en el crecimiento de las plantas.
Gryndler et al,. (1995), encontraron que plantas de maíz inoculadas de
manera dual con bacterias y HMA (G. fasciculatum) incrementaron el
porcentaje de colonización micorrizica (en un 88%) y el contenido de
fósforo (117%) y magnesio (13%) en los tejidos de las plantas. Por su parte
Kim et al. (1998), encontraron que doble inoculación con PGPR
(Enterobacter
agglomerans)
y
HMA
(G.
etunicatum)
estimularon
significativamente el peso fresco del follaje (13.49 g) y el contenido de
fósforo (3.40 mg) y nitrógeno (60.31 mg) en los tejidos de plantas de tomate
inoculadas con estos dos organismos comparadas con las plantas sin
inocular.
Staley et al., (1992), al inocular plantas de alfalfa y trébol con P. fluorescens
y HMA encontraron que el crecimiento en altura fue un 23% más que el
testigo. Así mismo, lograron observar que obtuvieron decrementos en la
cantidad de biomasa cuantificada, con los tratamientos rizobacteria y
hongo. Esto pudiera deberse a que Pseudomonas produce sustancias
fúngicas que debieron minimizar la colonización de los HMA, lo que estos
34
autores proponen que en futuras investigaciones se estudie los efectos de
las PGPR sobre los estados iniciales de colonización de los HMA, para
entender así, el concepto del manejo de las interacciones microbianas y su
efecto en el crecimiento de las plantas.
Dhillion
(1992),
encontró
resultados
similares
al
inocular
HMA
y
Pseudomonas sp. en plantas de arroz, observando una reducción en la
colonización micorrízica cuando se inoculaba al mismo tiempo con la
rizobacteria, no obstante el tratamiento donde fueron inoculados estos dos
microorganismos fue el más alto en cuanto a producción de biomasa (2.79
g) y concentración de fósforo (0.33 g) y nitrógeno (1.90 g) en los tejidos de
las plantas. Ravnskov et al., (1999b), observaron incrementos del 85% en la
biomasa radical y acumulación de fósforo (de 0.67 mg) en plantas de
pepino inoculadas con P. fluorescens (cepa DF57) y G. intraradices,
además que las poblaciones bacterianas que se contabilizaron se
incrementaron cuando estuvo presente el hongo micorrízico (en un 2.16 x
107 UFC) en comparación a la población que se cuantifico donde solo
estuvo la bacteria (1.55 x 107 UFC)
Azcón (1993), señala que los tiempos de inoculación de las PGPR y HMA
puede ser de tres formas: 1) bacterias y hongos de manera simultánea, 2)
después
de
la
colonización
micorrízica
y 3) en
forma
repetida,
dependiendo su supervivencia de la calidad y cantidad de exudados
radicales. Por su parte Bashan (1986), comenta que los tiempos de
inoculación son importantes para la obtención de un mayor beneficio en
la planta, reportando una mejor respuesta del hospedero en semilla y
plantas jóvenes que en plantas adultas.
35
IV. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1. Trabajo en Laboratorio
4.1.1. Aislamiento de Pseudomonas fluorecentes nativas
Se tomaron al azar muestras de aproximadamente 500 g en campo de la
rizosfera de plantas de papayo, las cuales se mezclaron para obtener una
muestra compuesta (Roberts y Henry, 2001) que se ocupó como sustrato
para la germinación de semillas de papayo, mismas que 20 días después
de su emergencia se ocuparon para tomar muestras de 25 g de raíces las
cuales se lavaron con agua destilada estéril, se maceraron y agitaron por
cinco minutos, realizando diluciones decimales que se sembraron en
placas con medio de Agar Soya Tripticasa (AST) adicionado con 8Hidroxiquinolina, incubándose durante 48 horas a 28 ºC, las colonias más
abundantes fueron seleccionadas y conservadas en viales a una
temperatura ambiente y en completa oscuridad (Muñoz, 1993; Mahaffee y
Kloepper, 1997; Quadt-Hallmann et al., 1997).
4.1.2. Pruebas para la selección de la mejor cepa de Pseudomonas
fluorecentes
4.1.2.1. Antibiosis
fitopatógenos
in
vitro
Pseudomonas
fluorescentes
Vs.
Hongos
Para conocer la capacidad de antibiosis de las rizobacterias
se
seleccionaron para este ensayo a Pythium sp. y Fusarium oxysporum, los
cuales fueron propagados en placas con medio: AST, AST + Peptona, PDA
y V-8 en presencia y ausencia de cloruro férrico (20 ppm), incubándose tres
placas (como repetición) por medio de cultivo durante 2 días a
temperatura ambiente y en completa oscuridad, posteriormente se
36
estriaron las rizobacterias a una distancia de 2 cm de los fitopatógenos,
nuevamente fueron incubadas en oscuridad durante 72 horas, la
existencia de halo de inhibición se cuantificó en milímetros (Axelrood et al.,
1996; Sturz et al., 1998; Cottyn et al., 2001).
Los datos obtenidos fueron analizados empleando el programa MSTAT y
cuando se presentaron diferencias significativas entre los tratamientos se
aplicó la prueba de Tukey (P<0.05).
4.1.2.2. Identificación de rizobacterias productoras de ácido cianhídrico
(HCN)
Para la realización de esta prueba se siguió la metodología propuesta por
Wei et al., (1991) y Mariano et al., (2000), la cual indica el estriado de la
rizobacteria en placas con medio AST suplementado con 4.4 g/L de
glicina, introduciendo al medio de cultivo tiras de papel filtro impregnadas
previamente con una solución de ácido pícrico (2.5 g/L) y carbonato de
sodio (12.5 g/L), haciendo que la tira se torne de color amarillo, la
producción de HCN esta indicada como; nula si la tira de papel no
cambia de color, moderadamente si se torna café y fuertemente si es roja.
4.1.2.3. Producción e identificación de sideróforos
En este experimento se seleccionó la rizobacteria que mayor halo de
inhibición tuvo en el ensayo de antibiosis, la cual fue sembrada en medio
líquido de Meyer y Abdallah (1978), agitándose a 200 r.p.m. durante 48
horas a una temperatura de 25 ºC, pasado este tiempo se centrífugo el
medio a 11,500 r.p.m. extrayendo el sobrenadante para ser determinado
sus propiedades espectrales mediante el método propuesto por Teintze et
al., (1981), para la identificación del sideroforo.
37
4.1.3. Selección e identificación de la especie de Pseudomonas que logró
el mayor rango de inhibición contra los hongos fitopatógenos
Una vez realizada la prueba de antibiosis se eligió la rizobacteria que
mayor halo de inhibió logró contra los dos fitopatógenos, identificando la
especie según Klinge (1960), Katoh y Itoh (1983), Fulghum (1994) y el
manual de Bergey´s (1994), los cuales toman como base para la
identificación de las especies de Pseudomonas caracteres morfológicos y
bioquímicos muy específicos para cada una de ellas.
4.1.4. Concentraciones bacterianas
formadoras de colonias (UFC)
y
cuantificación
de
unidades
Las concentraciones rizobacterianas utilizadas en los experimentos (109, 108,
106 y 104 células—mL-1 de medio) fueron preparadas de la siguiente manera;
la primera concentración fue ajustada por medio de un espectrofotómetro
marca Milton (Modelo 20D) a una absorbancia de 1, la cual fue tomada
como base para realizar diluciones decimales para ajustar las demás
concentraciones (Reddy et al., 1994; Glick et al., 1997), aplicando de cada
concentración 1 mL por planta (Enebak et al., 1998).
Para la cuantificación de unidades formadoras de colonias (UFC) se utilizó
el método de dilución para cuenta en placa realizando cinco repeticiones
por cada una de estas (Burr et al., 1978; Suslow y Schroth, 1982; Chiarini et
al., 1998), haciendo dos evaluaciones a las 24 y 48 horas posteriores a su
incubación.
38
4.1.5. Preparación del inóculo de HMA
4.1.5.1. Propagación de los HMA
El inóculo micorrízico que se empleó fue el complejo denominado MTZ-1,
compuesto por las especies; G. intraradices, G. mosseae, G. geosporum y
Gigaspora sp., proporcionado por el Laboratorio de Biotecnología de la
Facultad de Ciencias Agrícolas, Campus Xalapa de la Universidad
Veracruzana, el cual tenía un 80% de infectividad (determinado por las
tecnicas que en el inciso 4.1.5.2. y 4.1.5.3. se describen) al momento de la
inoculación de las plantas y contaba con 12.5 esporas por gramo de
sustrato seco.
4.1.5.2. Clareo y tinción de raíces
El clareo y tinción de raíces se realizó mediante la técnica propuesta por
Phillips y Hayman (1970), lavando las raíces que se tomaron como muestra
de las plantas de papayo con abundante agua, se cortaron en
fragmentos de aproximadamente un centímetro y se colocaran en frascos
según los tratamientos agregándoles KOH al 10% hasta cubrir las raíces, se
metieron en autoclave durante aproximadamente 15 minutos a 10 libras
de presión, inmediatamente después se sacaron y se les retiró el KOH
enjuagándolas con agua destilada y agregándoles HCl al 0.1N dejándolas
reposar cinco minutos, transcurrido ese tiempo se eliminó el ácido y sin
enjuagar se cubrieron con azul tripano al 0.05% colocando los frascos en
autoclave por cinco minutos a 121º C, pasado este lapso el colorante se
eliminó y las raíces se mantuvieron en ácido láctico hasta su observación.
39
4.1.5.3. Porciento de colonización micorrízica
Para la evaluación de las raíces micorrizadas se utilizó la técnica de
McGonigle et al. (1990), utilizando para esta metodología un microscopio
marca Nikon modelo PFX con un aumento de 200X equipado con una
retícula ocular en forma de cruz, estimando el porciento de colonización
cuando el eje de la retícula tocaba cualquier estructura como hifa,
vesícula o arbusculo en 100 observaciones. Los conteos realizados se
expresaron en porcientos mediante la siguiente formula:
Número de intersecciones colonizadas
% de colonización = 100 X ------------------------------------------------------------Número total de intersecciones observadas
Los
datos
obtenidos
en
los
ensayos
realizados
fueron
analizados
empleando el programa MSTAT y cuando se presentaron diferencias
significativas entre las plantas colonizadas de los tratamientos se aplico la
prueba de Tukey (P< 0.05).
4.1.6. Aislamiento de hongos fitopatógenos causantes del damping-off en
plantas de Carica papaya L
4.1.6.1. Inducción de la enfermedad
Se tomaron al azar muestras en campo de aproximadamente 500 g de la
rizosfera de plantas de papayo, las cuales se mezclaron para obtener una
muestra compuesta (Roberts y Henry, 2001), que se ocupó como sustrato
para la germinación y emergencia de plántulas de papayo, manteniendo
el sustrato a capacidad de campo para propiciar una alta humedad
relativa para el desarrollo óptimo de hongos fitopatogenos causantes del
damping-off.
40
4.1.6.2. Aislamiento e identificación de fitopatógenos causantes del
damping-off
Se aislaron los hongos de las plantas enfermas en placas con medio de
papa-dextrosa-agar (PDA) suplementado con tetraciclina (15 mL/L),
incubándose durante 20 días a 30 ºC en completa oscuridad (Ocamb y
Kommedahl, 1994; St-Arnaud et al., 1994; Raaijmakers et al., 1995; St-Arnaud
et al., 1997).
Su identificación fue de acuerdo a lo propuesto por Domsch et al., (1980),
Nelson et al., (1983) y Nelson et al., (1994), los cuales toman como base sus
características morfológicas. Para el experimento donde fue evaluado el
número
de
conidias
se
utilizó
un hematocitómetro
ajustando
las
concentraciones a 3, 5 y 7 conidias por gramo de suelo seco (Reddy et al.,
1994).
4.2. Trabajo en Invernadero
4.2.1. Ubicación del área experimental
El trabajo de invernadero se llevó a cabo en el campo experimental La
Bandera de Actopan, Veracruz, localizado a 360 m.s.n.m. a una Latitud
Norte de 19º 27' 30'' y Longitud Oeste de 96º 64' 20'' (Vazquez et al., 1992).
4.2.2. Material vegetal
Las semillas que se emplearon para todos los experimentos fueron de
papayo var. maradol las cuales se adquirieron en la compañía Western
Sedd, International B.V., Holanda, desinfectándose antes de ser utilizarlas
con hipoclorito de sodio al 10% (Berger et al., 1996).
41
4.2.3. Sustrato utilizado
El sustrato que se utilizo para todos los experimentos fue una mezcla de
suelo y arena (1:1) la cual previamente fue esterilizada con Basamid (a una
dosis de 40 g/m2), el cual ha mostrado ser un fumigante del suelo sin
residualidad y altamente eficiente (López-Aranda et al., 2001; Melgarejo et
al., 2001). El análisis del suelo lo realizó el Laboratorio de Alta Tecnología de
Xalapa (LATEX), el cual reportó los siguientes resultados:
Cuadro 3. Análisis de las propiedades físico-químicas del sustrato que se
empleo en el desarrollo de los experimentos
Determinaciones
Textura (Arena)
Textura (Limo)
Textura (Arcilla)
Densidad Aparente
Color
pH
Materia orgánica
Nitrógeno orgánico
Nitrógeno de nitratos
Fósforo
Potasio
Sodio
Calcio
Magnesio
Azufre
Hierro
Zinc
Manganeso
Resultados
68
%
11
%
21
%
1.13
g/mL
5 YR 5/1
7.8
2.2
%
0.11
%
53.20
mg/kg
70.0
mg/kg
0.80
me/100 g
55.9
me/100 g
33.1
me/100 g
1.8
me/100 g
17
ppm
6
ppm
1.9
ppm
14.4
ppm
4.3. Fase experimental
4.3.1. Experimento 1. Dosis respuesta de plantas de papayo inoculadas con
la mejor cepa de Pseudomonas fluorecentes
Una vez seleccionada la bacteria que mejor controlo a los fitopatógenos in
vitro se realizó un ensayo de dosis respuesta, inoculando con diferentes
42
concentraciones a las plántulas de papayo, utilizando la cepa aislada de
maíz
A9
de
Pseudomonas
fluorescens
como
referencia,
las
concentraciones se detallan a continuación:
Cuadro 4. Descripción de los tratamientos para el experimento dosisrespuesta
Tratamiento
Rizobacteria
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Aislamiento de Pseudomonas sp.
Aislamiento de Pseudomonas sp.
Aislamiento de Pseudomonas sp.
Aislamiento de Pseudomonas sp.
Pseudomonas fluorescens, A9
Pseudomonas fluorescens, A9
Pseudomonas fluorescens, A9
Pseudomonas fluorescens, A9
Control
Dosis
(celulas—mL-1)
109
108
106
104
109
108
106
104
Ninguna
Clave
Pp9
Pp8
Pp6
Pp4
Pf9
Pf8
Pf6
Pf4
C
El diseño experimental empleado tuvo un arreglo completamente al azar
(Reyes, 1990) con nueve tratamientos y siete repeticiones y como unidad
experimental
una
planta,
los
datos
obtenidos
fueron
analizados
empleando el programa MSTAT y cuando se presentaron diferencias
significativas entre las plantas de los tratamientos se aplicó la prueba de
Tukey (P< 0.05) para separar las medias y determinar la existencia de
mínima significancia estadística entre los tratamientos.
4.3.1.1. Variables evaluadas
rizobacteria-papayo
en
el
experimento
dosis-respuesta
I) Altura y número de hojas
La altura de las plantas fue cuantificada en centímetros a partir de la base
hasta la punta del tallo, el número de hojas fue contabilizado sin tomar en
cuenta las hojas cotiledonales, las mediciones para estas dos variables
43
tuvieron una periodicidad de cada nueve días a partir de la inoculación
de los microorganismos.
II) Unidades formadoras de colonias (UFC)
Las unidades formadoras de colonias se cuantificaron por medio del
método señalado en el inciso 4.1.4., contabilizando las UFC con una
periodicidad de cada nueve días a partir de la inoculación de las
rizobacteras hasta el final del experimento (54 días después de la
inoculación), por cada dilución se realizaron tres repeticiones.
III) Área foliar y biomasa
La determinación de estas dos variables fue al final del experimento (54
días después de la inoculación), utilizando el programa UTHSCSA Image
Tool para la evaluación en cm2 del área foliar, para la biomasa en fresco
(peso follaje y raíz) se empleó una balanza digital Swiss Quality (Modelo
125ASCS) utilizando como unidad de medida los gramos, para el caso de
la biomasa en seco, el material vegetal fresco se metió en una estufa a 70º
C durante tres días, evaluando el peso hasta que este fue constante (Toro
et al., 1997; Shishido y Chanway, 1998; Zhu et al., 2000).
4.3.2. Experimento 2. Susceptibilidad de plántulas de Carica papaya L al
ataque de hongos fitopatógenos causantes del damping-off
Una vez aislado e identificado el hongo patógeno causante del dampingoff (Fusarium oxysporum) en plántulas de papayo, se realizó un ensayo
para determinar la concentración de conidios (Reddy et al., 1994) con la
que se manifiesta la sintomatología de esta enfermedad (Cuadro 5).
44
Cuadro 5. Descripción de los tratamientos para evaluar que concentración
de conidias de Fusarium oxysporum enfermaban a plántulas de papayo de
damping-off
Tratamiento
1
2
3
4
Patógeno
Fusarium oxysporum
Fusarium oxysporum
Fusarium oxysporum
Control
Concentración
3 conidios/g de suelo seco
5 conidios/g de suelo seco
7 conidios/g de suelo seco
Ninguna
Una vez inoculadas las plantas con el patógeno estas se mantuvieron en
una cámara húmeda con una temperatura controlada de 28 ± 2 ºC,
manteniendo el sustrato con una humedad entre el 80% y 85% dando las
condiciones mas favorables para el desarrollo de la enfermedad
(Hannusch y Boland, 1996; Landa et al., 2001).
El diseño experimental tuvo un arreglo completamente al azar (Reyes 1990)
con cuatro tratamientos y siete repeticiones y tres unidades experimentales
por cada repetición, los datos obtenidos fueron analizados empleando el
programa MSTAT y cuando se presentaron diferencias significativas entre
las plantas de los tratamientos se aplicó la prueba de Tukey (P< 0.05) para
separar las medias y determinar la existencia de mínima significancia
estadística entre los tratamientos.
4.3.2.1. Variables a evaluar durante el desarrollo del experimento de la
susceptibilidad de Carica papaya L al ataque de hongos fitopatógenos
I) Severidad y necrosis
Para la evaluación de la severidad y necrosis se utilizaron las escalas
propuestas por St-Arnaud et al., (1994), que indican lo siguiente:
45
Cuadro 6. Escala propuesta por St-Arnaud et al. (1994) para evaluar la
severidad del damping-off en plantas de Carica papaya L.
Escala
Severidad
1
El tallo presenta de 0-1 manchas necróticas
2
El tallo presenta de 2-3 manchas necróticas
3
El tallo presenta de 4-5 manchas necróticas
4
El tallo presenta de 6-10 manchas necróticas
5
El tallo presenta 1/3 de la superficie dañada
Cuadro 7. Escala propuesta por St-Arnaud et al. (1994) para evaluar
necrosis causado por damping-off en plantas de Carica papaya L.
Escala
Necrosis
1
Daño en la raíz menor al 1%
2
Daño en la raíz del 1 al 3%
3
Daño en la raíz del 4 al 5%
4
Daño en la raíz del 6 al 10%
5
Daño en la raíz mayor del 10%
Para conocer el índice se utilizó la metodologia propuesta por Dugassa et
al. (1996), en lacual se toman como base las escalas antes citada y se
utiliza la formula siguiente:
Índice de severidad (IS%) = (Σ (nxb / NxB) x 100
Donde:
n = Número de plantas de la misma clase
b = Clase
N = Número total de plantas medidas
B = Número total de clases
4.3.3. Experimento 3. Efecto de la inoculación dual de Pseudomonas
fluorescentes y HMA en el control biológico del damping-off en plántulas
de Carica papaya L
Una vez determinada la concentración de respuesta tanto de la
rizobacteria como del hongo fitopatógeno, se inocularon plántulas de
46
Carica papaya con la mejor concentración de Pseudomonas sp. (104 cel.
mL-1), hongos micorrízicos arbusculares (10 g por planta) y Fusarium
oxysporum (7 conidios/g de suelo seco), planteándose los siguientes
tratamientos:
Cuadro 8. Descripción de los tratamientos para el experimento final
Tratamiento
Descripción
Clave
4
-1
1
Pseudomonas sp. 10 celulas—mL
P4
9
-1
2
Pseudomonas sp. 10 celulas—mL
P9
3
HMA
H
4
-1
4
Pseudomonas sp. 10 celulas—mL + F.
P4F
oxysporum
5
Pseudomonas sp. 109 celulas—mL-1 + F. oxysporum
P9F
6
HMA + F. oxysporum
HF
7
Pseudomonas sp. 104 celulas—mL-1 + HMA
P4H
8
Pseudomonas sp. 109 celulas—mL-1 + HMA
P9H
P4HF
9
Pseudomonas sp. 104 celulas—mL-1 + HMA + F.
oxysporum
10
Pseudomonas sp. 109 celulas—mL-1 + HMA + F.
P9HF
oxysporum
11
F. oxysporum
F
12
Control
C
Las plantas inoculadas con el patógeno se mantuvieron en una cámara
húmeda con una temperatura controlada de 28 ± 2 ºC, manteniendo el
sustrato con una humedad entre el 80% y 85% dando las condiciones mas
favorables para el desarrollo de la enfermedad (Hannusch y Boland, 1996;
Landa et al., 2001). El diseño experimental tuvo un arreglo completamente
al azar (Reyes, 1990) con doce tratamientos y cinco repeticiones y tres
unidades experimentales por repetición, los datos obtenidos fueron
analizados empleando el programa MSTAT y cuando se presentaron
diferencias significativas entre las plantas de los tratamientos se aplico la
prueba de Tukey (P< 0.05) para separar las medias y determinar la
existencia de mínima significancia estadística entre los tratamientos.
47
4.3.3.1. Variables a evaluar en el experimento sobre inoculación dual de
Pseudomonas fluorescentes y HMA en el control biológico del damping-off
en plántulas de Carica papaya L
I) Altura y número de hojas
La altura de las plantas fue cuantificada en centímetros a partir de la base
hasta la punta del tallo, el número de hojas fue contabilizado sin tomar en
cuenta las hojas cotiledonales, las mediciones para estas dos variables
tuvieron una periodicidad de cada nueve días a partir de la inoculación
de los microorganismos.
II) Unidades formadoras de colonias (UFC)
Las unidades formadoras de colonias se cuantificaron por medio del
método señalado en el inciso 4.1.4., determinándose las UFC a los 32 días
después de la inoculación de las rizobacterias y al final del experimento.
III) Área foliar y biomasa
La determinación de estas dos variables fue al final del experimento (63
días después de la inoculación), utilizando el programa UTHSCSA Image
Tool para la evaluación en cm2 del área foliar, para la biomasa en fresco
(peso follaje y raíz) se empleo una balanza digital Swiss Quality (Modelo
125ASCS) utilizando como unidad de medida los gramos, en el caso de la
biomasa en seco se utilizo una estufa calibrada a 70º C, hasta alcanzar un
peso constante (Toro et al., 1997; Zhu et al., 2000)..
48
IV) Severidad y necrosis
Para la evaluación de la severidad y necrosis se utilizaron las escalas
propuestas por St-Arnaud et al. (1994) (ver 4.3.2.1.1.), cuantificando estas
variables hasta el final del experimento.
V) Porciento de colonización micorrízica
El nivel de colonización se determinó a los 32 días después de la
inoculación de los hongos micorrízicos y al final del experimento, la técnica
de clareo y tinción que se utilizó se describe en el inciso 4.1.5.3. y para
calcular el porcentaje de colonización se ocupó la formula descrita en el
inciso 4.1.5.4.
49
V. RESULTADOS
5.1. Selección de Pseudomonas
5.1.1. Aislamiento de Pseudomonas fluorescentes y su capacidad de inhibir
el crecimiento de fitopatógenos del suelo
Cincuenta y seis rizobacterias fueron aisladas de la rizosfera de Carica
papaya L. a partir del medio AST suplementado con 8-Hidroxiquinolina, de
las cuales solo ocho produjeron pigmento fluorescente amarillo-verdoso el
cual es muy característico del genero Pseudomonas, sobre todo cuando
se crecen en medios con poco fierro disponible como el que se utilizó en
este experimento.
Solo las ocho rizobacterias fluorescentes se probaron en este caso, debido
a que se buscaba aislar una especie nativa de Pseudomonas con
capacidad antagónica contra hongos fitopatógenos causantes del
damping-off, logrando todos los organismos aislados inhibir en todos los
medios de cultivo probados, el crecimiento de F. oxysporum y Pythium sp.,
siendo la mas sobresaliente para estos dos casos la rizobacteria
catalogada con el número tres.
Cuando se realizó el análisis de varianza, éste reportó diferencias
significativas (P<0.05), para el halo de inhibición cuantificado a partir de las
72 horas después de estriadas las rizobacterias en los medios de cultivo
donde crecían los dos hongos fitopatógenos. Para el caso de
F.
oxysporum, la cepa número tres produjo los mayores halos de inhibición del
crecimiento en todos los medio de cultivos probados, sobresaliendo en los
medios AST, AST + fierro y AST + peptona, con más de 10 mm de inhibición
(Cuadro 9).
50
Cuadro 9. Halo de inhibición en mm cuantificado en diferentes medios con
rizobacterias y F. oxysporum
Halo de inhibición (mm)
Número de
aislamiento
AST
1
2
3
4
5
6
7
8
Pr > F
C.V. (%)
4.1 cd
3.9 d
11.1 a
3.1 de
5.1 b
4.1 cd
2.9 e
4.9 bc
0.0001
6.81
AST +
AST +
V-8 +
PDA +
Peptona V-8
PDA
Fierro
Fierro
Peptona
+ Fierro
3.9 b
3.9 b
3.1 c
0 c*
0 b*
0 b*
0 b*
4.1 b
3.2 c
4.2 b
0c
0b
0b
0b
10.1 a
11.2 a
9.2 a
7a
6a
4a
3a
4.1 b
3.2 c
3.1 c
0c
0b
0b
0b
4.2 b
4.1 b
4.1 b
3b
2b
0b
0b
3.2 bc
3.1 c
3.2 c
0c
0b
0b
0b
3.1 c
3.1 c
4.2 b
0c
0b
0b
0b
4.2 b
4.2 b
4.1 b
3b
2b
0b
0b
0.0001
0.0001
0.0001 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001
7.14
3.68
6.19
7.28
4.03
5.07
5.14
AST +
Fierro
Valores con la misma letra son estadísticamente iguales (P<0.05)
*Los datos se transformaron para realizar el análisis de varianza con la formula raíz de (X+1)
Para el caso de Pythium sp. nuevamente la rizobacteria numero tres fue la
que mayor halo de inhibición causó en el crecimiento de este hongo,
cuantificando mas de 9 mm en los medios AST, AST + Fierro y AST + peptona
(Cuadro 10).
Cuadro 10. Halo de inhibición en mm cuantificado en diferentes medios
con rizobacterias y Pythium sp.
Halo de inhibición (mm)
Número de
aislamiento
1
2
3
4
5
6
7
8
Pr > F
C.V. (%)
AST
AST +
Fierro
AST +
Peptona
2.8 cd
2.8 cd
9.1 a
2.1 d
4.1 bc
3.2 cd
2.9 cd
4.8 b
0.0001
12.13
3.8 bc
2.9 cd
9.3 a
2.8 de
4.1 b
3.2 bcd
2.1 e
4.1 b
0.0001
7.31
3.1 c
3.1 c
9.1 a
2.1 d
3.1 c
3.1 c
2.1 d
4.1 b
0.0001
7.00
AST +
Peptona
+ Fierro
3.1 c
3.1 c
8.2 a
3.1 c
3.0 c
3.1 c
3.0 c
4 b
0.0001
9.10
V-8
V-8 +
Fierro
PDA
PDA +
Fierro
0 b*
0 b*
0 b*
0 a*
0b
0b
0b
0a
5a
4a
2a
1a
0b
0b
0b
0a
1b
1b
0b
0a
0b
0b
0b
0a
0b
0b
0b
0a
1b
1b
0b
0a
0.0001 0.0001 0.0001 0.0001
4.96
4.87
5.83
4.34
Valores con la misma letra son estadísticamente iguales (P<0.05)
*Los datos se transformaron para realizar el análisis de varianza con la formula raíz de (X+1)
51
Con estos resultados se procedió a la selección de la rizobacteria
fluorescente tomando como base el mayor halo de inhibición hacia en los
dos fitopatógenos en la mayoría de los medios de cultivo probados, para
posteriormente ser identificada y probada en plántulas de papayo en
invernadero.
5.1.2. Rizobacterias con capacidad de producir ácido cianhídrico
Del total de rizobacterias aisladas cuarenta y uno de ellas no produjeron
este compuesto, siendo las quince restantes las que sintetizaron el ácido
cianhídrico (HCN) en diferentes intensidades.
Siendo solo cinco rizobacterias las que produjeron este compuesto de
manera fuerte, debido a la coloración marrón que lograron cambiar en la
tira de papel filtro que se introdujo en el medio de cultivo donde estaban
creciendo, y diez organismos lograron producirlo de forma moderada
(cambio de color anaranjado), destacando dentro de estas últimas a dos
cepas fluorescentes catalogadas como números 5 y 8.
5.1.3. Sideróforo producido por la rizobacteria seleccionada
Una vez caracterizadas las rizobacterias se seleccionó la número tres,
determinándole el tipo de sideróforo que producía mediante lecturas
espectrales. Cuantificando su pico máximo de absorción en una longitud
de onda entre 400-410 nm a una absorbancia de 0.224, para lo cual según
Teintze et al., (1981), está clasificado como del tipo pseudobactina las
cuales poseen en sus moléculas porciones de tipo catecol e hidroxamato
(Figura 3).
52
0.24
Pico máximo: 400-410 nm
0.21
Absorvancia
0.18
0.15
0.12
0.09
0.06
0.03
0
0
70
140
210
280
350
420
490
560
630
700
Longitud de onda (nm)
Figura 3. Espectro de absorción realizado para la identificación del
sideróforo producido por Pseudomonas sp. (rizobacteria número tres), la
cual es antagonista a F. oxysporum y Pythium sp.
Este tipo de sideroforo es muy característico del genero Pseudomonas, el
cual generalmente este implicado en el control biológico de hongos
patógenos del suelo causantes de enfermedades en las plantas.
5.1.4. identificación de la especie de Pseudomonas seleccionada
Una vez seleccionada la rizobacteria número tres, se determinó que el
género al que pertenece este microorganismo es Pseudomonas debido a
que produjo pigmentación amarillo-verdoso en el medio Agar Cetrimida, el
cual es específico para la detección de este género. Se probó que esta
rizobacteria
no
estuviera
contaminada
por
otros
heterótrofos
(Enterobacterias), para esto se estrío en medio Agar Bilis Rojo Violeta,
53
presentando reacción como lactosa negativa, lo que demuestra no estar
contaminada debido a que no produjo pigmentos de color rojo o naranja.
Una vez identificado el género de Pseudomonas se procedió a determinar
la especie a la cual pertenecía, resultando ser putida, debido a que no
creció en los medios de cultivo P-3 y P-4, los cuales se utilizan para la
diferenciación de especies entre P. fluorecens y P. putida mismos que
utilizan como fuente de carbono a la trehalosa y mio-inositol (Manual de
Bergey´s, 1994). Posteriormente, la P. putida se sembró en el medio NZCYM
y se puso a crecer a una temperatura de 4º C para la identificación del
biovar, el cual resultó ser del tipo B, debido a que creció bajo estas
condiciones donde el tipo A no crece.
Concluidas todas las pruebas bioquímicas se determinó que la rizobacteria
seleccionada y catalogada como la numero tres, se identificó como
Pseudomonas putida Biovar B.
5.2. Identificación de los hongos causantes del damping-off en plántulas
de Carica papaya
El hongo aislado de las raíces de plántulas de papayo resulto ser Fusarium
oxysporum, el cual presentó colonias blanquecinas-púrpuras con micelio
aéreo abundante,mismo que llegaba a cubrir toda la cápsula de Petri en
un período de 6 a 7 días. Este micelio se observó hialino y septado,
observándose la presencia de; a) Microconidias: abundantes, de forma
ovalada, sin septas, con dimensiones de 5.75 – 14.6 µm X 2.5 – 5.20 µm. b)
Macroconidias: de forma ovalada, con dimensiones de 20.8 – 31 µm X 2.6 –
5.0 µm; con 1 a 5 septas. c) Clamidiosporas: de forma redonda, paredes
oscuras y gruesas, con un diámetro de 5.20 – 12 µm, abundantes en la
54
medida que el medio de cultivo tiende a deshidratarse lo que indica su
funcionalidad como estructura de resistencia (Domsch et al., 1980).
5.3. Respuesta de plántulas de papayo var. Maradol a la inoculación con
diferentes concentraciones de Pseudomonas putida
5.3.1. Altura y número de hojas
El análisis de varianza estableció diferencias significativas (Tukey, P<0.05)
para estas dos variables a partir de los dieciocho días después de
inoculadas las plántulas con las diferentes concentraciones tanto de P.
putida (aislamiento nativo de Carica papaya L.) como de P. fluorescens
(rizobacteria de referencia) (Figura 4).
Las plantas que mayores alturas alcanzaron al final del experimento (54
días después de la inoculación) fueron las inoculadas con los tratamientos
Pp4, Pp6 y Pp9, logrando incrementos del 62%, 40% y 39%, respectivamente
con relación a las plantas sin inocular (tratamiento C).
Para el caso de la variable número de hojas las plantas que mejor
respondieron fueron las inoculadas con las concentraciones de los
tratamientos Pp4, Pp6 y Pp8, logrando incrementar su follaje con relación a
las plantas del tratamiento C en valores de 135%, 90% y 87%,
respectivamente.
Estos resultados demuestran que las plantas respondieron mejor con la
inoculación a bajas concentraciones con la cepa nativa de P. putida, no
obstante se obtuvieron incrementos al inocular las plantas con la cepa de
P. fluorescens en toda las concentraciones.
55
Altura (cm)
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0
9
18
27
36
45
54
Diasdespues
despues dede
laino
ulación
Días
lacinoculación
Pp9
Pp8
Pp6
Pp4
Pf8
Pf6
Pf4
C
Pf9
14
Número de hojas
12
10
8
6
4
2
0
0
9
18
27
36
45
Días despues de la inoculación
Pp9
Pp4
Pf6
Pp8
Pf9
Pf4
54
Pp6
Pf8
C
Figura 4. Cuantificación de altura y número de hojas de plántulas de
papayo inoculadas con diferentes concentraciones de Pseudomonas
putida y P. fluorescens
56
5.3.2. Área foliar y biomasa fresca y seca
Al final del experimento (54 días después de la inoculación) las plántulas de
papayo inoculadas con las Pseudomonas putida y fluorescens mostraron
un efecto superior a las plantas control (tratamiento C) para la variable
área foliar (Figura 5), existiendo diferencias significativas (Tukey, P<0.05)
entre las plantas de los tratamientos, siendo superiores aquellas que fueron
inoculadas con los microorganismos benéficos, resaltando
las del
tratamiento Pp4, donde se obtuvo un incremento por arriba del 366% con
relación a las plantas control.
80
a
2
Area foliar (cm )
70
b
60
50
b
b
c
40
d
d
d
30
e
20
10
0
Pp9 Pp8 Pp6 Pp4
Pf9
Pf8
Pf6
Pf4
C
Tratamient os
Figura 5. Área foliar de plántulas de papayo cuantificada a los 54 días
después de inoculadas las rizobacterias (P. putida y P. fluorecens) con
diferentes concentraciones. Las barras con la misma letra son
estadísticamente iguales (Tukey, P<0.05).
Para el caso de las variables biomasa fresca y seca de las plántulas de
papayo, el análisis estadístico reportó diferencias significativas entre las
plantas de los tratamientos (Cuadro 11).
57
Siendo las inoculadas con la dosis de 104 cel—mL-1 (tratamiento Pp4) las que
mejor biomasa produjeron, con incrementos de follaje y raíz fresco en un
198% y 162%, y biomasa seca de follaje y raíz en un 283% y 162%, en
relación a las plantas del tratamiento C (sin inocular).
Cuadro 11. Producción de biomasa fresca y seca de plántulas de papayo
inoculadas con rizobacterias
Tratamiento
Pp9
Pp8
Pp6
Pp4
Pf9
Pf8
Pf6
Pf4
C
Pr > F
C.V. (%)
Peso fresco
follaje (g)
1.18 b
1.15 b
1.20 b
1.52 a
1.34 ab
0.79 c
0.87 c
0.69 cd
0.51 d
0.0001
10.06
Peso fresco raíz
(g)
0.78 abcd
0.81abc
0.85 ab
0.92 a
0.86 a
0.65 bcd
0.61 cd
0.57 d
0.35 e
0.0001
14.84
Peso seco
follaje (g)
0.15 cd
0.17 bc
0.17 bc
0.23 a
0.19 b
0.11 de
0.11 de
0.09 ef
0.06 f
0.0001
10.11
Peso seco
raíz (g)
0.16 bc
0.18 ab
0.18 ab
0.21 a
0.16 bc
0.11 cd
0.10 cd
0.09 d
0.08 d
0.0001
11.24
Valores con la misma letra son estadísticamente iguales (Tukey, P<0.05)
5.3.3. Dinámica poblacional de P. putida y P. fluorescens de la rizosfera de
plántulas de papayo
El número de unidades formadoras de colonias (UFC) al final del
experimento (54 días después de la inoculación), se mantuvo en la
mayoría de los casos con relación a las UFC cuantificadas al inicio del
experimento (al momento de inocular las rizobacterias). Siendo las plantas
inoculadas con el tratamiento Pf6 las que reportaron una menor
colonización, observando que la población inicialmente de 15.1 x 107 bajo
drásticamente a 1.5 x 107. Por su parte las plantas del tratamiento Pp4
aunque a los 27 y 36 días después de la inoculación mostraron los mas
bajos niveles de colonización, al final del experimento lograron recuperar
su población (Figura 6).
58
Logaritmo 107 UFC/g de raíz
35
30
25
20
15
10
5
0
0
18
27
36
54
Días despues de la inoculación
Pp9
Pp8
Pp6
Pp4
Pf9
Pf8
Pf6
Pf4
Figura 6. Dinámica poblacional de P.putida y P. fluorecens en la rizosfera
de plántulas de Carica papaya L evaluado durante 54 días.
5.4. Efecto de diferentes concentraciones de Fusarium oxysporum en la
susceptibilidad de plántulas de papayo var. Maradol en vivero
5.4.1. Índice de Severidad y necrosis
El
análisis
estadístico
para
estas
dos variables
mostró
diferencias
significativas (Tukey, P<0.05) entre las plantas de los tratamientos a partir de
los 20 días después de inoculado el patógeno (Figura 7). Siendo las plantas
inoculadas con la dosis mas alta del patógeno (7 conidios/g de suelo seco)
las que mayores rangos de severidad y necrosis presentaron con relación a
las plantas inoculadas con los demás tratamientos, cuantificando al final
del experimento (35 días después de inoculado el patógeno) una
mortandad del 100% de las plantas inoculadas con este tratamiento.
59
Índice de severidad
80
60
40
20
0
5
10
15
20
25
30
35
Días despues de la inoculación
7 Co
5 Co
3 Co
C
Índice de necrosis
100
80
60
40
20
0
5
10
15
20
25
30
35
Días despues de la inoculación
7 Co
5 Co
3 Co
C
Figura 7. Dinámica de severidad y necrosis evaluadas en plantas de Carica
papaya inoculadas con diferentes concentraciones de conidios de
Fusarium oxysporum agente causal del damping-off
60
5.5. Efecto de la inoculación dual de HMA y P.putida en plantas de papayo
para el control biológico del damping-off
5.5.1. Altura y número de hojas
El análisis de varianza estableció diferencias significativas (Tukey, P<0.05)
para estas dos variables a partir de los dieciocho días después de
inoculadas las plántulas con el complejo micorrízico MTZ-1 y P. putida.
(Figura 8). Las plantas que mayores alturas alcanzaron al final del
experimento (72 días después de la inoculación) fueron las inoculadas con
los
tratamientos
P4H
y
P9H
con
incrementos
del
81%
y
79%,
respectivamente con relación a las plantas control (C).
Para el caso de la variable número de hojas las plantas que mejor
respondieron fueron las inoculadas con el tratamiento P4H, PH4F y P9H
logrando incrementar su follaje con relación a las plantas del tratamiento C
en valores de 90%, 87% y 83%, respectivamente.
Las plantas que fueron inoculadas con el tratamiento F a los 63 días del
experimento todas murieron por ahorcamiento de tallo y necrosis de raíz
causado por F. oxysporum, por lo que al final del experimento no fueron
cuantificadas.
Por lo que las plantas que mejor crecieron y desarrollaron fueron las
inoculadas de manera dual con HMA y rizobacteria, no obstante que estos
fueron los mejores tratamientos, en los demás casos las plantas que fueron
inoculadas con uno u otro microorganismo superaron a las plantas del
tratamiento F y C, las cuales para el primer caso, fueron inoculadas con el
patógeno y para el segundo no se les agregó ningún microorganismo.
61
12
Altura (cm)
10
8
6
4
2
0
0
9
18
27
36
45
54
63
72
Dias despues de la inoculación
P4
P9F
P4HF
P9
HF
P9HF
H
P4H
F
P4F
P9H
C
18
Número de hojas
16
14
12
10
8
6
4
2
0
0
9
18
27
36
45
54
63
72
Días despues de la inoculación
P4
P9F
P4HF
P9
HF
P9HF
H
P4H
F
P4F
P9H
C
Figura 8. Altura y número de hojas cuantificadas a lo largo de 72 días en
plántulas de papayo inoculadas con el complejo micorrízico MTZ-1, P.
putida (en concentraciones de 104 y 109 cel—mL-1) y F. oxysporum (con 7
conidios/g de suelo seco)
62
5.5.2. Área foliar y biomasa fresca y seca
Al final del experimento (72 días después de la inoculación) las plántulas de
papayo inoculadas con Pseudomonas putida y HMA mostraron ser
altamente superiores a las plantas del tratamiento control (C). Existiendo
diferencias
significativas
(Tukey,
P<0.05)
entre
las
plantas
de
los
tratamientos para la variable área foliar (Figura 9), siendo las plantas
inoculadas
con
el
tratamiento
P4H
las
que
alcanzaron
mayores
incrementos con 535% en relación a las plantas del tratamiento C. Es de
importancia resaltar que de todos los tratamientos las plantas que mejor
área foliar desarrollaron fueron las inoculadas con hongos micorrízicos y la
rizobacteria.
120
a
Área foliar (cm 2)
100
ab
b
cd
80
e
fg
60
ef
fgh
gh
hi
40
j
20
0
P4
P9
H
P4F
P9F
HF
P4H P9H P4HF P9HF
C
Tratamient os
Figura 9. Área foliar de plántulas de papayo cuantificada a los 72 días
después de inoculados los microorganismos (HMA, P. putida y F.
oxysporum). Las barras con la misma letra son estadísticamente iguales
(Tukey, P<0.05).
63
Para el caso de la variable biomasa fresca y seca el análisis estadístico
reportó diferencias significativas entre las plantas de los tratamientos
(Cuadro 12), existiendo incrementos de follaje y raíz fresco en un 201% y
98% respectivamente y de biomasa seca de follaje y raíz en un 622% y
236%, para las plantas inoculadas con el tratamiento P4H, los demás
tratamientos con HMA y P. putida fueron superiores en todas las variables
cuantificadas de biomasa con relación a los tratamientos donde solo se
inocularon los microorganismos de manera individual.
Cuadro 12. Producción de biomasa fresca y seca de plántulas de papayo
inoculadas con microorganismos
Tratamiento
P4
P9
H
P4F
P9F
HF
P4H
P9H
P4HF
P9HF
C
Pr > F
C.V. (%)
Peso fresco
follaje (g)
1.58 cd
1.42 de
1.36 def
1.42 de
1.27 ef
1.17 f
1.96 a
1.88 ab
1.90 ab
1.74 bc
0.65 g
0.0001
12.01
Peso fresco raíz
(g)
0.87 bc
0.86 bc
0.82 cd
0.86 bc
0.84 bc
0.81 cd
0.99 a
0.94 ab
0.96 ab
0.94 ab
0.50 e
0.0001
7.77
Peso seco
follaje (g)
0.39 abc
0.37 abc
0.34 abc
0.37 abc
0.31 bc
0.34 abc
0.65 a
0.57 ab
0.57 ab
0.50 ab
0.09 c
0.0001
56.13
Peso seco
raíz (g)
0.21 bcdc
0.19 bcde
0.14 cde
0.18 bcde
0.16 cde
0.14 de
0.37 a
0.33 ab
0.29 abc
0.26 abcd
0.11 e
0.0001
40.06
Valores con la misma letra son estadísticamente iguales (Tukey, P<0.05)
5.5.3. Índice de severidad y necrosis
El
análisis
estadístico
para
estas
dos variables
mostró
diferencias
significativas entre las plantas de los tratamientos a partir de los 18 días
después de inoculado el patógeno, siendo las plantas del tratamiento F las
que mayor índice de severidad y necrosis tuvieron hasta el final del
experimento (Figura 10). Las plantas que menores rangos tuvieron de
severidad y necrosis fueron las inoculadas con el patógeno mas HMA y P.
putida en sus dos concentraciones (104 y 109 cel—mL-1).
64
120
Índice de severidad
100
80
60
40
20
0
45
54
63
72
Días despues de la inoculación
P4F
P9F
HF
P4HF
P9HF
F
120
Índice de necrosis
100
80
60
40
20
0
45
54
63
72
Días despues de la inoculación
P4F
P9HF
P9F
F
HF
P4HF
Figura 10. Dinámica de severidad y necrosis evaluadas durante 72 días en
plantas de Carica papaya inoculadas con HMA, P putida y Fusarium
oxysporum
65
5.5.4. Evaluación de la colonización de HMA y P. putida en plántulas de
papayo
El análisis estadístico para la variable porciento de colonización micorrízica
mostró diferencias significativas entre las plantas de los tratamientos tanto
a los 36 días después de la inoculación (ddi) como al final del experimento
(72 ddi) (Cuadro 13). Obteniendo los mayores porcentajes de colonización
en las dos fechas de evaluación las plantas que fueron inoculadas con la
rizobacteria (a una concentración de 104 cel—mL-1) y el complejo de HMA
(tratamiento P4H).
Los demás tratamientos donde las plantas fueron inoculadas de manera
dual con los dos microorganismos benéficos en todos los casos, siempre
presentaron mayores valores de colonización en comparación en aquellas
donde solo se incorporo de manera individual tanto rizobacteria como
hongo micorrízico.
Cuadro 13. Porcentaje de colonización micorrizíca evaluado en plantas de
papayo a los 36 y 72 días después de la inoculación (ddi) con HMA, P.
putida y F. oxysporum
Tratamiento
Pp4
Pp9
H
P4F
P9F
HF
P4H
P9H
P4HF
P9HF
F
C
Pr > F
C.V. (%)
Colonización micorrízica (%)
36 ddi
72 ddi
0 e*
0 e*
0e
0e
45 d
64 d
0e
0e
0e
0e
43 d
60 d
62 a
82 a
55 c
80 a
57 bc
75 b
59 ab
69 c
0e
0e
0e
0e
0.0001
0.0001
2.06
2.16
Valores con la misma letra son estadísticamente iguales (Tukey, P<0.05)
*Los datos se transformaron para realizar el análisis de varianza con la formula raíz de (X+1)
66
Para el caso de las unidades formadoras de colonias (UFC), las plantas que
presentaron mayor colonización por parte de la rizobacteria fueron las
inoculadas con este microorganismo mas los hongos micorrízicos (complejo
MTZ-1), específicamente los tratamientos P4H y P9H para las dos fechas de
valuación
(Cuadro
14),
los
demás
tratamientos
incrementaron
su
población de una fecha a otra, resaltando siempre los inoculados con
HMA mas rizobacteria.
Cuadro 14. Unidades formadoras de colonias (UFC) cuantificadas en
plantas de papayo inoculadas con HMA, P. putida y F. oxysporum
Tratamiento
P4
P9
H
P4F
P9F
HF
P4H
P9H
P4HF
P9HF
F
C
Unidades formadoras de colonias
36 ddi
72 ddi
9
3.3 x 10
4.1 x 1010
9
2.9 x 10
3.1 x 1010
0
0
3.7 x 1010
2.8 x 108
2.5 x 108
2.6 x 1010
0
0
4.1 x 1011
5.6 x 1010
5.1 x 1010
2.9 x 1011
9
5.2 x 10
1.8 x 1011
9
4.7 x 10
1.6 x 1010
0
0
0
0
67
VI. DISCUSIÓN
6.1. Pseudomonas fluorescentes y su capacidad de inhibir in vitro el
crecimiento de Fusarium oxysporum y Pythium sp.
Aunque la inhibición in vitro del crecimiento tanto de F. oxysporum como
de Pythium sp. fue llevada a cabo por todas las Pseudomonas
fluorescentes en al menos uno de los medios de cultivo probados (Cuadro
9 y 10), solo una de ellas (la catalogada con el No. 3) logró un control del
crecimiento de los hongos en todos los medios de cultivo, disminuyendo la
formación del micelio aereo sin llegar a tocar el halo que la bacteria
produjo en las placas de petri, el cual presentaba un color verde
fluorescente cuando la bacteria crecía en los medios sin fierro, lo que se
debió a la producción de algún tipo de sideroforo que las bacterias de
este género producen y que en este experimento se identifico como del
tipo pseudobactina (Figura 3)(Muñoz, 1993). En los medios adicionados con
fierro el halo se observó sin fluorescencia y de color café claro. La
inhibición de los patógenos en estos medios de cultivo posiblemente se
deba a que las rizobacterias estén produciendo algún tipo de antibiótico u
otro metabolito secundario, que no está permitiendo el crecimiento radial
de los hongos fitopatógenos.
Las diferentes respuestas en inhibición del crecimiento de las rizobacterias
hacia los hongos fitopatógenos, se debe por una parte a su capacidad de
producir metabolitos en los medios de cultivo y por otra a la adaptación
de estos microorganismos a los diferentes componentes del sustrato
(medios de cultivo) a las que fueron sometidas, por lo que los mejores
aislamientos que mostraron mejor adaptación bajo esta circunstancia y
que además controlaron el crecimiento de los fitopatógenos, se pueden
considerar organismos con un alto potencial de control biológico. Glick
68
(1995), menciona que uno de los métodos de selección más utilizados para
obtener microorganismos como agentes de control biológico en el
laboratorio, es por su capacidad de producir metabolitos que inhiban el
crecimiento in vitro de hongos patógenos del suelo, siendo estas sustancias
(sideróforos, HCN o antibióticos) las que favorecen el control biológico del
patógeno, permitiendo seleccionar aquel microorganismo con capacidad
de producir una o más sustancias de este tipo.
Reddy et al., (1993), evaluaron 120 cepas rizobacterianas de diversos
géneros y especies, resaltando Pseudomonas putida y P. fluorescens como
los microorganismos que inhibieron significativamente (P<0.05) in vitro el
crecimiento miceliar de Pythium ultimum, Rhizoctonia solani
y Fusarium
solani, lo que probablemente algún mecanismos de control biológico
(como la producción de sideróforos, HCN, entre otros), estén provocando
esta reducción del crecimiento por parte de los hongos. Schmidli et al.,
(1997), encontraron resultados similares cuando la cepa CHA0 de
Pseudomonas fluorecens (productora de metabolitos como el pioluteorin,
ácido salicílico, pioquelin y pioverdin), inhibió significativamente (P<0.05) in
vitro el crecimiento de Pythium ultimum y Gaeumannomyces graminis en
comparación de la cepa mutante CHA89 la cual no presentó ningún nivel
de inhibición hacia estos patógenos.
Por su parte Frändberg y Schnürer (1998), aislaron 109 bacterias
provenientes de cereales con actividad de producir quitinasa, del total de
los aislamientos solo entre el 2% y 5% inhibieron in vitro el crecimiento de
Penicillium roqueforti, cuando las mejores cepas fueron probadas contra
otros microorganismos resalto la K122 perteneciente a Streptomyces
halsteddi logrando un porcentaje promedio de inhibición del 65% contra
Aspergillus flavus, A. fumigatus, Fusarium sporotrichoides, Heterobasidion
69
annosum, Microsporum canis, Mucor hiemalis, Penicillium roqueforti,
Phytophthora infestans, Rhizoctonia solani, Rhizopus stolonifer y Talaromyces
flavus. Landa et al. (2001), aislaron 23 rizobacterias de la rizosfera de
garbanzo y evaluaron su capacidad de inhibir in vitro el crecimiento de
Fusarium oxysporum f. sp. ciceris, encontrando que del total de
aislamientos,
19
de
ellos
pertenecientes
a
los
géneros
Bacillus,
Paenibacillus, Pseudomonas y Stenotrophomonas, que lograron inhibir
significativamente (P < 0.05) el crecimiento hifal del patógeno, quizás
debido a la producción de algún metabolito secundario como los
antibióticos o sideróforos que estén interfiriendo en la expansión del micelio
en los medios de cultivo.
6.2. Efecto de diferentes concentraciones de Pseudomonas putida y P.
fluorescens en el crecimiento y desarrollo de plántulas de papayo var.
Maradol
Las plántulas de papayo que mayores incrementos tuvieron en crecimiento
y desarrollo fueron las inoculadas con la cepa nativa de P. putida,
concretamente
cuando
este
microorganismo
se
inoculó
con
la
concentración más baja (104 celulas—mL-1) evaluada en este experimento,
caso contrario resultó ser el de P. fluorescens, donde las plantas
respondieron
mejor
con
la
concentración
más
alta
con
este
microorganismo. Esto permite inferir tres cuestiones:
a) Al inocular una gran cantidad de células bacterianas en la
rizosfera de las plantas, éstas por consecuencia tienen una exigencia
mayor en cuanto a aumentar la cantidad de exudados radicales que le
permitan mantener la alta demanda de carbono que las poblaciones de
microorganismos demandan, trayendo como consecuencia que las
70
plantas en principio no se vean beneficiadas con esta asociación,
reflejando un menor crecimiento y desarrollo
b) Algunas bacterias que son inoculadas en las plantas invaden
inmediatamente el cortex de la raíz proliferando dentro del tejido vascular,
lo que hace que algunas veces el efecto positivo en las plantas sea mas
lento debido a que estas poblaciones endofitas son directamente
afectadas por factores abióticos que influyen en el comportamiento de las
plantas, lo que hace que a veces estos microorganismos no se adapten y
mueran antes de empezar sus efectos positivos en ellas.
c) Los incrementos de las plantas de papayo a la inoculación con la
cepa nativa de P. putida probablemente está relacionado con la
adaptación a las condiciones fisiológicas de las raíces de la plantas de
papayo de donde fue aislada originalmente, mismas que al exudar ciertos
tipos de substancias radicales (las cuales cambian en tipo, cantidad y
calidad, de acuerdo a la planta que se trate) estén condicionando a los
microorganismos que existen en el suelo, siendo esta circunstancia
favorable para la rizobacteria nativa y no para la introducida (P.
fluorescens cepa A9).
Al respecto de estos tres puntos Pillay y Nowak (1997), establecen que la
promoción del crecimiento de las plantas está relacionado con el grado
de colonización que las rizobacterias establezcan en la raíz, sin embargo
existen factores como la cantidad de inóculo, temperatura del ambiente y
genotipo de la planta que influyen sobre las poblaciones bacterianas
afectando en mayor grado aquellas de menor afinidad con el hospedero
lo que influye directamente sobre el crecimiento y desarrollo de las plantas.
Ikeda et al., (1998), por su parte comentan que las plantas crecerán y
71
desarrollarán de manera exitosa, en la medida que las bacterias se logren
adaptar a las condiciones de pH, tipo de suelo, temperatura, tipo de
planta y otros microorganismos del suelo, para colonizar el sistemas radical
de las plantas. Hallmann et al., (1997) y Quadt-Hhallmann et al., (1997),
indican que existen otros agentes abióticos como la humedad del suelo,
factores edáficos y radiación UV que afectan a las plantas y a los procesos
de colonización de las rizobacterias sobre todo de las poblaciones de
microorganismos endófitos.
Otro factor importante que condiciona la simbiosis microorganismo-planta,
son los exudados radicales, los cuales seleccionan de manera indirecta los
tipos
de
poblaciones
microbianas
que
existen
en
la
rizosfera,
beneficiándose solo aquellos que estén con la capacidad de asimilar las
diferentes fuentes de carbón que las plantas estén emitiendo, limitando el
crecimiento de aquellas otras que no tengan la capacidad de incorporar
a su sistema fisiológico ese tipo de sustancias (Simons et al., 1996; Dekkers et
al., 1998; Raven y Edwards, 2001; Weissmann y Gerhardson, 2001).
En cuanto a los incrementos en las variables altura, número de hojas
(Figura 4), área foliar (Figura 5) y biomasa fresca y seca (Cuadro 11)
evaluadas en las plántulas de papayo inoculadas con las rizobacterias
están relacionados, quizás con la producción de algún tipo de hormona
(como las giberelinas, auxinas, citocininas, entre otras) que estos
microorganismos están sintetizando y que están influyendo de manera
positiva en las plantas, posiblemente teniendo un efecto directo en el
aumento de raíces (principalmente en la formación de pelos absorbentes),
lo cual incrementa en las plantas su capacidad de exploración y
desplazamiento en el suelo, aumentando principalmente su absorción de
agua y nutrimentos, reflejando este beneficio en un aumento en su
72
crecimiento y desarrollo, en comparación a las plantas no inoculadas con
estos microorganismos.
Al respecto Patten y Glick (1996), comentan que este mecanismo de
promoción del crecimiento de las plantas llevada a cabo por las
rizobacterias
es
muy
característico
de
los
géneros
Pseudomonas,
Azospirillum, Enterobacter, entre otros, los cuales generalmente sintetizan
hormonas del crecimiento como el ácido-indol-acético (AIA), el cual tiene
un efecto primario en aumentar el crecimiento y desarrollo de las plantas.
Glick et al., (1997), evaluaron incrementos en el peso fresco de follaje (11.9
mg) en plantas de canola inoculadas con Pseudomonas putida mientras
que las plantas sin inocular presentaron los valores mas bajos (8.2 mg).
Resultados que concuerdan con lo reportado por Chiarini et al. (1998), los
cuales cuantificaron aumentos significativos (P<0.05) en el peso fresco de
follaje (7.03 g) y raíz (7.62 g) en plantas de sorgo inoculadas con
Pseudomonas fluorescens y Burkholderia cepacia en comparación a las
plantas no inoculadas con valores de 3.98 g y 5.13 g respectivamente.
Conn et al. (1997), reportan aumentos en el peso fresco raíz (22.9 mg) de
plantas de papa inoculadas con la cepa mutante PsJN de Pseudomonas
sp. en comparación con las plantas control (4.5 mg).
6.3. Respuesta de plántulas de papayo var. Maradol a diferentes
concentraciones de Fusarium oxysporum
A los 15 días después de inoculado el patógeno (ddi) se observó que las
hojas de las plántulas de papayo presentaban líneas cloróticas de color
verde claro, característica muy marcada para las plantas que fueron
inoculadas con las dosis de 5 y 7 conidias/g de suelo seco de Fusarium
oxysporum. A medida que paso el tiempo (25 ddi) las plantas presentaron
mayor nivel de clorosis hasta alcanzar la marchitez total y por
73
consecuencia la muerte y caída de las hojas. Las plantas donde se
inocularon solo 3 conidias/g de suelo seco solo presentaron en algunas
hojas, líneas cloróticas a través de toda la lámina foliar, sin llegar a mostrar
en ningún momento necrosis a nivel del cuello de la planta. Estas
diferencias en sintomatología pueden estar relacionadas con la cantidad
de inoculó que se utilizó en este experimento pudiéndose originar distintas
respuestas del hospedero, sobre todo cuando las plantas fueron
inoculadas con la dosis más baja (3 conidias/g de suelo seco) del
patógeno, originando que los síntomas no fueran mas severos con relación
a las plantas inoculadas con las otras dosis, indicando posiblemente que el
patógeno vive como saprofito en la planta sin causarle la muerte y por
consecuencia no generando una sintomatología muy marcada.
Estos resultados se asemejan con los obtenidos por Reddy et al. (1993),
donde probaron tres dosis de conidias de Fusarium solani en plantas de
fríjol evaluando los mas altos índices de severidad de la enfermedad (entre
51% y 80%) con la concentración mas alta (7 conidias/g vermiculita) del
patógeno, concluyendo estos autores que en la medida que se aumenta
la dosis del hongo se incrementan los niveles de la enfermedad. Por su
parte Rekah et al. (2000), cuantificaron en plantas de jitomate los mas altos
índices de enfermedad (65%) ocasionada por Fusarium oxysporum f. sp.
lycopersici con las dosis de 104 macroconidias/ mL en comparación con la
concentración de 102 las cuales presentaron en menor grado, raíces
necrosadas y cambios en la coloración del tallo, por lo que al aumentar la
dosis los síntomas de la enfermedad se incrementan.
Esto se puede observar en la Figura 7 donde las plantas que mayor índice
de severidad y necrosis presentaron fueron las inoculadas con la dosis más
alta e intermedia del patógeno, observando en las plantas de estos
74
tratamientos una coloración marrón claro en la base del tallo con una
trayectoria ascendente, acentuándose esta sintomatología a medida que
avanzó la enfermedad, lo cual muestra que el hongo obstruye los tejidos
vasculares, impidiendo principalmente el paso de agua y nutrimentos en la
planta,
presentando
un
ahorcamiento
del
tallo
el
cual
es
una
sintomatología típica del damping-off. En las plantas también se observó
poco desarrollo del sistema radical y las pocas raíces que estas formaron,
se encontraban con necrosis tanto de las raíces secundarias como de la
principal, lo cual habla de la invasión que este hongo patógeno hizo hacia
las raíces de las plantas. Al final del experimento se realizó el reaislamiento
del patógeno, pudiendo constatar la presencia de este en todos los casos.
Al respecto Wolcan et al., (1999), reportan los mismos síntomas cuando
plantas de Lilum fueron inoculadas con F. oxysporum y F. moniliforme, las
cuales presentaron amarillamiento de las hojas en sentido ascendente con
respecto al tallo, necrosis de color marrón a negro que afecta a los tejidos
parenquimáticos y/o vascular de los tallos y pérdida de hojas además de
una baja producción de raíces absorventes.
Khalil et al., (2001), observaron que el ataque de F. oxysporum f. sp. gladioli
en plantas de gladiola se presenta afectando los cormos, observando
pudrición en los anillos concéntricos de su estructura, iniciando las lesiones
en la parte inferior de éste, justo donde inician las raicillas, por lo que los
síntomas son amarillamiento foliar y posteriormente, la muerte de las
plantas.
Monera (1999), comenta que en sandia una de las limitante mas
importantes de este cultivo es el ataque de F. oxysporum, el cual una vez
que penetra por las raíces, dificulta la ascensión y circulación de la savia,
75
produciendo un pardeamiento del tejido leñoso y una exudación gomosa,
presentando las hojas un amarillamiento claro, terminando las plantas por
morir a los tres o cuatro días de observar la presencia de la enfermedad.
6.4. Efecto de la inoculación dual de HMA y P. putida en plantas de
papayo para controlar Fusarium oxysporum agente causal del damping-off
El efecto de la inoculación dual de HMA y rizobacteria en el crecimiento y
desarrolló de plantas de papayo fue benéfico debido a que se observaron
incrementos en altura y número de hojas (Figura 8), área foliar (Figura 9) y
biomasa fresca y seca (Cuadro 12) en comparación cuando estos
microorganismos fueron inoculados de manera separada y a las plantas sin
inocular (Tratamiento C). Posiblemente estos efectos se deben a:
a) Un incremento posiblemente en la asimilación de nutrimentos del
suelo debido principalmente a la colonización de los hongos micorrizicos,
los cuales aumentaron la capacidad de exploración de las raíces de las
plantas de papayo en el suelo (hecho que se cuantificó en la cantidad de
biomasa evaluada al final del experimento, cuadro 12), influyendo en una
mayor captación de nutrimentos (principalmente de fósforo) y de agua.
Este efecto posiblemente se incremento en el sentido que las plantas
inoculadas con HMA y rizobacterias tuvieron el mayor porcentaje de
colonización micorrízica (Cuadro 13) en las plantas, lo que probablemente
afecto de manera positiva en el aumento en la nutrición de estas plantas
en comparación con las que solo fueron inoculadas con estos endófitos de
manera individual (tratamiento H).
Toro et al. (1997), encontraron que los niveles de colonización micorrízica
de Glomus intraradices en plantas de cebolla se incrementó en un 33%
76
cuando estas fueron co-inoculadas con la rizobacteria Bacillus subtilis y
aumentó en un 50% mas cuando las plantas fueron fertilizadas con roca
fosfórica, lo que influyó en el aumento en la nutrición de las plantas
cuantificando significativamente (P<0.05) incrementos en el peso seco del
follaje (66% y 100%), contenido de fósforo foliar (38% y 60%) y nitrógeno
foliar (33% y 42%) con relación a las plantas sin inocular. Gryndler et al.
(1995), encontraron que plantas de maíz inoculadas de manera dual con
bacterias y HMA (Glomus fasciculatum) incrementaron el porcentaje de
colonización micorrízica (en un 88%) y el contenido de fósforo (117%) y
magnesio (13%) en los tejidos de las plantas, lo que permitió que las plantas
desarrollaran mas biomasa seca (4.33 g) con relación a las plantas control
(3.47 g).
Por su parte, Fester et al., (1999), cuantificaron en plantas de cebada un
incremento en el peso fresco de follaje cuando estas se inocularon con G.
intraradices
más
diferentes
rizobacterias
(Pseudomonas
fluorescens,
Rhizobium leguminosarum y Agrobacterium rhizogenes), alcanzando los
niveles mas altos (cercanos a 300 g de materia fresca) las plantas coinoculadas con el hongo micorrizico mas A. rhizogenes en comparación a
las plantas con solo este microorganismo(con 100 g de materia fresca), así
mismo los porcentajes de colonización micorrízica alcanzados solo con G.
intraradices fue de 20%, mientras que con la co-inoculación aumentaron
en un 40%, 50% y 60% respectivamente, permitiendo concluir que esta
simbiosis entre bacteria-hongo-hospedero aumentar positivamente el
crecimiento
y
desarrollo
de
las
plantas
debido
a
su
influencia
probablemente en la mejor de la nutrición vegetal.
b) Otro de los mecanismos por los cuales se hayan cuantificado estos
incrementos en las variables evaluadas se deba a que la rizobacteria esté
77
sintetizando algún tipo de hormona (giberelinas, auxinas, citocininas, entre
otras) que esta influyendo su crecimiento y desarrollo, efecto que como en
el caso anterior (inciso a) se este potencializando debido a que las plantas
inoculadas con este microorganismo mas HMA incremento la población
bacteriana (Cuadro 14), lo que posiblemente este evidenciando un mayor
aporte hormonal en comparación a las plantas inoculadas solo con este
organismo, influyendo en una mayor producción de biomasa radical
(Cuadro 12), que esta permitiéndoles a las plantas mayor capacidad de
absorción de nutrimentos y agua.
Al respecto Ravnskov et al., (1999b), observaron incrementos del 85% en la
biomasa radical y acumulación de fósforo (de 0.67 mg) en plantas de
pepino inoculadas con Pseudomonas fluorescens (cepa DF57) y Glomus
intraradices, contabilizando un mayor numero de colonias cuando estuvo
presente el hongo micorrízico (en un 2.16 x 107 UFC) en comparación a la
población que se cuantificó donde solo estuvo la bacteria (1.55 x 107 UFC),
lo que les permitió inferir que la rizobacteria al ser productora de
giberelinas y al estar en poblaciones mayores cuando las plantas fueron
co-inoculadas,
incremento
el
aporte
hormonal
hacia
las
plantas
permitiendo un mayor crecimiento y desarrollo.
Frey-Klett et al., (1999), cuantificaron incrementos en el peso seco de
plantas de Pseudotsuga cuando estas se encontraban inoculadas tanto
con
la
cepa
de
Pseudomonas
fluorecens
BBc6R8
y
el
hongo
ectomicorrízico Lacaria bicolor, presentando las plantas una población
bacteriana estable (8 x 105 UFC) y un incremento en el porciento de
colonización (69%) con relación aquellas que solo se inocularon con el
hongo (58%), confirmando por una parte la eficiencia de la rizobacteria, la
cual en reportes anteriores ha promovido el crecimiento de otras plantas y
78
por otro lado que la doble inoculación ayuda a las plantas a incrementar
el crecimiento y desarrollo de las mismas.
Por su parte Mar et al., (2000), encontraron una mayor población
bacteriana y aumentos en el peso seco de follaje (8 g) y raíz (1.9 g) de
plantas de maíz co-inoculadas con G. deserticola y Azospirillum brasilense
cepa Sp245 con relación a las plantas sin inocular (2.2 g y 0.8 g
respectivamente), efectos que se vieron favorecidos debido a que la
rizobacteria es productora de ácido indol-acético, el cual tuvo sus efectos
en aumentar el crecimiento y desarrollo de las plantas, además de
promover la germinación de esporas y el crecimiento micelial del hongo.
c) El efecto de la inoculación dual de hongos micorrízicos y
rizobacteria posiblemente este potencializando la acción individual de
cada uno de ellos, permitiendo para el caso particular de las plantas que
fueron
inoculadas
con
Fusarium
oxysporum
una
promoción
del
crecimiento, desarrollo y protección, lo cual posiblemente se deba a:
I) El control del patógeno por la producción de algún
metabolito secundario como HCN (ver inciso 5.1.2.), sideróforos (Figura 3),
antibióticos, entre otros, sintetizados por Pseudomonas putida.
Duijff et al., (1999), comentan que ciertas cepas de este tipo de
rizobacterias tienen la capacidad de suprimir el crecimiento de patógenos
del suelo, debido a su versátil capacidad de producir metabolitos
secundarios, ejemplo de ello es la cepa de Pseudomonas putida WCS358
la cual redujo la necrosis de raíz en Linum usitatissimum ocasionada por
Fusarium oxysporum, debido a la producción de pioverdina, el cual es un
sideroforo que tuvo un efecto directo en la inhibición del crecimiento del
79
micelio de este hongo. Por parte Delany et al., (2001), encontraron que la
rizobacteria Pseudomonas fluorescens F113 fue una agente efectivo para
el control biológico de Pythium ultimum en remolacha, debido a su
capacidad de producir el antibiótico 2,4-diacetilfloroglucinol el cual actúa
directamente sobre la degradación de la pared celular del hongo.
II) La competencia por espacio para invadir los tejidos radicales
ocasionado específicamente por los hongos micorrízicos desplazando
probablemente al patógeno o bien la protección del hospedero por estos
endófitos al funcionar como barreras físicas impidiendo específicamente la
penetración del micelio originado por el hongo patógeno hacia las raíces
de la planta, Gadkar et al. (2001), mencionan que la colonización de los
hongos hacia las raíces de las plantas comienza con la penetración e
invasión de los tejidos corticales por parte de las hifas de estos hongos,
estableciéndose intercelularmente a través de la formación de hifas,
arbusculos y vesículas, las cuales al establecerse longitudinalmente por
todas las raíces, las protegen indirectamente contra el micelio de otros
hongos, funcionando como barreras físicas lo cual permite disminuir los
puntos de penetración en la raíz.
Al respecto Dumas-Gaudot et al., (2000), comentan que posiblemente este
sea el primer mecanismo que los hongos micorrizicos tienen en la
protección de las plantas al bloquear la invasión de micelio de hongos
causantes de enfermedades.
III) El desencadenamiento de la resistencia en la planta como
respuesta a la inoculación de estos dos microorganismos (estímulos
externos) que posiblemente estén de manera indirecta estimulando en
ellas la producción de algún tipo de sustancia dentro de estas (como
80
glucanasas, quitinasa, ácido salicílico, entre otras) que están haciendo que
la planta sea tolerante al ataque de este patógeno.
Hoffland et al., (1996), reportan que plantas de remolacha resistieron el
ataque de Fusarium oxysporum f. sp. rapan probablemente debido al
incremento en el sistema de resistencia de la planta ocasionado por la
inoculación de la cepa de Pseudomonas fluorescens la cual bajo los
niveles de necrosis en las plantas.
Chen et al., (1999a), encontraron que la cepa de Pseudomonas 63-28
indujo
resistencia
en
plantas
de
pepino
al
ataque
de
Pythium
aphanidermatum debido a que este microorganismo sintetiza ácido
salicílico el cual tiene una influencia en el incremento en las defensas de
las plantas. Pozo et al. (1998), evaluaron que Glomus mosseae incremento
en jitomate la actividad de quitinasas y β-1,3-glucanasas, lo cual permitió a
las plantas aumentar sus defensas contra la invasión de Phytophthora
parasitica.
Al respecto Barker et al., (1998), mencionan que los hongos micorrizícos al
intentar colonizar el hospedero, disparan los mecanismos naturales de
defensa de las plantas contra esta invasión, lo cual les permite aumentar la
síntesis
de
flavonoides,
enzymas,
quitinasas,
entre
otras,
lo
que
indirectamente las ayuda a protegerse contra otros organismos como los
patógenos.
Blilou et al., (1999), cuantificaron en plantas de chícharo un incremento en
el contenido libre de ácido salicílico (3.2 µg) en la raíz, cuando estas fueron
inoculadas
de
manera
dual
con
Glomus
mosseae
y
Rhizobium
leguminosarum en comparación con las plantas no inoculadas (1.2 µg), lo
81
que permite inferir que posiblemente estas plantas resistan el ataque de
algún patógeno cuando estas se encuentren co-inoculadas tanto con
HMA y rizobacterias.
82
VII. CONCLUSIONES
a. Las plantas de papayo cuando fueron co-inoculadas con hongos
micorrízicos y rizobacteria, expresaron los mayores incrementos en
crecimiento y desarrollo con relación a aquellas que solo fueron
inoculadas con cada uno de estos microorganismos
b. Las plantas co-inoculadas con hongos micorrízicos, rizobacteria y
Fusarium oxysporum presentaron los índices más bajos de severidad y
necrosis, por lo que la protección ejercida por estos microorganismos se
potencializó cuando estos fueron inoculados de manera dual, en
comparación donde solo se utilizaron HMA y P. putida
c. La selección de rizobacterias como agentes de control biológico puede
iniciarse a través de pruebas in vitro donde se evalúe la capacidad de
estos microorganismos para antagonizar el crecimiento de patógenos del
suelo
d. Existe una mayor respuesta en crecimiento y desarrollo de plantas de
papayo a la inoculación de la rizobacteria nativa (Pseudomonas putida)
en comparación a la introducida (P. fluorescens)
e. Las dosis bacterianas que garanticen un crecimiento y desarrollo de las
plantas pueden establecerse entre 109 y 104 cel ·mL dependiendo de la
cepa que se trate
f. En la medida que se establezcan dosis de patógenos para inocular
plantas, la respuesta de éstas variara dependiendo la cantidad de
conidias inoculadas, lo cual se reflejara en un índice de severidad distinto
83
VIII. LITERATURA CITADA
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