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Universidad de Colima
Doctorado en Ciencias; Área: Biotecnología
Presencia de hongos micorrízicos arbusculares y contribución de Glomus
intraradices en la absorción y translocación de cinc y cobre en girasol
(Helianthus annuus L.) crecido en un suelo contaminado con residuos de
mina
Tesis
Que para obtener el grado de
Doctor en Ciencias; Área: Biotecnología
Presenta
Rosario Pineda Hernández
Asesores
Dr. Sergio Aguilar
Dra. Lucía Yolanda Varela Fregoso
Coasesores
Dra. María del Rocío Flores Bello
Dr. Javier Farías Larios
Dr. José Gerardo López Aguirre
Tecomán, Colima., Noviembre de 2004
AGRADECIMIENTOS
A mi padre Dios, en el poderoso nombre de Jesucristo te doy gracias por sostenerme en
mis momentos de desalientos, por ser mi fortaleza, mi guía y mi luz en el camino
hacia mi meta y por lograrla con éxito.
A la Dirección General de Educación en Ciencia y Tecnología del Mar, por la confianza
depositada al otórgame la beca comisión
para la realización de este estudio,
especialmente al Biólogo Manuel López Yañes por su valioso apoyo en todos los
trámites de la beca.
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por proporcionarme apoyo
econónico con una beca, que sin duda, sin ella, no hubiera sido posible la
realización de este proyecto.
A los directores del CET-MAR # 12, MVZ Martín Palomera Todd, y M. en C. Ramón
Ramos Crespo por el consecuente e invaluable apoyo manifestado durante el periodo
de la realización de este estudio.
A todos mis compañeros que laboran en el CET- MAR # 12 por todo el apoyo.
A la Universidad de Colima y autoridades que laboran en la Facultad de Ciencia Biológicas
Agropecuarias (FCBA) Campus Tecomán, por haberme permitido interactuar con
todos los investigadores que participan el posgrado y desarrollar el proyecto de
investigación.
A la Dra. Ma. del Rocío Flores Bello y el Dr. Sergio Aguilar Espinosa por ser quienes me
iniciaron en ese mundo maravilloso de los hongos micorrízicos, por su asesoría en
las múltiples actividades de campo y de laboratorio, sus constantes asesorías, sus
acertadas sugerencias y por su apoyo moral, durante la realización de este proyecto.
A la Dra. Lucía Varela Fregoso por haber formado parte de mi comité tutorial (como
directora adjunta) por compartir su amplia experiencia y conocimientos
relacionados con los hongos, por su tiempo dedicado en la elaboración de este
documento y sobre todo por su amistad.
Al Consejo Académico asignado al Programa donde realicé mis estudios de postgrados: Dr.
Sergio Aguilar Espinosa, Dra. Ma. del Rocío Flores Bello, Dr. Javier Farías Larios
y Dr. José Gerardo López Aguirre, por sus acertados observaciones e indicaciones
que de manera sustancial contribuyeron al enriquecimiento de este trabajo.
A las Dra. Marilu López Lavín, M. en C. Edelmira Galindo Velasco y al Dr. Oscar
Rebolledo Domínguez, por el apoyo brindado en esos momentos de angustia y
desaliento.
Al M. en C. César Andrés Angel Sahagún por su valiosa asesoría en el análisis estadístico e
interpretación de los datos generados de la evaluación de todos los bioensayos.
Finalmente expreso mi reconocimiento a quienes de alguna forma contribuyeron en el logro
de la culminación de este proyecto. Entre ellas me refiero a las siguientes
personalidades:
Dr. David Crowley del Department of Environmental Science of University of California
en Riverside.
Dra. Corinne Leyval del Centre de Pédologie Biologique de Université de Nancy.
Dra. Ma. del Pilar Ortega Larrocea del Instituto de Geología de la Universidad Nacional
Autonoma de México.
Dr. Abdul Khan del College of Science, Technology and Environment, University of
Western Sydney,Campbelltown Campus, Locked Bag 1797. Penrith South NSW
1797 Australia.
Dr. José Miguel Barea Navarro de la Unidad Experimental del Zaidin en Granada España
DEDICATORIAS
A mis padres:
Sara y Rafael †gracias por traerme a este maravilloso camino de la vida, papá se que estas
con Dios muy contento porque alcance mi sueño.
A mis amados hijos Zyanya y Mixtli
Amados hijitos quiero decirles que son lo más valioso que Dios me ha dado, les
agradezco infinitamente toda su comprensión en esas largas de ausencia y por su
valiosa ayuda en la culminación mi trabajo.
A mi esposo Ing. Ramón Campos Mosqueda
Por todo su amor, paciencia y apoyo en todo el camino de este proyecto
A mis hermanos Connie, Teresa, Roma, Rafael, Primo, Bernardo y Rudy.
TODO LO PUEDO EN CRISTO QUE ME FORTALECE
(Filipenses 4: 13)
ÍNDICE
Página
ÍNDICE DE CUADROS
ÍNDICE DE FIGURAS
ABREVIATURAS
RESUMEN
ABSTRACT
1. INTRODUCCIÓN
2. ANTECEDENTES
2.1 Metales pesados
2.1.1 Metales pesados en el ambiente
2.1.2 Efecto de los metales pesados en suelos
2.2
2.3
2.4
2.5
2.6
Estrategias de remediación de suelos por métodos físicos y
químicos
2.2.1 Extracción
2.2.2 Sellado
2.2.3 Incineración
2.2.4 Tratamiento químico
2.2.5 Tratamiento electroquímico
Remediación de suelos por métodos biológicos
2.3.1. Biorremediación
2.3.2. Fitorremediación
2.3.3. Plantas hiperacumuladoras
2.3.4. Categorías de fitorremediación
Contribución de los microorganismos en la remediación de suelos
2.4.1. Interacción de microorganismos con los metales pesados
en la remediación de suelos
Hongos micorrízicos
2.5.1. Generalidades de los hongos micorrízicos
2.5.2. Clasificación de los diferentes hongos micorrízicos
Contribución de los HMA como mecanismo de recuperación de
suelos contaminados por metales pesados
2.6.1. Interacción de los HMA y los metales pesados
2.6.2. Función de los HMA en la fitorremediación de suelos
contaminados con metales pesados
2.6.3. Contribución de los HMA en la absorción y translocación
de los metales pesados por las plantas hiperacumuladoras
VII
VIII
IX
X
XI
1
6
6
6
11
21
23
23
24
25
26
27
27
28
32
40
42
42
47
47
49
52
52
54
61
Página
2.7
Importancia del cultivo de girasol (Helianthus annuus L.)
2.7.1. Origen
2.7.2. Características botánicas
2.7.3. Requerimientos edafoclimaticos
2.7.4. Particularidades del cultivo
2.7.5. Características del girasol como planta acumuladora para
ser escogida en este estudio
3 MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 Muestreo
3.1.1. Localización y descripción de los sitios de muestreo
3.1.2. Muestreo de suelos
3.1.3. Muestreo de raíces
3.2 Análisis físico y químicos del suelo colectado
3.2.1. Textura del suelo
3.2.2. pH del suelo
3.2.3. Conductividad eléctrica
3.2.4. Materia orgánica
3.3 Determinación de la concentración de metales pesados en suelo
3.4
3.5
3.6
3.7
3.8
3.9
colectado
Hongos micorrízicos arbusculares y colonización de las
plantas
3.4.1. Cuantificación de esporas
Determinación del porcentaje de colonización micorrízica
3.4.2. arbuscular
Selección del suelo de estudio
Propagación de los hongos micorrízicos arbusculares nativos
3.6.1. Cultivos trampa
3.6.2. Diversidad morfológica de HMA presentes en el suelo
de estudio
Contribución de Glomus intraradices en la absorción y
translocación de cinc y cobre
3.7.1. Desinfección de la semilla del girasol
3.7.2. Germinación de la semilla del girasol
3.7.3. Transplante
3.7.4. Inoculación
3.7.5. Duración del experimento
3.7.6 . Preparación y análisis de muestras
Variables evaluadas
Análisis estadístico
64
64
65
66
67
68
70
70
70
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80
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81
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84
84
85
85
Página
4
RESULTADOS
4.1 Análisis físicos y químicos de suelo
4.2 Concentración de metales pesados en los suelos muestreados
4.3 Cuantificación de esporas y determinación de la colonización
micorrízica arbuscular
4.4 Diversidad morfológica de HMA presentes en el suelo de estudio
4.5 Contribución de G. intraradices en la absorción y translocación del
Cu y Zn por plantas de girasol inoculada y no inoculadas
4.6 Número de esporas y colonización micorrízica al finalizar el
experimento
5
DISCUSIÓN
5.1 Análisis físicos y químicos de suelo
5.2 Concentración de metales pesados en los suelos muestreados
5.3 Cuantificación de esporas y determinación de la colonización
micorrízica arbuscular
5.4 Diversidad morfológica de HMA presentes en el suelo de estudio
5.5 Contribución de G. intraradices en la absorción y translocación
del Cu y Zn por plantas de girasol inoculadas y no inoculadas
5,6 Número de esporas y colonización micorrízica al finalizar el
experimento
6 CONCLUSIONES
7 LITERATURA CITADA
86
86
88
89
93
97
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100
100
102
104
106
107
111
112
114
ÍNDICE DE CUADROS
Página
Cuadro 1. Intervalos de límites normales y máximos permisibles
de metales pesados en suelo
19
Cuadro 2. Clasificación de contaminación y polución de suelos
contaminados
20
Cuadro 3. Clasificación actual de los hongos formadores de
micorriza arbuscular
52
Cuadro 4. Sitios muestreados
73
Cuadro 5. Características físicas y químicas de los suelos
muestreados
86
Cuadro 6. Concentración de metales pesados de los diferentes
sitios muestreados
88
Cuadro 7. Valores de la colonización micorrízica y el
número de esporas de los sitos muestreados
89
Cuadro 8. Absorción y translocación del Zn y Cu en plantas de
girasol inoculadas y no inoculadas, a los 40, 55 y 70 días
de crecimiento
98
ÍNDICE DE FIGURAS
Página
Figura 1. Ruta de incorporación de contaminantes del suelo a la
cadena alimenticia
7
Figura 2. Esquema mostrando la contaminación del suelo por metales
pesados
21
Figura 3. Categorías de fitorestauración de suelos contaminados
40
Figura 4 Esquema representativo de la asociación simbiótica entre
HMA-planta-metales pesados en suelos contaminados
47
Figura 5 Estructuras morfológicas de la micorríza arbuscular
50
Figura 6. Fenología de la planta de girasol
68
Figura 7. Mapa de la rivera del Río Marabasco, donde se indica la
ruta de los sitios muestreados
71
Figura 8. Panorámica de los diferentes sitios muestreados: Laguna de
Oxidación, Ávila Camacho, El Charco y El Centinela
72
Figura 9. Cultivo trampa utilizada en la propagación de los HMA
nativos de suelo con mayor concentración de Cu y Zn
79
Figura 10. Etapas de crecimiento de la planta de girasol: creciendo en
maceta con suelos
82
Figura 11. Planta de girasol creciendo en maceta con suelos después
del segundo muestreo a los 60 días de crecimiento
83
Figura 12. Espora globosa apreciándose hifa sustentora bulbosa
extraída de Ávila Camacho
90
Figura 13. Conjunto de esporas extraídas del sitio muestreado no
cultivado
91
Figura 14. Espora apreciándose la hifa en forma de embudo obtenida
de la zona no cultivada El Centinela, Jalisco, México
91
Figura 15. Hifas y vesículas de las raíces extraídas del suelo
muestreado Centinela no cultivado
92
Figura 16. Micelio externo y esporas extraído del suelo muestreado
Centinela no cultivad0
92
Figura 17 Arbusculos del sitio muestreado extraídas del sitio
muestreado Charco no cultivado
93
Figura 18.Espora globosa y espora subglobosa con hifa de sostén
extraída del suelo muestreado Centinela no cultivado
95
Figura 19.Espora rota mostrando doble pared extraída del suelo
muestreado Centinela no cultivado
95
Figura 20.Espora apreciándose hifa en forma de embudo extraída del
suelo muestreado Centinela no cultivado
96
Figura 21.Espora apreciándose hifa en forma de embudo, con pared
gruesa extraída del suelo muestreado Centinela no cultivado
96
ABREVIATURAS
Cd
Cadmio
Cr
Cromo
Cu
Cobre
HCl
Ácido clorhídrico
HNO3
Ácido nítrico
H2 O2
Agua oxigenada
HMA
Hongos micorrízicos arbusculares
FAA
Formol-alcohol-ácido
g
Gramo
Kg
Kilogramo
Km
Kilómetro
KOH
Hidróxido de potasio
MO
Materia orgánica
Pb
Plomo
pH
Potencial de hidrógeno
PVLG
Alcohol polivinilico lacto-glicerol
Zn
Cinc
RESUMEN
En el presente estudio se llevo a cabó un experimento en maceta con plantas de girasol
(Helianthus annus.L), inoculadas y no inoculadas con Glomus intraradices, para
determinar la contribución de los hongos micorrízicos arbusculares (HMA) en la absorción
y la translocación de Zn y de Cu, así mismo se determinó la presencia de HMA en suelos
irrigados con agua del río Marabasco, contaminada con metales pesados por filtraciones a
su cauce procedentes de la laguna de jales en donde se depositan residuos de mina. Se
muestrearon suelos de cuatro sitios seleccionados al azar a lo largo de un gradiente de 74
Km de longitud entre la laguna de oxidación situada en el municipio de Minatitlán, Colima
y la zona agrícola del municipio de Cihuatlán, Jalisco.
Se escogió el suelo con mayor concentración de Zn y Cu y con presencia de HMA nativos,
los cuales fueron propagados para su identificación. Posteriormente este suelo fue
esterilizado y en él se sembraron plantas de girasol inoculadas y no inoculadas con Glomus
intraradices. Al finalizar el experimento se cuantificó la concentración de Cu y Zn en la
raíz y en la parte aérea de las plantas de girasol inoculadas y no inoculadas. De acuerdo con
los resultados, se encontró una diferencia significativa entre los dos tratamientos y se
determinó que G. intraradices contribuye de manera positiva en la absorción de esos
metales por la raíz y redujo su paso hacia la parte aérea de la planta. El metal que se
absorbió en mayor cantidad fue el Cu y disminuyó su translocación hacia la parte aérea de
las plantas de girasol inoculadas. De la propagación de los HMA nativos se identificó
Glomus mosseae como la especie más representativa.
Palabras clave: Hongos micorrízicos arbusculares, Glomus, metales pesados,
fitoextracción, recuperación de suelos.
ABSTRACT
In the present study a pot experiment was conducted with plants of sunflower (Helianthus
annus L.), inoculated and not inoculated with Glomus intraradices, to determine the
contribution of arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) in absorption and translocation of Zn
and Cu; also the presence of AMF in soils irrigated with water of the Marabasco river,
contaminated with heavy metals by filtrations to its channel coming from the jales dam of a
mine wastes, was determined. Soils from four sites randomized throughout a gradient of 74
km in length, between the lagoon of oxidation located in the municipality of Minatitlán,
Colima and the agricultural zone of the municipality of Cihuatlán, Jalisco were sampled.
The soil with greater concentration of Zn and Cu and with presence of native AMF, was
chosen and native AMF were propagated for identification. Afterwards the soil was
sterilized and plants of sunflower inoculated and not inoculated with Glomus intraradices
were seeded in it. When finalizing the experiment the concentration of Cu and Zn in the
root and the aerial part of the inoculated and not inoculated plants of sunflower was
quantified. According with the results, a significant difference between both treatments was
found, and it was observed that G. intraradices contributed in a positive way in the
absorption of these metals by the root and reduced the passing towards the aerial part of the
plant. The metal that was absorbed in greater amount in the root was Cu, diminishing its
translocation towards the aerial part of the inoculated sunflower plant. The propagation of
the native populations of AMF, Glomus mosseae was identified as the most representative
species.
Keywords: arbuscular mycorrhizal fungi, Glomus, heavy metals, phytoextraction, soil
amendment
1. INTRODUCCIÓN
Uno de los problemas más señalados por la sociedad a nivel mundial que ocupa un lugar
prominente en los programas sociales y políticos es la de destacar la progresiva
degradación de los recursos naturales causada por la gran diversidad de contaminantes
tóxicos orgánicos e inorgánicos, tanto en la atmósfera, agua, suelo y subsuelo, procedentes
de diversas actividades naturales y antropogénicas, generando un irremediable deterioro en
el ambiente (Jensen et al., 2000; Khan et al., 1997; Adriano, 1992; McNeill y Waring.,
1992; Adriano, 1986).
Entre los contaminantes inorgánicos más nocivos para los seres vivos están los metales
pesados derivados principalmente de actividades mineras (Khan et al., 1997; Chen et
al.,1993; Alloway, 1990) que dan lugar a la pérdida irreversible de los recursos naturales
por no son biodegradables. Es necesario reducir los niveles de contaminación, minimizar
los elevados costos de restauración de suelos y cuerpos de agua contaminados, lo que
representa un enorme reto para la humanidad (McEldowney et al., 1993).
Con base en lo anterior existe la necesidad de desarrollar nuevas alternativas que permitan
recuperar los suelos altamente contaminados por metales pesados (Chaney et al., 2001;
Comis, 1996; Cunninghan y Lee, 1995; Chaney, 1983). Actualmente existen estudios
tendientes a resolver la contaminación originada por metales pesados en suelos, mediante
estrategias basadas en el uso de plantas que tienen la propiedad de acumular metales
pesados; proceso denominado “fitorremediación” que consiste en la remoción,
transferencia, estabilización y/o degradación y neutralización de compuestos orgánicos,
1
inorgánicos y radioactivos que resultan tóxicos en suelos y agua. Esta definición incluye
cualquier proceso biológico, químico o físico, inducido por las plantas, que ayude en la
absorción, degradación y metabolización de los contaminantes, ya sea por las plantas
mismas o por los microorganismos que se desarrollan en la rizósfera (Kabatas-Pendias y
Pendias, 2000; González, 1999; Kumar et al., 1995; Salt et al., 1995; Anderson y Coats,
1994; Baker et al., 1994; Raskin et al., 1994; Adriano, 1990).
Las limitantes que dichas plantas pueden encontrar en la recuperación de suelos
contaminados es la dificultad para establecerse y prosperar en situaciones adversas por la
contaminación; así como también su lento crecimiento y poco volumen radicular, por lo
que la importancia y beneficios de la simbiosis con los hongos micorrízicos en este sentido
es ampliamente reconocida (Khan et al., 2000; Leyval et al., 1997; Pawloswska, 1996;
Weissenhorn et al., 1995; Weissenhorn et al.,1993).
La capacidad de ciertos microorganismos de degradar contaminantes orgánicos como
hidrocarburos originó el término “biorremediación”, aplicado genéricamente a un grupo de
técnicas que utilizan procesos biológicos para la remediación de suelos y aguas, que
representan una de las técnicas más efectivas y de bajo costo en la recuperación de suelos y
aguas contaminadas (Besthelin et al., 1995; Lovley et al., 1995). Los procesos biológicos
involucran bacterias, hongos, algas, enzimas, así como plantas superiores incluyendo
árboles. Además de metabolizar y degradar compuestos orgánicos, los microorganismos
son capaces de absorber compuestos inorgánicos tóxicos, inmovilizándolos, y pueden
inhibir y/o catalizar diversas reacciones, ampliándose por lo tanto su campo de aplicación
2
(Meagher, 2000; Salt et al., 1999; Chaudhry et al., 1998; Raskin et al., 1997; Berthelin et
al.,1995; Brown et al., 1995; Chaney, 1983).
Los hongos micorrízicos arbusculares son microorganismos que habitan el suelo y
establecen una simbiosis de tipo mutualista con las raíces de una gran cantidad de plantas
(Turnau, 2002; Dodd, 2000; Barea et al., 1997; Turnau, 1993). Con respecto a la
importancia de la micorriza en la fitorremediación de suelos contaminados con metales
pesados, se ha comprobado que esta simbiosis tienen un efecto benéfico, ya que inmoviliza
los metales en la raíz reduciendo su translocación a la parte aérea de la planta y en
consecuencia, el flujo de metales a la cadena trófica (Pawlowska et al.,2000; Del Val et al.,
1999; Pawlowska et al.,1996; Barea et al., 1995; Leyval et al.,1995).
En el estado de Colima, concretamente en la región agrícola que colinda con el valle de
Cihuatlán, Jal., existen cultivos irrigados con afluentes del Río Marabasco que de acuerdo
con el resultado de análisis sobre la concentración de metales pesados realizados en sus
aguas presentan el contenidos de estos. Como consecuencia de esto, en la región agrícola
los lugareños denunciaron un pobre desarrollo de las plantas que ahí se cultivan.
Este suceso puede ser científicamente explicable tomando en cuenta que la literatura
reporta que en los afluentes de las industrias mineras existen concentraciones de metales
pesados más allá de las permisibles para un buen desarrollo de los cultivos. Estas altas
concentraciones causan fitotoxicidad interfiriendo con el desarrollo vegetal (Lasat, 2002;
3
Berti et al., 1995; Chaudhry et al., 1997a; Baker y Brooks, 1989). Una de las limitantes de
utilizar plantas para remediar suelos contaminados es la pobre masa radicular y entre las
poblaciones de microorganismos rizósfericos del suelo que contribuyen a aumentarla son
los hongos micorrízicos arbusculares. Por lo que el lograr maximizar la colonización
radicular por HMA en ambientes adversos como son los suelos contaminados con metales
pesados es ahora de gran interés (Khan et al., 2000; Chaudry et al.,1997b).
Con base en estos antecedentes en el presente trabajo, el interés de utilizar un modelo hasta
ahora no experimentado, que es la utilización de plantas de girasol asociadas con hongos
micorrízicos nativos para tratar de contrarrestar los efectos tóxicos de los metales pesados
Zn y Cu, presentes en suelos contaminados con filtraciones de residuos de minas.
Para abordar este problema se planteó el siguiente cuestionamiento: ¿La presencia de HMA
y la asociación de Glomus intraradices con girasol (Helianthus annuus L.) crecido en un
suelo contaminado con residuos de mina, aumentará la absorción y la translocación de
metales pesados?
Para dar respuesta a la pregunta anterior, se estableció la siguiente hipótesis: La presencia
de HMA y la contribución de Glomus intraradices en girasol (Helianthus annuus L.)
crecido en un suelo contaminado con residuos de mina, aumenta la absorción y
translocación de metales pesados.
4
Objetivo general
Evaluar la presencia de los hongos micorrízicos arbusculares y la contribución del Glomus
intraradices en girasol (Helianthus annuus L.) crecido en un suelo contaminado con
residuos de mina.
Objetivos particulares
Determinar las características físicas y químicas; así como la concentración de metales
pesados en suelos contaminados con residuos de mina.
Determinar el número de esporas de HMA en el suelo de los sitios muestreados y la
colonización micorrízica presente en la planta más representativas de cada sitio.
Identificar a nivel de especie, la población de HMA nativos más representativa del suelo
seleccionado.
Evaluar la contribución de Glomus intraradices en la absorción y translocación de cinc y
cobre en la biomasa aérea y radicular de plantas de girasol inoculadas y no inoculadas.
5
2. ANTECEDENTES
2.1 Metales pesados
2.1.1. Metales pesados en el ambiente
Los metales pesados, son convencionalmente definidos como elementos con propiedades
metálicas (conductibilidad, ductilidad, etc), número atómico mayor de 20, y cuya densidad
es mayor a los 5 g / cm3. Se consideran metales pesados el cadmio, cromo, mercurio, zinc,
cobre, plata y arsénico. Estos elementos constituyen un grupo de gran importancia, ya que,
pese a que son esenciales para las células, en altas concentraciones pueden resultar tóxicos
para los seres vivos, como humanos, organismos del suelo, plantas y animales (Spain et al.,
2003; Liao et al., 2003).
En las últimas décadas con el acelerado desarrollo industrial y crecimiento de las
poblaciones, han generado serios problemas de contaminación por metales pesados,
provocando un incremento de su concentración en el ambiente y su migración a suelos no
contaminados, que deterioran su calidad del suelo, del aire y del agua. La exposición a estos
metales en los humanos, causa una amplia gama de enfermedades entre las que destacan:
enfermedad de Minamata, Itai-Itai, cáncer, anemia, daños hepáticos, renales, pulmonares y
en vías respiratorias (Hasler, 1998; Adriano, 1986).
.
Las principales fuentes de metales pesados son actividades naturales, como desgastes de
cerros, volcanes, que constituyen una fuente relevante de los metales pesados en el suelo,
así como también actividades antropogénicas como la industria minera que está catalogada
6
como una de las actividades industriales más generadora de metales pesados. Además de
refinerías, aguas residuales, procesos nucleares y de la manufactura de una gran variedad
productos como de baterías, componentes eléctricos, aleaciones de metales, plaguicidas y
fertilizantes (Roane et al.,1996; Alloway, 1990; Chaney, 1994; Chaney, 1993).
En la atmósfera, los metales originados por las fuentes de emisión como la combustión de
nafta con plomo, se encuentran como material suspendido en el aire que respiramos. Por
otro lado, las aguas residuales no tratadas y las provenientes de minas y fábricas,
contaminan a los ríos y las aguas subterráneas, y los desechos que contienen metales
tóxicos simplemente abandonados en el ambiente contaminando el suelo y se acumulan en
las plantas y los tejidos orgánicos (Liesko et al., 1999; Chen et al., 1992) (Fig. 1).
Figura. 1. Ruta de incorporación de contaminantes del suelo a la cadena alimenticia
(Martín, 2000).
7
Debido que los metales pesados no son química ni biológicamente degradables y una vez
emitidos pueden permanecer en el ambiente durante cientos de años. Además, su
concentración en los seres vivos aumenta a medida que son ingeridos por otros, por lo que
la ingesta de plantas o animales contaminados puede provocar síntomas de intoxicación
(Chaney et al., 2001; Licsko et al., 1999; McEldowney et al., 1993).
De acuerdo con Cabrera, (1999); Tunnell et al., (1996); Alloway, (1990); Sopper, (1988) la
actividad minera genera el desprendimiento de sustancias tóxicas, algunas de ellas
asociadas con la roca, otras utilizadas para la separación de los minerales que se extraen y
son difundidos en el ambiente las cuales se bioacumulan en el organismo humano
ocasionando envenenamiento y una amplia variedad de enfermedades al trabajador así
como también
a los habitantes de las comunidades próximas a una mina y en
concentraciones elevadas ocasionan la muerte.
Por ejemplo los polvos de plomo provocan alteraciones al sistema nervioso central,
desestabilizando el carácter, irritabilidad, insomnio, afecta las células reproductivas
derivándose de esto malformaciones congénitas, abortos, partos prematuros, insuficiencias
renales. En las familias mineras los niños son principalmente afectados, ocasionándoles
pérdidas de la capacidad de aprendizaje, y lento crecimiento. El plomo se acumula en los
huesos impidiendo la producción de la sangre.
El cadmio por su semejanza química con el cinc provoca síntomas similares y su principal
vía de acceso es la digestiva, debido al consumo de alimentos y agua contaminada. Otra vía
8
es la respiratoria por inhalación de aire contaminado, la intoxicación crónica causa severos
daños renales, debido a que este elemento se acumula en los riñones, disminuye la actividad
pulmonar causando cáncer pulmonar. Se han registrado, además, alteraciones genéticas
como malformaciones cerebrales y craneofaciales y complicaciones en el embarazo y parto.
El mercurio es un metal sumamente tóxico que puede permanecer en el ambiente
circundante a las minas durante cien años, es conocido como un tóxico celular porque
afecta la acción enzimática evitando así la catálisis deseada, o eliminando la función de la
enzima. Aproximadamente el 80% es absorbido por los pulmones, riñón, cerebro, hígado,
glóbulos rojos de la sangre y la leche materna.
El cinc está situado en el 26º lugar de la lista de los elementos más comunes. Desde el
punto de vista ecológico, se califica al cinc de la misma manera que al aluminio, plomo,
cadmio, mercurio, talio, etc. Participa con un 0.0058% en la formación de la corteza
terrestre. Su uso más difundido es el de aleación para piezas de fundición, como protección
superficial (galvanizado o cincado) de chapas y alambres de hierro y bienes de uso en
general (canaletas de desagüe, cubos (baldes), abrevaderos, materiales para techado, etc.).
El cobre es un elemento químico de símbolo Cu, con número atómico 29; uno de los
metales de transición e importante metal no ferroso. Su utilidad se debe a la combinación
de sus propiedades químicas, físicas y mecánicas, así como a sus propiedades eléctricas y
su abundancia. El cobre fue uno de los primeros metales usados por los humanos.
9
El cobre metálico se encuentra en mezclas (llamadas aleaciones) con otros metales tales
como latón y bronce, se encuentra como parte de otros compuestos formando sales. Las
sales de cobre ocurren naturalmente, pero también son manufacturadas, la más común es el
sulfato de cobre. La mayoría de sus compuestos son de color azul-verde, son usados
comúnmente en la agricultura para tratar enfermedades de las plantas, como el moho, para
tratar agua, y como preservativos para alimentos, cueros y telas.
De acuerdo con Kabata- Pendias y Pendias (2000) el cobre puede entrar al ambiente desde
minas y de otros metales y desde fábricas que manufacturan o usan cobre metálico o
compuestos de cobre, a través de aguas residuales domésticas, la combustión de materiales
combustibles fósiles y desechos, la producción de madera, la producción de abonos de
fosfato, y de fuentes naturales (por ejemplo, por polvo del suelo esparcido por el viento,
volcanes, vegetación en descomposición, incendios forestales y del rocío de agua de mar).
El cobre en el suelo se adhiere firmemente a materia orgánica y a minerales, se disuelve en
agua se une rápidamente a partículas suspendidas en el agua, generalmente no entra al agua
subterránea. El cobre que es transportado por partículas emitidas por fundiciones y plantas
que procesan minerales regresa al suelo por la gravedad o por la lluvia o nieve.
El cobre no se degrada en el ambiente y por eso se puede acumular en plantas y animales
cuando se encuentra en suelos. En suelos ricos en cobre sólo un número pequeño de plantas
pueden vivir. Por esta razón no hay diversidad de plantas cerca de las fábricas o minas de
cobre, debido a su efecto sobre las plantas, por lo que es una seria amenaza para la cadena
alimenticia. El cobre puede seriamente influir en el proceso de ciertas suelos agrícolas,
dependiendo de la acidez del suelo y la presencia de materia orgánica, puede interrumpir la
10
actividad en el suelo, su influencia negativa en la actividad de microorganismos y
lombrices de tierra. Cuando el suelo está contaminado con cobre, los animales pueden
absorber concentraciones que dañan su salud. Principalmente las ovejas sufren un gran
efecto por envenenamiento con cobre, debido a que los efectos se manifiestan a bajas
concentraciones.
La acumulación de cobre en el hígado lleva a un daño progresivo de este órgano cuya
expresión más severa es la cirrosis hepática. El depósito de cobre en el sistema nervioso
central produce un daño neurológico, que en algunos aspectos se parece a la enfermedad de
Parkinson, y que puede acompañarse de manifestaciones psiquiátricas. Al nivel de la córnea
la acumulación de cobre se aprecia como un anillo parduzco pericórneal (anillo de KayserFleisher). El daño a los tejidos se puede disminuir sometiendo en forma temprana a los
pacientes a una dieta con bajo contenido de cobre, junto con una terapia con compuestos
que disminuyan su absorción (el más usado es el cinc) y medicamentos que favorezcan la
eliminación del exceso utilizando agentes quelantes como el EDTA.
2.1.2. Efecto de los metales pesados en los suelos
Los metales pesados son elementos químicos, presentes en todo tipo de suelo y sus niveles
de abundancia se reporta en porcentajes y partes por millón. Cuando el nivel de su
contenido en el suelo es por abajo de los límites permitidos como se muestra en el cuadro
1. Presenta un efecto inocuo en la vegetación y en las poblaciones microbianas, además
también desempeña un papel biológico en diversas funciones de las células, lo que les ha
11
permitido estar agrupados bajo el nombre general de “micro-elementos”. Cuando el suelo
tiene un nivel alto dentro de los límites permitidos de estos elementos, el término que se usa
es el de metal pesado, provocando contaminación de suelos, en este caso se afecta a largo
plazo a las plantas y a los microorganismos. Cuando el contenido de metales pesados en el
suelo alcanzan niveles que rebasan los máximos permitidos causando efectos inmediatos
como inhibición del crecimiento normal y el desarrollo de las plantas, y causa un disturbio
funcional en otros componentes del ambiente así como la disminución de las poblaciones
microbianas del suelo, el término que se usa o se emplea es “polución de suelos” (Martín,
2000; Kabata-Pendias, 1995).
En el suelo, los metales pesados están presentes como iones libres, compuestos metálicos
solubles, compuestos insolubles como óxidos, carbonatos e hidróxidos. Su acción directa
sobre los seres vivos ocurre a través del bloqueo de las actividades biológicas, es decir, la
inactivación enzimática por la formación de enlaces entre el metal y los grupos -SH
(sulfhidrilos) de las proteínas, causando daños irreversibles en los diferentes organismos.
Para que los metales pesados puedan ejercer su toxicidad sobre un ser vivo, éstos deben
encontrarse disponibles para ser captados por éste, es decir que el metal debe estar
biodisponible. El concepto de biodisponibilidad se encuentra íntimamente relacionado con
las condiciones fisicoquímicas del ambiente, que determinan la especiación y por lo tanto la
concentración de metal libre y lábil. Por ello es fundamental al determinar el grado de
contaminación por metales pesados de un ambiente, conocer su biodisponibilidad, es decir,
la concentración de metal libre presente en la muestra (Lloyd y Lovley, 2000).
12
Aproximadamente en un 10% de los metales se encuentran
como contenido nativo
pertenecientes a materiales de algunos suelos, pero más del 90% llegan al suelo por
deposiciones atmosféricas secas y húmedas y como resultado de algunas prácticas
agronómicas (Adriano, 1986). Algunos de estos metales como Cr, Cu, Co y Mo, son
elementos traza esenciales para animales, microorganismos y plantas, mientras otros no lo
son como Pb, Cd, Zn; sin embargo en altas concentraciones todos ellos son considerados
tóxicos. Su biodisponibilidad y toxicidad a microorganismos incluyendo hongos
micorrízicos, plantas y animales son influidos por diversos factores particularmente pH,
temperatura, potencial redox, capacidad de intercambio catiónico de la fase sólida y
competencia entre iones (Leyval et al., 1994; Schmit y Sticher, 1991).
La contaminación en suelos por metales pesados ocurre cuando estos son irrigados con
aguas procedentes de desechos de minas, aguas residuales contaminadas de parques
industriales y municipales, filtraciones de presas de jales (Zier et al., 1999; Wang et al.,
1992). Estos contaminantes pueden alcanzar niveles de concentración que provocan efectos
negativos en las propiedades físicas, químicas y biológicas como: reducción del contenido
de materia orgánica, disminución de nutrimentos, variación del pH generando suelos
ácidos, amplias fluctuaciones en la temperatura, efectos adversos en el número, diversidad
y actividad en los microorganismos de la rizósfera. También dificultan el crecimiento de
una cubierta vegetal protectora favoreciendo la aridez, erosión del suelo, y la dispersión de
los contaminantes hacia zonas y acuíferos adyacentes y como consecuencia aumenta la
vulnerabilidad de la planta al ataque por insectos, plagas y enfermedades, afectando su
desarrollo (Zhang et al., 2000; Cabrera et al., 1999).
13
El pH es un factor esencial, para que la mayoría de los metales tiendan a estar más
disponibles en un pH ácido, excepto As, Mo, Se y Cr, los cuales tienden a estar más
disponibles a pH alcalino es una variable importante para definir la movilidad del catión,
debido a que en medios con pH moderadamente alto se produce la precipitación como
hidróxidos. En medios muy alcalinos, pueden nuevamente pasar a la solución como
hidroxicomplejos. La adsorción de los metales pesados está fuertemente condicionada por
el pH del suelo y por tanto, también su biodisponibilidad de sus compuestos (Alloway,
1993).
La textura favorece la entrada e infiltración de la contaminación de metales pesados en el
suelo, por ejemplo la arcilla tiende a adsorber a los metales pesados, que quedan retenidos
en sus posiciones de cambio, por el contrario los suelos arenosos carecen de capacidad de
fijación de los metales pesados, los cuales pasan rápidamente al subsuelo y pueden
contaminar los niveles freáticos.
La materia orgánica, reacciona con los metales formando complejos de cambio y quelatos.
Los metales, una vez que forman quelatos o complejos, pueden migran con mayor facilidad
a lo largo del perfil del suelo. La materia orgánica puede adsorber tan fuertemente a
algunos metales, como es el Cu, que pueden quedar en forma no disponible por las plantas,
motivo por el cual, algunas plantas crecidas en suelos ricos en materia orgánica, presentan
carencia de elementos como el Cu., Pb y el Zn, eso no significa que los suelos no estén
contaminados ya que las poblaciones microbianas se reducen notablemente.
14
La complejación por la materia orgánica del suelo es una de los procesos que gobiernan la
solubilidad y la bioasimilación de metales pesados. La toxicidad de los metales pesados se
potencia en gran medida por su fuerte tendencia a formar complejos organometálicos, lo
que facilita su solubilidad, disponibilidad y dispersión. La estabilidad de muchos de estos
complejos frente a la degradación por los organismos del suelo es una causa muy
importante de la persistencia de la toxicidad. Pero también la presencia de abundantes
quelatos puede reducir la concentración de otros iones tóxicos en la solución del suelo
(Adriano, 1986; Alloway, 1990; Jackson y Alloway, 1993; Licsko et al., 1999).
Los metales pueden acumularse en tejidos vivos (bioacumularse) y luego ser transmitidos
de una especie animal a otra a través de la cadena alimenticia. Por ejemplo, un árbol puede
alimentarse de aguas subterráneas contaminadas con metales, acumular algunos de estos
metales en sus hojas, y luego hay pájaros que se alimentan de estas hojas y que pueden
verse afectados por la toxicidad de este metal (Cobb et al., 2000; Cabrera et al., 1987). La
toxicidad de los metales en la plantas pueden causar reducción en las raíces, quemaduras
en las hojas, deficiencia en los nutrimentos e incrementa su vulnerabilidad al ataque de
enfermedades e insectos (Angle et al., 1997; Kumar et al., 1995; Roane et al., 1994).
La utilización del lodo de aguas residuales en las regiones agrícolas aumenta la
concentración de metales pesados en suelo. Los estudios sugieren que las cosechas de
leguminosas, que dependen de la fijación simbiótica del N2, puedan ser sensibles a los
efectos tóxicos de los metales pesados presentes en dichos lodos. Así, se ha observado la
reducción en la nodulación, tamaño de la planta y actividad de la nitrogenasa en las plantas
15
del trébol blanco crecidas en un suelo altamente contaminado con Cd, Pb, y Zn (Rother et
al., 1993). Otros estudios han demostrado los efectos tóxicos de metales pesados en la
nodulación y actividad de la nitrogenasa (Vigue et al.,1991).
Dado que el arsénico es relativamente soluble en los ácidos y sales de arsénico el mayor
factor por controlar en la toxicidad del arsénico es su biodisponibilidad en el suelo y en la
planta; el arsénico soluble en agua es más fitotóxico que otras formas estrechamente
relacionadas (Sharpley, 1994). Los ácidos y sales de arsénico han sido usados en la
elaboración de plaguicidas durante muchos años, sin embargo esta práctica actualmente ha
dejado de utilizarse en el mundo.
La química y disponibilidad del cadmio en plantas de suelos agrícolas han sido estudiados,
un extenso parámetro de índices de la actividad biológica en suelos como la actividad
enzimática, fijación de nitrógeno y desnitrificación son ampliamente investigados (Chaney
et al., 2000), comparado con otros metales, el cadmio, es más movible en suelos en relación
a la lixiviación y disponibilidad en las plantas. Pero el cadmio es menos absorbido por el
suelo que el cobre, el níquel y el cinc, afortunadamente se encuentra presente en más bajas
concentraciones en fertilizantes, estiércol y biosólidos que otros metales (Vigue et al.,
1991).
Según Chaney et al., (2000) entre los factores más importantes encontrados que influyen en
absorción del cadmio por las plantas son las propiedades del suelo como materia orgánica,
pH, proporción Cd:Zn, niveles de hidruros de fierro, óxidos de manganeso, el nitrógeno
16
aplicado, niveles de cadmio en fertilizantes con fosfatos. El cinc provee protección contra
la transferencia del cadmio hacia la cadena alimenticia, por medio de su potencial para la
fitotoxicidad e inhibición de la absorción y translocación del cadmio en las plantas. Debido
a que el cinc y el cadmio son acumulados por las plantas en la proporción que se presentan
con elevadas concentraciones de cinc y cadmio, la máxima concentración foliar de cadmio
es limitada por la fitotoxicidad del cinc.
Aunque el cinc limita la máxima concentración de cadmio en las plantas y protege la
cadena alimenticia, la proporción Cd:Zn acerca de 0.010, solo el arroz y el tabaco son
capaces de transferir altos niveles de cadmio del suelo en forma biodisponible por ejemplo
cuando se fuma el tabaco se puede transferir cadmio hacia los pulmones (Chaney et al.,
2000).
El Cd y el Zn pueden llegar a las plantas y de ahí pasar al resto de la cadena trófica. Son
elementos bastante móviles. La contaminación por cadmio sin contaminación por cinc o
cobre es rara, el cadmio es incapaz de alcanzar los niveles fitotóxicos en suelos agrícolas
antes de que lo haga el cinc, reportándose concentraciones de metales en las plantas fuera
de los límites permisibles. De una manera u otra, la salud animal y humana son amenazadas
con las concentraciones de cadmio y cinc (Chaney et al., 2001; Chaney, 1993). Se han
realizado numerosas revisiones de literatura con respecto a la fitotoxicidad provocada por
metales. Steinborn (1999) estudió la fitotoxicidad por arsénico y encontró que diferentes
concentraciones de este elemento reducen la producción vegetal. Por ejemplo < 25 mg/kg
de arsénico en el suelo reducen la producción de frijol en un 14%; mientras que en otro
estudio se encontró que 414 mg/kg de As la redujo en un 30%.
17
El cobre, níquel y cinc
pueden ser tomados del suelo por las plantas a niveles
potencialmente tóxicos. Existen varios reportes acerca de la toxicidad de estos elementos:
(Chaney et al., 1997; Chaney, 1990) expresó una ligera evidencia de toxicidad por Cu o Zn
en pruebas de campo con aplicaciones por arriba de 213 mg Cu/ha y 1610 mg Zn/ha. Por
su parte Bertí y Huang (1995) reportaron toxicidad severa de Zn y Ni en maíz, sorgo y frijol
por acumulación de metal de 2100 mg Ni/ha y 11300 mg Zn /ha. El maíz es altamente
sensible a los metales pesados y la producción puede verse reducida hasta en un 50%.
En la agricultura debe prestarse atención a la contaminación por cinc con los lodos de
clarificación que se distribuyen sobre terrenos a cultivar, si es necesario, debe desistirse de
la explotación agrícola, ya que las plantas pueden acumularlo y llevar de esta manera la
contaminación al ser humano a través de la cadena alimentaría, lo que significa un riesgo
para su salud (Chaney, 1994), se puede detectar su acumulación en los suelos hasta un radio
de varios kilómetros de distancia de las plantas metalúrgicas, la acumulación en las plantas
produce necrosis y clorosis e inhibe el crecimiento.
Con el propósito de interpretar el nivel de los metales pesados en el suelo, solo han sido
considerados los valores iniciales de su contenido: valores analíticamente determinados
tanto en suelos normales no afectados por el impacto antropogénico como en suelos
afectados. Los valores que representan los límites máximos permitidos de concentración de
metales pesados en suelos fueron establecidos, principalmente aplicable al crecimiento y
desarrollo de plantas. Los lÍmites máximos permitidos fueron establecidos en Alemania, de
acuerdo con los resultados obtenidos de laboratorio, invernadero y experimentos de campo
18
(Cuadro 1). De acuerdo con Kloke (1980) y Chumbley (1991) los límites máximos
permitidos siguen siendo utilizadas en muchos países, como Holanda, Austria, Canada,
Japón y Estados Unidos de América.
Cuadro 1. Intervalos del contenidos de los límites normal y máximo permitidos de los
metales pesados en los suelos (Kloke 1980).
Intervalo de contenido normal
Límites máximos permitidos
Elementos
p.p.m.
químicos
Cadmio
0.1 - 1.0
3.0
Cobalto
1 - 10
50
Cromo
2 - 50
100
Cobre
1 - 20
100
Níquel
2- 5
50
Plomo
0.1 - 20
100
3 - 50
300
Cinc
En Polonia se ha evaluado la contaminación estableciendo un índice de contaminación/
polución (c / p) que se obtiene dividiendo la concentración de metal en el suelo y el límite
permitido, dando como resultado cinco clases de polución en suelos: 1) Ligera 2)
Moderada, 3) Considerable, 4) Muy contaminados y 5) Extremadamente contaminados,
(cuadro 2). La clase 3, suelos considerablemente contaminados, presentará riesgo de
19
contaminación en cultivos. La clase 4 corresponde a suelos que no deben usarse para la
producción de plantas utilizadas en alimentación, sobre todo si se trata de suelos ácidos y
de textura ligera. La clase 5 debería excluirse de cualquier uso agrícola y proceder, dentro
de lo posible, a su limpieza (Raskin et al., 1994; Kabata - Pendias, 1995).
Cuadro 2. Clasificación de contaminación y polución (c/p) de suelos (Kabata - Pendias
1995).
Índice c/p
 0.1
0.10 – 0.25
0.26 – 0.50
0.51 – 0.75
0.76 – 1.00
1.1 – 2.0
2.1 – 4.0
4.1 - 8.0
8.1 – 16.0
16.0
Significado
Contaminación muy leve
Contaminación leve
Contaminación moderada
Contaminación severa
Contaminación muy severa
Polución leve
Polución moderada
Polución severa
Polución muy severa
Polución excesiva
.
Los metales pesados incorporados al suelo pueden seguir cuatro diferentes vías:

pueden quedar retenidos en el suelo, ya sea disueltos en la solución del suelo o bien
fijados por procesos de adsorción, complejación y precipitación

pueden ser absorbidos por las plantas y así incorporarse a las cadenas tróficas

pueden pasar a la atmósfera por volatilización

pueden movilizarse a las aguas superficiales o subterráneas (Fig. 2 ).
20
Figura 2. Esquema mostrando la contaminación por metales pesados en el suelo (Calvo de
Anta, 1997).
2.2. Estrategias de remediación de suelos por métodos químicos y físicos
La contaminación del suelo por metales pesados representa un grave problema a nivel
mundial, debido a ello se han desarrollado tecnologías para reducir y/o enmendar el riesgo
de la contaminación de agua y suelos contaminados con metales pesados. La contaminación
de suelos por metales puede ser remediada por técnicas químicas, físicas y biológicas y son
21
agrupadas en dos categorías: a) in situ, este método remedia el suelo contaminado sin la
remoción del mismo y b) técnicas ex situ, las cuales por el tratamiento los suelos
contaminados requieren ser removidos del sitio. Las técnicas in situ tienen mayores
ventajas que las de ex situ debido a su bajo costo y a su reducido impacto en el
ecosistema (Chen et al., 1997).
La remediación del suelo es necesaria para eliminar o disminuir los riesgos a los humanos y
al ambiente de la toxicidad de los metales. Las enfermedades en el hombre son el resultado
de la alta concentración de Cd , Se, Zn, Cu, Cr, y Pb en suelo (Chaney et al., 1999), el
ganado y la fauna son dañados por estos metales (Raskin et al., 1994). La contaminación
del suelo con Zn, Ni y Cu causada por desechos de minas y fundidoras es conocida la
sensibilidad de las plantas (Chaney et al., 1999).
Las estrategias físicas y químicas de remediación más utilizadas para eliminar y/o reducir
los contaminantes del suelo son: extracción, sellado, incineración, excavación, tratamiento
químico y tratamiento electroquímico. No obstante, muchas de estas tecnologías son
costosas ya que su precio estimado de la recuperación de suelos en el mercado en Estados
Unidos de América fue aproximadamente de1-2 millones en 1997 incrementándose a 15-25
millones en el 2000 y probablemente 70 – 100 millones en 2005 (Cunninghan, 1996; Glass,
2000; McGrath et al., 2001).
Ciertas técnicas especializadas pueden exceder sus costos de 1000 dólares por tonelada, la
excavación de contaminantes, tiene un costo promedio de 1000 000 dólares por acre y su
22
eficacia es moderada, destruyendo la estructura del suelo así como su fertilidad, o la más
lamentable esparciendo la contaminación a sitios no contaminados (Adriano, 1996;
Alloway, 1993; McGrath et al., 1997; Raskin, 1997; Chaney et al., 2001). El problema es
más severo particularmente cuando grandes aéreas están contaminadas
con
radionucleótidos, como por ejemplo las áreas alrededor del reactor nuclear de Chernobyl.
2.2.1. Remediación de suelo por extracción
La extracción entre las más conocidas son el “Soil Washing” ó lavado de suelos, se realiza
habitualmente en depósito. Se basa en una separación o una reducción del volumen. El
rendimiento depende de la solubilidad de los compuestos contaminantes en la solución de
lavado que se utilice. Otra de las técnicas es conocida como “Soil Vacuum”. Se produce
una extracción de los contaminantes y se utiliza para eliminar compuestos orgánicos
volátiles y mercurio. Para potenciar la eficacia se puede utilizar además vapor de agua, una
modificación es la técnica de “Soil Venting”, donde se combina el efecto de extracción con
la inyección de aire. En este tipo de técnicas las características físicas y químicas del suelo
pueden alterar la eficacia de la técnica (Burns et al., 1996).
2.2.2. Remediación de suelo por sellado
La técnica del sellado trata al suelo con un agente que lo encapsula y lo aísla. El suelo es
excavado, la zona se sella con un impermeabilizante y se redeposita el suelo. Para
desarrollar las barreras de aislamiento se ha utilizado diversas sustancias, como el cemento,
23
cal, plásticos, arcilla, etc. El procedimiento tiene el inconveniente que se pueden producir
grietas por las que los contaminantes pueden fugarse. Sometiendo al suelo a altas
temperaturas (1600-2300°C) se consigue su vitrificación con lo que se llegan a fundir los
materiales del suelo, produciendose una masa vítrea similar a la obsidiana. Durante el
proceso hay que controlar la volatilización de numerosos compuestos. La propia filosofía
de estas técnicas (persigue la eliminación del suelo) las hace sólo recomendable en
situaciones extremas. En otras ocasiones se realiza el aislamiento directamente sobre los
niveles de aguas freáticas y mediante bombeos exhaustivos se consigue deprimir los niveles
freáticos para alejarlos del suelo y subsuelo contaminados (Huang et al., 1998).
2.2.3. Remediación de suelo por incineración
La incineración es una técnica apropiada para el tratamiento de residuos principalmente
para la fracción orgánica y combustible. Esta técnica reduce considerablemente el volumen
y la peligrosidad de los residuos. Sin embargo, debe considerar el tratamiento de las
emisiones atmosféricas, de los residuos líquidos; así como mismo la disposición apropiada
de las cenizas y escorias que se generan en el proceso.
La incineración de residuos no sólo se utiliza como una alternativa de tratamiento sino que
también para el aprovechamiento del poder calorífico contenido en los residuos. Algunos
procesos productivos, especialmente los de producción de cemento y de cal, presentan a
nivel mundial una experiencia importante en coincineración de residuos como combustibles
24
alternativos, en forma complementaria al combustible tradicional. En nuestro país, algunas
instalaciones ya realizan operaciones de coincineración de residuos y en el futuro se espera
que otras empresas productoras de cemento, cal y de productos forestales comiencen a
utilizar residuos como combustible, debido al menor costo que implica la utilización de
estos compuestos en la generación de calor (Adriano, 1992).
La incineración genera emisiones atmosféricas de contaminantes orgánicos e inorgánicos,
en forma de gases y partículas presentando un riesgo a la salud de la población expuesta. Su
dispersión puede darse a escala local y regional y su posterior deposición puede significar
un riesgo al patrimonio ambiental o a otras actividades productivas. Dependiendo de los
residuos utilizados, las emisiones a la atmósfera corresponderán a partículas totales en
suspensión cuya composición química puede estar formada por metales pesados y sus
compuestos u otras sustancias orgánicas e inorgánicas. Asimismo, las emisiones pueden
corresponder a sustancias en forma de gases, entre ellos los compuestos clorados y
fluorados (Cunningham et al., 1996).
2.2.4. Tratamiento químico
De acuerdo con Adriano (1986) el tratamiento químico es un método útil para:
hidrocarburos, aldehídos, ácidos orgánicos, fenoles, cianuros y plaguicidas organoclorados.
Éste trata de depurar el suelo mediante la degradación de los contaminantes por reacciones
25
químicas. Frecuentemente se trata de reacciones de oxidación de los compuestos orgánicos.
Como agente oxidante se emplea el oxígeno y el agua oxigenada. Este tratamiento se utiliza
preferentemente in situ, inyectando el agente depurador a zonas profundas mediante
barrenas huecas, o a veces, simplemente mediante un laboreo apropiado del terreno.
Otro procedimiento químico es la descloración. Esta técnica se utilizó, en un principio, para
la estabilización de productos del petróleo. En suelos se ha empleado para la descloración
de PBC. Consiste en la inyección de CaO, Ca(OH)2 o NaOH. El suelo al reaccionar se
calienta y al aumentar el pH hasta valores de 9 a 11 se produce la descloración de los PBC
(Adriano, 1986).
2.2.5. Remediación de suelo por tratamientos electroquímicos
El tratamiento electroquímico es un procedimiento a realizar in situ, el desplazamiento de
los contaminantes se logra mediante la creación de campos eléctricos. Consiste en
introducir, a suficiente profundidad electrodos en el suelo. Los contaminantes fluyen desde
un electrodo a otro siguiendo las líneas del campo eléctrico. En el tratamiento de desechos
peligrosos, la electrólisis se usa ampliamente para los metales como cadmio, cobre, oro,
plomo, plata y cinc. La recuperación de metales por electrolisis por la electro-deposición
directa, reduciendo particularmente metales. Un ejemplo específico es la remoción
26
electrolítica de cadmio y níquel en agua contaminada por desechos de baterías usando
electrodos fibrosos de carbono (Abda y Oren, 1993).
2.3. Remediación de suelos por métodos biológicos
2.3.1. Biorremediación
Los métodos tradicionales para la remediación de sitios contaminados se ha demostrado
que además de ser costosos a menudo no son eficaces. La biorremediación aparece como
una técnica alternativa efectiva y de bajo costo en el intento de mitigar y reducir la
contaminación de compuestos orgánicos e inorgánicos, recurriendo a sistemas biológicos,
tales como plantas, hongos, enzimas y bacterias que sustituyan a las actuales estrategias de
enmienda de suelo y agua (Chaney et al., 1999; Garbisu y Alkorta, 1997; Rao et al., 1996).
El biorremedio aprovecha la diversidad y versatilidades genéticas de los microorganismos
para producir rupturas o cambios moleculares en los contaminantes generando compuestos
de menor o ningún impacto ambiental (Khan, 2000; Saxena et al., 1999; Wenzel et al.,
1999; Brown, 1998; Cunningham, 1996; Meeussen et al., 1994; Alloway, 1993; Adriano,
1992; Adriano, 1986).
Estos cambios ocurren usualmente en la naturaleza, sin embargo su velocidad es baja,
mediante una adecuada manipulación estos sistemas biológicos pueden ser optimizados
para aumentar la velocidad de cambio o degradación y así usarlos en sitios con una elevada
concentración de contaminantes de importancia ambiental en suelos, aguas y aire
27
(McGrath, 2001; Khan, 2000; De Oliveira y Narasimha, 1999). Una gran cantidad de
contaminantes como plaguicidas, herbicidas, petróleo, gasolina y metales pesados pueden
ser eliminados por biorremediación (Lasat, 2002; McGrath et al., 2001; Reed, 1992).
Al incremento del uso de la biorremediación como una estrategia sostenible y económica,
se le está prestando una particular atención, principalmente en Europa y Estados Unidos de
América (Khan y Kuek et al., 2000 ).
2.3.2. Fitorremediación
El concepto de usar plantas para limpiar suelos contaminados no es nuevo, desde hace 300
años las plantas fueron propuestas para el uso en el tratamiento de aguas residuales
(Hartman,1975). En Rusia en los años 60´s se realizaron investigaciones utilizando plantas
para recuperar suelos contaminados con radionucleótidos. Existen reportes sobre el empleo
de plantas acuáticas en aguas contaminadas con plomo, cobre, cadmio, hierro y mercurio.
La remediación de la acumulación de metales pesados en suelos utilizando plantas es
también ampliamente reconocida (Ernst, 2000).
La fitorremediación (el prefijo fito- significa planta) es una estrategia que se utiliza en la
remediación de suelos contaminados (Chaney, 1997), es un proceso de descontaminación
que involucra el empleo de plantas que pueden remover, transferir, estabilizar,
descomponer y/o degradar contaminantes de suelo, sedimentos y agua, como solventes,
plaguicidas, hidrocarburos poliaromáticos, metales pesados, explosivos, elementos
28
radiactivos, fertilizantes, para hacerlos más biodisponibles para la planta (McGrath et al.,
2001; Macek et al., 2000; Mench et al.,1999; Raskin et al., 1994; Chen, et al.,1990).
Esta técnica se encuentra todavía en su etapa inicial de investigación y de desarrollo, el
número de pruebas de campo realizadas hasta la fecha es no obstante pequeña (Brown et
al., 2003; Chen, 2000; Chaney et al., 1999), está surgiendo como un método terapéutico
atractivo debido a su simplicidad el costo relativamente bajo. Además de la remoción de
contaminantes, la limitación de ofrecimientos de técnicas de lixiviación del suelo,
facilitando su mejora o el mantenimiento de estructura y propiedades, así como su
fertilidad, hay también la posibilidad de bio-recuperación de ciertos contaminantes como
por ejemplo metales pesados (Chaney et al., 2000; Watanabe, 1997). Aunque el
conocimiento básico de que las plantas pueden ser usadas para remediación del ambiente ha
sido desde décadas pasadas, solo recientemente ha sido reconocido completamente el valor
de las plantas acumuladoras de metales en la recuperación de suelos contaminados (Salt et
al., 1997).
Después de una minuciosa investigación, la fitorremediación se esta convirtiendo en una
tecnología alternativa de remediación de suelos contaminados realmente útil económica y
efectiva (Watanawe, 1997). Esta nueva técnica de enmienda esta basada en prácticas
agronómicas, es rápida y eficiente, y consiste en cultivar plantas en un lugar contaminado,
después cosecharlas y estas plantas llenas de metales pesados, estás podrían venderse a
compañías de energía eléctrica como fuente de biomasa para generar energía, la que a su
vez podría generar una ganancia. Las cenizas resultantes de la incineración también se
29
podrían ser llevadas a una fundición para recobrar el metal y nuevamente crear un flujo de
ingresos (Raskin et al., 1997; Salt et al., 1995; Crowley et al., 1991).
Según Jentschke (2000), los árboles pueden realizar una acción de bombeo orgánico cuando
sus raíces se extienden hacia la capa freática, formando una masa densa de raíces que
absorbe una gran cantidad de agua. Los álamos, por ejemplo, absorben 113 litros de agua
por día, y hay una variedad de álamo (Populus deltoides) que absorbe hasta 1325 litros por
día. La acción de bombeo de las raíces disminuye la tendencia de los contaminantes
superficiales al descender hacia el agua subterránea y el agua potable.
En zonas agrícolas, los álamos plantados a lo largo de cursos de agua reducen el excedente
de fertilizantes y herbicidas que contienen dichas aguas. Asimismo, los árboles plantados
en vertederos como sustitutos orgánicos de la tradicional capa de arcilla o de plástico
absorben agua de lluvia que, de lo contrario, se filtraría por el vertedero y llegaría al fondo
en forma de "lixiviado" contaminado (Drake et al., 1999; El-Dermerdash et al., 1994).
Esta novedosa tecnología, tiene muchas ventajas con respecto a los métodos
convencionales de tratamientos de lugares contaminados; en primer lugar es una tecnología
económica, de bajo costo, en segundo lugar posee un impacto regenerativo en lugares en
donde se aplica y en tercer lugar su capacidad extractiva se mantiene debido al crecimiento
vegetal. Además es capaz de ser modificada para aumentar su capacidad y selectividad
extractiva, un caso bien conocido es la modificación genética de Arabodopsis thaliana para
reducir ion mercurioso (Pawlowska et al., 2000; De Olivera, 1999; Salt et al., 1998; Kumar
et al., 1995; Baker et al.,1994).
30
Los beneficios derivados de esta estrategia de fitoenmienda abarcan los sectores del
ambiente, la salud, industria y energía. Las pruebas científicas han confirmado la validez de
esta estrategia y se han emprendido gestiones para obtener financiamiento para los
crecientes esfuerzos puestos en marcha en varios países (Chaney, 1997).
Es importante reconocer que la fitorremediación ofrece ventajas adicionales a la limpieza
de suelos y mantos freáticos al emplear alguno de los siguientes mecanismos:
Incremento de la actividad y población microbiana en el subsuelo, que eleva la cantidad de
carbón orgánico. Mejoras en la aeración del suelo por la liberación de oxígeno por las
raíces. El retraso del movimiento e intercepción de compuestos orgánicos y algunos
metales. Estimulación de las transformaciones de compuestos tóxicos a compuestos de
menor toxicidad. Captación de hidrocarburos volátiles por las hojas, que sirven de
“tapadera” a los lugares contaminados. Los suelos contaminados por metales son
notoriamente difíciles de remediar, debido al alto costo, no saben que hacer con el suelo
contaminado, por lo que la fitorremediación es una alternativa con un costo efectivo; varios
análisis han demostrado que el costo de fitoextracción de metales es sólo una fracción de
aquellos asociados con técnicas de ingeniería convencionales. Además, debido a que
remedia el suelo in situ, la fitorremediación evita una ruptura dramática del terreno y
preserva el ecosistema (Lasat, 2002).
La fitorremediación no es un remedio para todos los suelos contaminados, antes de que esta
tecnología pueda volverse técnicamente eficiente y costo-eficaz, hay algunas limitaciones
que necesitan ser superadas como por ejemplo, sus mecanismos tanto moleculares,
bioquímicos y fisiológicos son pocos conocidos e insuficientemente entendidos, sus
31
procesos como hiperacumuladoras, un gran número de plantas hiperacumuladoras todavía
pueden descubrirse e identificarse (Freitas et al., 2004; Prasad y Freitas, 2003; Raskin et
al., 1994).
El proceso del fitorremediación es lento porque el índice de acumulación es directamente
proporcional al de crecimiento de la planta, porque no hay planta con todas las
características adecuadas con los criterios ideales de una hiperacumladora eficaz
(crecimiento rápido y raíces extensas de biomasa alta, fáciles de cosechar, plantas
acumuladoras de una amplia gama de metales tóxicos), por lo que es necesario introducir
sistemas biológicos como la simbiosis entre hongos micorrízicos y las plantas para
coadyuvar en la recuperación de suelos contaminados, o más aun modificarlas
genéticamente para mejorarlas y sean empleadas satisfactoriamente como agentes en el
proceso de fitorremediación (Clemens et al., 2002; Maagher et al., 2000; Lovley y Coates,
1997).
2.3.3. Plantas hiperacumuladoras de metales pesados
Todas las plantas poseen un potencial para absorber una amplia variedad de metales del
suelo pero la mayor parte de las plantas tienden solamente a absorber los que son esenciales
para su supervivencia y desarrollo. Existe una notable excepción de esta regla de un
pequeño grupo de plantas que pueden tolerar, absorber, y translocar altos niveles de ciertos
metales, estas plantas reciben el nombre de hiperacumuladoras (Chen et al., 2001).
32
El concepto de "planta hiperacumuladora" fue establecido por R.R. Brooks y sus
colaboradores en 1977, quienes fueron los pioneros en el estudio de plantas que pueden
acumular metales. Una definición propone que si una planta contiene más de 0.1% de Ni,
Co, Cu, Cr y Pb o 1% del Zn en sus hojas sobre una base del peso seco, ésta puede ser
llamada una “hiperacumuladora”, independientemente de la concentración del metal en el
suelo (Robinson et al., 2003; Chaney et al., 2000; Chaney et al., 1997; Peters y Shem,
1994; Baker y Brooks, 1989; Baker et al., 1988; Chaney, 1983; Brooks et al., 1979). Las
primeras plantas hiperacumuladoras caracterizadas son miembros de las familias
Brasssicaceae y Fabaceae. La idea de usar plantas para extraer metales de suelos
contaminados fue reintroducida y desarrollada por Chaney (1983) y el primer ensayo en el
campo de la fitoextración fue conducido en 1991. La especie Thlaspi caerulescens
(carrespique) y Viola calaminaria son especies de plantas documentadas por acumular
elevados niveles de metales en sus hojas (Baumann, 1985).
De acuerdo con Salt et al., (1998), se establece que el botánico A. Baumann, trabajando en
los límites entre Bélgica y Alemania observó las hojas de ciertas especies de plantas que
crecían en suelos enriquecidos naturalmente con cinc y conteniendo altas concentraciones
de este elemento. Las especies que particularmente registró fueron la violeta (Viola
aclamaria ) y la mostaza (Thlaspi calaminare) recientemente clasificada como Thlaspi
caerulescens. Las cuales contenían cerca de 1 y 1.7% de cinc en el peso seco de las hojas.
Estas fueron comparadas con los niveles de cinc entre 0.001 y 0.02% del peso seco de hojas
de otras plantas.
33
Los estudios realizados en Estados Unidos de América reportaron al selenio como un
componente de la planta responsable de trastornos en ciertos animales en Dakota del Sur.
Esta investigación indujo al descubrimiento de plantas capaces de acumular selenio arriba
de 0.6% en la biomasa seca de los brotes. Una década mas tarde dos botánicos italianos,
Minguzzi y Vergnano (1948) descubrieron plantas que acumulaban níquel, ellos observaron
que las hojas secas de Alyssum bertolonii que crecían en suelos serpentinos ricos en níquel,
cerca de Florencia Italia contenían alrededor de 1% de níquel, por arriba de 100 a 1000
veces más alto que otras plantas que crecían cercanas al sitio.
El Dr. Rufus L. Chaney encabeza en los Estados Unidos de Norteamérica los estudios para
evaluar plantas llamadas “hiperacumuladoras” que absorben grandes cantidades de metal de
los suelos. En esas investigaciones se encontró una especie
conocida como Thlaspi
caerulencens, que acumula hasta 30 000 partes por millón (ppm) de zinc y hasta 6000 ppm
de cadmio en sus hojas, sin reducir el rendimiento de la planta (Brown et al., 1995).
También se ha demostrado la tolerancia al cadmio en el diente de león (Taraxacum
officinale) (Kabir y Koide, 2000; Kuleff y Djingova, 1991). Otras especies como
Chichorium intybus, Erigeron canadensis y Eupatorium capillifolium han sido investigadas
como especies indicadoras de cadmio, cromo, níquel o vanadio, es decir como especies que
indican la biodisponibilidad de estos metales contaminantes, por incorporarlos sin mostrar
síntomas de toxicidad. El Amaranthus reflexus ha demostrado ser efectiva en absorber el
amenazador cesio-137 radiactivo, también resulta muy prometedora como hiperacumulador
de plomo, por su parte el helecho originario de Florida, Pteris vittata es capaz de absorber
34
el peligroso arsénico, lo más curioso es que el helecho crece mejor en suelos que contienen
elevadas cantidades de arsénico que en los que carecen de él (Martín et al., 1996)
El cadmio se puede acumular en girasol, Helianthus annuus (Davies et al., 2001; Simón,
1998). El girasol es una rizofiltradora potencial de cadmio, níquel, cobre, cinc, cromo y
plomo; así como de radioisótopos (Brooks, 1998). Existen plantas que al mismo tiempo que
son hiperacumuladoras de cobre, lo son del cobalto, entre ellas algunas especies de la
familia Asteraceae (Brooks 1998). El girasol (Helianthus annuus L.) es la especie que
absorbe los metales pesados en mayor cantidad en sus raíces que en sus brotes si se cosecha
la biomasa entera de la planta, por lo que se considera una planta hiperacumuladora
favorable en la fitoextracción de Cd, Zn, Pb y elementos radiactivos (Christie et al., 2004;
Reeves, 2003; Davies, 2002; Cabrera et al., 1999; Kumar et al., 1995).
Desde el punto de vista ecológico el papel de las plantas hiperacumuladoras no está aun
completamente claro, pero se ha sugerido que éstas suministran protección contra el ataque
de hongos patógenos e insectos. Las recientes evidencias han confirmado la función de
protección de la acumuladora de níquel contra hongos y bacterias patógenos en Steptanthus
polygaloides e insectos herbívoros en S. polygaloides y T. montanum (Li et al., 2003). El
efecto contra los insectos herbívoros está bien demostrado en Thlaspi caerulescens, que es
una planta hiperaculadora de cinc.
Con esta extraordinaria habilidad las plantas hiperacumuladoras de metales pueden ser
usadas en actividades de remediación en el ambiente, además que constituyen un
importante recurso biológico en las futuras revegetaciones y fitorremediaciones de áreas
35
contaminados con metales pesados. Sin embargo las aplicaciones máximas todavía no se
han logrado, una razón importante es la falta de conocimientos de los mecanismos
moleculares y procesos biológicos involucrados que permiten tolerar, la adquisición, el
transporte y acumulación de los metales en las planta, incluso que se puedan alimentar de
los metales (Lovley, 1997).
En las últimas décadas, la intensa búsqueda se ha conducido a investigar la biología de
fitoextración de metal, pero a pesar de los sucesos significativos, la comprensión del
mecanismo de las plantas que permiten la extracción del metal emergen lentamente. El
suceso natural de especies de plantas capaces de acumular extraordinariamente altos niveles
concentraciones hace de la investigación un proceso particularmente interesante. Como
resultado, se están obteniendo los primeros avances para la comprensión de los mecanismos
a nivel molecular por los cuales las plantas son capaces de tolerar los excesos y absorber
metales pesados, que serían venenos peligrosos para otras especies, mientras que las
hiperacumuladoras los incorporan como nutrientes (Huang et al., 1997)
Hasta el momento, se ha descubierto que algunas moléculas facilitan el transporte de los
metales pesados al interior de la planta a través de las raíces, por procesos de absorción en
las vacuolas que aumentan su biodisponibilidad para las plantas, son conocidas como
agentes quelantes como EDTA y DTPA (Chen et al., 2001; Khan et al., 2000; Turnau et al.,
1998; Huang et al., 1997; Leyval et al.,1995), que son capaces de formar iones complejos
con el metal facilitando en gran medida la absorción, estas sustancias pueden ser
producidas por la propia planta y liberadas al suelo a través de las raíces. De acuerdo con
36
Leyval et al., (1997) la absorción de los metales pueden ser ayudadas por microorganismos
como hongos micorrízicos.
Los genes responsables de la hiperacumulación de los metales en los tejidos finos de la
planta se han identificado y se han reproducido. El metabolismo del glutatión y de los
ácidos orgánicos desempeñan un papel dominante en plantas en tolerancia de los metales.
El glutatión es un componente de bacterias, plantas y animales. En el proceso de
fitorremediación de metales en el ambiente, los ácidos orgánicos desempeñan un papel
importante en tolerancia del metal (Hall, 2002)
De acuerdo con Pilon-Smits et al., (2002) las estrategias genéticas en la producción de las
plantas transgénicas y el papel que desempeñan los microorganismos contribuyen a la
importancia en el proceso de fitorremediación, así como el desciframiento completo del
genoma de Arabidopsis, además de los intensos estudios moleculares que se están llevando
a cabo sobre Thlaspi, y el conocimientos de algunos genes implicados en las absorción y
en la tolerancia a algunos metales específicos, resultan muy prometedores en la obtención
de las primeras variedades de plantas transgénicas con capacidades hiperacumuladoras
mejoradas (Zhu et al., 1999).
A pesar de los subsecuentes reportes de investigaciones que afirman la identificación de
plantas acumuladoras de elevados niveles de cobalto, cobre, manganeso y plomo están bien
descritas (Baker y Brooks, 1989). Sin embargo la existencia de plantas hiperacumuladoras
de metales como níquel, cinc y selenio son cuestionadas continuamente y requieren futuras
investigaciones (Salt, 1998).
37
En fitorremediación se necesitan plantas de rápido crecimiento con una alta capacidad de
incorporación de metales y una rápida ganancia de biomasa, para que puedan interferir en la
biodisponibilidad de metales tóxicos en suelos y las limitaciones de las plantas
hiperacumuladoras son pequeña biomasa radicular, su restringida selectividad de los
elementos, el minúsculo conocimiento acerca de la agronomía, la genética y las
enfermedades de éstas plantas. En su gran mayoría las plantas que acumulan metales son
especies silvestres pequeñas en tamaño y tienen las tasas de crecimiento lento como
ejemplo se tiene a Thlaspi caerulescens, que es una planta no micotrófica y de lento
crecimiento son características que limitan el porcentaje de la fitoextracción. (Baker y
Walker, 1997).
Otras plantas acumuladoras con abundante biomasa son micotróficas tales como girasol y
sauce, por lo que ahora reciben mayor atención que asociadas con HMA son tolerantes a
metales y pueden por lo tanto ser consideradas para descontaminar suelos levemente
contaminados. La asociación de las plantas con hongos micorrízicos representa una serie
de importantes ventajas entre las que destacan protección contra ataque de parásitos y
enfermedades, mayor área de extensión de las raíces facilitando la absorción de nutrimentos
así como también contaminantes inorgánicos y orgánicos (Leyval et al., 2001; Ernst, 2000).
Actualmente las plantas hiperacumuladoras identificadas son 397, este número puede ser
cambiado en el futuro, ya que más plantas que crecen en suelos ricos en metales son
investigadas, en la mayoría de los casos, no se trata de especies raras, sino de cultivos
comunes que se han ensayado con éxito como posibles especies fitorremediadoras en el
futuro como son la alfalfa, la mostaza, el tomate, la calabaza, el esparto, el sauce y el
38
bambú. Las principales familias a las que pertenecen las plantas hiperaculadoras se
mencionan a continuación: Asteraceae, Aceraceae, Poaceae, Brassicaceae, Betulaceae,
Convolvulaceae, Cyperaceae, Fabaceae, Malvaceae y Oleaceae. (De Oliveira y Vara,
1999)
El gran interés despertado por las plantas hiperacumuladoras, especialmente para
destoxificar un ambiente contaminado, obliga también a resolver otros problemas relativos
a otras disciplinas, hace hincapié en ello y destaca que, cuando se potencie la investigación
conjunta de diversos campos como botánica, fisiología vegetal, agronomía, química y
genética, probablemente se inicie un brillante futuro para la fitorremediación. El entorno de
las plantas hiperacumuladoras revela la necesidad de impulsar mayores conocimientos
multidisciplinarios que aumenten la rentabilidad y eficacia de dichas plantas: sus
aplicaciones son interesantes en muchas áreas, y particularmente importantes en la
protección del ambiente (Lasat, 2002).
Los recientes investigaciones sobre la glomalina que es una glucoproteína que se encuentra
en las hifas de los hongos micorrízicos (Wright y Upadhayaya, 1996), han contribuido de
manera considerable en la recuperación de suelos contaminados por metales pesados, ya
que acuerdo con (González-Chávez et al., 2002) la glomalina puede atrapar elementos
potencialmente tóxicos. El glutation es un antioxidante constituido por aminoácidos
cisteina, glicina y ácido glutámico que fijan los metales pesados, los ácidos orgánicos
forman los complejos con los metales, un proceso de la desintoxicación del metal por lo
que la glomalina, el glutatión y los ácidos orgánicos desempeñan un papel dominante en
tolerancia del metal por las plantas. Las estrategias genéticas y las plantas transgénicas, las
39
pruebas en la producción y el campo microbiológico traerán la importancia del campo de
recuperación de suelos contaminados (Hall, 2002).
2.3.4. Categorías de la fitorremediación
La fitorremediación de acuerdo con Salt et al., (1998) generalmente se divide en las
siguientes áreas: Fitoextracción, fitovolatilización, rizofiltración fitodegradación, y
fitoestabilización que se describen a continuación (Fig. 3).
Fig. 3. Categorías de fitorremediación de suelos contaminados (Lasat, 2002).
La fitoextracción, conocida también como fitoacumulación, es la captación de metales
contaminantes por las raíces de las plantas y su acumulación en tallos y hojas. Algunas
plantas absorben cantidades extraordinarias de metales en comparación con otras. Se
40
selecciona una de estas plantas o varias de este tipo y se plantan en un sitio según los
metales presentes y las características del lugar. Después de un tiempo, cuando las plantas
han crecido, se cortan y se incineran o se deja que se transformen en abono vegetal para
reciclar los metales. Este procedimiento se puede repetir la cantidad de veces que sea
necesario para reducir la concentración de contaminantes en el suelo a límites aceptables. Si
se incineran las plantas, las cenizas deben colocarse en un vertedero para desechos
peligrosos, pero la cantidad de ceniza será sólo alrededor del 10% del volumen de los
desechos que habría que eliminar si se excavara el suelo contaminado para tratarlo
(Robinson et al.,2002; Khan et al., 2001; Chaney et al., 1997).
La fitovolatilización se produce a medida que los árboles y otras plantas en crecimiento
absorben agua junto con contaminantes orgánicos. Algunos de los contaminantes pueden
llegar hasta las hojas y evaporarse en la atmósfera. Los álamos, por ejemplo, evaporan el
90% de los contaminantes que absorben (Raskin et al., 1997)
La rizofiltración es una técnica prometedora para abordar el problema de la contaminación
del agua con metales. La rizofiltración es similar a la fitoextracción, pero las plantas que se
usan para la limpieza se cultivan en invernaderos con las raíces en agua, en lugar de suelo.
Cuando las plantas tienen un sistema radical bien desarrollado, se recoge agua contaminada
de un vertedero, se transporta hasta el lugar donde están las plantas y las plantas se colocan
en esta agua, las raíces absorben el agua junto con los contaminantes. A medida que las
raíces se saturan de contaminantes, se cortan y se eliminan. Además de extraer metales del
agua, la rizofiltración puede ser útil para descargas industriales, escorrentía de tierras
41
agrícolas, drenaje de minas de ácidos y contaminantes radiactivos. Las plantas de girasol
fueron utilizadas con éxito en la extracción de contaminantes radiactivos del agua de una
laguna en una prueba realizada en Chernobyl Ucrania (Duschenkov et al., 1995).
La fitoestabilización es un proceso mediante el cual se reduce la movilidad de los
contaminantes y previene la migración de metales a aguas subterráneas o al aire, también
reduce su biodisponibilidad hacia la cadena alimenticia. Esta técnica también se utiliza para
reforestar sitios disturbados que carecen de vegetación debido a las altas concentraciones de
contaminantes, las plantas tolerantes a los metales se utilizan para restaurar la vegetación y
de esa manera disminuir la migración potencial de la contaminación con la erosión del
viento y de la lixiviación de contaminantes del suelo a aguas subterráneas. En algunos
casos de fitoestabilización, los metales pueden ser transformados a menos biodisponibles y
por consiguiente a formas menos tóxicas (Reeves, 2003; Berti y Cunningham, 2000).
2.4. Contribución de los microorganismos en la remediación de suelos
2.4.1. Interacción de microorganismos con los metales pesados en la remediación
El suelo provee un hábitat para una gran variedad de organismos desde microbios hasta
especies superiores como plantas. Las propiedades biológicas del suelo incluyen la
actividad y diversidad de microorganismos del suelo. Las bacterias son los organismos más
pequeños y numerosos en el suelo con más de 400 géneros y un estimado de 104 especies.
En un gramo de peso seco de suelo rizosférico existe una gran cantidad de
42
microorganismos de aproximadamente de 108 para bacterias, 106 actinomicetos, y 105 para
otros hongos (Karthikeyan et al.,2003). La biomasa de microorganismos puede exceder 500
mg de carbón por kilogramo de suelo sin embargo, los microorganismos solo comprenden
menos del 3% del carbono orgánico del suelo y ocupan sólo 0.001% del volumen total
(Zhang et al.,1997).
La densidad de las poblaciones microbianas varía significativamente verticalmente y
horizontalmente en el suelo. La dispersión de la biomasa microbiana dentro de una muestra
de suelo está relacionada con diversos factores como la distancia de la superficie del suelo
debido a la difusión de oxígeno, la locación y disponibilidad de materiales orgánicos como
fuentes potenciales de comida (Lovley, 2000).
El término “rizósfera” fue introducido por primera vez en 1904 para descubrir la
interacción específica entre la bacteria y las raíces de las leguminosas. El términos se ha
refinado desde entonces para referirse a la región bajo la influencia inmediata de las raíces
de plantas donde haya una abundante población microbiana (Karthikeyan et al.,2003).
Dentro de la amplia diversidad microbiana, existen microorganismos resistentes y
microorganismos tolerantes a metales. Los resistentes se caracterizan por poseer
mecanismos de destoxificación codificados genéticamente, inducidos por la presencia del
metal. En cambio, los tolerantes son indiferentes a la presencia o ausencia de metal. Tanto
los microorganismos resistentes como tolerantes son de particular interés como captores de
43
metales en sitios contaminados, debido a que ambos pueden extraer los contaminantes. La
resistencia o tolerancia experimentada por microorganismos es posible gracias a la acción
de
diferentes
mecanismos.
Estos
fenómenos
son:
biosorción,
bioacumulación,
biomineralización, biotransformación y quimiosorción mediada por microorganismos
(Lovley, 2000).
Por lo anterior los microorganismos pueden ser considerados como reactores bioquímicos
que conducen el proceso de biodegradación de contaminantes del suelo, esta idea es una
extensión lógica de varios estudios que demuestran que numerosos procesos bioquímicos se
llevan a cabo con la ayuda de microorganismos (Lovley, 2000).
Se conoce muy poco acerca de la enorme diversidad de las poblaciones microbianas del
suelo, sus propiedades, su comportamiento en el entorno del suelo, los microorganismos
que habitan en la rizósfera interactúan con las raíces de las plantas formando útiles
asociaciones simbióticas que hacen posible la supervivencia de las plantas bajo condiciones
de estrés como deficiencia de nutrimentos, alta concentración de metales pesados, sequedad
del suelo, afectan la asociación de las raíces de las plantas por los hongos micorrízicos y
Rhizobium (Khan, 1997).
Algunos metales pesados son esenciales para el ser humano porque suministran cofactores
básicos para diversas funciones de proteínas y enzimas, pero en altas concentraciones los
metales pesados pueden actuar en forma nociva bloqueando los grupos funcionales
44
esenciales desplazando los iones modificando la conformación activa de las moléculas
biológicas, por otra parte los metales pesados son tóxicos tanto para organismos superiores
como para microorganismos. El efecto de los metales pesados a las comunidades
microbianas han despertado la atención en la recuperación de suelos contaminados
(Simonton et al., 2000).
Los microorganismos como hongos y bacterias consumen y digieren sustancias orgánicas,
de las cuales se alimentan y obtienen energía. Algunos microorganismos pueden digerir
sustancias orgánicas tales como combustibles o solventes, que son peligrosas para los seres
humanos, y descomponerlas en productos inocuos mediante un proceso llamado
biodegradación. Las sustancias naturales liberadas por las raíces de las plantas (azúcar,
alcohol y ácidos) contienen carbono orgánico, del cual se alimentan los microorganismos
del suelo, y los nutrimentos adicionales intensifican su actividad. Además, las plantas
aflojan el suelo y transportan agua al lugar, facilitando así la biodegradación (Karthikeyan
et al.,2003).
De acuerdo con Guider et al., (1999); Garbisu y Alkorta, (1997) los metales pesados que se
encuentran depositados en los suelos no son degradados biológicamente ni ocurren cambios
en su estructura molecular, pero si son transformados de un estado de oxidación a otro.
Como consecuencia de la alteración del estado de oxidación, los metales pueden convertirse
en: más solubles en agua y pueden ser removidos por lixiviación, inherentemente menos
tóxicos, menos solubles en agua de tal manera que se precipitan y se convierten en menos
45
biodisponibles y finalmente pueden ser volatizados, esto sucede cuando se cambia el estado
de oxidación de los metales pesados.
Los microorganismos del suelo desempeñan un papel importante en la movilización e
inmovilización de cationes metálicos, siendo cada vez más aparente la reducción de los
metales pesados por los microorganismos, además pueden ser manipulados para ayudar en
la remediación de los sitios contaminados por metales pesados. Los microorganismos
pueden recuperar suelos contaminados con metales pesados por transformación de valencia,
precipitación extracelular química o volatilización (Lovley, 1993).
Los factores fisicoquímicos como pH, superficie o radio de acción, temperatura, salinidad,
materia orgánica, disponibilidad de oxígeno, afectan el hábitat microbiano. Es fundamental
el rol de los microorganismos en los ciclos biogeoquímicos de los metales y su utilización
en los procesos de biorremediación de desechos sólidos y líquidos es esencial para el
cuidado del medio ambiente (Karthikeyan et al., 2003; Nies, 1999).
En la interacción suelo-planta destacan los hongos micorrízicos arbusculares (HMA) esta
simbiosis mutualística (Fig. 4) ejerce gran influencia en la nutrición y tolerancia de las
plantas a estrés bióticos y abióticos (Siquiera y Saggin, 1995). Los HMA son los
microorganismos del suelo más comunes y constituyen un importante componente
funcional del sistema suelo-planta suceso presente en casi todos los hábitats y climas
(Barea et al., 1997), incluyendo suelos disturbados. Sin embargo los suelos degradados
46
pueden sufrir cambios en la diversidad y abundancia en las poblaciones de los HMA. En
este contexto, cuando las poblaciones de microorganismos degradativos como los hongos
micorrízicos arbusculares son inoculados en sitios contaminados, estos deben poseer
enzimas que ayudan a transformar el estado de oxidación de los metales, haciéndolos
menos tóxicos (Leyval et al., 2000; Loth, 1996).
Plantas
Metales pesados en
acumuladoras
suelos
.
HMA
Fig. 4. Esquema representativo de la asociación simbiótica entre planta-HMA-metales
pesados en suelos contaminados fuente (Leyval et al., 1997).
2.5.
Hongos micorrízicos
2.5.1. Generalidades de los HMA
La simbiosis micorrízica se refiere a la asociación o simbiosis entre plantas y hongos como
“un estado de interdependencia fisiológica equilibrada de dos o más organismos en el que
no se estimulan permanentemente los mecanismos de reacción defensiva”, la relación
hongo-suelo es la simbiosis del suelo más común y las respuestas principales ante la
presencia de la inoculación es en suelos deficientes en nutrientes o en humedad. La
47
simbiosis micorrízica incrementa la efectividad en la absorción de nutrientes mejorando el
crecimiento o aumento en la biomasa en las plantas (Abbott y Robson, 1992).
Los hongos micorrízicos son microorganismos que han permanecido asociados a las raíces
de las plantas desde que éstas existen en el mundo, el término micorriza fue utilizado por
primera vez por el científico alemán Albert Frank en 1885, del griego: “mykes” (hongo) y
“rhiza” (raíces) (Harrinson, 1997). Cincuenta años antes de Frank, estas asociaciones ya
eran consideradas, de naturaleza parasítica, hasta que en 1987 se pudo demostrar que la
colonización de las raíces era más bien simbiótica en lugar de parasitaria (Hayman, 1987).
Las estructuras producidas por los hongos (HMA) dentro de la raíz del hospedero incluyen:
un sistema de hifas contiguo, a través del punto de penetración inicial, con la red de hifas
que se extiende en el interior del suelo, arbúsculos pequeños, intracelulares, cuya función es
la transferencia de nutrimentos entre los simbiontes; y alargadas vesículas intercalares o
terminales cuya función parece ser de almacén orgánico del endofito (Carlin y Brown,
1982).
La fisiología de las micorrizas arbusculares es compleja y acompañada de su formación, se
puede explicar en las siguientes etapas: Activación de los propágulos que son básicamente
esporas, fragmentos de raíces colonizadas e hifas, la penetración e iniciación de la
colonización se realiza cuando las hifas hacen contacto con un punto en la superficie de la
raíz, la posibilidad de que ésta penetre e inicie la colonización depende de diversos factores
como: el hongo debe ser capaz de formar un haustorio y penetrar inmediatamente, quizá
48
necesite crecer un poco sobre la superficie de la raíz, tal vez el número de propágulos para
iniciar la colonización deba ser pequeño, o bien, quizá deba haber un número máximo de
invasiones, etc. (Smith et al., 1997; Barea, 1995).
Se ha demostrado que la infección inicia con una serie de unidades infectivas discretas,
extendiéndose cada una hasta 5 mm hacia los lados del punto de entrada. estas unidades se
unen para formar la colonización continua. En otros reportes se ha observado una extensión
de hasta 10 mm desde el punto de entrada, independientemente del patrón seguido, los
hongos pueden ocupar más de la mitad de la raíz en 3 y 4 semanas después de la entrada
(Carlin y Brown, 1982).
Aunque la absorción del fósforo parece ser uno de los principales efectos que facilita la
inoculación, existen otros nutrimentos, minerales y metales pesados que pueden estar
disponibles a través de la asociación planta-hongo, así como la translocación del agua. La
producción de hormonas y otros cambios celulares son también incluidos como parte de la
respuesta de la planta ante la colonización (Cox y Tinker, 1976).
2.5.2. Clasificación de los diferentes tipos de hongos micorrízicos
Las plantas inoculadas son más resistentes al estrés ambiental que las plantas no
inoculadas. Aunque en general se reconocen dos tipos de micorrizas: las endotróficas
(endomicorrizas) y las ectotróficas (ectomicorrizas), se menciona la existencia de un tercer
49
grupo, las ecto-endomicorrizas considerado como un grupo intermedio entre las otras dos
asociaciones que es frecuente en los viveros (Quilambo, 2003).
De las endomicorrizas, el 90% de las especies vegetales existentes sobre la corteza terrestre,
forman este tipo de asociación. La característica de esta asociación es la penetración
intracelular en las células corticales y epidérmicas de la raíz para formar arbúsculos y
vesículas que aseguran una gran superficie de contacto entre ambos asociados. El
abundante micelio, que se ramifica a través de la raíz y se extiende hacia fuera del suelo,
formando una maraña (Fig.5). Carecen de manto fúngico externo visible (Morton y Benny,
1990).
Figura 5. Representación de la estructura morfológica de la micorriza vesículo arbuscular
(Barea y Azcon, 1997).
De acuerdo con Scnnerini y Bonfante-Fasolo (1982) las endomicorrizas se subdividen en:
Micorriza de ericoides de la familia Ericaceae. Se desarrollan principalmente en tierras
árticas en clima boreal, sus principales características son: sin manto de hifas, sin red de
50
Hartig, hifas retorcidas en las células radicales, hongos asociados Ascomycetes
(Basidiomycetes).
Las micorrizas de orquídeas se desarrollan principalmente en tierras calientes con pH ácido
y en suelo pantanoso. Con estructuras características: sin manto de hifas, sin red de Hartig,
hifas en las células radicales, posiblemente haustorio no ramificado micelio hialino, hongos
asociados Ascomycetes (Basidiomycetes).
La micorriza arbuscular, la más extendida sobre el planeta, tanto por el número de
hospederos, como por su distribución geográfica. Ocurren en el 96% de las plantas
vasculares, desde el punto de vista como biofertilizante. Morton y Benny (1990) definen
dos estructuras que son características de las micorrizas arbusculares: Las vesículas que son
grandes hifas infladas, en forma globosa usualmente llenas de lípidos, los cuales son
necesarias durante la etapa de crecimiento y sirven como órganos de energía y
almacenamiento, o como estructuras reproductivas. Los arbúsculos son minúsculas
dicotómicas, muy finas intracelulares los cuales invaginan la membrana plasmática,
sirviendo como sitio de intercambio nutrimental entre el hongo y el hospedero, presentan
una vida media de 9 a15 días, al cabo de los cuales se colapsan o son digeridos por la célula
hospedera. Forman abundante micelio que ramifica a través de la raíces y se extienden
hacia fuera. Los hongos micorrízicos arbusculares pertenecen a la clase Glomeromycetes
(Cuadro 3).
51
Cuadro 3. Clasificación actual de los hongos formadores de micorriza arbuscular (Oehl,F.,
y Sieverding, 2004)
Subdivisión: Glomeromycota
Clase: Glomeromycetes
ORDEN
FAMILIA
GÉNERO
Glomerales
Glomeraceae
fam. ined.
Gigasporaceae
Acaulosporaceae
Gerdemanniaceae
Diversisporaceae fam.
ined.
Paraglomeraceae
Geosiphonaceae
Archaeosporaceae
Glomus (Glomus Group A or B)
incertae sedis (Glomus Group A or B)
Gigaspora & Scutellospora
Acaulospora & Entrophospora
Pacispora (=Gerdemannia)
incertae sedis (Glomus Group C)
Diversisporales
Paraglomerales
Archaeosporales
Paraglomus
Geosiphon
Archaeospora
2.6. Contribución de los HMA como mecanismo de recuperación de
suelos contaminados por metales pesados
2.6.1 Interacción de los HMA en la contaminación con metales pesados
De acuerdo con Atimanav (2004) la simbiosis micorrízica se presenta en todos los hábitats
incluyendo en suelos contaminados ya sean estos, producidos o derivados de actividades
mineras y de acuerdo con con experimentos realizados por Leyval et al., (1997) pueden
mejorar la revegetación de suelos con desechos de minas u otros sitios degradados. Las
especies de hongos que son aislados de áreas contaminadas las cuales son enriquecidos
naturalmente por metales pesados o de viejos sitios de desechos industriales mineros son
más resistentes a los metales pesados que los HMA reproducidos de sitios no contaminados
52
por lo que constituyen un componente funcional importante en la interacción suelo-plantahongo en la recuperación de suelos degradados por metales pesados.
Los HMA son importantes en la recuperación de suelos contaminados debido a que juegan
un papel vital en la tolerancia (Del Val et al., 1999) y en la acumulación (Zhu et al., 2001;
Joner et al., 1997) de metales por las plantas. El micelio externo de los HMA explora un
amplio volumen de suelo al esparcirse más allá de la zona de exploración de las raíces
(Malcova et al., 2003; Khan et al., 2000) proporcionando de este modo acceso a un mayor
volumen de metales pesados presentes en la rizósfera. Una alta cantidad de metales
pesados también pueden almacenarse en las estructuras micorrízadas de raíces y en las
esporas, por ejemplo concentraciones de más de 1200 mg / kg de cinc han sido reportados
en tejido de Glomus mosseae y sobre 600 mg / kg en G versiforme (Chen et al., 2003;
Leyval et al., 1996; Dehn y Shuepp, 1989).
Otro aspecto importante de esta simbiosis es que los HMA pueden incrementar el
establecimiento y el crecimiento de plantas sin importar los altos niveles de metales
pesados (Weissenhorn et al., 1993; Enkhtuya et al., 2002) en el suelo. Además de una
mejor obtención de nutrimentos del suelo, disponibilidad de agua y propiedades de
agregación de suelo (Rilling et al., 2002; Kabir et al., 2000) aspectos asociados con la
simbiosis, los HMA son significativos en los mejoramientos ecológicos de la rizósfera
(Medina et al., 2003; Azcón-Aguilar et al., 2003).
53
De acuerdo con numerosas investigaciones se ha observado que la simbiosis de los HMA
con las plantas acumuladoras puedan proteger a ésta de los efectos de las altas
concentraciones de los metales pesados y se ha reportado la disminución de la toxicidad de
cinc y cadmio en suelos contaminados (Tao et al., 1997; Weissenhorn et al., 1995). Varios
mecanismos biológicos y físicos han sido propuestos para explicar la contribución de los
HMA a la tolerancia al metal de las plantas hospederas. La inmovilización del metal en la
biomasa de los hongos es uno de los mecanismos involucrados (Li et al., 2000).
2.6.2. Función de la simbiosis micorrízica en la recuperación de suelos contaminados
con metales pesados
Ante la necesidad de reforestar o la posibilidad de usar plantas en un proceso de
descontaminación del suelo (Backer et al., 1994), mediante el empleo de tecnologías
emergentes conocidas como “remediación verde” o fitorremediación (Salt et al.,1995), las
interacciones entre micorrizas y metales pesados se ha tornado de gran importancia en la
restauración de ecosistemas. La interacción entre los hongos micorrízicos arbusculares
(HMA) y los minerales, particularmente los metales pesados, ha sido el objetivo de una
variedad de recientes estudios debido a un efecto benéfico de la micorriza sobre la
tolerancia de las plantas contra la toxicidad de dichos metales pesados (Leyval et al., 2002)
Es bien conocido que los HMA pueden ser afectados por la toxicidad de los metales en la
disminución de su número de esporas en el suelo; así como en la colonización de las raíces
de las plantas, pero se ha observado que en muchos casos éstas plantas acumuladoras son
54
micotróficas y se han detectado colonización en sus raíces y esporas en el suelo rizósferico
aunque en un número muy reducido comparado con otras plantas que crecen en suelos no
contaminados (Khan et al., 2002; Harrier, 2001; Leyval et al., 2001; Leyval et al., 1997;
Weissenhorn et al., 1995; Haselwandter et al., 1994).
En los últimos años el interés de la investigación se ha centrado en la diversidad y
tolerancia de los HMA a los metales pesados en los suelos contaminados, tratando de
entender sus mecanismos de adaptación y tolerancia de HMA a metales pesados en suelos,
debido a que esto podría facilitar el manejo de estos microorganismos de suelo, para
programas de restauración / Biorremediación. Autores como Jeffries et al., (2003); Del Val
et al., (1999) mostraron que la diversidad los hongos micorrízicos asociada con plantas de
maíz en un experimento de campo a largo plazo, no defirió entre tres parcelas que habían
recibido diferentes niveles de lodos de cañería que contenían metales pesados. Sin
embargo, el número de esporas de cada especie fue menor en el suelo con la concentración
más alta de metales pesados. Usando el mismo experimento de campo a largo plazo y la
misma variedad de planta, pero suelos más ácidos; Weissenhorn (1996) encontró una
reducción del número, pero además de diversidad de esporas de HMA en el suelo que
recibía la cantidad más alta de lodo.
En un suelo altamente contaminado en el norte de Francia donde solo plantas adaptadas
podían crecer, fueron recogidas raíces de Arrhenaterum elatius a lo largo de una pendiente
de concentración de metales pesados. Hasta tres especies diferentes de Glomus fueron
identificadas dentro de las raíces de Arrhenaterum, las cuales defirieron a lo largo de la
55
pendiente de metales (Leyval et al., Datos no publicados). La contribución de estos HMA a
la tolerancia de las plantas a metales pesados o la acumulación de metales pesados por las
plantas no ha sido establecida. Cuatro especies de Glomus fueron encontradas además en la
rizósfera de otra planta tolerante al metal, Viola calaminaria, creciendo en un suelo
altamente contaminado con metales pesados (21 y 41 mg kg-1 Zn y Cd, respectivamente)
(Tonin et al., 2001). Éstas especies de Glomus incrementaron la concentración de Cd y Zn
en las raíces de trébol, pero no en los retoños, y no afectó el crecimiento en las plantas. Por
el contrario, una especies de Glomus aislada de la rizósfera de Viola calaminaria
incrementó el crecimiento de maíz y alfalfa en suelos contaminados por metales pesados y
redujo la concentración de Zn en raíces y retoños (Hildenbrandt et al., 1999; Kaldorf et al.,
1999).
Se han reportado plantas micorrizadas que crecen en los sitios contaminados por metales
pesados (Chaudhry et al.,1998; Shetty et al., 1995; Weissenhorn et al.,1995; Pawlowska et
al., 1996; Chaudhry et al., 1980); indicando que estos hongos han desarrollado una
tolerancia a los metales pesados y que pueden desempeñar un papel en la fitorremediación
del sitio. También se ha observado que la asociación entre los HMA con raíces de las
plantas incrementan la absorción, translocación, metabolización y acumulación de algunos
elementos traza como Cu (Gildon y Tinker, 1983), Pb (Díaz et al., 1996), Cd (Guo et al.,
1996; Joner et al.,1997), Ni (Killham et al.,1983), Zn (Lambert et al., 1979; Davies et al.,
1987; (Galli et al., 1994), Zn y Ni (Jamal 2002), otros metales como Hg y Cr (Galli et al.,
1994) y Co (Killham y Firestone, 1995).
56
Killham y Firestone (1995) determinaron la influencia de la colonización de Glomus
fasciculatum en la absorción metales pesados y crecimiento de pasto perenne (Ehrharta
calycina) en un suelo areno arcilloso con metales pesados como: Cu, Ni, Pb, Zn, Fe y Co,
que fueron aplicados simulando lluvia ácida con pH 3.0, 4.0 y 5.6. Los porcentajes de las
deposiciones fueron similares a los efluentes de fundidoras. La concentración de los
metales pesados en los brotes de las plantas micorrizadas fue mayor que en las plantas
testigo expuestas a la lluvia ácida simulada.
Cuando Gildon y Tinker (1983) analizaron el efecto de metales pesados en la extensión y
desarrollo de la colonización de cebolla por Glomus mosseae, ellos encontraron que la
intensidad de la colonización se reducía progresivamente cuando se incrementaba la adición
de Cu o Zn. Los dos metales tuvieron sorpresivamente efectos similares. Sin embargo las
plantas de trébol que crecieron en áreas fuertemente contaminadas con metales pesados
mostraron niveles de colonización de alrededor del 30%, mientras que en niveles con
menos concentración de contaminación con metales pesados se ha manifestado una alta
colonización en la raíces de cebolla en experimentos en maceta. De acuerdo con el
porcentaje de raíz colonizada, Glomus mosseae aislado de un suelo contaminado fue más
tolerante con el Zn y Cd que Glomus mosseae aislado de suelo no contaminado.
Concluyendo que el peso seco de brotes y la concentración de fósforo fueron
significativamente aumentados por los hongos tolerantes a los metales en comparación a la
cepa no tolerante.
Dueck et al., (1986) examinaron el efecto de G. fasciculatum en dos pastos (Festuca rubra
y Calamagrostis epipejos) en dunas costeras con presencia de cinc, ellos encontraron que la
57
colonización de HMA puede reducir el efecto negativo del Zn en el crecimiento de la
planta. Así también ambos el Zn y los HMA influyen en el crecimiento de la planta,
mientras que el Zn inhibe el crecimiento, los HMA estimulan el desarrollo radicular y de
los brotes, especialmente en el caso de F. rubra. Con respecto al crecimiento de las raíces,
ambas especies mostraron una interacción significativa entre el efecto de Zn y HMA.
Posteriormente Leyval et al., (1991) y Weissenhorn et al., (1993) confirmaron los
resultados de Gildon y Tinker (1983). En suelos contaminados por deposiciones
atmosféricas de fundidoras encontraron HMA más tolerantes al Cd que una cepa de G.
mosseae aislada de suelo no contaminado. Esta tolerancia de Cd fue observada en el
número de esporas (Weissenhorn et al., 1993) y en el porcentaje de colonización
micorrízica. De acuerdo con Weissenhorn et al., (1996), la prolongada exposición de los
metales pesados puede desarrollar tolerancia en los HMA, pero el mecanismo es poco
conocido, por consiguiente es posible mejorar la capacidad de las plantas en la recuperación
de suelos, inoculándolas con HMA.
Griffioen et al., (1994) reportaron altos niveles de colonización micorrízica en Agrostis
capillaris creciendo en suelos contaminados por Zn y Cd colindantes a una refinería de Zn.
En contraste, en el área alrededor de una vieja mina de cobre encontraron una correlación
negativa entre la colonización de A. capillaris por HMA y el contenido total de cobre en el
suelo. Desafortunadamente no analizaron
sus resultados sobre la relación entre la
biodisponibilidad de los elementos y las propiedades físicas y químicas de los diferentes
suelos. Noyd et al., (1996) señalaron que la colonización de los HMA de las plantas
58
nativas en una pradera contaminada con hierro, se incrementaron lo cual ayudó a establecer
a una comunidad sostenible de hierba nativa que significaría considerables logros en la
recuperación del sitio.
Varios autores han reportado la extracción de esporas de HMA tales como Glomus y
Gigaspora asociadas a la mayoría de las plantas que crecían en ambientes contaminados
con metales pesados. Christie (2004) y Raman et al., (1993) identificaron a Glomus y
Gigaspora spp. en micorrizósferas de catorce especies de plantas que colonizaban un
desecho de mina de magnesita en la India. Mientras que Weissenhorn y Leyval et al.,
(1994) aislaron solo a Glomus mosseae; Dueck et al., (1986) aislaron Glomus fasciculatum
de los suelos contaminados por metales pesados. Pawlowska et al., (1996) examinaron
grandes cantidades ricos en Cd, Pb y Zn en Polonia y recuperaron esporas de Glomus
aggregatum, G. fasciculatum y Entrophospora spp. de las micorrizósferas de las plantas
que crecían en los suelos.
Galli et al., (1994) dichos autores sugirieron que las micorrizas pueden desempeñar un
papel crucial en la protección de la planta contra los metales pesados. La eficacia de la
protección, sin embargo, difiere entre los distintos aislados de hongos micorrízicos y los
diferentes metales pesados. Joner y Leyval (1997) señalaron que las hifas extra- radicales
de los HMA Glomus mosseae pueden transportar el Cd del suelo a las plantas de trébol
creciendo en macetas seccionadas. Los autores no señalaron ninguna restricción en el
crecimiento de las hifas en suelos con altos niveles de Cd extraíble.
59
La captación de metales por la simbiosis micorrizíca obedece a varios factores tales como
las propiedades físicas y químicas del suelo (Wang y Chao, 1992), particularmente su nivel
de fertilidad (Lambert et al., 1979; Thompson, 1990), su pH (El-Kherbawy et al.,1989;
Killham y Firestone, 1983), la planta hospedera (Griffioen y Emst, 1989; Kucey y Janzen,
1987), el tipo de hongos involucrados (Gildon y Tinker, 1981) y, sobre todo, la
concentración de los metales en los suelos. Bajo condiciones de deficiencia, la mayoría de
los estudios señalan un aumento en la captación de metal por las plantas micorrizadas. En
este contexto, se ha observado un aumento en la concentración de Zn en las hojas, causada
por HMA, en suelos con altas concentraciones de este elemento (Christie, 2004; Thompson,
1990; Faber et al., 1990).
La acumulación de cadmio, plomo y cinc, en cultivos irrigados con desechos de la industria
minera y eléctrica; las muestras del suelo superficial analizadas mostraron que las raíces de
zanahoria son afectadas ya que sus hojas contenían altas concentraciones de metales
pesados, ya que estos son absorbidos por las plantas llegando a los frutos y transfiriéndose a
la cadena alimenticia. Por lo que es necesario la recuperación de suelos contaminados
utilizando la simbiosis entre plantas acumuladoras con los hongos micorrízicos por lo que
el maximizar una colonización radicular en plantas que crecen en ambientes adversos,
como son los suelos contaminados con metales pesados es ahora de gran interés, porque se
considera que las micorrízas arbusculares son clave en estrategias destinadas a frenar la
contaminación de suelos, la erosión y desertificación, basadas en la revegetación con
especies arbustivas autóctonas (Kugonic y Graman, 1999; Kothari et al., 1990).
60
2.6.3. Contribución de los HMA en la absorción y translocación de los metales pesados
por plantas hiperacumuladoras
Cuando los suelos contienen altas cantidades potencialmente tóxicas de metales pesados, la
simbiosis micorrízica induce bajas concentraciones de estos metales en la parte aérea de la
planta y por consiguiente un efecto benéfico en su crecimiento. Díaz y Honrubia (1995)
detectaron un aumento en la acumulación de plomo en las plantas micorrizadas, utilizando
poblaciones de hongos nativos, ellos observaron una disminución en la concentración de
plomo en la parte foliar de A. cytisoides micorrizadas creciendo en suelos con altas
concentraciones de plomo y cadmio. (Chen, 2000 y Weissenhorn et al., 1995) también
informaron una reducción en la concentración de plomo en plantas micorrizadas.
Los efectos provocados por los HMA en las plantas colonizadas en la absorción y
traslocación de metales son poco conocidos; pero la absorción de metales pesados depende
de la especie de la planta, de la concentración del metal, del medio de crecimiento y
posiblemente de la especie de hongo, pudiendo aumentar o disminuir la absorción de
ciertos metales (Heggo et al., 1990).
Con respecto al significado de las micorrizas en fitorremediación de suelos contaminados
con metales pesados, se ha comprobado que las plantas micorrizadas tienen un efecto
benéfico, basado en la capacidad que confiere a la planta para inmovilizar metales en la raíz
reduciendo así su translocación a la parte aérea y, en consecuencia, el flujo de metales a la
cadena trófica (Del Val et al., 1999). En este contexto, dos aspectos principales deben
61
considerarse: el primero trata de los efectos de los metales pesados sobre los hongos
micorrízicos y su simbionte, el segundo se refiere al efecto provocado en los hongos en la
absorción del suelo para la planta y transferencia a los brotes y la tolerancia de las plantas
un exceso de metales pesados en el suelo (Nogueira, 1996; Leyva et al., 1997).
Los reportes de las altas concentraciones de metales muestran variaciones en la
acumulación de metal y la translocación dentro de la planta dependiendo del hongo, de la
planta hospedera, densidad de la raíz, características del suelo, metales y su disponibilidad
(Joner y Leyval, 2001; Leyval et al., 1997; El-Kerbawy et al., 1989). Las micorrizas
arbusculares pueden subsistir en suelos altamente contaminados con metales pesados, sin
embargo la colonización a menudo es reducida en esas condiciones. Varios metales pesados
son fungitóxicos, reduciendo la germinación de las esporas, el crecimiento micelial y
consecuentemente la colonización micorrízica (Jamal, 2002).
Los HMA aislados de suelos contaminados son más tolerantes a metales pesados y pueden
disminuir la concentración en retoños y raíces, o disminuir la traslocación de raíces a
retoños (Joner y Leyval, 1997; Diaz et al., 1996). Lo último puede ser debido a la alta
capacidad de absorción de metal de estos hongos, lo cual podría “filtrar” iones de metal
durante la absorción (Joner et al., 2000). En otro estudio realizado por Weissenhorn et al.,
(1994), la colonización radicular de maíz en suelo contaminado aumentó la masa vegetal y
redujo la absorción de Cd, Zn y Cu en la parte aérea y raíces.
62
Los HMA pueden disminuir los efectos adversos de la fitotoxicidad inducida por el exceso
de metales que no solo revisten importancia ecológica y, más recientemente, tecnológica;
considerando la necesidad de rehabilitar áreas contaminadas con metales pesados dispersas
por todo el mundo (Leyval et al., 1997).
Se ha prestado poca atención al papel de la MA en ambientes que contienen un elevado y
potencialmente nivel tóxico de elementos minerales, si bien la inoculación con hongos
micorrízicos reduce la concentración de cinc y cadmio en las hojas de la planta que crecen
en suelos con alta concentración de estos metales (Heggo et al., 1990) mencionan que la
toxicidad del Zn para las raíces de Betula pendula puede ser reducida por la colonización
con hongos micorrízicos y la influencia en el mejoramiento fue positivamente asociada con
la compatibilidad entre la filtración del hongo y la planta.
Un mejoramiento similar se ha observado en Betula papyrifela asociada con varios
simbiontes micorrízicos expuestos a cobre y a níquel. Autores como Joner y Hutchinson,
(1986), Gildon y Tinker, (1989) demostrarón que las micorrízas arbusculares pueden
también afectar la incorporación de metales pesados por las plantas y que los hongos
arbusculares son tolerantes a las altas concentraciones en el suelo.
Numerosos estudios han mostrado ahora que bajo condiciones moderadas de contaminación
de cinc, las plantas hospederas de los HMA se encontraba colonizada. Los trabajos
realizados por Griffionen et al., (1994) en una parcela próxima a una refinería de cinc,
contaminada con cinc y cadmio, la especie de Agrostis capilaris utilizada en programas de
63
rehabilitación de suelos contaminados con metales pesados se encontraba colonizada,
debiendo por lo tanto beneficiarse de la simbiosis.
La colonización con los hongos nativos tolerantes a los metales ha mostrado que puede
proteger a las plantas contra los efectos tóxicos de concentraciones excesivas de metales
pesados. Los hongos MA mejoraron la incorporación de Zn en el melocotón en los suelos
deficientes en California en maíz (Zea mays L.) y trigo (Triticum aestivum L.) en algunos
suelos deficientes en la India (Christie et al., 2004).
Una reciente contribución de los HMA en la ecología de los suelos, se relaciona con el
descubrimiento de la glicoproteína llamada glomalina. Wright y Upadhyaya (1998)
mostraron que la abundante concentración (comúnmente varios mg/kg) de proteína en el
suelo, esta altamente correlacionada con los agregados.
2.7. Importancia del cultivo del girasol
2.7.1. Origen
El origen del girasol se remonta a 3000 años a.c. en el norte de México y oeste de Estados
Unidos de América, ya que fue cultivado por las tribus indígenas de Nuevo México y
Arizona, fue uno de los principales productos agrícolas empleados en la alimentación de
muchas comunidades americanas antes del descubrimiento. La semilla de girasol fue
introducida en España por los colonizadores y después se extendió al resto de Europa, pero
64
fue durante el siglo XIX cuando comenzó la explotación industrial de su aceite destinado a
la alimentación.
2.7.2. Características botánicas
Perteneciente a la familia de las Asteraceae cuyo nombre científico es Helianthus annuus.
Es una planta anual, con un desarrollo vigoroso en todos sus órganos, dentro de esta especie
existen numerosos tipos o subespecies cultivadas como plantas ornamentales, oleaginosas y
forrajeras, cada una de las partes de la planta se describen a continuación.
Raíz: esta formada por una raíz pivotante y un sistema de raíces secundarias de las que
nacen las terciarias que exploran el suelo en sentido vertical y horizontal, normalmente la
longitud de la raíz principal sobrepasa la altura del tallo.
Tallo: es de consistencia semileñosa y maciza en su interior, siendo cilíndrico y con
diámetro variable entre 2 y 6 cm y a una altura hasta el capítulo entre 40 cm y 2 m. La
superficie exterior del tallo es rugosa, asurcada y vellosa, excepto en su base (Alba y
Llanos, 1990).
Hojas: son alternas, grandes, trinervadas, largamente pecioladas acuminadas, dentadas y de
áspera vellosidad tanto en el haz como el envés. El número varia entre 12 y 49, de acuerdo
con las condiciones de cultivo y la variedad, el color también es variable y va de verde
oscuro a verde amarillento.
65
Inflorescencia: el receptáculo floral o capítulo puede tener forma plana, cóncava o convexa,
el capítulo es solitario y rotatorio y esta rodeado por brácteas involúcrales. Las flores del
exterior del capítulo (pétalos amarillos) son estériles, están dispuestos radialmente y su
función es atraer a los insectos polinizadores. Las flores del interior están formadas por un
ovario inferior, dos sépalos, una corola en forma de tubo compuesta por cinco pétalos y
cinco antenas unidas a la base del tubo de la corola.
Fruto: es un aquenio de tamaño comprendido entre 3 y 20 mm de largo y 2 y 13 mm de
ancho. El pericarpio es fibroso y duro, quedando pegado a la semilla, la membrana seminal
crece en el endospermo y forma una película fina que recubre al embrión y asegura la
adherencia entre el pericarpio y la semilla (Alba y Llanos, 1990).
2.7.3. Requerimientos edafoclimáticos
Suelo: es un cultivo poco exigente en el tipo de suelo, aunque prefiere los arcillo-arenosos y
ricos en materia orgánica, es muy poco tolerante a la salinidad y contenido de aceite
disminuye cuando ésta aumenta en el suelo. En suelos neutros o alcalinos la producción de
girasol no se ve afectada, además es una de las plantas con mayor capacidad para utilizar
residuos químicos (Alba y Llanos, 1990).
Temperatura: es un factor muy importante en el desarrollo del girasol, adaptándose muy
bien a un amplio margen de temperatura que van desde 25-35C a 13-17 C.
Fotoperiodo y luz: las diferencias en cuanto a la aparición de hojas, fecha de floración y a la
duración de las fases de crecimiento y desarrollo son atribuidas al fotoperiodo. Durante la
66
fase reproductiva el fotoperiodo deja de tener influencia y comienza a tener importancia la
intensidad y la calidad de la luz, por tanto un sombreo en plantas jóvenes produce un
alargamiento del tallo y reduce la superficie foliar (Alba y Llanos, 1990)..
2.7.4. Particularidades del cultivo
La época de la siembra es variable y depende de las características climatológicas de cada
región. El conocimiento de la forma que tiene la planta de crecer y desarrollarse sus
órganos, desde la germinación de la semilla hasta la maduración de sus semillas, permite
una correcta utilización de los medios de producción, y una interpretación acertada de la
forma de reaccionar de la planta frente a la influencia del medio ambiente y a las prácticas
agrícolas utilizadas para su producción (Carter, 1987).
La semillas de girasol, presentan un hábito de crecimiento (Fig. 6) como se explica a
continuación: la germinación de la semilla es aproximadamente de 10 a 20 días, entre los
15 y 25 días se produce el enraizamiento de la planta, el período de crecimiento más activo
de la planta es alrededor de 40 y 50 días, aparecen de cinco pares de hojas al principio de
floración en el cual se presenta la máxima absorción de elementos minerales del suelo. La
floración puede durar de 10 a 12, días comienza con la apertura de las primeras flores
liguladas y finalmente la maduración puede durar entre 35 y 50 días. Esta fase comienza
con el final de la floración y llega hasta el estado de madurez fisiológica (Alba y Llanos,
1990) (Fig. 6).
67
Fig. 6. Fenología de la planta del girasol, tomada de (Alba y Llanos, 1990).
2.7.5. Características del girasol como planta fitorremediadora
El girasol fue escogido para este estudio por las siguiente razones:

Facilidad de manejo en su cultivo

Se adapta fácilmente a un amplio intervalo en la variación de temperatura.

La época de la siembra es variable y depende de las características
climatológicas de cada región.

Es una planta hiperacumuladora de una variedad de metales pesados como:
Cr (III), Cr (IV), (Davies et al., 2001), de As, Bi, Cd, Cu, Mn, Pb, Sb, TI y
68
Zn (Christie et al.,2004; Cabrera et al., 1999), también metales radioactivos
como uranio (De Oliveira 1999; De Oliveira et al., 2003)

Es una planta micotrófica (Davies et al., 2001; Cabrera et al., 1999;
Chandrashekara et al., 1995)

Puede remediar tanto suelos como aguas contaminadas.
Como se mencionó anteriormente una de las limitaciones de la utilización de plantas para
recuperar suelos contaminados es su lento crecimiento y su poca biomasa radicular (Raskin,
1995; Chaudhry et al., 1998) pero de acuerdo con Xiong, (1997) y Davies (2001) las
Asteraceae toleran altos niveles de algunos metales en comparación con otros grupos
taxonómicos y se les ha propuesto como especies fitoremediadoras.
El girasol es reportado con una alta biomasa radicular y capacidad de acumular metales, no
obstante una baja tolerancia al cromo comparado con otras plantas acumuladoras
(Shahanden y Hossner, 2000). Es una planta micotrófica ya que el género Glomus puede
colonizar al girasol (Chandrashekara et al., 1995; Davies et al., 2001). Los HMA ayudan a
desarrollar el volumen y extensión radicular aumentando el área de descontaminación de
suelos con metales pesados. Sin embargo el estudio de la interacción de los HMA y el
girasol con los suelos contaminados puede proveer información del papel ecológico de los
HMA en los suelos contaminados por metales pesados especialmente cinc y cobre y su
participación en la tolerancia de estos metales.
69
3. MATERIALES Y MÉTODOS
El trabajo experimental se realizó en las instalaciones de la Facultad de Ciencias Biológicas
y Agropecuarias de la Universidad de Colima, Campus Tecomán, localizada en el Km. 40
de la autopista Colima-Manzanillo a 1854’ LN y 10352’ LW.
3.1. Muestreo de suelos
3.1.1. Localización y descripción de los sitios de muestreo
En este trabajo se estudiaron cuatro suelos seleccionados completamente al azar, a lo largo
de un gradiente de 74 Km de longitud, entre la laguna de oxidación situada en el municipio
de Minatitlán, Colima con una altura de 740 msnm y la zona agrícola del municipio de
Cihuatlán, Jalisco, que cuenta con una altura de 13 msnm. En la laguna de oxidación o de
jales son depositados los desechos que resultan de la extracción de hierro del consorcio
minero Peña Colorada ”Benito Juárez”, ubicado en el municipio de Minatitlán, Colima a
una altura de 850 msnm.
Contiguo a la presa de jales transita el caudal del Río Marabasco también llamado
Cihuatlán, Chacala o Paticajo, el cual recibe filtraciones de la laguna de oxidación por lo
que sus aguas contienen metales como: plomo, hierro, cinc, cobre, cromo y cadmio (Meyer
et al., 1999), su cauce recorre la pendiente hasta llegar a la zona agrícola del municipio de
Cihuatlán del estado de Jalisco. En el transcurso del río, los habitantes aledaños utilizan sus
aguas para riego y consumo para ganado bovino y aves. La ubicación de los sitios
seleccionados se muestran en la (Fig. 7).
70
1
2
4
3
Fig. 7 Mapa de la rivera del Río Marabasco, señalando los sitios muestreados.
1.- Laguna de Oxidación, 2.- Ávila Camacho, 3.- El Charco y 4.- El
Centinela.
El sitio 1 se localizasitúa en la laguna de oxidación del Consorcio Minero “Peña Colorada
Benito Juárez”, en la cual se vierten los residuos del proceso de extracción de hierro. En
esta área, el tule y el diente de león son las plantas representativas. El sitio 2, se encuentra
ubicado en la parte media entre la laguna de oxidación y el valle de Cihuatlán, y
corresponde con el lugar conocido como Manuel Ávila Camacho perteneciente al
municipio de Minatitlán. En esta zona crecen plantas silvestres y las más representativas
son conocidas comúnmente como diente de león y tule.
El sitio 3 se encuentra en la región llamada “El Charco”, de donde se tomaron muestras de
una área con cultivo de plátanos y chile jalapeño y una zona no cultivada con presencia de
plantas silvestres. El sitio 4 llamado “El Centinela de Arriba” del municipio de Cihuatlán,
71
Jalisco en donde se colectó un suelo cultivado con plátano y limón; así como un suelo no
cultivado con presencia de plantas silvestres (Fig. 8; Cuadro 4).
.
A
C)
B
D)
E)
F)
Figura 8. Panorámica de los diferentes sitios muestreados: A) y B) Laguna de Oxidación,
C) Ávila Camacho, D) El Centinela no cultivado, E) El Centinela Cultivado y F) El
Charco no Cultivado.
72
Cuadro 4. Sitios de colecta del suelo para el estudio.
Sitios
Laguna
Municipio
Estatus
Número de
muestras
de Minatitlán
No cultivada
5
Manuel Ávila
Minatitlán
No cultivada
5
El Charco
Cihuatlán
Plátano
5
El Charco
Cihuatlán
No cultivada
5
El Centinela
Cihuatlán
Plátano
5
El Centinela
Cihuatlán
No cultivada
5
oxidación
3.1.2 Muestro de suelos
El muestreo de suelo se llevó a cabo bajo una metodología completamente al azar, en un
transecto de 74 Km de longitud, empleando el método de muestreo en zig-zag, sugerido por
Sieverding (1991), colectando el suelo rizósferico de las plantas dominantes a una
profundidad de 0 a 25 cm. De cada sitio se tomaron cinco submuestras las cuales se
mezclaron para formar una muestra compuesta de aproximadamente un 1 kg. Las muestras
obtenidas se secaron al ambiente bajo sombra, posteriormente se tamizaron en malla de 4
mm de apertura y se guardaron a 5º C en bolsas de polietileno debidamente selladas y
etiquetadas, hasta su análisis físico y químico; así como la determinación de la
73
concentración de metales pesados y determinar el porcentaje de colonización micorrízica en
las raíces de las plantas dominantes, en los sitios de colecta.
3.1.3. Muestreo de raíces
Las raíces se tomaron entre 0-25 cm de profundidad fueron colectadas de las plantas
dominantes de cada uno de los sitios muestreados. Cinco muestras de raíces fueron tomadas
de puntos al azar. Las raíces fueron cuidadosamente extraídas del suelo y colocadas en
bolsas de plástico debidamente etiquetadas, posteriormente fueron llevadas al laboratorio,
una vez ahí se colocaron en frascos con formol-alcohol-ácido acético (FAA) hasta su
procesamiento.
3.2. Análisis físicos y químicos de suelos
Las características físicas y químicas que se determinaron fueron: Textura, conductividad
eléctrica, potencial de hidrógeno (pH) y el contenido de materia orgánica. Los cuales se
realizaron de la siguiente manera.
3.2.1. Textura del suelo
La textura se determinó por el método del hidrómetro de Bouyoucos (Day, 1963). Se tomó
una muestra de 100 g de suelo, se le agregaron 5 ml de solución dispersante
(hexametafosfato de sodio). Después se pasó esta suspensión a una batidora y luego se pasó
74
a una probeta de 250 ml. Inmediatamente se realizó la primera lectura de densidad, la cual
corresponde a la densidad de la suspensión de arcilla más limo. Se dejó en reposo y se
realizó la segunda lectura que corresponde a la arcilla. Se hicieron los cálculos
correspondientes y se determinó la textura utilizando el triángulo de las texturas.
3.2.2. pH del suelo
El pH del suelo se determinó por el método propuesto por Rayment y Higginson (1992), se
pesaron 10 g de suelo el cual fue mezclado con 20 ml de agua destilada, la suspensión
suelo-agua se agitó por una hora a 25 C, se dejó reposar por 15 min, la medición fue
tomada empleando un electrodo de vidrio (McLean, 1982).
3.2.3. Conductividad eléctrica del suelo
La conductividad eléctrica del suelo fue determinada para medir la salinidad del suelo. Se
tomó una relación suelo agua (1:1) utilizando 100 g de suelo al cual se agregaron 100 ml
de agua destilada, la suspensión suelo-agua se agitó por una hora a 25 C, se dejó reposar
por 15 min. La lectura fue tomada con la ayuda de un conductímetro calibrado.
3.2.4. Materia orgánica
El contenido de materia orgánica fue determinado por el método de oxidación del carbono
de la materia orgánica por la combinación del dicromato de potasio y el ácido sulfúrico
75
(Walkley-Black, 1976). Se tomaron 10 g de suelo muestreado, se trata con 5 ml de
dicromato de potasio 1N y con el doble de ácido sulfúrico concentrado. Después de media
hora de reposo se añaden 100 ml de agua, 5 ml de ácido fosfórico y 6 gotas de fenilamina,
para titular con solución sulfato ferroso.
3.3. Determinación de la concentración de metales pesados
Se examinó el contenido de los siguientes elementos: plomo, cadmio, arsénico, cinc,
cromo, cobre y hierro. Se empleó el método de extracción con reflujo con agua regia (HCL:
HNO3 2:1 v/v)
(Berrow y Stein, 1983), y posteriormente fueron determinados por
espectrofotometría por absorción atómica (Schlichting et al., 1995). Estos análisis se
realizaron en el Laboratorio de Alta Tecnología de Xalapa (LATEX).
3.4. Hongos micorrízicos arbusculares y colonización en plantas silvstres
3.4.1.Cuantificación de esporas
Las esporas fueron extraídas en 100 g de suelo, empleando el método de tamizado en
húmedo y decantación de acuerdo con Gerdemann y Nicolson, (1963), continuando con la
centrifugación en una solución de sacarosa al 50% (Walker et al., 1992). Las esporas así
obtenidas se observaron en el microscopio estereoscópico para realizar el conteo,
contándose solamente esporas turgentes y brillantes.
76
Para reportar el número de esporas en suelo seco se determinó el contenido de humedad de
cada suelo. El peso seco se obtuvo después de pesar el suelo húmedo y secarlo a 60 C,
hasta peso constante volver a pesar hasta obtener el peso seco por la diferencia de pesos y
finalmente reportar el número de esporas en 100 g de suelo seco (Anderson e Ingram,
1993).
3.4.2. Determinación de la colonización micorrízica
Las raíces fueron lavadas con agua para eliminar el FAA y cortadas en fragmentos de
aproximadamente 1 cm de longitud. Una vez lavadas se procesaron de acuerdo con la
técnica de Phillips y Hayman (1970) modificada por Kormanik et al., (1978). Las raíces se
colocaron en una solución de hidróxido de potasio (KOH) al 10% hasta cubrirlas y se
metieron en autoclave, posteriormente se enjuagaron por los menos tres veces con agua
destilada para retirar el KOH y se enjuagó 3 veces con agua corriente. A continuación las
raíces se sumergieron en ácido clorhídrico (HCl) al 1% y finalmente se agregó la solución
colorante fucsina ácida al 0.05 % y se llevaron a una temperatura de 121º C por 10 min.
Para determinar la colonización micorrízica arbuscular de las raíces, se utilizó el método
sistemático del portaobjeto (McGonigle et al. 1990). Esta evaluación se realizó con un
microscopio compuesto Olympus modelo 1x70-MO81. Los valores se expresaron en
porcentaje de colonización micorrízica.
Los segmentos de raíces, fueron seleccionados al azar a partir de las muestras teñidas y se
colocaron en láminas portaobjetos, con la ayuda de un microscopio compuesto Olympus
modelo 1x70-MO81 con un aumento de 40 X, se pudo observar la presencia de estructuras
77
fúngicas. Se hicieron tres repeticiones para cada sitio. La longitud de la colonización
cortical fue estimada en milímetros (valor promedio) y expresada como el porcentaje de
raíces colonizadas.
3.5. Selección del suelo de estudio
Para la selección del suelo a utilizar en el experimento final, se eligio el que presentó el
mayor contenido de metales pesados y además en el que se constató la mayor presencia de
estructuras morfológicas de hongos micorrízicos arbusculares en las plantas silvestres.
3.6.
Propagación de HMA nativos de suelos contaminados
3.6.1. Cultivo trampa
Para la identificación de los HMA se propagaron utilizando como cultivo trampa una
mezcla de sorgo (Sorghum vulgare. L) y pasto de guinea (Panicum maximum). Para este
ensayo se usó el suelo con mayor concentración de metales pesados y con presencia de
hongos micorrízicos arbusculares. El suelo se mezcló con arena en una proporción 2:1. Se
colocó en macetas de 350 g y se sembraron con una mezcla de semillas de pasto bahía
(Paspalum notatum) y alfalfa (Medicagato sativa). Las macetas se colocaron en bolsas “sun
bags” de acuerdo con la técnica de Walker (2001) y se mantuvieron en condiciones
semicontroladas de invernadero con una temperatura promedio de 22 C en el día y de 15
C por la noche, con una humedad relativa (H.R.) del 60-80% y con un intervalo de
78
oscuridad y luz de 10/12. Después de 16–18 semanas de crecimiento se suspendió el riego
para estimular la producción de esporas. Una vez secas las plantas se cortó la parte aérea y
el suelo se guardó en bolsas de plástico en un lugar seco y fresco hasta su procesamiento
(Fig. 9).
Fig. 9. Cultivo trampa utilizado en la propagación de HMA nativos del suelo con
mayor concentración de Cu y Zn.
3.6.2. Diversidad morfológica de HMA nativos presentes en el suelo de estudio
Para la identificación de las esporas se extrajeron del suelo siguiendo la técnica de tamizado
húmedo y decantación (Gerdemann y Nicolson, 1963) seguida de centrifugación en
gradiente de sacarosa (Walker, 1997). Las esporas se colocaron en una caja de Petri y
fueron observadas bajo el microscopio estereoscópio Olympus SZ40. Se separaron de
acuerdo con sus características morfológicas principalmente color, tamaño, forma,
presencia de hifas de sostén como sugieren Walker (1983) y Schenck et al., (1990).
79
Posteriormente se seleccionaron los morfotipos más representativos, se realizaron
preparaciones permanentes colocando esporas intactas usando alcohol polivínilico lactoglicerol (Morton et al., 1993). Se observaron en el microscopio para su identificación. En la
identificación se utilizarondo los criterios taxonómicos de Schenck y Perez (1990).
3.7.
Contribución de Glomus intraradices en la absorción de cinc y cobre
El diseño experimental consistió en una distribución completamente al azar con dos
tratamientos: inoculación con hongos micorrízicos y sin inoculación, con diez repeticiones.
Este estudio se efectúo bajo condiciones de invernadero, utilizando como planta
hiperacumuladora el girasol (Helianthus annuus L.). El hongo usado en este experimento
fue Glomus intraradices procedente de un suelo no contaminado de Campeche que fue
propagado como se describe en la sección 3.6.1.
3.7.1. Desinfección de la semilla
Las semillas de girasol (Helianthus annuus L.) se desinfectaron en su superficie, por
inmersión en alcohol al 70% por un minuto, a continuación se sumergieron en hipoclorito
de sodio al 10% por quince minutos, posteriormente la semilla se enjuagó ocho veces con
agua destilada estéril (Talukdar y Germida, 1994; Duncan y Howard, 2000; Zhu et al.,
2000).
80
3.7.2. Germinación de la semilla de girasol
Una vez esterilizadas las semillas, se sembraron utilizando como sustrato polvillo de coco
se colocó en charolas de germinación de 48.5 x 35 x 13.5 cm de polietileno de alta densidad
y con perforaciones de 3/8 de pulgadas en la base para drenaje y aireación. Las semillas se
mantuvieron húmedas utilizando agua destilada estéril y permanecieron en condiciones
semicontroladas de invernadero hasta que las plántulas presentaron el primer par de hojas
verdaderas, aproximadamente a los 15 días después de la siembra, posteriormente se
procedió al transplante.
3.7. 3. Transplante de girasol
Se seleccionaron plántulas con características semejantes en tamaño, color, diámetro del
tallo y número de hojas, se transplantaron a macetas de plástico 1.5 kg de capacidad
previamente desinfectadas. El sustrato de crecimiento que se utilizó en las macetas fue el
suelo seleccionado. Dicho suelo fue esterilizado mediante vapor con anterioridad a la
siembra. En cada maceta se trasplantaron tres plántulas lo que representó una unidad
experimental, éstas fueron colocadas en condiciones semicontroladas de invernadero (Fig.
10 y 11).
81
b)
a)
c)
Fig. 10. Diversas etapas de la planta de girasol: creciendo en maceta con suelos
a)germinación b) nascencia c) después del primer muestreo a los 40 días de
crecimiento.
82
Fig.11. Planta de girasol: creciendo en maceta con suelos después del segundo muestreo a
los 60 días de crecimiento.
3.7.4. Inoculación micorrízica
Al momento del transplante, las plántulas se inocularon con 1.5 g de inóculo, el cual
consistía de una mezcla suelo/ raíz de Glomus intraradices. El inóculo fue puesto en una
capa 5 cm debajo de la superficie del suelo. Las macetas se mantuvieron en condiciones de
invernadero por ocho semanas, las plantas fueron regadas con agua corriente según se
necesitó y no se aplico fertilizante, ni solución nutritiva. La superficie de las macetas fue
cubierta con discos de papel aluminio para reducir la transpiración del suelo y eliminar la
contaminación.
83
3.7.5 Duración del experimento
De acuerdo con Davies, (2001) el lapso de tiempo para completar el estudio con plantas de
girasol es de aproximadamente 50 días, pero la duración del presente experimento fue de 70
días con el fin de registrar el comportamiento de la absorción del cinc y cobre por la planta
posteriormente a su fase de mayor absorción de nutrimentos. Las fechas programadas
fueron las siguientes:

A los 25 días después del trasplante, contando con 40 días. de crecimiento, en este
periodo la planta presenta una mayor absorción de nutrimentos.

A los 55 días después de la siembra.

A los 70 días después de la siembra.
3.7.6 Preparación y análisis de muestras
Al término del experimento, las plantas fueron cuidadosamente extraídas de las macetas,
separándose la parte aérea y radicular, se lavaron con agua corriente para eliminar los
residuos de suelo, posteriormente se procesaron cada una de las partes de las plantas para
determinar la concentración de los metales pesados.
84
3.8.
Variables evaluadas
Las variables evaluadas fueron: concentración de metales pesados en la parte aérea y en las
raíces de las plantas inoculadas y no inoculadas, concentración de metales pesados en el
suelo con la planta inoculada y no inoculada, colonización micorrízica y la población de
esporas, al finalizar el experimento.
3.9.
Análisis estadístico
Se efectuó un análisis de varianza (ANOVA) para una distribución de los tratamientos
completamente al azar con dos tratamientos, mediante el programa estadístico
SAS
(Statistical Analysis System) (SAS, 1990) y se utilizó la prueba de Tukey al 0.05 de
probabilidad para la separación de los promedios y determinación del mejor tratamiento.
85
4.
RESULTADOS
4.1. Análisis físicos y químicos de los suelos
Los resultados obtenidos de los análisis físicos y químicos de los suelos colectados y
estudiados se presentan en el Cuadro 5. Con respecto al pH, los valores se indican que los
suelos varían dentro de un intervalo de 6.4 a 7.1. El de pH 6.4 es considerado como
ligeramente ácido y los que presentan un pH de 7.0 y 7.1 son neutros, por lo que de acuerdo
con Daub y Seese (1996) estos suelos se clasifican como ligeramente ácidos a neutros.
Cuadro 5. Características químicas y físicas de los diferentes suelos muestreados. Los
datos son promedio de 3 repeticiones.
Sitio
pH (H2 O)
Laguna de oxidación.
6.4
Materia
orgánica
CE
(mScm-1)
0.8
0.70
Textura
Areno-limo-arcilloso
(15 % arcilla 13% limo 72 %arena)
Ávila Camacho
7.0
1.6
0.1
Arena
(5 % arcilla 5 % limo 90% arena)
El Charco con cultivo
7.1
2.8
0.8
Franco Arenoso
(14% arcilla 12 % limo 74%arena)
El Charco no cultivado
6.9
1.9
0.1
Arena
(5 % arcilla 5 % limo 90% arena)
El Centinela con cultivo
7.1
2.9
0.5
Areno limo arcilloso
(15 % arcilla 13 % lino 72% arena)
El Centinela no cultivado
6.9
2.1
0.2
Franco arenoso
(14% arcilla 12% limo 74% arena)
Nota: Análisis realizados en el laboratorio de la Facultad de Ciencia Biológicas y Agropecuarias de la
Universidad de Colima, utilizando métodos estandarizados de suelo y las especificaciones del .PROYNOM-021-RECNAT-2000 (SEMARNAT,2000). Estos análisis fueron ratificados por el Laboratorio de
Alta Tecnología de Xalapa, Ver. (LATEX).
86
El valor de pH, dentro del cual se encuentra el suelo de la Laguna de Oxidación (6.4) es
considerado como ligeramente ácido. Mientras que en los otros suelos muestreados como
El Charco y El Centinela no cultivados, El Charco y El Centinela cultivados a sí como
también el suelo de Ávila Camacho presentan un pH neutro.
Con respecto a los contenidos de materia orgánica, se estableció que en la Laguna de
Oxidación, el suelo es muy pobre en materia orgánica (0.8); además con un pH ligeramente
ácido; ambos factores intervienen en la solubilidad de los metales pesados. En los sitios
muestreados de Ávila Camacho, El Charco y El Centinela no cultivado son moderadamente
altos en materia orgánica, pero son ricos en esa propiedad química los suelos de El Charco
y El Centinela cultivados, considerando que estos suelos son neutros se limite la movilidad
y disponibilidad de metales pesados (Termminghof et al., 1997).
La textura de suelo es otro factor importante que influye en la movilidad y disponibilidad
de los metales pesados. De acuerdo con los resultados de los análisis realizados a los
suelos colectados, se observa que la textura que presentan los suelos muestreados de Ávila
Camacho y El Charco sin cultivar son arenosos, mientras en El Charco cultivado y El
Centinela con cultivo son franco arenosos y los suelos de la Laguna de Oxidación y El
Centinela cultivado son areno-limo-arcilloso.
Recordando que la conductividad eléctrica de un suelo nos indica la salinidad del mismo y
de acuerdo con los resultados obtenidos de los suelos muestreados, nos señalan que estos
suelos no son salinos.
87
4.2. Concentración de metales pesados en los suelos muestreados.
En el Cuadro 6 se muestran los resultados de la concentración de metales pesados de los
sitios muestreados, que se obtuvieron en el laboratorio y además se exponen como
referencia los límites máximos permitidos en los países Europeos, Estados Unidos de
América y Canadá (Kloke, 1980).
Cuadro 6. Concentración de metales pesados (ppm) en cada uno de los suelos colectados.
Sitios
Laguna de
Muestreados oxidación
Ávila
ElCharco
Camacho (cultivado)
El Charco
(sin cultivo)
ElCentinela El Centinela
( cultivado)
(sin cultivo)
Plomo
100 L.M.P
22.9
12.90
15.21
14.78
17.23
20.01
Cromo
100L.M..P
4.47
49.06
42.00
39.87
27.27
25.10
Cadmio
3.0L.M..P
2.0
1.18
1.98
2.01
1.99
2.01
Cinc
300L.M..P
270.60
72.86
64.59
69.06
69.93
89.71
Cobre
100L.M..P
592.92
42.36
54.60
88.46
110.01
44.10
Fuente: Análisis realizados en el laboratorio de Alta Tecnología de Xalapa (LATEX), utilizando métodos
estandarizados de suelo y las especificaciones del PROY-NOM-021-RECNAT-2000.
(SEMARNAT,2000). Límite máximo permitido (LMP).
En el suelo de la laguna de oxidación se registraron las concentraciones más altas de Cu y
de Zn, sin dejar de ser importante la presencia de Pb, Cd y C. Con respecto a los otros
suelos muestreados, se observa también una considerable concentración de metales
pesados, siendo el sitio El Charco con cultivo mostrando las concentraciones mas bajas
88
exceptuando el Pb y en El Centinela no cultivado se denota la mayor presencia de Cu y Zn
por lo que este sitio fue seleccionado para el estudio de investigación.
4.3 Cuantificación de esporas y determinación de la colonización
micorrízica de los sitios muestreados
Los resultados obtenidos de la colonización micorrízica y el número de esporas en los
sitios muestreados se exponen en el Cuadro 7.
Cuadro 7. Colonización micorrízica expontána en los suelos de los sitios muestreados. Los
datos son promedios de tres repeticiones.
Sitios
Colonización
micorrízica (%)
Número de esporas por
100 g suelo seco
1  0.45
00
Ávila Camacho
59.0  9.18
505  3.62
El Charco (con cultivo)
43.3  7.41
418  2.23
El Charco (no cultivado)
48.9  2.35
432  1.48
ElCentinela (con cultivo)
43.6  5.67
402  1.35
ElCentinela (no cultivado)
32.8  6.45
344  1.14
Laguna de oxidación
Es importante hacer notar que en suelo de la laguna de oxidación, presentó una mayor
concentración de metales pesados, no se registró la presencia de esporas y una colonización
radicular pobre, que no es relevante. Con respecto a los demás suelos estudiados el de Ávila
Camacho, como observa en el Cuadro 7 es el que muestra un mayor número de esporas
(505esporas/ 100g de suelo seco), así como también de vesículas, estableciendose que en
89
los demás sitios estudiados con el aumento de la concentración de metales pesados en sus
suelos se disminuye el porcentaje de colonización y el número de esporas de HMA.
Una muestra de las esporas extraídas de los suelos colectados se presentan en la Fig. 12.
Figura 12. Espora globosa que muestra la hifa sustentora bulbosa, extraída del suelo de
Ávila Camacho.
En los sitios restantes como El Charco y El Centinela con cultivo y sin cultivar, también se
observó la presencia de esporas (Fig. 13 y 14).
90
Figura 13. Esporas extraídas del sitio El Centinela no cultivado en donde se aprecian
hifas de sostén (Fotografía tomada a 10x ).
Figura 14. Espora apreciándose la hifa en forma de embudo extraída del sitio El Centinela
no cultivado (Fotografía tomada a 20x.).
Las tinciones realizadas en las raíces de las plantas de los sitios muestreados, se observó la
presencia de estructuras como hifas (Fig. 15), micelio (Fig. 16) y arbúsculos (Fig. 17).
91
D
a)
(b
Figura 15. Estructuras de HMA en la raíces de plantas más representativas del sitio El
Centinela no cultivado: a) hifas y b) vesícula.
a)
b)
Figura 16. Ilustración que muestra a) micelio externo y b) esporas en el suelo colectado en
Ávila Camacho.
92
Figura 17. Detalles de los arbúsculos del sitio El Charco (no cultivado).
4.4. Diversidad morfológica de HMA presentes en el suelo de estudio
Las esporas de los HMA nativos extraídos del suelo con mayor contaminación de Zn y Cu
fueron propagadas de donde se distinguieron cuatro diferentes morfotipos
de HMA,
identificándose solamente el más ampliamente representado y de acuerdo con las
características morfológicas denotadas en el manual de Schenk y Pérez (1992) realizada por
la Dra. Lucía Varela Fregoso, las esporas identificadas corresponden a Glomus mosseae.
De acuerdo con el INVAM las características morfológicas que presenta Glomus mosseae
se describen a continuación. Algunos cultivos en las macetas producen esporas en
agregados de 2-8 rodeado por un estrecho perídio, el color del esporocarpo varía de caféamarillas a cafés. El perídio alrededor de estas esporas es de unos 10-38 µm de espesor,
con robustas hifas (con paredes de 8-18 µm de ancho y unos 1.6-3.5 µm de espesor)
93
mezclado con muchas finas ramificaciones de hifa (2-5 µm de ancho, paredes de < 1 µm de
espesor). El peridio no altera la estructura de la pared de la espora, y parece ser un carácter
inestable (generalmente se pierde después de muchas sucesiones o cultivos sucesivos).
En las esporas completas el color varia de naranja a café oscuro, siendo en su mayoría
amarillos-café con forma globosa a subglobosa algo irregulares, la distribución de tamaño
es de 100-260 µm con un promedio de 195 µm. Con respecto a la pared de la espora: estas
poseen tres capas que la forman consecutivamente, pero con diferencias (secuencia baja, de
izquierda a derecha). Las dos superficiales seguido mudan la piel, variando los grados de
madurez, o indican las esporas mas viejas. La forma de la hifa varia de acampanada a una
forma de embudo de ancho 16-32 µm como promedio 24 µm.
En el suelo de estudio se encontraron esporas en su mayoría de un color amarillo claro a
café oscuro de forma globosa a subglobosa, el tamaño fue de 100 a 260 m de diámetro en
promedio 150 m (Fig. 15) y con paredes de 7.5 a 12.5 m (Figs. 18 y 19) con hifas
sustentoras que presentan un septo recurveado con forma de embudo que es una
característica particular de Glomus mosseae (Figs. 20 y 21).
94
a)
b)
Figura 18. a) Espora globosa b) Espora subglobosa con hifa de sostén. Esporas montadas
en PVLG (Fotografías tomadas a 20x).
Figura 19. Espora rota mostrando doble pared, montada en PVLG (Fotografía tomada a
40x).
95
Figura 20. Espora con hifa en forma de embudo, fijadas en alcohol polivinilico lactoglicerol (PVLG), (Fotografía tomada 20x)
Figura 21. Espora montada en PVLG apreciándose una hifa en forma de embudo, con
pared gruesa (Fotografía tomada a 40x).
96
4.5. Contribución de Glomus intraradices en la absorción y translocación
del cinc y cobre por el girasol
El suelo muestreado de El Centinela no cultivado fue elegido como sitio de estudio porque
fue el que presentó una mayor concentración de cinc (89.71ppm) y cobre (110.01 ppm)
además se observo la presencia de HMA nativos, pero debido a que su propagación no fue
suficiente para ser empleado como inóculo; se tomo la decisión de usar a Glomus
intraradices, para cuantificar su contribución en la absorción y translocación del cinc y
cobre por las plantas de girasol inoculadas.
Se calendarizaron tres muestreos de acuerdo con las etapas de crecimiento de esta planta
con el fin de cuantificar la concentración de estos metales en la raíz y la parte aérea de la
planta; estos muestreos se realizaron en las siguientes fechas.
A los 40, a los 55 y 70 días después de la siembra se analizó la absorción de cobre y del
cinc en la parte aérea y radicular en las plantas de girasol. Los resultados de la absorción y
la translocación del cobre y cinc por las plantas de girasol inoculadas y no inoculadas se
muestran en el Cuadro 8.
97
Cuadro 8. Contenido del cobre y cinc en plantas de girasol M y NM en ppm a los 40, 55 y
70 días de crecimiento, como los medios de diez replicas.
Fechas
Raíz
Parte aérea
Planta Completa
ZnM
CuM
66.6 ± 0.84b
75.0 ± 6.83a
38.6 ± 2.52b
46.0 ± 6.33a
105 ± 1.71b
121 ± 6.58a
ZnNM
Cu NM
43.0 ± 2.82b
57.0 ± 7.67a
25.5 ± 0.78b
37.0 ± 5.90a
68.5 ± 1.80b
94.0 ± 6.78a
ZnM
CuM
16.6 ± 0.57b
26.6 ± 0.73a
17.1 ±0.67a
11.6 ± 0.94b
33.7 ± 0.62a
36.2 ± 0.82a
ZnNM
Cu NM
16.8 ± 0.57b
22.4 ± 1.27a
16.1 ± 0.68a
11.1 ± 0.91b
32.9 ± 0.68a
33.5 ± 1.09a
ZnM
CuM
15.9 ± 0.70b
26.1 ± 1.17a
16.3 ± 0.91a
11.0 ± 1.22b
32.2 ± 0.80b
37.1 ± 1.95a
ZnNM
Cu NM
16.3 ± 1.06b
21.8 ± 2.48a
15.8 ± 1.38a
10.8 ± 1.28b
32.1 ± 1.22a
32.6 ± 1.88a
40 días
55 días
70 días
Letras distintas presentan diferencia significativa (P<0.05; prueba-t) entre tratamientos (Zn y Cu Micorrizado a los 40
días; Zn y Cu no Micorrizado a los 40 días; Zn y Cu Micorrizado a los 55 días; Zn y Cu no Micorrizado a los 55
días; Zn y Cu Micorrizado a los 70 días; Zn y Cu no Micorrizado a los 70 días).
De los resultados que se exponen en el Cuadro 8, se observa a los 40 días (primer muestreo)
el análisis estadístico mostró diferencia significativa para la absorción y la translocación del
cobre entre las plantas de girasol inoculadas (M) y no inoculadas (NM).
En las raíces de las plantas inoculadas (M) se muestra que el Cu fue absorbido en mayor
proporción con respecto al Zn. Con referencia a las plantas no inoculadas (NM) se observa
que la absorción de los metales fue en menor cantidad. Si se compara la absorción de los
98
metales en las plantas completas con inóculo y sin inoculación se manifiesta las diferencias
entre los tratamientos.
Con respecto a la translocación, es notorio que tanto el Zn como el Cu permanecieron en
mayor proporción en la parte radicular disminuyéndose así la translocación hacia la parte
aérea de las plantas (M) y en menor cantidad de las plantas (NM).
Con referencia a los resultados que se muestran a los 55 y 70 días, segundo y tercer
muestreo, respectivamente; en la absorción de Cu por las plantas de girasol inoculadas (M)
se observa que existen mínimas diferencias entre el segundo y tercer muestreo con 26.6 a
26.1 mg / kg; mostrándose diferencia significativa con el primer muestreo de 75 mg / kg.
En la translocación también existen diferencias mínimas entre el segundo y tercer muestreo
entre las plantas inoculadas y no inoculadas.
Con respecto al Zn, no existió diferencia significativa entre el segundo y tercer muestreo,
entre las planta inoculadas (M) y no inoculadas (NM).
4.6. Colonización micorrízica del suelo de estudio al término del
experimento
De acuerdo con la concentración de metales registrada en el suelo de estudio, se considera
como levemente contaminado, por ese hecho la colonización micorrízica y el número de
esporas en el suelo sustrato al finalizar el experimento fue la siguiente: Como promedio de
tres repeticiones, la colonización micorrízica presentó (61.7 ± 2.56) y el número de esporas
por 100 g de suelo seco se registró (472 ± 3.69).
99
5. DISCUSIÓN
5.1 Análisis físicos y químicos de los suelos colectados
De acuerdo con Alloway (1995) el pH es un factor importante para determinar la
solubilidad de los metales como el Cu y el Zn en el suelo; así como también su movilidad
y disponibilidad para las plantas, específicamente a medida que disminuye el pH aumenta
la solubilidad del Cu y Zn, así como también otros metales pesados. De esta manera, el
suelo de la Laguna de Oxidación que presentó un pH ligeramente ácido, y de acuerdo con
Weissenhorn et al., (1994) este suelo presenta una mayor movilidad y disponibilidad de
metales pesados, convirtiendo un suelo con una mayor concentración de ellos. Con respecto
a los otros suelos muestreados son considerados como neutros y de acuerdo con Alloway,
(1993), Kabata-Pendias (2000) en este tipo de suelos la concentración movilidad de los
metales pesados es menor, lo que se refleja en la movilidad de estos elementos en sus
suelos que son menores que en la laguna de oxidación.
Un aspecto relevante de la materia orgánica es su atracción por los metales pesados cuando
éstos se encuentran en disolución, tiene propiedades secuestradoras ya que contiene una
gran cantidad de cargas negativas y a menudo forma complejos orgánicos solubles, que
pueden polimerizarse sobre los complejos moleculares del humus. De esta forma, la materia
orgánica del suelo a menudo actúa como almacén de estos elementos, si bien puede
transferirlos a la vegetación o a la fase acuosa si se produce su descomposición en medio
ácido u oxidante. Debido a la capacidad de la materia orgánica para formar complejos
estables con los iones metálicos, la relación entre la materia orgánica del suelo y los
100
metales pesados es muy importante, especialmente en suelos neutros y tendientes a
alcalinos, donde su afinidad es aún mayor. De acuerdo con Alloway, (1995) una de las
asociaciones materia orgánica-metal pesado más estrecha se da con el cobre, lo que redunda
en una fuerte disminución de su potencial tóxico.
Un suelo con alto porcentaje de materia orgánica y un pH neutro son factores básicos que
representan una alta capacidad amortiguadora en la disponibilidad de los metales pesados
por las plantas. De lo anterior se destaca que el sito de la Laguna de Oxidación, es pobre en
materia orgánica y su pH tiende a ácido por lo que la movilidad de los metales pesados es
elevada como se refleja en los resultados, mientras que en los suelos restantes, muestran
contenidos de materia orgánica normal y un pH neutro por lo que de acuerdo con Alloway
(1995) y Kabata-Pendias (2000) son suelos que amortiguan la disponibilidad de los metales
pesados lo que se refleja en los resultados en donde la concentración de ellos es menor que
en la laguna de oxidación motivo por el cual muestran una menor toxicidad debido a la
menor solubilidad de los metales.
De acuerdo con Kabata-Pendias (2000), la entrada e infiltración de los metales pesados en
el suelo está regulado por la textura de los suelos. En los resultados se observa que
solamente dos suelos arenosos carecen de la capacidad para fijar los metales pesados en el
suelo, lo cual pasa rápidamente al subsuelos y contaminan los mantos freáticos, en cambio
con respecto a los otros suelos colectados, presentan en su textura una mayor cantidad de
limo y arcilla por lo que tienden a fijar los metales pesados.
101
Los resultados de los análisis físicos y químicos realizados a los suelos colectados en este
estudio, muestran concordancia con los resultados de los experimentos realizados por
líderes en la recuperación de suelos contaminados con metales tales como: Haselwandter et
al.,(1994); Leyval et al., (1991); Turnau, (1998); Chaney et al., (1998); Jamal et al., (2002);
Leyval et al., (2002) en donde señalan que los suelos en donde son depositados los residuos
de minas presentan un pH ácido, con pobre contenido de materia orgánica. En nuestro
estudio el suelo colectado de la laguna de oxidación, en donde son depositados los residuos
de la mina “Benito Juárez” muestra un pH (6.4) ligeramente ácido y un pobre contenido
(0.8) de materia orgánica.
5.2 Concentración de metales pesados en los suelos colectados
Se compararon con los máximos permitidos del Cuadro 1, en donde se muestran la
concentración normal y los límites permisibles de la concentración de metales pesados en
suelos de los países europeos y norteamericanos, debido a que en México, según la
SEMARNAT, actualmente está en elaboración la Norma Mexicana que establece los
criterios para determinar los máximos permitidos, se espera que a principios del 2005 esté
en consulta pública (comunicación vía correo electrónico), razón por la cual los resultados
solamente se compararon con normas europeas y norteamericanas.
En el suelo de la laguna de oxidación, el cadmio, cobre y cinc rebasan el límite permitido,
mientras que el plomo y el cromo se encuentran dentro del contenido normal. Siendo el
cobre el que rebasa el límite máximo permitido.
102
El suelo de Ávila Camacho muestra que los contenidos de cadmio, cinc, cobre, cadmio cinc
rebasan el contenido del límite permitido, pero ningún metal se sobrepasan de los límites
máximos permitidos.
Los suelos de los sitios de El Charco y El Centinela cultivados, así como El Charco no
cultivado reportan que el plomo y el cromo se encuentran dentro de los límites del
contenido permitido, pero el cadmio rebasa ligeramente este límite, en cambio el cobre y el
cinc se encuentran excesivamente fuera de ese límite sin salirse de los límites máximos
permitidos.
Analizando los resultados del sitio El Centinela no cultivado, se observa que solamente el
cromo se encuentra dentro del limite permitido, en cambio el cadmio, cinc, y plomo se
encuentran extralimitados de este intervalo, se reporta solamente que el cobre se encuentra
fuera del límite máximo permitido. Por lo que este suelo se presenta como el sitio con la
mayor concentración en cinc, cobre y el cadmio en menor proporción, debido a que las
propiedades física y químicas del Zn y Cd son muy semejantes y de acuerdo con Chaney et
al., (2000) el Zn suministra protección contra la transferencia del Cd
a la cadena
alimenticia, motivo por el cual se tomó solamente el Cu y el Zn en la evaluación con
Glomus intraradices en la absorción y translocación por las plantas de girasol.
Recordando la relación inversa entre el pH, la movilidad y disponibilidad de metales
pesados en el suelo, a mayor pH menor movilidad y disponibilidad y viceversa; en los
suelos de los sitios muestreados que tienen un pH neutro se presenta una menor movilidad
103
y disponibilidad de metales pesados. Por lo anterior se deberá considerar ese factor en los
resultados obtenidos de la concentración de metales pesados de los suelos muestreados, y
debido a que presentan un pH neutro la concentración de metales pesados no es elevada.
Comparando los resultados de los suelos muestreados que se presentan en el Cuadro 2 en
donde se muestra la clasificación de contaminación y polución de los suelos colectados, se
puede establecer que el suelo de la Laguna de Oxidación, con respecto al cobre presenta
una severa polución, una leve polución en cinc, mientras que el plomo, cadmio y cromo se
muestran levemente contaminados. En los suelos El Centinela y El Charco cultivados, El
Charco no cultivado presentan una leve contaminación. No así el suelo El Centinela no
cultivado con respecto al cobre y al cinc se muestra como un suelo con una leve polución.
5.3 Cuantificación de esporas y determinación de la colonización
micorrízica
Aun bajo condiciones de contaminación es importante hacer notar que aunque los suelos de
los sitios muestreados contenían concentraciones de metales pesados se constato la
existencia de esporas en el suelo y de vesículas en las raíces de las plantas endémicas
En el suelo de la laguna de oxidación, no se encontraron esporas y el porcentaje de
colonización en las raíces no fue significativa, estos resultados muestran una semejanza con
los obtenidos por Leyval et al., (1991); Haselwandter et al., (1994); Weissenhorn et al.,
(1995); Turnau, (1998); Jamal et al., (2002); Leyval et al., (2002); Malcova et al., (2003),
ellos reportaron que en suelos en donde son depositados residuos de minas son afectadas las
poblaciones de HMA reduciendo el número de esporas en el suelo y la colonización en las
104
plantas endémicas del lugar, lo anterior también depende del nivel de contaminación. Como
se observa en los resultados a medida que aumentan la concentración de los metales
disminuyen la población de hongos micorrízicos.
Los resultados sugieren que en el establecimientos de programas de fitorremeiación es
necesario incluir la inoculación con HMA en las plantas hiperacumuladoras. Es interesante
destacar que en este suelo se observó la presencia de plantas registradas como formadoras
de micorriza como el diente de león y el tule, las cuales se han reportado como plantas
hiperacumuladoras de metales pesados.
El suelo de la laguna de oxidación es el que presenta, una severa polución, relacionando
con la nula presencia de poblaciones de HMA y escasa materia orgánica y con un pH
tendiendo a ácido que de acuerdo con la literatura aumenta la solubilidad de los metales
pesados. Con respecto a los demás suelos del sitio El Centinela y El Charco cultivados, así
como El Charco no cultivado presentan una colonización promedio del 39% y un número
de esporas en 100 g de suelos seco son un promedio de aproximadamente de 400 esporas,
de lo cual se puede decir que aunque exista una moderada contaminación en estos suelos es
interesante decir que los HMA presentan una tolerancia a estos metales.
El suelo de El Centinela no cultivado presenta con respecto a los sitios del Centinela y El
Charco cultivados y El Charco no cultivado un menor número de esporas y porcentaje de
colonización micorrízica, por lo que es significativo hacer notar que la concentración de los
metales pesados en este suelo es mayor que en los sitos anteriormente mencionados con
excepción al suelo de la laguna de oxidación por lo que, de acuerdo con Leyval et al.,
105
(2002) y Malcova et al., (2003) también mostraron resultados similares a los obtenidos en
este estudio con relación al porcentaje de colonización y el número de esporas en donde se
coincide que cuando en el suelo aumenta la concentración de metales pesados entonces se
disminuyen las poblaciones de los HMA nativos de estos suelos.
Recordando que los sitios muestreados se encuentran ubicados a lo largo de una pendiente
y es el sitio de la Laguna de Oxidación el que se ubica en la cima, siguiendo el sitio Ávila
Camacho continuando con el sitio llamado El Charco y finalizando el Centinela, de acuerdo
con ellos se detecta que a medida que disminuye la pendiente se aumenta la concentración
de Zn y Cu y disminuye el porcentaje de colonización micorrízica y el número de esporas;
tal como se menciona anteriormente el número de esporas de los suelos rizósfericos
disminuyen de acuerdo con el aumento de la concentración de metales pesados de esos
suelos.
Sin embargo, aunque los suelos muestreados, con excepción del suelo de la Laguna de
Oxidación, presentan una leve contaminación, pueden afectar la largo plazo al crecimiento
de las plantas, el crecimiento de las poblaciones microbianas, y el paso los metales hacia la
cadena alimenticia.
5.4. Diversidad morfológica de HMA en el suelo de estudio
En los mirfotipos de esporas de los HMA propagados en cultivo trampa y de acuerdo con
las observaciones de las preparaciones en PVLG en el microscopio estereoscopio no se
106
encontró una diversidad de especies, pero la más representativas pertenece al orden
taxonómico de los Glomales, de acuerdo con sus características morfologicas la
identificación se trata de Glomus mosseae, que según autores como Gildon y Tinker (1983);
Leyval et al., (1995); del Val et al., (1998); Jarausch-Wehrheim et al., (1999); Pawlowska
et al., (2000), Christie et al., (2004), esta especie ha sido aislada de diversos suelos
contaminados, donde ha mostrato mayor tolerancia al Zn, Cd y Cu, que las especies
aisladas de suelos no contaminados y de acuerdo con la literatura es el que ha demostrado
la mayor capacidad de tolerar la toxicidad de metales pesados como el Zn y Cu en las
plantas.
En el presente estudio, no fue posible utilizar esta especie de Glomus mosseae ya que su
propagación no se logro contar con el inóculo necesario para inocular las plantas de
girasol, hecho que se lamenta por lo anteriormente mencionado.
Los principales factores que probablemente afectarón la reproducción de los HMA nativos
pudieron ser los que se mencionan a continuación: la concentración de los metales pesados,
el cultivo trampa que se utilizo en la propagaciónde los HMA y el tiempo de crecimiento
del cultivo trampa.
5.5. Contribución de Glomus intraradices en la absorción y translocación
del cinc y cobre.
El primer muestreo realizado a los 40 días, como se mencionó anteriormente fué el
periodo de máxima absorción por las plantas, y es interesante hacer notar, que los
resultados establecen una marcada diferencia entre plantas inoculadas y las no inoculadas
107
con G. Intraradices; ya que en las primeras la absorción del cinc y cobre es
considerablemente mayor que en las plantas sin inocular (Cuadro 8). También es
importante apreciar que la mayor concentración de los metales pesados permaneció en las
raíces disminuyendo así la translocacion hacia la parte aérea de las plantas inoculadas.
Estos resultados no coinciden con los reportados con Leyval et al., (1995) y Christie et al.,
(2004) quienes señalan en sus resultados una reducida absorción de Cu y Zn por plantas de
maíz inoculadas Esto puede atribuirse a que el suelo empleado en sus estudios, existió una
elevada concentración de estos metales, excedia a los máximos permisibles. También puede
adscribirse al decrecimiento de la colonización (ma) en la planta acumuladora debido a las
elevadas concentraciones de metales pesados en suelos, esto ha sido reportado por Schuepp
et al., (1989); Leyval et al., (1991); Christie et al., (2004). Los resultados obtenidos en este
estudio, coinciden con lo señalan por Li, (2002) y Davies, (2001) quienes reportan
diferencias significativas para la absorción de metales pesados entre las plantas
acumuladoras inoculadas (M) y no inoculadas (NM).
Por otra parte en nuestro estudio, la notable absorción de Cu y Zn en las plantas inoculadas,
se deba a que el suelo fue considerado como levemente contaminado sugún Kabata Pendias, (1995), y se ha demostrado que los efectos primarios de los metales pesados se
producen en las raíces, lo que se traduce en una menor elongación después de ser expuestas
a estos metales (Lamber et al., 1998) también puede atribuirse al importante papel que
desempeña la simbiosis micorrízica en la mejora de la disponibilidad de estos metales en el
suelo de estudio.
108
El análisis de los resultados que se muestran en el Cuadro 8, con respecto a la absorción del
Zn y el Cu, se denota que el cobre muestra una mayor presencia que el Zn en las raíces de
las plantas inoculadas. Con respecto a la translocación del Cu y del Zn a la parte aérea de
las plantas inoculadas se percibe una reducción en el transito de la raíz hacia la parte aérea.
La comparación entre las plantas M y las plantas NM, establece que la mayor absorción de
cinc y cobre por las raíces, así como también la disminución de la translocacion a la parte
aérea ocurrió en las plantas inoculadas, estos resultados se atribuyen a la importante
función que desempeñan los HMA en la tolerancia a los metales pesados en la recuperación
de suelos contaminados, por otra parte, la glomalina que es una glucoproteína atrapa a los
metales pesados, está puede ser la razón por la cual los contaminates permanecen la mayor
parte en las raíces.
Con respecto a los resultados de los dos muestreos restantes a los 55 y 70 días que se
muestran en el Cuadro 8, coinciden con lo reportado por autores como Leyval et al.,(1995),
quienes señalan concentraciones de metal significativamente más bajas; lo cual puede
atribuirse a diversos factores que pudieron estar involucrados como son: el término del
periodo de máxima absorción de la planta acumuladora, el aumento de la biomasa radicular
y aérea de las plantas inoculadas. Probablemente en nuestro estudio, los resultados de los
dos últimos muestreos la concentración del Cu y del Zn sea debido a que estos metales se
almacenaron en el micelio específicamente en la glomalina siendo esta una glicoproteína la
cual puede atrapar metales pesados. Estos resultados demuestran el delicado balance entre
los efectos micorrízicos en el crecimiento de la planta y la adquisición de estos metales, tal
como lo establecen autores como Leyval et al., (1997); Christie et al., (2004). La
109
comprensión de la absorción y de la translocación del cinc y del cobre por las plantas
inoculadas es importante y se requiere resaltar diversos factores como la disponibilidad de
estos metales en el suelo para ser absorbidos por la planta y los sitios de almacenamiento en
los órganos de las plantas, su evolución durante el ciclo de crecimiento y su fisiología;
como es sugerido por autores como Weissenhorn et al., (1995) y Zhu et al., (2001).
Si se preguntara para que utilizar los HMA en nuestro modelo de estudiosi la planta de
girasol ya por si sola puede absorber y disminuir el paso de estos metales hacia la parte
aérea, la respuesta es que los HMA pueden proveer una capacidad adicional para retener
metales en la raíz contribuyendo a optimizar la absorción y la translocación, además de
conferir una protección a las plantas contra la toxicidad del Zn y Cu. Se ha demostrado que
los efectos primarios de los metales pesados se producen en las raíces, lo que muestra una
menor elongación después de ser expuestas a estos metales cuando éstos superan los límites
permisibles, lo que origina el aspecto achaparrado de las plantas por lo que es esencial el
inóculo de los HMA que contribuye a aumentar la biomasa radicular, extendiendo así su
radio de acción en la absorción de metales pesados, además que protegen a la planta contra
el estrés presentado por la toxicidad de los metales. Por lo que las plantas de girasol
inoculadas presentan una tolerancia a estos metales y pueden ser consideradas para la
recuperación de suelos contaminados para mejorar el crecimiento, viabilidad de las plantas
y su resistencia a éstos metales.
110
5.6. Colonización micorrízica al término del experimento
De acuerdo con los resultados obtenidos la colonización micorrízica presentó (61.7 ± 2.56)
y el número de esporas por 100 g de suelo seco se registró (472 ± 3.69), indican que la
colonización micorrízica muestra sensibilidad al cobre y al cinc, pero no se muestra
afectada de manera drástica, ya que comparada con la colonización de un suelo no
contaminado que dependiendo de factores abióticos es de aproximadamente del 80- 90%
(Pawlowska et al.,2000) por lo que se deduce, que la colonización sigue ocurriendo incluso
en estos niveles de contaminación, De acuerdo con Weissenhorn y Leyval (1996);
Weissenhorn et al., (1994), dichos autores señalan que los HMA del género Glomus son
tolerantes a metales pesados como Zn y Cu en suelos levemente contaminados.
111
6. CONCLUSIONES
La concentración de metales determinada en los suelos colectados, se concluye que el suelo
de la laguna de oxidación puede ser considerado como un suelo con severa polución;
mientras que los restantes de acuerdo con los límites permitidos son clasificados como
ligeramente contaminados.
En los suelos de la laguna de oxidación no se confirmó la presencia de esporas y la
colonización no fue significativa. En los suelos restantes colectados, si se registró una
significante presencia de HMA, por lo que se concluye que son tolerantes a los metales
pesados aunque en elevadas concentraciones su presencia es miníma.
De acuerdo con las características morfológicas la identificación la población de HMA más
representativas en el suelo de estudio El Centinela sin cultivo fue el Glomus intraradices,
por lo que se concluye que una de las especies de HMA más tolerante a los metales
pesados.
Los resultados del estudio en maceta muestran que la hipótesis planteada debe ser aceptada;
ya que estos indican que la inoculación de G. intraradices contribuye de manera positiva en
la absorción y la translocación de Cu y de Zn en las plantas de girasolTambién demuestra
que en las raíces hubo una mayor absorción de Cu que de Zn y se encontró en estas, una
cantidad mas elevada que en la parte aérea, por lo que se concluye que sí contribuyó en la
disminución de la translocación de estos metales hacia la parte foliar del girasol.
112
Con respecto a las plantas de girasol no inoculadas, por ser una especie catalogada como
acumuladora de metales pesados, si se registró absorción y translocación de metales;
aunque en menor grado que las plantas inoculadas con G intraradices. Esto indica que la
planta tiene sus propios mecanismos de protección contra la toxicidad de los metales, tales
como la acumulación en los plástidos de las células de las raíces o secuestración por
proteínas inducibles de bajo peso molecular retenedoras de metales como fitoquelatinas y
metalotioneinas.
La función que desempeñan los HMA en la resistencia de las plantas en particular de las
hiperacumuladoras, al estrés provocado por los metales y en la protección de la cadena
alimenticia, no debe ser ignorada por lo que es necesario realizar mas investigación para
una mejor comprensión de la participación de los HMA en suelos contaminados. Así como
para elucidar su contribución en los procesos de absorción y translocación de los metales
pesados, a través de las hifas, al sistema radicular y posteriormente a las hojas y demás
orgános aéreos de las plantas.
113
7. LITERATURA CITADA
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