Download Enfermedades autoinmunes: diagno´stico

Q&A
Clinical Chemistry 58:11
1510–1514 (2012)
Enfermedades autoinmunes:
diagnóstico temprano y nuevas estrategias de tratamiento
Moderadores: Danijela Konforte1 y Eleftherios P. Diamandis1,2,3*
Expertos: Walther J. van Venrooij,4 Rik Lories,5 y Michael M. Ward6
Las enfermedades autoinmunes son numerosas y heterogéneas, y presentan un amplio espectro de manifestaciones
clı́nicas y tratamientos impredecibles. Las opciones de tratamiento incluyen medicamentos, tales como, analgésicos y
antiinflamatoriosnoesteroideos,fármacos antirreumáticos
modificadores de la enfermedad, agentes biológicos y glucocorticoides. Si la enfermedad se diagnostica en forma
temprana, el objetivo del tratamiento es la remisión sin
inflamación activa y sin deterioro funcional.
Numerosos estudios en ratones y humanos han mejorado
nuestro conocimiento sobre la contribución de los diferentes mediadores inmunológicos a la patogénesis de las
enfermedades autoinmunes. A pesar de estos avances, las
principales causas de la interrupción de la tolerancia inmunológica que conduce al desarrollo de enfermedades
autoinmunes siguen siendo en gran medida desconocidas.
Un gran porcentaje del riesgo de desarrollar una enfermedad autoinmune se atribuye a factores genéticos. Por
ejemplo, las regiones ALH (antı́geno leucocitario humano) contribuyen aproximadamente a la mitad de la
susceptibilidad genética para la artritis reumatoide (AR).7
Algunos estudios asociados a la genómica han identificado variantes en genes posiblemente patógenos en las
regiones de no ALH, incluyendo la PTPN228 [proteı́na
tirosina fosfatasa, no receptora de tipo 22 (linfoide)], el
locus TRAF1-C5 [TRAF1 (factor 1 asociado a receptor
de TNF) a C5 (componente 5 del complemento)], el
PADI4 (peptidil arginina deiminasa, tipo IV) y el
STAT4 (transductor de señales y activador de la transcripción 4). Otros polimorfismos localizados en los genes
1
Departamento de Laboratorio Médico y Patobiologı́a, University of Toronto,
Toronto, Ontario, Canadá; 2 Departamento de Bioquı́mica Clı́nica, University
Health Network, Toronto, Ontario, Canada; 3 Departmento de Patologı́a y
Laboratorio Médico, Mount Sinai Hospital, Toronto, Ontario, Canada; 4 Profesor
e Investigador de enfermedades autoinmunes, Centro de Biologı́a Molecular de
Nijmegen, Radbound University, Nijmegen, Paı́ses Bajos; 5 Investigador y Profesor del Departamento de Reumatologı́a, K.U. Lovaina, Katholieke Universidad
de Lovaina, Lovaina, Bélgica; 6 Reumatólogo e Investigador en el Programa de
Investigación Intramuros, Instituto Nacional de Artritis y Enfermedades Musculoesqueléticas y de la Piel, NIH, Bethesda, Md.
* Dirigir correspondencia para el autor a: Mount Sinai Hospital, Joseph and Wolf
Lebovic Centre, 60 Murray St. (Box 32), Flr. 6, Rm. L6 –201, Toronto, Ontario,
M5T 3L9 Canada. Fax 416-619-5521; e-mail [email protected].
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que codifican para las citocinas del factor de necrosis tumoral (FNT), ası́ como la interleucina-1 (IL-1), IL-6, IL-4
e IL-5 parecen estar relacionados con un fenotipo de enfermedad agresiva. La epigenética y microRNAs reciben
una mayor atención como mecanismos que interaccionan con el genoma y llevan a la respuesta inflamatoria
persistente en la enfermedad autoinmune.
El tratamiento clı́nico de enfermedades autoinmunes
representa un desafı́o considerable para los proveedores de atención médica. La ausencia de una definición de los subgrupos en individuos con enfermedad
autoinmune temprana es una de las principales lagunas
en este campo. En el presente Q&A, 3 expertos analizarán los últimos avances en el área de diagnóstico temprano de las enfermedades autoinmunes y sus implicaciones para las estrategias mejoradas de tratamientos.
¿Podrı́an mencionar algunos de los más recientes
avances que han permitido una mejor comprensión
de la patogénesis de las enfermedades autoinmunes?
Walther J. van Venrooij:
Se cree que los anticuerpos
péptido anticitrulinados
(APAC) están implicados
en la patologı́a de la AR, y
que los anticuerpos para
modificaciones quı́micas
de proteı́nas están involucrados en el desarrollo
de enfermedades autoinmunes. Existe vasta evidencia que apoya esta
Recibido para su publicación el 31 de mayo de 2012. Aceptado pata su publicación el 1 de junio de 2012.
7
Abreviaturas no estándar: AR, artritis reumatoide; FNT, factor de necrosis
tumoral; IL-1, interleucina-1; APAC, anticuerpo péptido anticitrulinado; LES,
lupus eritematoso sistémico; NETosis, muerte de varios patógenos por trampas
extracelulares de neutrófilos; ACR-EULAR, American College of Rheumatology/
European League against Rheumatism (Colegio Americano de Reumatologı́a y
Liga Europea Contra el Reumatismo); CCP2, péptido citrulinado cı́clico de
segunda generación (prueba); AN, artritis no diferenciada; MTX, metotrexato.
8
Los genes humanos: PTPN22, proteı́na tirosina fosfatasa, no receptora de tipo
22 (linfoide); TRAF1, factor 1 asociado a receptor de TNF; C5, componente del
complemento 5; PADI4, peptidil arginina deiminasa, tipo, IV; STAT4, transductor
de señales y activador de la transcripción 4.
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creencia en el caso de la AR. Por ejemplo, la positividad de
APAC y artritis en pequeñas articulaciones son predictores coherentes de artritis crónica en pacientes con artritis
precoz. Las concentraciones de APAC, los perfiles de
reconocimiento de epı́topos y el uso del isotipo aumentan
notablemente ante la aparición de la enfermedad. Algunos estudios realizados en modelos animales experimentales han demostrado que los APAC no sólo pueden inducir, sino también favorecer el desarrollo de la artritis.
Algunos argumentos a favor de esta afirmación se pueden
encontrar en una revisión de 2011 de Nature Reviews
Rheumatology (Revista de Crı́ticas Naturales en
Reumatologı́a).
Rik Lories: La última década ha sido testigo de
dos evoluciones notables
en el campo, en particular, para las enfermedades crónicas articulares como la artritis
reumatoide y la espondiloartritis. En primer lugar, la investigación
traslacional se acerca
avant la lettre (al pie de la
letra) y ha evolucionado rápidamente en el uso a gran
escala de tratamientos especı́ficos (es decir, productos
biológicos contra citocinas, como el TNF-alfa y la IL6). Estos tratamientos han tenido un enorme impacto
en muchos pacientes. Al mismo tiempo, la integración
de la genética, epidemiologı́a (por ejemplo, el impacto
de fumar) y los datos básicos de la inmunologı́a han
producido ideas completamente novedosas en la patogénesis de algunas enfermedades. Este hecho es, de
nuevo, particularmente sorprendente para la AR, una
enfermedad en la que el papel central de los anticuerpos contra las proteı́nas citrulinadas ha desencadenado
una cascada de nuevos descubrimientos.
Michael M. Ward: En la
AR, los APAC tienen
mayor especificidad de
diagnóstico en comparación con el factor reumatoide y también presentan importancia de
pronóstico. La estrecha
asociación de estos anticuerpos con un conjunto
particular de locus del
MHC, HLA-DR␤ (el
llamado epı́topo compartido) y el aumento de la prevalencia en fumadores ha establecido un importante subconjunto de AR inconfundible etiológicamente. Este
contexto sigue el modelo del desarrollo de la autoinmunidad en un huésped genéticamente susceptible en
respuesta a un desencadenante ambiental inhalado o a
la inflamación respiratoria crónica. La reactividad cruzada de los APAC con enzimas de la flora oral sugiere la
presencia de un desencadenante alternativo que puede
explicar la asociación entre la AR y la periodontitis.
En el lupus eritematoso sistémico (LES), la expresión coordinada de varios genes inducibles por el
interferón-␣ ha demostrado que se correlaciona con la
actividad clı́nica del LES, lo que sugiere que el
interferón-␣ es una citocina clave en la mediación de la
inflamación en esta enfermedad. Pruebas recientes
sugieren que los neutrófilos pueden ser células extremadamente importantes en la etiologı́a del LES. Los
pacientes con esta enfermedad tienen una mayor cantidad de granulocitos de baja densidad que están propensos a sufrir NETosis (muerte de diversos patógenos
por trampas extracelulares de neutrófilos), de esta
forma exponen constituyentes nucleares como los
antı́genos, promueven la liberación de interferones del
tipo I y causan daño endotelial. En las enfermedades
reumáticas en términos más generales, los estudios de
asociación de genoma completo han indicado que la
vı́a Th17 (CD4 ⫹ células T auxiliar) es probablemente
importante para el desarrollo de la enfermedad de
Crohn, psoriasis y espondilitis anquilosante, además
puede ser la base de las asociaciones clı́nicas de estas
afecciones.
¿Cuáles son los criterios utilizados actualmente, incluyendo los biomarcadores clı́nicos, para el diagnóstico y la clasificación temprana de las enfermedades
autoinmunes? En su opinión, ¿qué permitirá mejorar
aún más el diagnóstico temprano?
Walther J. van Venrooij: Para la AR, me refiero a la
reciente publicación del 2010 de los criterios de clasificación por parte del ACR-EULAR (American College
of Rheumatology/European League against Rheumatism). Estos criterios nuevos muestran claramente que
la serologı́a especı́fica de las enfermedades autoinmunes es cada vez más importante para lograr un diagnóstico temprano y por consiguiente un tratamiento
inmediato.
Rik Lories: Los nuevos estudios en las ciencias básicas,
la epidemiologı́a y genética han dejado claro a los
cientı́ficos clı́nicos que muchos criterios de clasificación necesitan una actualización. Recientemente, se
han publicado nuevos criterios para la AR, espondiloartritis axial y artritis psoriásica, y aún más importante
son objeto de debate. Estos criterios están en sintonı́a
con los nuevos descubrimientos e incluyen biomarcadores bioquı́micos o de imagen (por ejemplo, los
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APAC o lesiones caracterı́sticas en imágenes de resonancia magnética). Los criterios bien establecidos ayudan, pero no sustituyen el reto de un diagnóstico temprano. Desde el punto de vista clı́nico, un médico
experto realiza el diagnóstico en pacientes individuales.
Los criterios son importantes para la clasificación a
nivel grupal, proporcionan un marco en el que las observaciones clı́nicas pueden examinarse y contribuyen
ası́ a diagnósticos más especı́ficos.
Michael M. Ward: Los criterios de clasificación para la
AR se actualizaron en el 2010. La presencia del factor
reumatoide o los APAC, particularmente en alta concentración, se tienen muy en cuenta en estos criterios,
por ejemplo, la seropositividad y artritis en 4 o más
articulaciones pequeñas son suficientes datos para un
diagnóstico definitivo de AR. El aumento de concentraciones de proteı́nas C-reactivas o las tasas de sedimentación globular también contribuyen, pero no son
tan ponderadas en la clasificación como los autoanticuerpos. Los criterios originales de clasificación de
1982 del Colegio Americano de Reumatologı́a para el
LES se actualizaron en 1997 e incluyen anticuerpos
antifosfolı́pidos y algunos otros cambios. El grupo Systemic Lupus International Collaborating Clinics ha
propuesto recientemente una nueva revisión, la cual se
descubrió que tiene mayor sensibilidad diagnóstica y
menor especificidad que los criterios de 1982 (Arthritis
Rheum 2012; doi: 10.1002/art.34473). Esta propuesta
preliminar exige 4 manifestaciones, que incluyen al
menos 1 de 11 manifestaciones clı́nicas y 1 de 6 manifestaciones inmunológicas (anticuerpos antinucleares,
anti-ADN, anti-Sm, anticuerpos antifosfolı́pidos,
complemento bajo y prueba de Coombs directa) con ya
sea, nefritis lúpica positiva en un anticuerpo antinuclear o en una prueba de anti-ADN. Los esfuerzos para
actualizar los criterios de clasificación de la esclerodermia también han comenzado. Se notificó que los anticuerpos agonistas biológicamente activos del receptor
del factor de crecimiento, derivado de plaquetas, se
consideran para el diagnóstico de la esclerodermia, y
reproducir el estudio, sin embargo ha sido difı́cil. Para
lograr avances en el diagnóstico temprano de otras enfermedades autoinmunes serán necesarios progresos
similares en la comprensión de inmunopatogénesis. Es
poco probable que los marcadores genéticos sean de
utilidad para el diagnóstico temprano, dada la naturaleza poligénica de estas afecciones y el bajo valor predictivo positivo de estos marcadores.
La generación de APAC es un evento inicial en la
evolución de la AR. ¿Podrı́an opinar acerca de la utilidad clı́nica de las pruebas disponibles en la actua1512 Clinical Chemistry 58:11 (2012)
lidad para la detección y cuantificación de los APAC
y qué se puede hacer para estandarizarlos?
Walther J. van Venrooij: De acuerdo con la literatura,
la prueba de péptido citrulinado cı́clico (CCP2) de segunda generación sigue siendo reconocida como el
mejor método disponible para el análisis de los APAC.
El uso de pruebas distintas paralelamente podrı́a permitir la diferenciación entre subgrupos de APACpositivos visibles. La estandarización puede ser mejorada mediante el uso de unidades internacionales
basadas en la reactividad de un suero de referencia estandarizado. Este suero ha sido aprobado por el Comité de Estandarización de Autoanticuerpos en Enfermedades Reumáticas y Afines, el cual está disponible a
través de los Centros para el Control y Prevención de
Enfermedades. La utilización de un suero de referencia
también puede llevar a una mejor distinción entre las
concentraciones elevadas y bajas de los APAC, lo cual
es importante según los criterios de clasificación de la
AR, publicados el 2010.
Rik Lories: Los sistemas comerciales para detectar los
APAC deben ser debidamente validados. Desde el
punto de vista clı́nico, es de gran interés contar con un
alto valor predictivo positivo y las pruebas deben
reconocer, tantos subtipos clı́nicamente relevantes
como sea posible. Sin embargo, desde el punto de vista
cientı́fico, un mayor análisis individual de los diferentes APAC es importante para entender la aparición y la
evolución de la enfermedad. Por lo tanto, los objetivos
de la práctica clı́nica e investigación básica pueden no
ser los mismos.
Michael M. Ward: Dependiendo de la ELISA especı́fica
utilizada y los estudios de cohortes, los APAC tienen
una especificidad de diagnóstico descrita de 0.86 a 1.00
y una sensibilidad de diagnóstico de 0.39 a 0.92 para el
diagnóstico de la AR, y la mayorı́a de las sensibilidades
de diagnóstico están por encima de 0.65. Algunos estudios tienen escasa precisión, linealidad insuficiente y
poca concordancia con otros. Se están estableciendo
reactivos de referencia y bancos de suero para su uso en
la estandarización de rendimiento de análisis.
El contexto genético de las enfermedades autoinmunes aún debe representarse claramente. ¿Qué
avances adicionales son necesarios antes de que los
marcadores genéticos se comiencen a utilizar en el
ámbito clı́nico para estratificar el riesgo de las enfermedades, ası́ como para contribuir con las estrategias de tratamiento?
Walther J. van Venrooij: Ciertamente creo que en un
futuro próximo, los correspondientes contextos gené-
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ticos se medirán rutinariamente cuando exista la sospecha de una enfermedad autoinmune. Sin embargo
estas mediciones deben ser rentables.
Rik Lories: Se han realizado progresos evidentes en los
estudios de asociación de genoma completo que involucran a miles de marcadores a la vez en amplios estudios de cohortes de pacientes. Aunque estos métodos
tuvieron éxito, también se han identificado nuevos retos. La relación entre los marcadores y genes especı́ficos
puede ser controvertida. Sólo variantes comunes se detectan en la actualidad, muchos de ellos tienen un impacto limitado en la susceptibilidad a la enfermedad.
Un mayor progreso puede provenir no sólo de mejoras en
la tecnologı́a (por ejemplo, secuenciación de próxima
generación), sino también de fenotipos más especı́ficos de
pacientes y controles. Tal ejercicio de tipificación
fenotı́pica (APAC positivos contra negativos en la AR) ha
resultado muy exitoso en la genética de la AR.
Michael M. Ward: Para que los marcadores genéticos
se utilicen con aplicaciones clı́nicas, estos marcadores
deben brindar información única sobre el pronóstico y
la respuesta al tratamiento, no proporcionados por
otras fuentes más fácilmente disponibles y menos costosas, ya sea la historia clı́nica, el examen o las pruebas
de laboratorio más comúnmente utilizadas. Los estudios observacionales que muestran las diferencias en
los resultados de los pacientes según el genotipo deben
ser seguidos de estudios controlados y aleatorios que
muestren que una estrategia de detección sistemática
para identificar marcadores genéticos y el tratamiento
clı́nico basado en la detección sistemática se traducen
en mejores resultados en los pacientes que los obtenidos con una estrategia sin detección sistemática. Idealmente, el tratamiento basado en la detección sistemática
también tendrı́a como resultado un cuidado más eficiente
y rentable, por lo cual estos resultados también se deben
medir. En la actualidad, los marcadores de una posible
toxicidad farmacológica (glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y tiopurina S-metiltransferasa) se utilizan, pero
los marcadores genéticos no se emplean clı́nicamente
para el pronóstico o para guiar las decisiones del tratamiento. La heterogeneidad de los sı́ntomas, signos y las
respuestas al tratamiento de los pacientes del mismo
genotipo complicarán estos esfuerzos.
¿Pueden analizar brevemente las estrategias actuales
de tratamiento, especı́ficas para las diferentes etapas
de la enfermedad autoinmune? ¿Existen marcadores
que se utilizan clı́nicamente para evaluar la respuesta al tratamiento y predecir el resultado?
Walther J. van Venrooij: Los pacientes con AR se
pueden clasificar en 2 subgrupos principales: APAC
positivos y negativos. Estos grupos muestran cuadros
clı́nicos muy similares en la fase temprana de la enfermedad, pero los APAC positivos de los pacientes desarrollan una enfermedad mucho más erosiva. Como
consecuencia, los individuos con APAC positivos que
padecen dolencias menores, tales como, la artritis indiferenciada (AI) deben tratarse. Se ha señalado que
estos pacientes respondieron más positivamente al
tratamiento con metotrexato (MTX) que los pacientes
con APAC negativos. Los pacientes que padecen AI y
que tienen concentraciones bajas o intermedias de
APAC responden mejor al MTX que los pacientes que
padecen AI y que presentan elevadas concentraciones
de APAC positivos, lo que indica que el tratamiento
con MTX puede ser insuficiente (Ann Rheum Dis
2010; 69:1333-7) para los pacientes con altas concentraciones de APAC.
Rik Lories: Mi principal experiencia es la espondilitis
anquilosante y la espondiloartritis relacionada. He
aprendido que además de los antiinflamatorios no esteroideos, los fármacos anti-TNF son ahora esenciales
en el algoritmo de tratamiento. El amplio uso de imágenes por resonancia magnética, una técnica que puede
visualizar la inflamación, ha cambiado la práctica
clı́nica. La predicción de los resultados es aún más
difı́cil, pero cada vez más exitosa en otras enfermedades, tales como la artritis reumatoide. En los estudios de otras enfermedades sistémicas, como el LES,
también se está explorando actualmente el uso de productos biológicos y los nuevos descubrimientos
clı́nicos se esperan con ansiedad.
Michael M. Ward: Esto es difı́cil de contestar debido a
que hay muchas enfermedades autoinmunes y son
diferentes. En general, el enfoque del tratamiento es la
mejora de la calidad de vida y el control rápido de los
sı́ntomas y de la inflamación para limitar el posible
daño permanente de órganos, ya sean las articulaciones, la piel, las paredes de vasos, el riñón u otros órganos. Las pautas del tratamiento para la AR sugieren
medicamentos un poco más agresivos sólo para los pacientes que han padecido AR por más tiempo, en comparación con los pacientes que han tenido AR durante
menos de 6 meses; el tratamiento se guı́a más por la
persistencia de la artritis activa y la presencia escasa de
factores de pronóstico, como el funcionamiento fı́sico
deficiente, manifestaciones extraarticulares, erosiones
óseas en las radiografı́as y la presencia de altas concentraciones del factor reumatoide o los APAC. En
pacientes con vasculitis asociada a la presencia de anticuerpos citoplasmáticos antineutrófilos activos, un
concepto de tratamiento en fases incluye un perı́odo
inicial de 6 meses de inmunosupresión más intensiva
para lograr la remisión, seguido de un perı́odo más
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prolongado de inmunosupresión menos intensiva para
mantener o “consolidar” la remisión, en un intento de
disminuir la toxicidad del tratamiento. Un paradigma
similar de inducción para la remisión y de remisión
para el mantenimiento se ha utilizado en estudios recientes de la nefritis lúpica proliferativa. Aunque la validez de las fases de la respuesta al tratamiento es cuestionable, la idea de un tratamiento agresivo inicial para
limitar la inflamación y luego reducir la intensidad del
tratamiento tiene ventajas clı́nicas. En la granulomatosis con poliangeı́tis (enfermedad de Wegener), existen
datos contradictorios acerca de la capacidad de antiproteinasa en 3 niveles de anticuerpos para predecir las
recaı́das clı́nicas.
¿Se puede especular sobre cómo el diagnóstico y
tratamiento clı́nico de las enfermedades autoinmunes van a cambiar en los próximos 10 años?
¿Cuáles serán los principales factores que impulsarán este cambio?
Walther J. van Venrooij: El ejemplo de la AR muestra
que tan importante es el diagnóstico temprano para
que el tratamiento sea más eficaz con el fin de evitar
daños irreparables en las articulaciones y los órganos.
Desafortunadamente, la mayorı́a del dinero de las investigaciones está dirigido hacia el descubrimiento de
nuevos agentes terapéuticos. Posiblemente nuevos factores serológicos de predicción temprana de enfermedades autoinmunes se pueden encontrar en estudios detallados de modificaciones quı́micas aberrantes
de proteı́nas que se producen en las enfermedades (por
ejemplo, la fosforilación y metilación).
Rik Lories: El mayor conocimiento se traducirá en una
medicina más personalizada. Las nuevas estrategias, a
menudo altamente eficaces, están disponibles. Uno de
los retos será trasladar este progreso observado en pacientes con artritis reumatoide y espondiloartritis a
otras enfermedades sistémicas más raras. Un reto adicional será el tratamiento individual del paciente. Actualmente existen diferentes opciones de tratamiento
disponibles, y el cambio es común cuando un paciente
percibe el retorno de los sı́ntomas. Sin embargo, en el
cuidado médico se deben evitar decisiones precipitadas
y evaluar cuidadosamente cada pregunta a nivel indivi-
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dual. Esto permitirá mejorar los resultados a largo
plazo y el perfil de seguridad de los medicamentos
utilizados.
Michael M. Ward: La tendencia de diagnóstico de las
enfermedades autoinmunes se dirige claramente hacia
las “-ómicas”, incluyendo la genómica y proteómica. A
medida que esta tecnologı́a mejora, puede ser posible
identificar perfiles especı́ficos de autoanticuerpos; por
ejemplo, podrı́a llevar a un diagnóstico más preciso o
precoz. Los tratamientos serán cada vez más individualizados y se elegirán sobre la base de los conocimientos
de los mediadores principales (por ejemplo, citocinas o
vı́as de señalización) de la inflamación en un paciente
especı́fico. Está claro que de los pacientes con la misma
enfermedad, algunos responden a una anticitocina biológica pero no a un tratamiento de anticitocina diferente, probablemente debido a que las diversas vı́as
tienen un papel principal. En el futuro, tal vez en un
perı́odo posterior a los próximos 10 años, estas diferencias se identificarán de manera anticipada para que el
tratamiento identificado de manera apropiada pueda
seleccionarse.
Contribuciones del autor: Todos los autores confirmaron que han
contribuido al contenido intelectual de este documento y han cumplido
con los siguientes 3 requisitos: (a) contribuciones significativas para la
concepción y el diseño, adquisición de datos o análisis e interpretación de
estos, (b) la redacción o revisión del artı́culo en cuanto a su contenido
intelectual; y (c) aprobación final del artı́culo publicado.
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Empleo o liderazgo: E.P. Diamandis, Clinical Chemistry, AACC.
Consultor o función de asesorı́a: No se declara.
Propiedad del archivo: No se declara.
Honorarios: No se declaran.
Financiamiento de la investigación: M.M. Ward, Programa de Investigación Intramuros, Instituto Nacional de Artritis y Enfermedades Musculoesqueléticas y de la Piel, NIH.
Testimonio de expertos: No se declara.
Previously published online at DOI:0.1373/clinchem.2012.189480