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INSTITUTO NACIONAL DE SALUD PÚBLICA
CENTRO DE INVESTIGACIÓN SOBRE ENFERMEDADES INFECCIOSAS
“Seroprevalencia de anticuerpos neutralizantes contra el
virus Dengue en dos poblaciones del Estado de Morelos,
México”
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO ACADÉMICO DE
MAESTRA EN CIENCIAS DE LA SALUD, CON ÁREA DE CONCENTRACIÓN EN
ENFERMEDADES INFECCIOSAS
PRESENTA:
Q.F.B. Irma Yvonne Amaya Larios
DIRECTOR DE TESIS: DR. JOSÉ RAMOS CASTAÑEDA (INSP)
ASESOR INTERNO: M EN C. RUTH ARALÍ MARTÍNEZ VEGA (INSP)
ASESOR EXTERNO: DRA. MARÍA ALBA LOROÑO PINO.
Cuernavaca, Morelos.
Febrero 2013
0
INSTITUTO NACIONAL DE SALUD PÚBLICA
CENTRO DE INVESTIGACIÓN SOBRE ENFERMEDADES INFECCIOSAS
T e s i s para obtener el grado de
Maestra en Ciencias de la Salud, con área de concentración en Enfermedades
Infecciosas
“Seroprevalencia de anticuerpos neutralizantes contra el
virus Dengue en dos poblaciones del Estado de Morelos,
México”
PRESENTA:
Q.F.B. Irma Yvonne Amaya Larios
Director de Tesis:
Dr. José Ramos Castañeda (INSP)
Asesor Interno:
M En C. Ruth Aralí Martínez Vega (INSP)
Asesor Externo:
Dra. María Alba Loroño Pino.
Cuernavaca, Morelos, 21 de Febrero del 2013
1
“El agradecimiento es la memoria del corazón"
Lao-tsé
Y en la memoria de mi corazón, se encuentran todos ustedes.
Gracias familia por acompañarme en cada una de mis metas, por cada palabra de
aliento, por cada consejo y sobre todo por ser un gran ejemplo de sabiduría y
perseverancia.
Dr. José Ramos le agradezco la oportunidad que me ha brindado así como su
experiencia y sabiduría y sobre todo por ser mi mentor. Ruth te agradezco todo tú
apoyo incondicional, gracias por ser de esa clase de personas que da lo mejor si y
siempre está dispuesta a ayudar y a compartir su conocimiento. Ambos son un gran
ejemplo a seguir, los admiro y respecto.
A la Mtra. Lilia E. Fragoso, gracias por enseñarme éste camino de la salud pública y
gracias por ser una gran amiga, así como mi guía e inspiración.
A mis amigos y compañeros por su apoyo constante y por cada sueño compartido y
meta que hemos logrado juntos.
Y gracias a aquella persona tan especial que forma parte de mi equilibrio personal y
profesional, gracias por recordarme el significado de la generosidad y gracias por
transmitirme esa serenidad que me reconfortó cuando más lo necesite.
A todos ustedes muchas gracias porque siempre han estado conmigo, en las buenas y
en las malas, gracias por darme motivos para seguir luchando, gracias por ser mi
inspiración y ejemplo a seguir, porque todos ustedes han dejado algo bueno en mi vida
y les estaré eternamente agradecida.
2
"La experiencia más maravillosa que podemos tener es el misterio; es la emoción
fundamental que permanece en la base del arte y la ciencia verdaderos."
Albert Einstein
3
ÍNDICE
1. Resumen
6
2. Introducción
7
3. Antecedentes
2.1 Agente etiológico
8
2.2 Cuadro clínico
12
2.3 Participación del sistema inmune del
hospedero en una infección por DENV
14
2.4 Diagnóstico del dengue
15
2.5 Vacunación contra DENV
19
2.6 Epidemiología
19
2.6.1 Seroprevalencia contra DENV
24
4. Justificación
28
5. Objetivos
29
6. Metodología
5.1 Diseño del estudio
30
5.2 Población de estudio
30
5.3 Criterios de inclusión
31
5.4 Criterios de exclusión
31
5.5 Consideraciones para la clasificación de
grupos etarios
31
5.6 Determinación del tamaño de la muestra
33
5.7 Variables
34
5.8 Ensayo de laboratorio
5.8.1 Prueba indirecta de ELISA para Ig G.
4
34
5.8.2 PRNT
34
5.9 Análisis estadístico
35
5.10 Fuente de financiamiento
36
6. Resultados
37
7. Discusión
47
8. Limitaciones
50
9. Conclusión
51
10. Referencias
52
Anexo 1
59
Anexo 2
67
Anexo 3
72
Anexo 4
74
5
RESUMEN
El dengue es una enfermedad causada por los virus dengue, los cuales son
transmitidos al hombre por varias especies de mosquitos vectores. El dengue es
considerado como la enfermedad arboviral más problemática en salud pública a
nivel mundial, debido a su alta incidencia en regiones tropicales y subtropicales
del planeta. La identificación de la población contribuye en la identificación de
uno de los factores que influye en la transmisión. El objetivo de este proyecto fue
determinar la seroprevalencia de anticuerpos neutralizantes para cada uno de
los 4 serotipos de virus dengue (DENV) en las poblaciones de Axochiapan y
Tepalcingo del Estado de Morelos, México. Se realizó un estudio de corte
transversal, anidado en la cohorte obtenida durante el estudio de investigación
denominado: “Infección peridomiciliaria como determinante de la transmisión del
dengue”. Fueron considerados para el estudio 929 sujetos. Los sueros fueron
analizados mediante la técnica de ELISA IgG-Indirecta, de los sueros positivos
para IgG se seleccionaron 137 para determinación de títulos de anticuerpos
neutralizantes (PRNT60%). La seroprevalencia global en el estudio contra DENV
fue 76.6%, y la seroprevalencia a partir de los 30 años de edad fue mayor al
90% (p<0.0001). En el primer grupo etario (5 a 9 años) la seroprevalencia
específica por serotipo de 82.5%, 45.0%, 65.0% y 2.5% para DENV-1, DENV-2,
DENV-3 y DENV-4, respectivamente; en el grupo de 10 a 25 años y en el de
mayores de 25 años la seroprevalencia para los cuatro serotipos fue por encima
del 60%, excepto en el grupo de 10 a 25 años para DENV-4 en el que la
prevalencia fue de 42.9%. Se observó una asociación significativa de la
seropositividad con la edad, localidad y ocupación (p<0.05). Los resultados
obtenidos ayudan a conocer a la población susceptible y sentar las bases para
realizar estudios que permitirán establecer la relación entre títulos de anticuerpos
neutralizantes y protección.
6
1. INTRODUCCIÓN
El dengue es una enfermedad viral considerada como un problema de salud pública a
nivel mundial. La infección por el virus Dengue (DENV) puede cursar como
asintomática o puede manifestarse con un cuadro clínico amplio en el que se incluyen
las formas graves y no graves de la enfermedad (Kyle JL, et al., 2008).
El DENV se transmite principalmente por mosquitos del género Aedes siendo las
especies aegypti y albopictus las más importantes a nivel mundial. Su transmisión
depende de la inmunidad de la población (Guzman MG et al., 2002), del aumento de
las vías de comunicación y del cambio climático (Hales et al., 2002; Hopp et al., 2003;
Patz et al.,2005), así como de la evolución del virus y de la falta de una vacuna eficaz
(Khoa T.D. 2011).
Las medidas de control y prevención del dengue están enfocadas en la reducción de la
densidad vectorial. Desafortunadamente, con éstas medidas, la incidencia del dengue
no ha disminuido, por lo que es necesario explorar otros factores que contribuyen en el
control de su transmisión, como lo es la inmunidad de la población humana.
Los estudios de seroprevalencia identifican a la población susceptible y permiten
alimentar a modelos matemáticos para la predicción de brotes y con ello poder focalizar
las medidas de control del vector. Por otra parte estos estudios permiten definir el
grupo blanco a vacunar, una vez que la vacuna se introduzca al mercado.
Por lo anterior el objetivo de éste estudio es determinar la seroprevalencia contra los
cuatro serotipos del DENV en un grupo de sujetos mayores de 5 años, residentes en
las poblaciones de Axochiapan y Tepalcingo, del Estado de Morelos.
7
2. ANTECEDENTES
Las primeras epidemias documentadas de dengue ocurrieron entre 1779-1780; sin
embargo, la etiología se definió hasta hace aproximadamente un siglo y no fue hasta la
segunda guerra mundial en el que los japoneses y americanos pudieron aislar el DENV
e identificar los cuatro serotipos (DENV-1 a DENV-4) (Kyle JL, et al., 2008).
2.1 Agente etiológico
El DENV es un arbovirus que pertenece a la familia Flaviviridae del género flavivirus. A
diferencia de otros flavivirus, el DENV solo tiene como hospedero al humano y como
reservorio a otros primates (Weaver et al., 2009).
El genoma del DENV es una molécula de ácido ribonucleico (ARN) de cadena simple y
de sentido positivo de aproximadamente 11 kilobases de longitud. Su genoma viral se
traduce como un polipéptido de 3,391 aminoácidos que es procesado por el complejo
de proteasas virales, proteínas no estructurales NS2b/NS3 y proteasas celulares,
generando tres proteínas estructurales (proteína C, pre M/M y E) y siete proteínas no
estructurales (NS) (NS1, NS2a/b, NS3, NS4a/b, NS5), algunas de las cuales tienen la
habilidad de modificar la membrana del retículo endoplásmico favoreciendo la síntesis
de nuevos productos virales (Weaver et al., 2009) (Morrison J et al, 2012).
Las proteínas estructurales integran al virión y las proteínas NS están involucradas en
la replicación del virus una vez infectada la célula (Rothman A, 2011 Chambers, T.J.,
et al, 1990).
La glicoproteína E es el principal componente de la superficie del virión, conformada
por los dominios I, II y III (Rothman A., 2011) previamente definidos por Heinz y
colaboradores como dominios antigénicos C, A y B respectivamente (Roehrig, 2003;
Roehrig et al., 1998). Una serie de análisis bioquímicos de dichos dominios permitieron
identificar los aminoácidos que los conforman. El dominio A esta conformado por los
aminoácidos 51 a 135 y 195 a 284, entre el cual está localizado el dominio C que
abarca los aminoácidos del 1 al 50 y del 136 al 194 y finalmente el dominio B que
8
incluye a los aminoácidos 300 a 395 (Roehrig et al 2003). La función del dominio III es
de unión al receptor, el dominio II está involucrado en la dimerización de la
glicoproteína E y su fusión con la membrana endocítica y el dominio I es considerado
como la región bisagra. Los anticuerpos dirigidos contra la gran mayoría de los
epítopos localizados en el dominio III son serotipo específicos y aquellos que están
dirigidos contra el dominio II presentan diferentes grados de reactividad cruzada entre
los cuatro serotipos de DENV y con algunos otros flavivirus (Rothman A, 2011).
Utilizando anticuerpos monoclonales (mAbs) fueron localizados los epitopes de la
proteína E que se muestran en la figura 1(Lin H-E et al. 2012).
Figura 1. Localización de epítopos de la glicoproteína E reconocidos por mAbs. Los epítopos de mAbs
contra DENV1 (A) se representan con el color azul marino y DENV2 (B) están representados con el color
morado. Los epítopos de color magenta son aquellos que comparten DENV2 y DENV3. Imagen tomada
de: Lin H-E, Tsai W-Y, Liu I-J, Li P-C, Liao M-Y, et al. (2012) Analysis of Epitopes on Dengue Virus
Envelope Protein Recognized by Monoclonal Antibodies and Polyclonal Human Sera by a High
Throughput Assay. PLoS Negl Trop Dis 6(1): e1447. doi:10.1371/journal.pntd.
9
La proteína prM forma un heterodímero con la proteína E en el ensamble inicial del
virión, posteriormente este precursor sufre una proteólisis por acción de una proteasa
del sistema trans del aparato de Golgi parecida a una furina. Con la eliminación del Cterminal no-glicosilado, la proteína prM da origen a la proteína M que se asocia a la
envoltura lipídica del virión maduro (Rothman A, 2011).
La proteína C es rica en lisinas y argininas lo que la hace de carácter básico
favoreciendo su interacción con el ARN viral para la formación de la nucleocápside viral
(Acosta-Bas C et al, 2005).
La NS1 es una glicoproteína específica producida en células infectadas por DENV,
pero que no forma parte de la estructura del virión; es sintetizada en el retículo
endoplásmico como monómero y posteriormente forma un homodímero que puede
permanecer en la superficie de las células infectadas o puede ser secretado al medio
extracelular como un hexámero (Acosta-Bas C et al, 2005; Rothman A, 2011).
La secuenciación completa del ácido nucleico del DENV confirmó la homología de los 4
serotipos, así como la identificación de sitios genéticamente conservados, lo que
permitió la clasificación de grupos genéticamente distintos dentro de cada serotipo,
denominados genotipos en los que se incluyen a las cepas endémicas/epidémicas y
selváticas, mismos que se organizaron de acuerdo a su diversidad genética y
distribución geográfica (Rico-Hesse, 1990; Costa RL et al, 2012; Keyle JL et al 2008;
Wever S et al 2009) (Figura 2).
Los análisis filogénicos sugieren que cada serotipo tiene un antecesor selvático de
hace 1115 años. Otras observaciones en el análisis demostraron que el serotipo más
divergente es DENV-4, seguido de DENV-2, 1 y 3 (Keyle JL et al 2008).
.
10
Figura 2. Árbol filogenético de los cuatro serotipos de DENV. El nombre de las cepas corresponde a la
abreviatura del sitio donde se colectaron por primera vez/nombre de la cepa/ año de colecta. Imagen
tomada de: Weaver SC, Vasilakis N. Molecular evolution of dengue viruses: Contributions of
phylogenetics to understanding the history and epidemiology of the preeminent arboviral disease.
Infection, Genetics and Evolution, 2009; 9(4): 523-40.
11
2.2 Cuadro clínico
La frecuencia de infecciones de dengue se caracteriza por ser de tipo iceberg,
aproximadamente el 10% de las infecciones son reportadas a las autoridades de salud
y el 50% - 90% de todas las infecciones son asintomáticas (Kyle JL, et al.,2008;
Balmaseda A, et al 2006; Simmons CP et al 2012).
En la infección por cualquiera de los cuatro serotipos del DENV el espectro clínico es
amplio considerando que sus manifestaciones pueden ser desde no graves hasta
graves (Whitehorn J et al 2011; Kyle JL et al 2008; Simmons PC et al 2012) y la
mayoría de los pacientes se recuperan después de un cuadro clínico benigno.
El periodo de incubación del virus es de 4 a 7 días, posterior a este tiempo se
presentan signos y síntomas inespecíficos del dengue, entre los más comunes son la
fiebre y el malestar general; los signos y síntomas específicos son el dolor retro-orbital,
dolor muscular, trombocitopenia, sangrado espontáneo, leucopenia y elevación de las
transaminasas hepáticas (Rothman A,2011; Simmons PC et al 2012).
La Organización Mundial de la Salud (OMS) en 1997 clasificó en tres categorías las
infecciones sintomáticas: fiebre indiferenciada, fiebre por dengue y fiebre hemorrágica
por dengue, está última dividida en cuatro grados de severidad (I-IV). En 2009 la OMS
sugirió clasificar a los casos de dengue de acuerdo al grado de severidad en dengue
sin signos de alarma, dengue con signos de alarma y dengue severo, como se muestra
en la figura 3 (WHO, 2009) (Figura 3).
Criterios para el dengue con signos de alarma y sin ellos
Criterios para dengue grave
Dengue probable
Extravasación
Signos de alarma*
12
grave
de
Vivir en áreas endémicas de
dengue/viajar a ellas.
Fiebre y dos o más de los
siguientes criterios:




Náuseas, vómito
Erupción cutánea
Molestias y dolores
Prueba de torniquete
positiva
 Leucopenia
 Cualquier signo de
alarma
Dengue
conformado
por
laboratorio (importante cuando
no
hay
signos
de
extravasación de plasma).

Dolor
abdominal
intenso o abdomen
doloroso
a
la
palpación
 Vómitos persistentes
 Acumulación clínica de
líquidos
 Sangrado de mucosas
 Letargia, agitación
 Hepatomegalia > 2 cm
 Laboratorio: aumento
del
hematocrito
concurrente con rápida
disminución
del
número de plaquetas.
*
Requiere
estricta
observación e intervención
médica.
plasma que conduce a:


Choque (SCD)
Acumulación
de
líquidos
con
insuficiencia
respiratoria
Sangrado
intenso
según
evaluación del médico tratante
Compromiso orgánico grave:



Hígado: AST o ALT
1000
Sistema
nervioso
central: Alteración de
la conciencia
Corazón
y
otros
órganos.
Figura 3. Clasificación sugerida por la OMS en el 2009 para los casos sintomáticos de dengue. Imagen
modificada de: WHO. Dengue: guías para el diagnóstico, tratamiento, prevención y control. [Internet].
Nueva
Edición.
Geneva:
WHO
[citado
2012
Dic
6].
Disponible
en:
http://www2.paho.org/hq/dmdocuments/2011/ndeng31570.pdf
Actualmente en México los Sistemas de Vigilancia Epidemiológica de Dengue
continúan reportando los casos de dengue como: fiebre por dengue y fiebre
hemorrágica por dengue (SINAVE/DGE/SALUD/Sistema Especial de Vigilancia
Epidemiológica
de
Dengue
(citado
Diciembre
7,
2012).
Disponible
en:
http://www.dgepi.salud.gob.mx/denguepano/PANORAMAS_2012/Pano_dengue_sem48
_2012.pdf.)
2.3 Participación del sistema inmune del hospedero en una infección por DENV
Ante una infección por el DENV, el sistema inmune del hospedero responde de
acuerdo a la presencia o ausencia de anticuerpos contra el virus (Rothman A., 2011;
Wahala, et al., 2010). En una infección primaria, una vez iniciada la fiebre comienza la
producción de las Inmunoglobulinas M (IgM) las cuales son detectables a los 5-8 días
después de la fiebre alcanzando su máximo nivel a las dos semanas (Sa-Ngasang et
13
al., 2006; Díaz Quijano F. A. et al., 2006); en cambio la inmunoglobulina G (IgG) se
detecta hasta el día 14 y puede mantenerse en circulación por años. En infecciones
secundarias los anticuerpos IgM se detectan antes de los 7 días y se observa un
aumento de los anticuerpos IgG en la fase aguda de la enfermedad (Vázquez-Pichardo
M et al., 2011).
Otro tipo de anticuerpos generados durante una infección por el DENV, son los
dirigidos contra la proteína NS1 desencadenando una lisis mediada por complemento
de las células infectadas (Rothman A., 2011).
En algunos casos la inmunidad inducida durante la infección por alguno de los cuatro
serotipos protege al individuo de por vida contra el serotipo infectante (inmunidad
homotípica) y le confiere protección cruzada de corta duración (6 a 9 meses) contra los
otros serotipos (inmunidad heterotípica) (Sánchez-Burgos G,
et al. 2008; Rothman
A., 2011). Algunos estudios sugieren que la inmunidad heterotípica neutralizante es el
factor más importante que explica el patrón secular de la transmisión del dengue.
Adicionalmente, la respuesta inmunitaria heterotípica no neutralizante se ha
relacionado con una mayor incidencia de casos graves (Sánchez-Burgos G,
et al.
2008; Wearing HJ, 2006)
De acuerdo a estudios reportados por Wearing y Adams (Wearing et al.,2006, Adams,
2006), observan una sincronía en la aparición del DENV2 y DENV3 lo que no ocurre
con DENV4, quizá porque DENV2 y DENV3 podrían estar suprimiendo la transmisión
de DENV4 (Weaver S.et al., 2009).
La respuesta inmune generada por el hospedero ante una infección secundaria por el
DENV así como el tiempo entre las infecciones, la edad, el estado nutricional y el
genotipo viral, se han considerado como factor de riesgo para el desarrollo de dengue
hemorrágico (DH) y síndrome de choque por dengue (SCD) (Kyle JL et al., 2008,
Raghwani J et al. 2011). Estudios epidemiológicos realizados en Tailandia, Indonesia y
Cuba han reportado una asociación entre una infección secundaria y el desarrollo de
las formas graves de dengue (DH/SDC), dado que se ha observado que la mayoría de
los casos de DH/SCD se presentan durante una infección secundaría por un serotipo
14
diferente al de la infección primaria, o en niños recién nacidos de madres con
inmunidad preexistente de dengue (Kyle JL, et al.,2008, Laughlin CA, et al.,2012).
Existen dos teorías que intentan explicar este fenómeno; la primera teoría establece
que en infecciones secundarias la entrada del virus a la célula se ve favorecida por un
aumento en la expresión de receptores fijadores de Complemento (Fc), este fenómeno
recibe el nombre de “Antobody-dependent enhancement of infection” (ADE), mismo que
sólo se ha observado en ensayos realizados en ratones y monos (Goncalvez AP et al.,
2007) y no se ha podido comprobar en humanos (Rothman A., 2011). En éstos
ensayos las mutaciones realizadas en la región Fc del anticuerpo, eliminan el ADE en
el ratón por lo que se considera que el receptor para Fc localizado en la membrana de
la célula hospedera facilita la entrada del virión a la célula (Laughlin CA, et al.,2012).
La otra teoría de la inmunopatogénesis de dengue se centra en la respuesta de las
células T de memoria que se activan en infecciones heterólogas secundarias
produciendo citocinas que alteran la permeabilidad vascular e incrementan la
inflamación (Rothman A., 2011).
2.4 Diagnóstico del dengue
La elección del método de laboratorio para el diagnóstico del dengue dependerá del día
en que se tomó la muestra después de iniciados los síntomas (Figura 4). A los 4 o 5
días a partir de la aparición de los síntomas se puede realizar el diagnóstico en suero,
plasma y células sanguíneas; los métodos empleados son: reacción en cadena de la
polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) para la detección del ácido nucleico,
aislamiento del virus usando células de mosquito C6/36 ó células Vero y la detección
serológica del antígeno NS1 (Métodos directos). A excepción de la detección de NS1,
las demás son técnicas costosas que requieren personal especializado y que
generalmente se emplean con fines epidemiológicos (WHO, 2009; Peeling RW et al,
2010).
Posterior a los 5 días de iniciados los síntomas, el método para el diagnóstico deberá
ser serológico para la detección de IgM/IgG contra el DENV (Métodos indirectos)
(WHO, 2009; Peeling RW et al, 2010). Las técnicas empleadas son: inhibición de la
hemaglutinación y el inmunoensayo enzimático (ELISA), ambos permiten detectar
15
anticuerpos totales contra los cuatro serotipos de DENV y clasificar las infecciones en
primarias y secundarias.
Figura 4. El gráfico muestra el tipo de pruebas que se pueden realizar para el diagnóstico confirmatorio
de dengue una vez iniciado los síntomas. El día 0 (cero) corresponde al inicio de los síntomas. Imagen
tomada de: WHO. Dengue: guías para el diagnóstico, tratamiento, prevención y control. [Internet]. Nueva
Edición.
Geneva:
WHO
[citado
Dic
6,
2012].
Disponible
en:
http://www2.paho.org/hq/dmdocuments/2011/ndeng31570.pdf
En México la Secretaria de Salud utiliza un algoritmo para el diagnóstico para el
diagnóstico de una infección por el DENV en vigilancia epidemiológica de rutina. La
técnica utilizada para la confirmación del caso sospechoso de dengue es la detección
del antigeno NS1 por ELISA en los primeros 5 días de iniciada la fiebre, o la detección
de IgM e IgG si NS1 es negativa. La identificacón del serotipo se realiza en el 10% de
los casos confirmados de fiebre por dengue por medio de una RT-PCR o de un cultivo
celular (Figura 5).
16
Figura 5. Propuesta de algoritmo para el diagnóstico de dengue en infecciones primarias o secundarias
en vigilancia epidemiológica de rutina. Imagen proporcionada por la Secretaria de Salud, 2012.
El buen funcionamiento de los sistemas de vigilancia epidemiológica depende de la
capacidad de diagnóstico del laboratorio en la detección del inicio de un brote. En los
estudios epidemiológicos los principales métodos de laboratorio utilizados son: RT-PCR
para identificación de serotipo viral y ELISA para la detección de IgG.
La sensibilidad y especificidad de los estuches de diagnóstico utilizados en la prueba
de ELISA-Indirecta dependerán de la compañía que los fabrica. Groen y cols. En el
2000 publicaron la sensibilidad y especificidad de seis estuches de diagnóstico para la
identificación cualitativa de anticuerpos IgG contra el DENV: los resultados mostraron
que el estuche fabricado por la compañía Pan Bio cuenta con los niveles más altos de
sensibilidad y especificidad con respecto a los otros estuches de diagnóstico
analizados (Tabla 1).
17
Tabla 1. Sensibilidad y especificidad de seis estuches de diagnóstico para IgG indirecta
(Groen et al.,2000).
Compañía
Antígeno
Principio
Duración
del ensayo
Sensibilidad
Especificidad
(%)
(%)
ᵏ
MRL
Diagnostics
DENV 1, 2,
3, 4
Indirecta
120 min
100
88
0.830
PanBio
DENV 1, 2,
3, 4
Indirecta
60 min
100
98
0.917
Progen
Biotechnik
DENV 2
Indirecta
90 min
77
86
0.785
INDX EIA
DENV 2
Indirecta
45 min
97
98
0.913
DEN 1, 2, 3,
4
Indirecta
210 min
85
95
0.847
Genelabs
Diagnostics
En los estudios retrospectivos en los que se trata de identificar los serotipos que han
circulado en una determinada población, se utiliza la prueba de neutralización de
reducción en placa (PRNT) considerada por la OMS como el gold estándar
para
dengue, ya que detecta títulos de anticuerpos neutralizantes específicos por serotipo
(Putnak JR et al., 2008; Roehrig JT, 2003; Russell PK, 1967; Thomas SJ et al.,2009).
Esta prueba es realizada por muchos laboratorios alrededor del mundo desde 1967
cuando fue adaptada por Russell y cols.; desde entonces, ha sido modificada por cada
laboratorio, lo que representa una desventaja cuando se desea comparar resultados
entre laboratorios, ya que dependerán los resultados de las líneas celulares utilizadas
así como de las cepas virales empleadas (Rainwater Lovett et al. 2012). Por lo anterior,
la OMS e investigadores se han dado a la tarea de estandarizar la prueba (WHO,
2009).
2.5 Vacunación contra DENV
Las iniciativas en el desarrollo de vacunas contra el dengue se han enfocado en
modelos de vacunas con virus atenuados, inactivados y de subunidades. La proteína E
se ha empleado como antígeno objetivo en vacunas atenuadas y en vacunas de sub18
unidades contra el dengue. En individuos inmunizados con vacunas vivas atenuadas
contra el DENV, los títulos y especificidad de los anticuerpos y células T generadas
son comparables con los producidos durante una infección natural. Rothman en el 2011
pone a consideración la administración de una vacuna tetravalente por la posibilidad de
que se presenten complicaciones como ADE en individuos vacunados en los que no se
logre una respuesta inmune protectora contra los cuatro serotipos (Rothman A., 2011).
Sin embargo en los primeros resultados de eficacia del modelo de vacuna tetravalente
desarrollado por Sanofi Pasteur en Tailandia en el grupo etario vacunado (4 a 11 años
de edad) hasta el momento no se ha descrito que se haya presentado el fenómeno
ADE (Zambrano-Mora, BM, 2010). Por otro parte, la eficacia reportada fue de 30.2%
(IC-95% 13.4-56.6) después de aplicar la tercera dosis, la cual cambia con respecto al
serotipo, dado que la eficacia para los serotipos DENV-1, DENV-3 y DENV-4 está por
encima del 50% mientras que para DENV-2 la eficacia a los 28 días después de la
aplicación de la tercera dosis es de 9.2% (IC-95% -75.0-51.3). Por el momento estos
datos aún no se pueden considerar como concluyentes ya que el comportamiento
epidemiológico es diferente en Tailandia con respecto al de Latinoamérica y quizá la
eficacia de la vacuna podría también ser diferente (Sabchareon A et al. 2012).
2.6 Epidemiología
La incidencia del dengue en el mundo en los últimos 50 años se ha incrementado 30
veces y se estima que aproximadamente 3 billones de personas que viven en regiones
tropicales y subtropicales están en riesgo de infectarse (Kyle JL, et al., 2008; WHO,
2009).
Al año se reportan 34 millones de casos febriles y más de 20,000 muertes asociadas a
la enfermedad (Panhuis W G et al., 2010). Del 10% al 50% de las infecciones por este
virus son sintomáticas y el resto asintomáticas, sin embargo sólo una fracción de las
sintomáticas son reportadas, lo que hace pensar que la incidencia de los casos está
subestimada (Kyle JL et al., 2008).
Las tasas de mortalidad varía del 1% al 10% y depende en gran medida de la atención
oportuna que se le dé al enfermo (Kohoa T D et al., 2011) (Figura 6).
19
Figura 6. Lugares en el mundo con mayor transmisión de DENV. Imagen tomada de:
Simmons
CP,
Farrar JJ, Vinh Chau N, Wills B. Dengue. N ENGL L MED 2012;366:1423-32.
En México, se cuenta con el reporte de casos de dengue desde 1978, en el cual se ha
observado que los años en los que se presentan un mayor número de casos coinciden
con la introducción de un nuevo serotipo (Figura 7).
20
Figura 7. Casos de dengue en México, 1978-2012 (SINAVE/DGE/SALUD/Sistema Especial de Vigilancia
Epidemiológica de Dengue. Cierre preliminar, 2012).
Los estados con mayor incidencia en los últimos 7 años corresponden a Campeche,
Quinta Roo, Yucatán, Colima y Morelos, mientras que en Aguascalientes, Baja
California, Chihuahua, México, Distrito Federal y Tlaxcala (Figuran 8).
21
ESTADO
2005
AGUASCALIENTES
BAJA CALIFORNIA
BAJA CALIFORNIA SUR
CAMPECHE
COAHUILA
COLIMA
CHIAPAS
CHIHUAHUA
DISTRITO FEDERAL
DURANGO
GUANAJUATO
GUERRERO
HIDALGO
JALISCO
MÉXICO
MICHOACÁN
MORELOS
NAYARIT
NUEVO LEÓN
OAXACA
PUEBLA
QUERÉTARO
QUINTANA ROO
SAN LUIS POTOSI
SINALOA
SONORA
TABASCO
TAMAULIPAS
TLAXCALA
VERACRUZ
YUCATÁN
ZACATECAS
TOTAL
Figura
8.
Incidencia
por
INCIDENCIA POR ENTIDAD FEDERATIVA (por 100,000 hab)
2006
2007
2008
2009
0
0
0
0
0.39
14.62
2010
2011
0
0
0.17
0.28
0.26
0.60
40.25
95.51
349.63
11.81
5.85
100.00
147.30
122.31
0
0
0
0
21.96
7.07
11.72
28.17
4.93
9.12
32.52
1.11
20.96
3.31
0.19
75.12
283.60
162.10
413.17
1252.40
219.05
63.47
49.37
16.78
66.32
35.85
97.69
24.86
18.18
0.00
0.00
0.03
0.09
0.00
0.06
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
7.97
21.58
4.21
19.41
1.16
0.77
0.00
0.00
12.77
0.28
3.91
0.00
0.00
45.39
145.06
145.73
145.09
209.81
242.91
30.50
29.92
9.23
1.88
25.24
56.62
1.97
2.21
1.44
27.15
13.81
20.60
799.62
26.26
3.27
0.00
0.05
0.31
0.40
1.81
0.28
0.04
0.92
10.74
58.10
66.11
122.22
44.72
15.10
17.71
173.42
82.20
488.50
75.11
105.01
56.48
48.72
61.06
114.39
36.09
1117.75
190.86
6.47
20.39
4.18
88.35
19.51
15.15
54.09
15.98
33.77
92.68
156.37
39.97
68.60
126.36
33.02
0.92
4.40
5.69
10.78
10.56
22.03
3.02
0.00
6.75
0.48
0.18
2.09
0.06
4.27
77.39
188.01
362.19
36.78
63.39
196.50
200.44
7.68
11.60
10.60
11.36
136.14
12.94
3.31
25.64
16.94
22.89
50.30
102.02
45.75
4.21
3.15
3.53
0.61
44.22
19.96
170.18
3.72
19.24
9.07
88.42
47.21
308.65
25.33
18.84
232.61
6.50
62.23
48.69
45.10
30.52
3.15
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
63.00
118.21
210.61
56.86
177.00
18.12
27.77
8.87
33.88
99.40
37.99
241.37
154.69
380.26
0.00
0.00
11.28
0.14
0.00
0.00
0.00
21.06
28.45
49.50
33.37
122.77
39.94
18.75
entidad
federativa
por
cada
100,000
habitantes,
2005-2011
(SINAVE/DGE/SALUD/Sistema Especial de Vigilancia Epidemiológica de Dengue. Cierre preliminar,
2012).
En las localidades de Axochiapan y Tepalcingo del Estado de Morelos durante el 2010
se registraron 144 casos de FD con una tasa de 528.03 casos/100,000 habitantes,
cifras similares a las reportadas en el 2008 (Tabla 2).
22
Tabla 2. Tasas de incidencia de dengue por 100, 000 habitantes (2006-2010) en las
localidades de Axochiapan y Tepalcingo (Fuente: Panorama epidemiológico de fiebre y
fiebre hemorrágica por dengue en entidades federativas, Secretaria de Salud. 2011).
2006
2007
2008
2009
2010
Localidad Casos Tasa
Casos Tasa
Casos Tasa
Casos Tasa
Casos Tasa
Axochiapan 148 910.5
13
80.0
22 135.3
92 560.0
103
633.7
Tepalcingo
48 435.7
97 880.5
7
63.5
51 463.0
41
372.2
Total
196 718.7
110 403.4
29 106.3
143 524.4
144
528.0
Al comprar las tasas registradas en Axochiapan y Tepalcingo con la media nacional y
con las reportadas en el Estado de Morelos, se observan que en general están por
encima de la media nacional y estatal (Tabla 3).
Tabla 3. Tasas de incidencia de dengue por 100, 000 habitantes (2006-2010), a nivel
nacional, estatal y local. (Fuente: Dirección General de Epidemiología).
Año
Nacional Morelos Axochiapan y Tepalcingo
2006
22.94
139.7
718.7
2007
40.6
67.7
403.4
2008
26.3
357.6
106.3
2009
112.2
64.1
524.4
2010
33.9
88.1
528.0
Con respecto a la circulación de los serotipos reportados en México desde 1984 se ha
observado una relación entre la aparición de picos epidémicos y la presencia de un
serotipo predominante (DENV-1, 2 ó 3). Actualmente los serotipos DENV-1, DENV-2 y
DENV-3 se han reportado en Jalisco y Quintana Roo; DENV-1, DENV-2 y DENV-4 en
23
Michoacán, Guerrero, Tabasco, Veracruz y Yucatán. En Chiapas se ha reportado la
circulación de los cuatro serotipos (Panorama epidemiológico de fiebre y fiebre
hemorrágica por dengue en entidades federativas, Secretaria de Salud).
2.6.1. Seroprevalencia contra DENV
La seroprevalencia determinada en algunas regiones de América entre el 2000 y el
2008 nos puede dar un panorama general de la población que ya ha estado expuesta a
una infección por DENV en algún momento de su vida, en éstas regiones de América.
En México los estudios realizados muestran una seroprevalencia entre el 9.1% para
Tabasco en población de universitarios (población cerrada) de entre 18 y 39 años de
edad y del 79.6 % en Veracruz para todas las edades, ubicando a ésta última como
una población hiperendémica (Navarrete-Espinosa J, et al .2006). Colima registró una
seroprevalencia
del 32.8%,
sin
embargo
está
seroprevalencia
parece
estar
subestimada ya que la inmunocromatografía usada en este estudio tiene baja
sensibilidad para IgG, pero una especificidad del 98% comparada con la prueba de
ELISA. Los hallazgos en éste estudio sugieren que en la ciudad de Colima el dengue
es endémico manteniendo la transmisión continua para eventuales brotes epidémicos
que se pueden presentar cuando la densidad vectorial alcanzan niveles elevados o
cuando la cantidad de población susceptible aumenta (Espinoza-Gómez F,
2003) (Tabla 4).
24
et al.
Tabla 4. Prevalencia de anticuerpos IgG contra DENV en varios países del Continente
Americano.
País y año
Tamaño de
la muestra
Método de
laboratorio
Edad
Seroprevalencia
Referencias
36.9%
Iturrino-Monge R,
et al. 2006.
91%
Balmaseda A, et
al , 2006.
40%
Brunkard JM.et al.
2007.
78%
Brunkard JM.et al.
2007.
79.6%
NavarreteEspinosa J, et al
.2006.
9.1%
Sánchez-Burgos
G, et al. 2008.
(años)
Costa Rica
(2002-2003)
206
ELISA
(Pan Bio test ®)
Nicaragua
(2001-2002)
398
Inhibición ELISA
EUA
(Brownsville,2005)
600
ELISA Ig G
Indirecta
(Pan Bio test ®)
México
)
(Matamoros,2005)
600
ELISA Ig G
Indirecta
(Pan Bio test ®)
México
(Veracruz,2008)
500
ELISA
(UMELISATECNOSUMA)
México
(Tabasco,2005)
273
ELISA Ig G
Captura
(Pan Bio test ®)
1 -10
4-16
> 15
> 15
Todas
18-39
La evidencia reportada en estudios de seroprevalencia por grupo etario indica que la
presencia de anticuerpos IgG tiene una correlación positiva con respecto a la edad.
(Tabla 5). En Singapur en el 2004, la seroprevalencia global encontrada fue de 59%; en
los cuales en el grupo de 18 a 24 años mostró una seroprevalencia del 17.2% y el
grupo de 55 a 74 años tuvo una seroprevalencia del 88.9% (Tabla 5).
25
Tabla 5. Estudios de seroprevalencia por grupo etario en poblaciones de Brasil, EUA y
México.
País y años de muestreo
(n=Tamaño de la muestra)
Brownsville, 2005 (n=600)
(Brunkard JM. et al. 2007.)
Matamoros, 2005 (n=600)
(Brunkard JM. et al. 2007.)
Veracruz , 2003 (n=500)
(Navarrete-Espinosa J, et al.
2006.)
Edad
(Años)
Seroprevalencia
(%)
5-14
15-24
25-44
45-64
>64
5-24
25-34
35-44
45-54
55-64
65-74
>75
<1
1-4
5-14
15-24
25-44
45-64
65 +
0
16.7
56.2
13.5
42.8
79
75
72
80
79
95
90
17
66
69
79
86
86
94
Lo anterior es un comportamiento típico en poblaciones endémicas en donde la
población ha estado expuesta a DENV desde su nacimiento, lo que explica el aumento
en la seroprevalencia conforme aumenta la edad de la población (Weng Yew Y et al.
2009).
Las poblaciones endémicas son capaces de mantener la transmisión del DENV porque
de acuerdo a la historia natural de la enfermedad en lugares endémicos, se establece
que las infecciones primarias le confieren inmunidad de larga duración contra el
serotipo infectante y les da protección contra los otros serotipos por un periodo de
varios meses, durante el cual, las infecciones heterólogas son asintomáticas y
producen el nivel de viremia suficiente para que el mosquito adquiera el virus y lo
mantenga en circulación (Sabin A, 1952; Whala MP, et al.,2011;Murphy BR, et al.,
2011).
Cabe resaltar que en poblaciones endémicas de México los estudios de
seroprevalencia realizados no han sido representativos de toda la población lo que
26
limita la identificación de asociaciones entre las variables de edad, sexo, características
demográficas y la presencia de anticuerpos IgG contra el DENV.
27
3. JUSTIFICACIÓN
La inmunidad generada en la población contra los diversos serotipos del DENV es uno de los
factores de la transmisión que se han estudiado con la finalidad de establecer su periodicidad y
así poder predecir y controlar las epidemias, enfocándonos en áreas de mayor probabilidad de
presentación de brotes.
En estudios realizados por Wearing y Adams, se establece que la periodicidad de la
transmisión del dengue sólo depende de la respuesta inmunitaria de reacción cruzada de corta
duración, observando una sincronía en la aparición de DENV-2 y DENV-3, misma que no se
observa con DENV-4; lo que hace pensar que los serotipos 2 y 3 podrían estar suprimiendo la
transmisión de DENV-4. Por lo anterior se sugiere que uno de los factores que podría explicar
el patrón secular de la transmisión del DENV es la inmunidad heterotípica neutralizante.
Los estudios de inmunidad contra el DENV realizados en México son pocos y en su mayoría
describen la seroprevalencia de población cerrada. En Veracruz la seroprevalencia reportada
en una población cubierta por el Programa IMSS-Oportunidades fue de 79.6%, parecida a la
seroprevalencia reportada en Matamoros (Brunkard JM.et al. 2007; Navarrete-Espinosa J, et
al .2006). En Tabasco la prevalencia de anticuerpos IgG contra el DENV fue de 9.1%, sin
embargo, el tipo de prueba diagnóstica no fue la óptima por lo que quizá podría estar
subestimada (Sánchez-Burgos et al. 2008). Por otro lado, ese es el único estudio que reporta
títulos de anticuerpos neutralizantes por serotipo mostrando la heterogeneidad de la respuesta
inmune en un grupo expuesto al DENV (Sánchez-Burgos G, et al. 2008).
Con la finalidad de contar con estudios seroepidemiológicos que representen a toda una
población y contribuir a la identificación de factores que influyen en la transmisión, así como
aportar la información para la toma de decisiones en la selección del grupo etario a vacunar, se
decidió iniciar el presente estudio. Creemos además, que el conocer la frecuencia y títulos de
anticuerpos neutralizantes por serotipo, nos ayudaría a sentar las bases para la realización de
estudios futuros que ayuden a definir el título protector de anticuerpos para cada serotipo.
El presente estudio determinó la seroprevalencia por serotipo del DENV de una población
representativa de dos localidades de Morelos, México.
28
4. OBJETIVOS
4.1 OBJETIVO GENERAL
Determinar la seroprevalencia de inmunoglobulinas G y la frecuencia de anticuerpos
neutralizantes por serotipo de DENV en las poblaciones de Axochiapan y Tepalcingo
del Estado de Morelos, México.
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
4.2.1 Determinar la seroprevalencia de IgG específica para DENV por grupo etario en
Axochiapan y Tepalcingo, Morelos.
4.2.2 Determinar la frecuencia de anticuerpos neutralizantes contra cada serotipo de
DENV por grupo etario.
4.2.3 Evaluar la asociación entre la edad y los anticuerpos neutralizantes serotipo
específico.
4.2.4
Determinar
la
proporción
de
respuestas
neutralizantes y su asociación con los grupos etarios.
29
homotípicas
y
heterotípicas
5. METODOLOGÍA
5.1 Diseño
Se realizó un estudio de corte transversal anidado en una cohorte de sujetos mayores
de 5 años residentes en la localidad de Axochiapan y Tepalcingo (Martínez-Vega et al.,
2012).
5.2 Población de estudio
Los sujetos seleccionados pertenecen a una cohorte de personas mayores de 5 años,
quienes son residentes en las localidades de Axochiapan y Tepalcingo de la
jurisdicción número 3 del Estado de Morelos, México. A cada uno de los participantes
de la cohorte mayores de 18 años se les solicitó la firma del consentimiento informado
y a los sujetos de entre 7 y 17 años se les pidió firmaran el asentimiento informado y a
sus padres o tutores se les solicitó la firma del consentimiento. Si el participante tenía
entre 5 y 6 años únicamente se pidió la firma del consentimiento informado de los
padres o tutores (Anexo 1). Una vez que aceptaron participar se les realizó una
encuesta basal para el estudio sociodemográfico (Anexo 2) y se les tomó una muestra
de sangre venosa, en la primera y segunda visita. La descripción general del estudio de
cohorte al que está anidado el presente estudio se localiza en el anexo 3.
La muestra de sangre que se tomó en la primera visita en la realización de la cohorte
(muestra basal), fue la que se utilizó en éste estudio para determinar la
seroprevalencia, por lo que el estudio se considera como una investigación sin riesgo,
ya que se emplearon las muestras que se obtuvieron durante la cohorte.
La información sociodemográfica de los participantes fue obtenida de las encuestas
realizadas en la cohorte, dicha información es confidencial y se encuentra codifica por
número de identificación y no por nombre.
30
La cohorte “Infección peridomiciliaria como determinante de la transmisión del dengue”
(CI:986) y el presente estudio (CI:494) cuentan con el permiso de la Comisión de Ética
del Instituto Nacional de Salud Pública.
5.3 Criterios de inclusión:
Los criterios de inclusión para el estudio de corte transversal fueron los siguientes:
•
Sujetos mayores de 5 años de edad.
•
Firma del consentimiento informado.
•
Asentimiento en los sujetos entre 7 y 17 años de edad.
5.4 Criterios de exclusión
Para el estudio se excluyeron a sujetos que declararon en la encuesta basal no haber
vivido toda su vida en las comunidades de Axochiapan y Tepalcingo, Morelos, con la
finalidad de que la información refleje la inmunidad que se ha adquirido en la región, así
como los serotipos que han circulado en estas poblaciones.
5.5 Consideraciones para la clasificación de grupos etarios:
Los sujetos que cumplieron con los criterios de inclusión y exclusión se clasificaron en
tres grupos etarios, de acuerdo a los serotipos reportados que han circulado en
Morelos desde 1984, de manera que el grupo entre 5 y 9 años han estado expuestos a
alguno de los tres serotipos (DENV-1,2,3), el grupo entre 10 y 25 años han estado
expuestos por lo menos en una ocasión a los cuatro serotipos, mientras que el grupo
de mayores de 25 años ha estado expuesto en dos ocasiones a los tres serotipos
(DENV1-3) y en una ocasión al DENV4 (Figura 9).
31
AÑO
DENV 1
DENV 2
DENV 3
DENV 4
1995
-
X
-
-
1996
-
-
-
X
1997
X
-
X
X
1998
X
-
X
-
1999
-
X
X
-
2000
-
-
-
-
2001
-
-
X
-
2002
-
X
X
-
2003
-
X
X
-
2004
-
X
-
-
2005
X
X
-
-
2006
X
X
X
-
2007
X
-
X
-
2008
X
-
X
-
2009
X
-
-
-
2010
X
X
-
-
2011
X
-
-
-
Figura 9. Serotipos de DENV reportados desde 1995 hasta el 2011 en el Estado de Morelos, México
((x)=serotipo reportado, (-) =no hubo reporte de aislamiento). Fuente: Secretaria de Salud.
32
5.6 Determinación del tamaño de muestra
Para la selección del tamaño de muestra de éste estudio transversal se consideró una
prevalencia esperada en el grupo de menores de 10 años (grupo de menor exposición)
del 15%, y una prevalencia del 30% en los otros grupos etarios (grupos de mayor
exposición), con un poder del 80% y un nivel de confiabilidad del 95% se estimó
evaluar 133 sujetos en cada grupo. Sin embargo, de acuerdo al censo de INEGI en el
2000 el grupo entre 5 y 9 años es del 11.6%, por lo que se esperaba obtener 136 niños
de la cohorte (n=1197). Sin embargo en el estudio de cohorte sólo se obtuvieron 122
niños, por lo anterior, se decidió determinar la seroprevalencia en todos los sujetos de
la cohorte que cumplieron con todos los criterios de inclusión y exclusión establecidos
para el estudio transversal (n=929).
Para la determinación de la seroprevalencia por serotipo del DENV se realizó en 137
sujetos seropositivos para DENV, en los cuales se consideró todos los niños de entre 5
y 9 años de edad (n=40) y los primeros 97 sujetos captados, por motivos de
disponibilidad de reactivos en la University of Texas Medical Branch (UTMB).
5.7 Variables
Variable dependiente o de resultado: Detección de anticuerpos IgG contra DENV.
Otra variable dependiente: Detección de anticuerpos neutralizantes contra los
diferentes serotipos de DENV.
Variable independiente principal o explicativa: Edad de los sujetos como medida
indirecta de la exposición a los diferentes serotipos durante su vida.
Otras variables independientes: Sexo, nivel de educación, ocupación.
33
5.8 Ensayos de laboratorio
5.8.1 Prueba indirecta de ELISA para IgG
La seroprevalencia se determinó con la prueba indirecta de ELISA para IgG con el kit
de Panbio E-DEN 01G siguiendo las indicaciones del fabricante. Las muestras fueron
clasificadas de acuerdo al punto de corte de cada estuche en: positivas, negativas e
indeterminadas. Sólo una muestra fue indeterminada y no se consideró para el análisis
estadístico. Además fueron verificados los criterios de calidad de cada estuche,
siguiendo las recomendaciones del fabricante. El kit no discrimina entre los cuatro
serotipos de DENV (Figura 10).
1
2
3
4
A
B
Figura 10. Placa para ELISA ya revelada. 1A Control positivo; 2B Control negativo; 2A, 3A y 4A
calibradores; El resto de los pozos son muestras de los individuos seleccionados.
5.8.2 PRNT60%
Los sueros de los sujetos seropositivos fueron evaluados para la determinación de
títulos de anticuerpos neutralizantes, así como su serotipificación, mediante el ensayo
de PRNT60%, siguiendo el protocolo establecido por el Dr. Nikos Vasilakis de la UTMB
(Anexo 4) (Figura 11). El límite de cuantificación de la prueba fue la dilución 1:20, por lo
que las muestras que fueron negativas a la dilución1:20 fueron consideradas como
34
indetectables y para el análisis se les asignó la dilución de 1:10. Las cepas de
referencia fueron para DENV1 Hawaii, DENV2 16681, DENV3 FSP032 y DENV4 H241.
Dilución
10
-2
10
-4
10
-8
10 -16
10 -32
10 -
64
10 -2
10 -2
-2 la figura se muestra una prueba de PRNT por duplicado, en la cual se observan las placas
Figura 11.
10En
de color carmín que se forman en ausencia de anticuerpos neutralizantes.
5.9 Análisis estadístico
Se realizó una descripción por grupo etario de las características de la muestra
seleccionada utilizando la prueba de Mann-Whitney para las variables continuas y la
prueba de ji cuadrada para las variables categóricas.
Posteriormente, se determinó la seroprevalencia de anticuerpos IgG por grupo etario y
se realizó un análisis bivariado con Mann-Whitney para las variables continuas y la
prueba de ji cuadrada para las variables categóricas. Las variables que presentaron
una p<0.20 fueron utilizadas para el análisis multivariado con un modelo de regresión
logística. El modelo final incluyó aquellas variables con un p<0.05 o aquellas que
modificaban el OR de la variable independiente principal (grupo etario) en más de un
20%. El modelo final se ajustó por sexo aunque esta variable no cumplió con las
condiciones mencionadas anteriormente, sin embargo es una variable que se considera
en la mayoría de los estudios.
Adicionalmente, se calculó la frecuencia de anticuerpos IgG específicos para los cuatro
serotipos de DENV y el logaritmo de los títulos de anticuerpos neutralizantes contra
cada serotipo, así como la frecuencia de reacciones homotípicas y heterotípicas. Se
35
comparó la frecuencia y los títulos de anticuerpos entre los grupos utilizando la prueba
de ji cuadrada y de Mann-Whitney respectivamente.
Finalmente se compararon los títulos de anticuerpos neutralizantes por serotipo según
la ocurrencia de infección reciente por DENV sin considerar el grupo etario. La
infección reciente fue detectada en la cohorte, por lo que en los sujetos que fueron
considerados para el estudio transversal también se contaba con la información de
infección reciente en la muestra basal, ya que habían sido positivos para IgM o IgG de
captura en la prueba de ELISA.
El análisis estadístico se realizó usando el paquete estadístico Stata SE 12®.
5.10 Fuente de financiamiento
El proyecto contó con los siguientes financiamientos externos:
- Premio en Epidemiología del fondo de investigación 2010 del Instituto Científico
Pfizer.
- Fondo Sectorial de Investigación en Salud y Seguridad Social de CONACYT 2010.
36
6. RESULTADOS
6.1 Características demográficas de la población
De los 1197 sujetos de la cohorte se analizaron encuestas y muestras serológicas
basales de 929 sujetos que cumplieron con los criterios de inclusión y exclusión
previamente señalados. Las encuestas y las muestras serológicas basales fueron
obtenidas entre junio y noviembre del 2011 en las localidades de Axochiapan y
Tepalcingo, Morelos.
Axochiapan es una localidad a 1030 metros de altitud, situada en el municipio de
Axochiapan en el Estado de Morelos, con 17 508 habitantes (2010), de los cuales el
48.9% son hombres.
La localidad de Tepalcingo está a 1160 metros de altitud, situada en el municipio de
Tepalcingo en el Estado de Morelos, con 12 053 habitantes (2010). El 48.1% son
hombres.
De acuerdo a la información demográfica reportada por el Instituto Nacional de
Estadística y Geografía (INEGI) en las localidades de Axochiapan y Tepalcingo en el
2005, el 11.9%, 35.3% y 53.12% correspondió al grupo de 5 a 9 años, de 10 a 25 años
y de mayores de 25 años respectivamente, por lo que nuestros grupos etarios son
representativos de las localidades si consideramos que
el 12.1%, 33.6% y 54.4%
corresponden al grupo de 5 a 9 años, de 9 a 10 años y de mayores de 25 años
respectivamente. Consistente con el grupo etario, la ocupación principal para el primero
y el segundo grupo, es el ser estudiante, mientras que para el tercer grupo etario lo
constituyen los sujetos que trabajan ya sea en el hogar o fuera del hogar. El 53.2% de
los sujetos considerados para el presente estudio pertenecieron al grupo de expuestos
de la cohorte, es decir pertenecen a al grupo que estaba cerca de un caso confirmado
por dengue. El 85.8% declaró tener algún tipo de derechohabiencia del cual el 74.65%
contaba con seguro popular en el momento de la encuesta. Por otra parte, al 17.1% se
37
les detectó una infección reciente pre-reclutamiento por DENV, dicha infección fue
detectada en el estudio de cohorte (Tabla 6).
Tabla 6. Datos demográficos de los participantes del estudio de las localidades de
Axochiapan y Tepalcingo, Morelos, México, 2011.
Total
n=929
5-9 años
n=112(12.1%)
10-25 años
n=312(33.6%)
>25 años
n=505(54.4%)
Edad
Mediana(rango)
28 (5-86)
7
17
47
Sexo Hombre (%)
381 (40.1)
65 (58.0)
129 (41.3)
187 (37.0)
<0.001
Expuestos* (%)
494(53.2)
66(58.9)
166(53.2)
262(51.9)
0.401
Localidad (%)
Tepalcingo
325 (35)
38 (33.9)
89(28.5)
198(39.2)
0.008
Estudia (%)
278 (30)
108 (96.4)
164(52.6)
6(1.2)
<0.001
Variable
Nivel de
educación (%)
<0.001
Analfabeta
111(12)
21(18.8)
6(1.9)
84(16.6)
Lee o escribe
260(28)
91(81.3)
59(18.9)
110(21.8)
Básica
188(20.2)
0(0)
81(26)
107(21.2)
Secundaria
240(25.8)
0(0)
110(35.3)
130(25.7)
Preparatoria
70(7.5)
0(0)
44(14.1)
26(5.1)
Licenciatura
25(2.7)
0(0)
7(2.2)
18(3.6)
Post-grado
35(3.8)
0(0)
5(1.6)
30(5.9)
Ocupación (%)
Estudiante
Estudia y trabaja
Empleado
p
<0.001
246(26.5)
106(94.6)
139(44.6)
1(0.2)
28 (3)
2(1.8)
24(7.7)
2(0.4)
170(18.3)
0(0)
50(16)
120(23.8)
38
Total
n=929
5-9 años
n=112(12.1%)
10-25 años
n=312(33.6%)
>25 años
n=505(54.4%)
140 (15.1)
0(0)
17(5.5)
123(24.4)
277 (29.8)
0(0)
63(20.2)
214(42.4)
68(7.3)
4(3.6)
19(6.1)
45(8.9)
Derechohabiencia
797(85.79)
104(92.86)
262(83.9)
431(85.35)
0.211
Infección prereclutamiento***
159 (17.1)
19(17)
78(25)
62(12.3)
<0.001
Variable
Independiente
Ama de casa
Otros**
p
*Grupo expuesto de los sujetos de cohorte; **desempleados, jubilados, personas de la tercera edad sin
sueldo, discapacitados;
***grupo de infectados de la cohorte.
6.2 Seroprevalencia de anticuerpos IgG contra DENV.
La seroprevalencia global para el DENV fue 76.6% (IC-95% 73.6-79.2), con una
seroprevalencia mayor al 90% a partir de los 30 años (p<0.001), lo que indica que la
mayoría de la población ya había estado en contacto con el DENV. Así mismo, se
observa a partir de los 40 años, una seroprevalencia superior al 90%, excepto en el
último quinquenio, en el cual la seroprevalencia fue de 83.3%, sin embargo el intervalo
es muy amplio (IC-95% 35.8-99.6) (Figura 12).
39
Figura 12. Seroprevalencia global de inmunoglobulina IgG contra DENV de las
localidades de Axochiapan y Tepalcingo, Morelos, México, 2011*.
*En las barras se indica el IC del 95%.
En Tepalcingo se encontró una seroprevalencia de 72.8% (IC-95% 67.6-77.6) y en
Axochiapan de 78.4% (IC-95% 74.9-81.6) (p=0.112). En ambas localidades se observó
un incremento de la seroprevalencia con la edad (Figura 13).
Figura 13. Seroprevalencia de inmunoglobulinas IgG contra DENV por grupo etario
para Axochiapan y Tepalcingo, Morelos, México, 2011.
40
Las características demográficas asociadas a la seroprevalencia para DENV fueron
analizadas en 928 sujetos de los 929, ya que uno de los sujetos fue reportado en la
prueba de ELISA para IgG como indeterminado, por tal motivo no fue considerado para
este análisis. El análisis bivariado mostró asociación entre la seroprevalencia global y
las variables de edad, localidad, ocupación, el nivel de educación y el ser estudiante en
el momento en que se realizó la encuesta (Tabla 7).
El modelo final del análisis multivariado se ajustó por las variables de edad, sexo,
localidad y ocupación; en el análisis se observó que la posibilidad de ser seropositivo
en el grupo de mayores de 25 años es de 17.76 veces con respecto al grupo de 5 a 9
años; en cuanto a la ocupación, los grupos con mayor posibilidad de ser seropositivos
con respecto al grupo de estudiantes correspondieron a aquellos que declararon tener
una ocupación independiente (Tabla 7).
Tabla 7. Características asociadas a la seroprevalencia para DENV de las localidades
de Axochiapan y Tepalcingo, Morelos, México.
Variable
Total
n=928
Seronegativos
n=215
Seropositivos
n=713
OR
(IC 95%)
Grupo etario
(5 a 9 años)
112(12.1)
72(33.5)
40(5.6)
1.0
Grupo etario
(10 a 25 años)
311(33.5)
117(54.4)
194(27.21)
2.98
(1.9-4.68)
2.17
(1.30-3.62)
33.16
(19.09-57.62)
17.76
(8.40-37.54)
Grupo etario
(> 25 años)
Sexo
Mujeres (%)
Hombre (%)
505(54.4)
26(12.1)
479(67.2)
547 (58.9)
381(41.6)
115(53.5)
100(46.5)
432(60.6)
281(39.4)
Expuestos* (%)
493(53.1)
113(52.6)
380(53.3)
Localidad (%)
Tepalcingo
Axochiapan
325(35.0)
603 (65)
88(40.9)
127(59.1)
237(33.2)
476(66.7)
Estudia (%)
278 (30)
147 (68.4)
131(18.4)
41
1.0
0.75
(0.55-1.02)
1.03
(0.76-1.40)
1.0
1.39
(1.02-1.90)
0.10
(0.07-0.14)
OR aᵻ
(IC 95%)
1.08
(0.71-1.63)
2.07
(1.41-3.05)
Total
n=928
Seronegativos
n=215
Seropositivos
n=713
OR
(IC 95%)
Analfabeta
90(9.7)
6(2.8)
84(11.8)
1.0
Niños que aún no
leen ni escriben
21(2.3)
11(5.1)
10(1.4)
0.06
(0.02-0.21)
Lee o escribe
259(27.9)
89(41.4)
170(23.8)
0.14
(0.06-0.32)
Primaria y
Secundaria
428(46.1)
90(41.9)
338(47.4)
0.27
(0.11-0.63)
130(14)
19(8.8)
111(15.6)
0.42
(0.16-1.09)
246(26.5)
135(62.8)
111(15.6)
1.0
28 (3)
12(5.6)
16(2.2)
1.62
(0.74-3.57)
1.11
(0.47-2.58)
170(18.3)
23(10.7)
147(20.6)
140(15.1)
10(4.7)
130(18.2)
7.77
(4.69-12.9)
15.81
(7.92-31.54)
1.86
(1.00-3.47)
2.31
(1.01-5.28)
276 (29.7)
29(13.5)
247(34.6)
10.36
(6.54-16.40)
2.29
(1.25-4.19)
Otros**
68(7.3)
6(2.8)
62(8.7)
12.57
(5.24-30.14)
4.09
(1.59-10.50)
Seguro
797(85.8)
197(91.6)
600(84.2)
0.99
(0.99-1)
Variable
OR aᵻ
(IC 95%)
Nivel de
educación (%)
Preparatoria,
técnico y
licenciatura.
Ocupación (%)
Estudiante
Estudiante y
empleado.
Empleado
Independiente
Ama de casa
* Grupo expuesto de la cohorte;** Desempleados, jubilados, personas de la tercera edad sin sueldo y
discapacitados.
ᵻ Modelo multivariado de regresión logística
42
6.3 Seroprevalencia de anticuerpos neutralizantes serotipo específico contra
DENV por grupo etario
La seroprevalencia de anticuerpos neutralizantes en el primer grupo etario (n=40) fue
de 82.5% (IC-95% 67.22-92.66), 45% (IC-95% 29.25-61.50) y 65% (IC-95% 48.31-79.37)
para DENV 1 a DENV 3 respectivamente, además es importante señalar que el 2.5%
(IC-95% 0.06-13.15) de seroprevalencia encontrada para DENV4 está relacionado a una
respuesta inmune de reacción cruzada ya que fueron individuos que se infectaron
recientemente y que no habían estado expuestos a una infección por DENV4 (Figura
13).
En el segundo grupo etario (n=27) se observó una seroprevalencia por encima del 60%
para los tres serotipos excepto para DENV4 (42.9%, IC 95% 24.46-62.82); en cambio
para el tercer grupo etario (n=70) la seroprevalencia fue mayor al 65% para los cuatro
serotipos. Adicionalmente se observa una diferencia estadísticamente significativa
entre DENV2 y DENV4 en los tres grupos etarios, lo que no sucede con DENV1 y 3
(Figura 13).
Figura 13. Seroprevalencia por serotipo contra DENV por grupo etarios de las
localidades de Axochiapan y Tepalcingo, Morelos, México, 2011.
Con respecto a los títulos de anticuerpos
neutralizantes
podemos observar que se
*
*
refleja el patrón de exposición de los serotipos que han circulado
* en ésta región, como
es el caso para el grupo de entre 5 y 9 años, el cual ha estado expuesto por lo menos a
uno de los tres serotipos (DENV1-3). En cambio para el segundo y tercer grupo,
*
*
podemos observar
que han estado expuestos en más de una ocasión a alguno de los
cuatro serotipos de DENV. DENV-3 ha circulado en la última década en más ocasiones
que DENV-4 mismo que sólo se ha reportado en 1996 y 1997 en la región de Morelos.
Sin embargo, los títulos de anticuerpos neutralizantes para DENV-3 en el grupo de
mayores de 25 años son más bajos con respecto a DENV-4 (Figura 14). Además se
*
puede observar como los títulos de anticuerpos neutralizantes para DENV-2 y DENV-4
tienen un comportamiento similar a diferencia de DENV-1 y DENV-3 en los tres grupos
etarios (Tabla 8).
43
Figura 14. Logaritmo de anticuerpos neutralizantes contra los cuatro serotipos de
DENV, de los sujetos participantes de las localidades de Axochiapan y Tepalcingo,
Morelos, México, 2011 (PRNT 60%).
1
1.5
2
2.5
3
Log de anticuerpos neutralizantes contra todos los serotipos de DENV
5-9 años
10-25 años
> 25 años
Grupo etario
DENV1
DENV3
DENV2
DENV4
Tabla 8. Asociación entre el título de anticuerpos neutralizantes y el grupo etario.
Grupo etario*
Mediana (25%-75%)
1 vs 2
1 vs 3
2 vs 3
DENV1
1.9(1.6-2.2)
0.91
0.0017
0.0152
DENV2
1.9(1.3-2.5)
<0.0001
<0.0001
0.37
DENV3
1.3(1-1.6)
0.46
0.17
0.05
DENV4
1(1-1.6)
<0.0001
<0.0001
0.0004
*El primer grupo etario corresponde al grupo de 5 a 9 años, el segundo al grupo de 10 a 25 años y el
tercer grupo a los mayores de 25 años. Prueba de Mann-Whitney.
Considerando que se ha observado en la literatura el incremento de los anticuerpos
posterior a una infección, se estudió la asociación entre los títulos de anticuerpos
neutralizantes y la infección reciente pre-reclutamiento de la cohorte. El título de
anticuerpos neutralizantes contra el DENV-1 fue mayor en los sujetos con infección
44
reciente, como era de esperarse ya que éste serotipo circuló durante el periodo de
muestreo (Figura 15).
3
Figura 15. Logaritmo de anticuerpos neutralizantes contra los cuatro serotipos de
DENV, de acuerdo al tipo de respuesta inmune (PRNT 60%).
1
1.5
2
2.5
*
No Infectados
Infectados
DENV1
DENV3
DENV2
DENV4
* p=0.0005 para DENV1de infectados (n=38) vs DENV1(n=99) no infectados recientemente. Prueba de
Mann-Whitney
El 81.62% (n=111) de la respuesta inmune fue heterotípica y su frecuencia aumentó
conforme la edad. Tabla 9. Porcentaje de respuesta homotípica y heterotípica por
grupo etario.
Grupo etario
Respuesta homotípica (%)
Respuesta heterotípica (%)
5 a 9 años
40
60
10 a 25 años
22.2
77.78
> 25 años
4.35
95.65
45
p <0.001
Lo anterior es un comportamiento típico de comunidades endémicas, dado que la edad
es un reflejo del tiempo en que han estado expuestos los individuos a la circulación de
los diferentes serotipos de DENV (Figura 16).
3
Figura 16. Títulos de anticuerpos neutralizantes por serotipo de DENV con respecto al
tipo de respuesta de los individuos.
2.5
*
**
2
*
1
1.5
*
Respuesta Homotípica
Respuesta Heterotípica
DENV1
DENV3
DENV2
DENV4
*p<0.0001 para R. Homotípica (n=25) vs R. Heterotípica (n=111); ** p<0.005 para R. Homotípica para
DENV3(n=25) vs R. Heterotípica para DENV3 (n=111). Prueba de Mann-Whitney.
46
7. DISCUSIÓN
La seroprevalencia en este estudio fue de 76.58%, similar a la reportada en otras
poblaciones endémicas. Con respecto a la seroprevalencia por grupo etario se puede
comparar con la de República Dominicana (97%) en sujetos mayores de 20 años, así
mismo la seroprevalencia del grupo de 5 a 9 años es del 35.70% menor a la reportada
en Bangkok (53%) en un grupo de 7 a 9 años y con respecto a la reportada en el Sur
de Vietnam (86%) en niños de 13 años. En población mexicana, la seroprevalencia es
semejante a la reportada en Veracruz y Matamoros (Brunkard
JM.et al.
2007.,
Espinoza-Gómez F, et al. 2003).
En general, en los estudios de seroprevalencia se observa un aumento con respecto a
la edad como resultado de un mayor tiempo de exposición a la circulación del DENV en
las regiones endémicas (Espinoza-Gomez et al., 2003; Navarrete-Espinosa J et al.,
2006; Brunkard JM et al., 2007; Weng Yew Y et al. 2009; Braga C et al., 2010;
Sissoko D et al., 2010).
La seroprevalencia encontrada en estas poblaciones de Axochiapan y Tepalcingo así
como la presencia de casos de dengue en los últimos cinco años las ubican como
zonas endémicas de México. En Axochiapan las tasas de incidencia son más altas que
en Tepalcingo, sin embargo, la seroprevalencia en ambas comunidades no fue
estadísticamente diferente, lo que nos habla de una misma tendencia pero con una
magnitud diferente y que podría explicarse por la diferencia en la densidad poblacional
(Axochiapan 0.193 hab/km²; Tepalcingo 0.072 hab/km²) (INEGI, 2010).
La proporción de hombres y mujeres seropositivos para DENV fue similar a lo que se
ha reportado en otros estudios (Braga C, et al., 2010; Teixeria MG, et al., 2002; van
Benthem BH, et al., 2005; Trravassos da R, et al., 2000). Así mismo, ajustando por
edad y sexo la ocupación estuvo asociada a la seropositividad. Los trabajadores
independientes, personas de la tercera edad sin sueldo, discapacitados y jubilados así
como las amas de casa estuvieron asociados a una mayor seroprevalencia comparado
con el grupo de estudiantes. En Singapur ya se había reportado la asociación entre
seroprevalencia y amas de casa (Weng Yew Y et al. 2009). Estas observaciones
47
pueden tener dos explicaciones, una de ellas es la asistencia de los estudiantes a las
instituciones educativas por largos periodos de tiempo, lo que los hace estar menos
expuestos al vector por la ausencia de potenciales criaderos de mosquitos en las
escuelas, algo que no ocurre en los hogares. La otra explicación está bajo el supuesto
de que el mosquito infectado vive cerca del hogar, por lo que en las horas en las que
el mosquito pica coinciden con los horarios escolares, algo que no sucede con las
amas de casa, los jubilados, discapacitados y en cuanto a los empleados estos están
en el mismo lugar en las horas de picadura de mosquito (Iturrino-Monge et al., 2006;
Weng Yew Y et al. 2009).
Con respecto a la frecuencia de los anticuerpos neutralizantes por serotipo, se
observaron diferencias para DENV-2 y DENV-4 entre los grupos etarios, pero no para
DENV-1 y DENV-3. Lo anterior podría explicarse por el hecho de que DENV-1 ha
circulado predominantemente en el área en los últimos 3 años y esta circulación tiende
a homogenizar la frecuencia entre los grupos etarios. Para el caso de DENV-3 se ha
reportado una relación filogenética entre los serotipos 1 y 3, que se refleja en una
relación antigénica entre ellos, de tal forma que la frecuencia de anticuerpos contra
DENV-3 será proporcional a los de DENV-1 (Kyle JL,
et al., 2008; Twiddy SS et al.,
2003; Zanotto C, et al., 1996; Lewis JA, et al., 1993). Estas observaciones coinciden
con estudios realizados in vitro con anticuerpos monoclonales del tipo IgG los cuales
mostraron alta actividad neutralizantes contra DENV-1 y DENV-3, en comparación
contra DENV-2 y DENV-4 (Schieffelin J
et al., 2010). Otros estudios
detectaron
anticuerpos neutralizantes en infecciones primarias y secundarias, en las que se
observó que ante una infección por el serotipo 1 el siguiente serotipo con títulos más
altos de anticuerpos correspondió al serotipo 3 (Graham RR et al.,1999; Kuno G, et
al., 1993; Murphy BR et al.,2011).
La respuesta heterotípica encontrada se asoció positivamente con la edad por la
diversidad de anticuerpos generados ante una constate exposición, además de
desencadenar un incremento de los títulos contra los otros por una respuesta de
reacción cruzada. Lo anterior se pudo observar en el presente estudio, en donde los
48
títulos más altos de anticuerpos neutralizantes para los cuatro serotipos correspondían
a los de la respuesta heterotípica (Murphy BR et al.,2011; Midgley CM, et al., 2010;
Simmons M, et al., 2010).
Por otra parte, la identificación del serotipo que infectó por primera vez a los
participantes del estudio no se puede conocer con certeza. Se podría hacer una
relación entre el serotipo del DENV que circuló los primeros años de vida de los
participantes y la magnitud de los títulos de anticuerpos neutralizantes contra alguno de
los cuatro serotipos de acuerdo a la teoría del pecado original antigénico, que establece
que durante una infección secundaria por DENV los títulos de anticuerpos
neutralizantes del serotipo que infectó la primera vez serán más altos con respecto a
los del serotipo que infecta por segunda ocasión. Halstead y cols. detectaron éste
fenómeno en individuos febriles a los que se les tomó una muestra de suero en la fase
aguda y en la fase convaleciente, los hallazgos mostraron un aumento en los títulos de
anticuerpos del serotipo que en la fase aguda contaba con los títulos más altos
(Halstead SB, et al., 1983). Sin embargo, existen otros estudios en los que los títulos
de anticuerpos más altos correspondieron al serotipo de la infección secundaria (Kuno
G, et al., 1993; Graham RR et al.,1999). Estas posibles discrepancias se pueden
deber a la diferencia de edad entre los individuos, a los intervalos entre la primera y
segunda infección y a la variación de la respuesta inmune de los individuos, por lo que
es difícil identificar con certeza el serotipo que infectó por primera vez si en su
momento no se realizó un aislamiento viral (Kuno G, et al., 1993).
El presente estudio es el primero en reportar la seroprevalencia global y por serotipo
del DENV en una población endémica mexicana con un intervalo de edad amplio. En
vista de los resultados de la vacuna de SANOFI, la protección determinada por
anticuerpos neutralizantes queda en entre dicho, sin embargo, estudios como el que
aquí se presentan son necesarios para establecer la diversidad de las respuestas de
anticuerpos contra DENV en un contexto endémico, lo cual permitirá en primera
instancia, conocer la población susceptible y sentar las bases para realizar estudios
que permitan establecer la relación entre títulos neutralizantes y protección.
49
8. LIMITACIONES
Una de las limitaciones del estudio es el muestreo inicial (posible sesgo de selección),
el cual fue por conveniencia y según las condiciones de la cohorte. Esto no representa
ningún problema dado que la muestra fue representativa de la población (La
distribución etaria fue similar a la reportada por el INEGI) y la seroprevalencia entre el
grupo expuesto y no expuesto de la cohorte no fue estadísticamente diferente. Sin
embargo, se debe de tener en cuenta que los resultados de este estudio sólo son
aplicables a los mayores de 5 años, debido a que el grupo de menores de 5 años, no
se consideró en el muestreo por el ser el quinquenio de edad menos afectado y por
cuestiones éticas establecidas en el proyecto inicial.
Un posible sesgo podría ser el de medición, particularmente el de mala clasificación del
estado inmune del paciente. Para evitar este sesgo se decidió utilizar el estuche de
diagnóstico de Panbio IgG indirecto para la prueba de ELISA, la cual en una evaluación
de seis estuches de diagnóstico para IgG contra DENV resultó ser el de mayor
especificidad (98%) y sensibilidad (100%) (Groen J., et al., 2000).
50
9. CONCLUSIÓN
En el presente estudio se
pudo observar la asociación de la edad, localidad y
ocupación con la seropositividad. La seroprevalencia aumentó con respecto a la edad.
En Axochiapan se reportó un OR más alto para seropositividad. Por otro lado el ser
estudiante fue la variable asociada a protección. Además, la seroprevalencia por
serotipo permitió definir el título de anticuerpos neutralizantes y estudiar la posible
historia de exposición a la circulación del DENV en las localidades de Axochiapan y
Tepalcingo, corroborando que ante exposiciones repetidas los títulos de anticuerpos
aumentan por un efecto de reforzamiento continuo.
Los datos generados en este estudio podrán servir como base para la generación de
modelos matemáticos que permitan identificar el momento de aparición y la magnitud
de un brote en zonas endémicas de México. Además se podrán emplear para la toma
de decisiones en cuanto a la selección del grupo etario blanco para vacunar.
51
10.
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58
ANEXO 1
Consentimientos informados
59
60
61
62
63
64
65
66
ANEXO 2
Formulario de evaluación basal para sujetos a seguir (F2A) de la cohorte.
67
A. DATOS DE IDENTIFICACIÓN:
1. Código:
2. Exposición a CR:
No
Si
3. Código del CR correspondiente :
1
4. Código casa :
2
5. Fecha de encuesta:
3
CR
4
5
Día
Mes
Año
6. Nombre completo:
7. Apellido paterno:
8. Apellido materno:
9. Fecha de Nacimiento:
Día
Mes
Año
10. Estado de nacimiento:
11.
CURP:
12.
Edad:
13.
Sexo:
F
M
14. Nivel de
educación:
Analfabeta
Lee o escribe
Básica
Secundaria
Preparatoria
Técnico
Licenciatura
Post-grado
No evaluado
15. Estudia actualmente:
16. Ocupación:
Si
Estudiante
Desempleado
No
No evaluado
Empleado
Pensionado
Independiente
Otro
Ama de casa
No evaluado
17. ¿Cuál otra ocupación?:
18. Derechohabiencia:
IMSS
ISSSTE
19. Localidad donde está ubicada la vivienda:
SEDENA
Tepalcingo
20. Colonia:
68
SP
Ninguno
Axochiapan
No evaluado
21. Dirección de vivienda (Calle y #):
22. Código postal:
23. Teléfono fijo de la vivienda:
24. Teléfono celular:
25. Otro teléfono:
26. Ha vivido toda su vida en Morelos:
Si
No
27. Desde que año ha vivido en Morelos:
B. ENFERMEDAD FEBRIL EN LOS ÚLTIMOS DOS MESES:
28. Ha presentado fiebre en los últimos dos meses:
29. Consultó al médico por la fiebre:
Si
Si
No
No
NE
NE
30. ¿En cuál localidad está ubicado el centro
médico/consultorio médico?
31. ¿A cuál centro médico?:
32. Fecha aproximada de consulta:
33. Manejo médico:
Día
Ambulatorio
Mes
Año
Hospitalización
C. SINTOMATOLOGÍA EN LOS ÚLTIMOS 15 DÍAS:
34. ¿Se ha sentido enfermo en los últimos 15 días?:
No
Si
NE
¿En los últimos 15 días ha presentado?
35.
36.
37.
38.
Fiebre
Dolor detrás de los ojos o al movilizarlos
Dolor en las articulaciones
Dolor en los músculos
No
No
No
No
69
Si
Si
Si
Si
NE
NE
NE
NE
39.
40.
41.
42.
43.
44.
45.
46.
47.
48.
Dolor de cabeza
Tos
Secreción u obstrucción nasal (mocos)
Dolor o ardor en la garganta espontáneo o al pasar alimentos
Color rojo en la piel (exantema, brote)
Vómito
Deposiciones líquidas (diarrea)
Sangrado espontáneo de encías
Sangrado nasal espontáneo
Otro tipo de sangrado espontáneo
No
No
No
No
No
No
No
No
No
No
Si
Si
Si
Si
Si
Si
Si
Si
Si
Si
NE
NE
NE
NE
NE
NE
NE
NE
NE
NE
49. ¿Cuál otro tipo de sangrado?:
D. CARACTERÍSTICAS DE LA MOVILIDAD
50. ¿Trabaja fuera de su localidad?:
No
Si
No aplica
No evaluado
51. ¿En qué municipio está ubicada la localidad donde trabaja?:
52. ¿Dónde, en cuál localidad?:
53. ¿En cuál colonia está ubicado su lugar de trabajo?:
54. ¿Estudia fuera de su localidad?: No
Si
No evaluado
55. ¿En qué municipio está ubicada la localidad donde estudia?:
56. ¿Dónde, en cuál localidad?:
57. ¿En cuál colonia está ubicado su colegio/escuela?:
58. ¿Cómo se llama el colegio/escuela donde estudia?:
59. ¿En los últimos 15 días ha estado
fuera de su localidad?:
No
Si
No recuerda
No evaluado
60. ¿Dónde?:
61. ¿En un día hábil cuántas horas del día (24 horas) permanece usted en la casa?:
62. ¿En un día feriado (domingo o festivo), cuántas horas del día
permanece usted en la casa?:
63. Cuál es el lugar, diferente de su casa,
donde permanece más tiempo:
Escuela/colegio
64. ¿Cuál otro lugar?:
70
Trabajo
¿Otro?
¿Cuáles son los 5 lugares que usted más frecuenta dentro de su localidad?:
65.
66.
67.
68.
69.
Lugar 1:
Lugar 2:
Lugar 3:
Lugar 4:
Lugar 5:
¿Cuáles son los 5 lugares que usted más frecuenta fuera de su localidad?:
70.
71.
72.
73.
74.
Lugar 1:
Lugar 2:
Lugar 3:
Lugar 4:
Lugar 5:
E. MUESTRAS SANGUÍNEAS RECOLECTADAS
75. Se tomó muestra de sangre venosa:
76. Fecha de toma de muestra de sangre:
Si
No
Día
Mes
77. ¿Por qué no se tomó?:
78. OBSERVACIONES:
71
Año
ANEXO 3
Descripción general del estudio de cohorte: Infección peridomiciliaria como
determinante de la transmisión del dengue.
72
Descripción general del estudio de cohorte: Infección peridomiciliaria como
determinante de la transmisión del dengue.
Los programas de control vectorial, que principalmente se han dirigido al domicilio y
peridomicilio de los casos de dengue, no han tenido el impacto esperado sobre su
transmisión.
Este
proyecto
se
evalúa
el
supuesto
de
que
la
transmisión
endémica/epidémica del dengue se inicia en el peridomicilio de los casos primarios.
El objetivo es estimar la asociación existente entre la exposición a un caso sintomático
de dengue y la incidencia de infección peridomiciliaria.
Metodología: Se realizó una cohorte prospectiva (Tepalcingo y Axochiapan, Morelos)
utilizando el sistema de vigilancia estatal para detección de casos incidentes de
dengue. A los cohabitantes mayores de 5 años y a una muestra de sujetos que viven
50m a la redonda (cohorte expuesta) se les tomó muestras pareadas de sangre para
medir anticuerpos específicos contra dengue con una diferencia de entre 3 y 4 meses
(ELISA IgM e IgG de captura). Además, se seleccionaron sujetos de zonas que no
habían presentado casos incidentes a 200m a la redonda en los dos meses previos al
muestreo (cohorte no expuesta). Se consideró como variable dependiente la infección
incidente sintomática/asintomática, como independiente principal la exposición al caso
confirmado de dengue y como otras variables explicatorias sociodemográficas,
ambientales y socio-culturales.
73
ANEXO 4
PROTOCOLO PRNT
74
PROTOCOLO PRNT
A) Materiales
1) DMEM – high glucose
2) FBS
3) Pen/strep
4) PBS w/o Ca2+, Mg2+
5) Cajas de cultivo de T150 o T175
6) Placas de 24 pozos
7) Metil- ceulosa sigma-aldrich, cat. no. M0512-250G
8) Células VERO
9) Sustrato de peroxidasa
B) Procedimiento para la realización de PRNT
Las células utilizadas son células VERO en medio DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle
Medium, Gibco, Invitrogen Corporation) suplementado con 10 % de suero fetal bovino,
1 % de pen/strep (P/S) y 1% de TBP.
Virus:
Las cepas virales empleadas en el ensayo son las siguientes: DENV-1 (Hawai), DENV2 (16681), DENV-3 (FSP032) y DENV-4 (H-241),
Ensayo de PRNT:
Para la realización de PRNT se requiere inactivar los sueros de los sujetos en un baño
de agua a una temperatura de 56°C durante 30 min.
El suero es diluido en medio DMEM. Las diluciones son 1:20,1:40, 1:80, 1:160, 1:320 y
1:640. Una vez realizadas las diluciones de los sueros inactivados se toman 75 µl de
75
cada dilución del suero y 75 µl del virus y se colocan en una placa de 96 pozos y se
incuban a 37°C por una hora en constante agitación.
Al finalizar la incubación del suero con el virus se toman 100 µl y se colocaran sobre el
cultivo de las células VERO en placas de 24 pozos por una hora a 28°C, 5% CO2. Al
terminar el periodo de incubación se aspirara el sobrenadante y se realizan 2 lavados
con 1 ml de PBS 1X (Solución salina de buffer de fosfatos) para cada pozo. Una vez
realizados los lavados se añade 1ml de metil-celulosa con medio DMEM a cada pozo y
se deja incubando a 28°C, 5% CO2 durante 5 días.
Después de los 5 días se lava con PBS 1X, se le agrega 1ml de la solución metil
alcohol:acetona y se deja a temperatura ambiente (TA) por 30 min. Se descarta la
solución de metil alcohol:acetona y se deja secar al aire libre.
Para el revelado, es necesario hacer lo siguiente:
•
Realizar dos lavados con PBS 1X.
•
Agregar la solución de bloqueo e incubar a TA por 30 min. En seguida se le
agregan 100 µl de anticuerpo de DENV por pozo y se incuba por 1hr.
•
Se realizan 3 lavados con PBS 1X a TA.
•
Se agrega el anticuerpo secundario conjugado a HRP (100 µl por pozo) y se
deja incubar por 1 hr.
•
Se aspira y se lava 3 veces con PBS 1X a TA.
•
Se agregan 100 µl de la solución reveladora del kit de sustrato de peroxidasa
(ENZO biochem, cat no 43825) y se incuba en la obscuridad durante 10 a 15 min.
•
Finalmente se cuentan las unidades formadoras de placas.
La determinación de PRNT60% se determina considerando la dilución en la cual el
número de placas es menor al 60% de las placas contadas en el control. Para la
realización del control, se sigue con el mismo procedimiento, excepto que no se incuba
con suero, únicamente se incuba el virus.
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