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INSTITUTO NACIONAL DE SALUD PÚBLICA CENTRO DE INVESTIGACIÓN SOBRE ENFERMEDADES INFECCIOSAS “Seroprevalencia de anticuerpos neutralizantes contra el virus Dengue en dos poblaciones del Estado de Morelos, México” TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO ACADÉMICO DE MAESTRA EN CIENCIAS DE LA SALUD, CON ÁREA DE CONCENTRACIÓN EN ENFERMEDADES INFECCIOSAS PRESENTA: Q.F.B. Irma Yvonne Amaya Larios DIRECTOR DE TESIS: DR. JOSÉ RAMOS CASTAÑEDA (INSP) ASESOR INTERNO: M EN C. RUTH ARALÍ MARTÍNEZ VEGA (INSP) ASESOR EXTERNO: DRA. MARÍA ALBA LOROÑO PINO. Cuernavaca, Morelos. Febrero 2013 0 INSTITUTO NACIONAL DE SALUD PÚBLICA CENTRO DE INVESTIGACIÓN SOBRE ENFERMEDADES INFECCIOSAS T e s i s para obtener el grado de Maestra en Ciencias de la Salud, con área de concentración en Enfermedades Infecciosas “Seroprevalencia de anticuerpos neutralizantes contra el virus Dengue en dos poblaciones del Estado de Morelos, México” PRESENTA: Q.F.B. Irma Yvonne Amaya Larios Director de Tesis: Dr. José Ramos Castañeda (INSP) Asesor Interno: M En C. Ruth Aralí Martínez Vega (INSP) Asesor Externo: Dra. María Alba Loroño Pino. Cuernavaca, Morelos, 21 de Febrero del 2013 1 “El agradecimiento es la memoria del corazón" Lao-tsé Y en la memoria de mi corazón, se encuentran todos ustedes. Gracias familia por acompañarme en cada una de mis metas, por cada palabra de aliento, por cada consejo y sobre todo por ser un gran ejemplo de sabiduría y perseverancia. Dr. José Ramos le agradezco la oportunidad que me ha brindado así como su experiencia y sabiduría y sobre todo por ser mi mentor. Ruth te agradezco todo tú apoyo incondicional, gracias por ser de esa clase de personas que da lo mejor si y siempre está dispuesta a ayudar y a compartir su conocimiento. Ambos son un gran ejemplo a seguir, los admiro y respecto. A la Mtra. Lilia E. Fragoso, gracias por enseñarme éste camino de la salud pública y gracias por ser una gran amiga, así como mi guía e inspiración. A mis amigos y compañeros por su apoyo constante y por cada sueño compartido y meta que hemos logrado juntos. Y gracias a aquella persona tan especial que forma parte de mi equilibrio personal y profesional, gracias por recordarme el significado de la generosidad y gracias por transmitirme esa serenidad que me reconfortó cuando más lo necesite. A todos ustedes muchas gracias porque siempre han estado conmigo, en las buenas y en las malas, gracias por darme motivos para seguir luchando, gracias por ser mi inspiración y ejemplo a seguir, porque todos ustedes han dejado algo bueno en mi vida y les estaré eternamente agradecida. 2 "La experiencia más maravillosa que podemos tener es el misterio; es la emoción fundamental que permanece en la base del arte y la ciencia verdaderos." Albert Einstein 3 ÍNDICE 1. Resumen 6 2. Introducción 7 3. Antecedentes 2.1 Agente etiológico 8 2.2 Cuadro clínico 12 2.3 Participación del sistema inmune del hospedero en una infección por DENV 14 2.4 Diagnóstico del dengue 15 2.5 Vacunación contra DENV 19 2.6 Epidemiología 19 2.6.1 Seroprevalencia contra DENV 24 4. Justificación 28 5. Objetivos 29 6. Metodología 5.1 Diseño del estudio 30 5.2 Población de estudio 30 5.3 Criterios de inclusión 31 5.4 Criterios de exclusión 31 5.5 Consideraciones para la clasificación de grupos etarios 31 5.6 Determinación del tamaño de la muestra 33 5.7 Variables 34 5.8 Ensayo de laboratorio 5.8.1 Prueba indirecta de ELISA para Ig G. 4 34 5.8.2 PRNT 34 5.9 Análisis estadístico 35 5.10 Fuente de financiamiento 36 6. Resultados 37 7. Discusión 47 8. Limitaciones 50 9. Conclusión 51 10. Referencias 52 Anexo 1 59 Anexo 2 67 Anexo 3 72 Anexo 4 74 5 RESUMEN El dengue es una enfermedad causada por los virus dengue, los cuales son transmitidos al hombre por varias especies de mosquitos vectores. El dengue es considerado como la enfermedad arboviral más problemática en salud pública a nivel mundial, debido a su alta incidencia en regiones tropicales y subtropicales del planeta. La identificación de la población contribuye en la identificación de uno de los factores que influye en la transmisión. El objetivo de este proyecto fue determinar la seroprevalencia de anticuerpos neutralizantes para cada uno de los 4 serotipos de virus dengue (DENV) en las poblaciones de Axochiapan y Tepalcingo del Estado de Morelos, México. Se realizó un estudio de corte transversal, anidado en la cohorte obtenida durante el estudio de investigación denominado: “Infección peridomiciliaria como determinante de la transmisión del dengue”. Fueron considerados para el estudio 929 sujetos. Los sueros fueron analizados mediante la técnica de ELISA IgG-Indirecta, de los sueros positivos para IgG se seleccionaron 137 para determinación de títulos de anticuerpos neutralizantes (PRNT60%). La seroprevalencia global en el estudio contra DENV fue 76.6%, y la seroprevalencia a partir de los 30 años de edad fue mayor al 90% (p<0.0001). En el primer grupo etario (5 a 9 años) la seroprevalencia específica por serotipo de 82.5%, 45.0%, 65.0% y 2.5% para DENV-1, DENV-2, DENV-3 y DENV-4, respectivamente; en el grupo de 10 a 25 años y en el de mayores de 25 años la seroprevalencia para los cuatro serotipos fue por encima del 60%, excepto en el grupo de 10 a 25 años para DENV-4 en el que la prevalencia fue de 42.9%. Se observó una asociación significativa de la seropositividad con la edad, localidad y ocupación (p<0.05). Los resultados obtenidos ayudan a conocer a la población susceptible y sentar las bases para realizar estudios que permitirán establecer la relación entre títulos de anticuerpos neutralizantes y protección. 6 1. INTRODUCCIÓN El dengue es una enfermedad viral considerada como un problema de salud pública a nivel mundial. La infección por el virus Dengue (DENV) puede cursar como asintomática o puede manifestarse con un cuadro clínico amplio en el que se incluyen las formas graves y no graves de la enfermedad (Kyle JL, et al., 2008). El DENV se transmite principalmente por mosquitos del género Aedes siendo las especies aegypti y albopictus las más importantes a nivel mundial. Su transmisión depende de la inmunidad de la población (Guzman MG et al., 2002), del aumento de las vías de comunicación y del cambio climático (Hales et al., 2002; Hopp et al., 2003; Patz et al.,2005), así como de la evolución del virus y de la falta de una vacuna eficaz (Khoa T.D. 2011). Las medidas de control y prevención del dengue están enfocadas en la reducción de la densidad vectorial. Desafortunadamente, con éstas medidas, la incidencia del dengue no ha disminuido, por lo que es necesario explorar otros factores que contribuyen en el control de su transmisión, como lo es la inmunidad de la población humana. Los estudios de seroprevalencia identifican a la población susceptible y permiten alimentar a modelos matemáticos para la predicción de brotes y con ello poder focalizar las medidas de control del vector. Por otra parte estos estudios permiten definir el grupo blanco a vacunar, una vez que la vacuna se introduzca al mercado. Por lo anterior el objetivo de éste estudio es determinar la seroprevalencia contra los cuatro serotipos del DENV en un grupo de sujetos mayores de 5 años, residentes en las poblaciones de Axochiapan y Tepalcingo, del Estado de Morelos. 7 2. ANTECEDENTES Las primeras epidemias documentadas de dengue ocurrieron entre 1779-1780; sin embargo, la etiología se definió hasta hace aproximadamente un siglo y no fue hasta la segunda guerra mundial en el que los japoneses y americanos pudieron aislar el DENV e identificar los cuatro serotipos (DENV-1 a DENV-4) (Kyle JL, et al., 2008). 2.1 Agente etiológico El DENV es un arbovirus que pertenece a la familia Flaviviridae del género flavivirus. A diferencia de otros flavivirus, el DENV solo tiene como hospedero al humano y como reservorio a otros primates (Weaver et al., 2009). El genoma del DENV es una molécula de ácido ribonucleico (ARN) de cadena simple y de sentido positivo de aproximadamente 11 kilobases de longitud. Su genoma viral se traduce como un polipéptido de 3,391 aminoácidos que es procesado por el complejo de proteasas virales, proteínas no estructurales NS2b/NS3 y proteasas celulares, generando tres proteínas estructurales (proteína C, pre M/M y E) y siete proteínas no estructurales (NS) (NS1, NS2a/b, NS3, NS4a/b, NS5), algunas de las cuales tienen la habilidad de modificar la membrana del retículo endoplásmico favoreciendo la síntesis de nuevos productos virales (Weaver et al., 2009) (Morrison J et al, 2012). Las proteínas estructurales integran al virión y las proteínas NS están involucradas en la replicación del virus una vez infectada la célula (Rothman A, 2011 Chambers, T.J., et al, 1990). La glicoproteína E es el principal componente de la superficie del virión, conformada por los dominios I, II y III (Rothman A., 2011) previamente definidos por Heinz y colaboradores como dominios antigénicos C, A y B respectivamente (Roehrig, 2003; Roehrig et al., 1998). Una serie de análisis bioquímicos de dichos dominios permitieron identificar los aminoácidos que los conforman. El dominio A esta conformado por los aminoácidos 51 a 135 y 195 a 284, entre el cual está localizado el dominio C que abarca los aminoácidos del 1 al 50 y del 136 al 194 y finalmente el dominio B que 8 incluye a los aminoácidos 300 a 395 (Roehrig et al 2003). La función del dominio III es de unión al receptor, el dominio II está involucrado en la dimerización de la glicoproteína E y su fusión con la membrana endocítica y el dominio I es considerado como la región bisagra. Los anticuerpos dirigidos contra la gran mayoría de los epítopos localizados en el dominio III son serotipo específicos y aquellos que están dirigidos contra el dominio II presentan diferentes grados de reactividad cruzada entre los cuatro serotipos de DENV y con algunos otros flavivirus (Rothman A, 2011). Utilizando anticuerpos monoclonales (mAbs) fueron localizados los epitopes de la proteína E que se muestran en la figura 1(Lin H-E et al. 2012). Figura 1. Localización de epítopos de la glicoproteína E reconocidos por mAbs. Los epítopos de mAbs contra DENV1 (A) se representan con el color azul marino y DENV2 (B) están representados con el color morado. Los epítopos de color magenta son aquellos que comparten DENV2 y DENV3. Imagen tomada de: Lin H-E, Tsai W-Y, Liu I-J, Li P-C, Liao M-Y, et al. (2012) Analysis of Epitopes on Dengue Virus Envelope Protein Recognized by Monoclonal Antibodies and Polyclonal Human Sera by a High Throughput Assay. PLoS Negl Trop Dis 6(1): e1447. doi:10.1371/journal.pntd. 9 La proteína prM forma un heterodímero con la proteína E en el ensamble inicial del virión, posteriormente este precursor sufre una proteólisis por acción de una proteasa del sistema trans del aparato de Golgi parecida a una furina. Con la eliminación del Cterminal no-glicosilado, la proteína prM da origen a la proteína M que se asocia a la envoltura lipídica del virión maduro (Rothman A, 2011). La proteína C es rica en lisinas y argininas lo que la hace de carácter básico favoreciendo su interacción con el ARN viral para la formación de la nucleocápside viral (Acosta-Bas C et al, 2005). La NS1 es una glicoproteína específica producida en células infectadas por DENV, pero que no forma parte de la estructura del virión; es sintetizada en el retículo endoplásmico como monómero y posteriormente forma un homodímero que puede permanecer en la superficie de las células infectadas o puede ser secretado al medio extracelular como un hexámero (Acosta-Bas C et al, 2005; Rothman A, 2011). La secuenciación completa del ácido nucleico del DENV confirmó la homología de los 4 serotipos, así como la identificación de sitios genéticamente conservados, lo que permitió la clasificación de grupos genéticamente distintos dentro de cada serotipo, denominados genotipos en los que se incluyen a las cepas endémicas/epidémicas y selváticas, mismos que se organizaron de acuerdo a su diversidad genética y distribución geográfica (Rico-Hesse, 1990; Costa RL et al, 2012; Keyle JL et al 2008; Wever S et al 2009) (Figura 2). Los análisis filogénicos sugieren que cada serotipo tiene un antecesor selvático de hace 1115 años. Otras observaciones en el análisis demostraron que el serotipo más divergente es DENV-4, seguido de DENV-2, 1 y 3 (Keyle JL et al 2008). . 10 Figura 2. Árbol filogenético de los cuatro serotipos de DENV. El nombre de las cepas corresponde a la abreviatura del sitio donde se colectaron por primera vez/nombre de la cepa/ año de colecta. Imagen tomada de: Weaver SC, Vasilakis N. Molecular evolution of dengue viruses: Contributions of phylogenetics to understanding the history and epidemiology of the preeminent arboviral disease. Infection, Genetics and Evolution, 2009; 9(4): 523-40. 11 2.2 Cuadro clínico La frecuencia de infecciones de dengue se caracteriza por ser de tipo iceberg, aproximadamente el 10% de las infecciones son reportadas a las autoridades de salud y el 50% - 90% de todas las infecciones son asintomáticas (Kyle JL, et al.,2008; Balmaseda A, et al 2006; Simmons CP et al 2012). En la infección por cualquiera de los cuatro serotipos del DENV el espectro clínico es amplio considerando que sus manifestaciones pueden ser desde no graves hasta graves (Whitehorn J et al 2011; Kyle JL et al 2008; Simmons PC et al 2012) y la mayoría de los pacientes se recuperan después de un cuadro clínico benigno. El periodo de incubación del virus es de 4 a 7 días, posterior a este tiempo se presentan signos y síntomas inespecíficos del dengue, entre los más comunes son la fiebre y el malestar general; los signos y síntomas específicos son el dolor retro-orbital, dolor muscular, trombocitopenia, sangrado espontáneo, leucopenia y elevación de las transaminasas hepáticas (Rothman A,2011; Simmons PC et al 2012). La Organización Mundial de la Salud (OMS) en 1997 clasificó en tres categorías las infecciones sintomáticas: fiebre indiferenciada, fiebre por dengue y fiebre hemorrágica por dengue, está última dividida en cuatro grados de severidad (I-IV). En 2009 la OMS sugirió clasificar a los casos de dengue de acuerdo al grado de severidad en dengue sin signos de alarma, dengue con signos de alarma y dengue severo, como se muestra en la figura 3 (WHO, 2009) (Figura 3). Criterios para el dengue con signos de alarma y sin ellos Criterios para dengue grave Dengue probable Extravasación Signos de alarma* 12 grave de Vivir en áreas endémicas de dengue/viajar a ellas. Fiebre y dos o más de los siguientes criterios: Náuseas, vómito Erupción cutánea Molestias y dolores Prueba de torniquete positiva Leucopenia Cualquier signo de alarma Dengue conformado por laboratorio (importante cuando no hay signos de extravasación de plasma). Dolor abdominal intenso o abdomen doloroso a la palpación Vómitos persistentes Acumulación clínica de líquidos Sangrado de mucosas Letargia, agitación Hepatomegalia > 2 cm Laboratorio: aumento del hematocrito concurrente con rápida disminución del número de plaquetas. * Requiere estricta observación e intervención médica. plasma que conduce a: Choque (SCD) Acumulación de líquidos con insuficiencia respiratoria Sangrado intenso según evaluación del médico tratante Compromiso orgánico grave: Hígado: AST o ALT 1000 Sistema nervioso central: Alteración de la conciencia Corazón y otros órganos. Figura 3. Clasificación sugerida por la OMS en el 2009 para los casos sintomáticos de dengue. Imagen modificada de: WHO. Dengue: guías para el diagnóstico, tratamiento, prevención y control. [Internet]. Nueva Edición. Geneva: WHO [citado 2012 Dic 6]. Disponible en: http://www2.paho.org/hq/dmdocuments/2011/ndeng31570.pdf Actualmente en México los Sistemas de Vigilancia Epidemiológica de Dengue continúan reportando los casos de dengue como: fiebre por dengue y fiebre hemorrágica por dengue (SINAVE/DGE/SALUD/Sistema Especial de Vigilancia Epidemiológica de Dengue (citado Diciembre 7, 2012). Disponible en: http://www.dgepi.salud.gob.mx/denguepano/PANORAMAS_2012/Pano_dengue_sem48 _2012.pdf.) 2.3 Participación del sistema inmune del hospedero en una infección por DENV Ante una infección por el DENV, el sistema inmune del hospedero responde de acuerdo a la presencia o ausencia de anticuerpos contra el virus (Rothman A., 2011; Wahala, et al., 2010). En una infección primaria, una vez iniciada la fiebre comienza la producción de las Inmunoglobulinas M (IgM) las cuales son detectables a los 5-8 días después de la fiebre alcanzando su máximo nivel a las dos semanas (Sa-Ngasang et 13 al., 2006; Díaz Quijano F. A. et al., 2006); en cambio la inmunoglobulina G (IgG) se detecta hasta el día 14 y puede mantenerse en circulación por años. En infecciones secundarias los anticuerpos IgM se detectan antes de los 7 días y se observa un aumento de los anticuerpos IgG en la fase aguda de la enfermedad (Vázquez-Pichardo M et al., 2011). Otro tipo de anticuerpos generados durante una infección por el DENV, son los dirigidos contra la proteína NS1 desencadenando una lisis mediada por complemento de las células infectadas (Rothman A., 2011). En algunos casos la inmunidad inducida durante la infección por alguno de los cuatro serotipos protege al individuo de por vida contra el serotipo infectante (inmunidad homotípica) y le confiere protección cruzada de corta duración (6 a 9 meses) contra los otros serotipos (inmunidad heterotípica) (Sánchez-Burgos G, et al. 2008; Rothman A., 2011). Algunos estudios sugieren que la inmunidad heterotípica neutralizante es el factor más importante que explica el patrón secular de la transmisión del dengue. Adicionalmente, la respuesta inmunitaria heterotípica no neutralizante se ha relacionado con una mayor incidencia de casos graves (Sánchez-Burgos G, et al. 2008; Wearing HJ, 2006) De acuerdo a estudios reportados por Wearing y Adams (Wearing et al.,2006, Adams, 2006), observan una sincronía en la aparición del DENV2 y DENV3 lo que no ocurre con DENV4, quizá porque DENV2 y DENV3 podrían estar suprimiendo la transmisión de DENV4 (Weaver S.et al., 2009). La respuesta inmune generada por el hospedero ante una infección secundaria por el DENV así como el tiempo entre las infecciones, la edad, el estado nutricional y el genotipo viral, se han considerado como factor de riesgo para el desarrollo de dengue hemorrágico (DH) y síndrome de choque por dengue (SCD) (Kyle JL et al., 2008, Raghwani J et al. 2011). Estudios epidemiológicos realizados en Tailandia, Indonesia y Cuba han reportado una asociación entre una infección secundaria y el desarrollo de las formas graves de dengue (DH/SDC), dado que se ha observado que la mayoría de los casos de DH/SCD se presentan durante una infección secundaría por un serotipo 14 diferente al de la infección primaria, o en niños recién nacidos de madres con inmunidad preexistente de dengue (Kyle JL, et al.,2008, Laughlin CA, et al.,2012). Existen dos teorías que intentan explicar este fenómeno; la primera teoría establece que en infecciones secundarias la entrada del virus a la célula se ve favorecida por un aumento en la expresión de receptores fijadores de Complemento (Fc), este fenómeno recibe el nombre de “Antobody-dependent enhancement of infection” (ADE), mismo que sólo se ha observado en ensayos realizados en ratones y monos (Goncalvez AP et al., 2007) y no se ha podido comprobar en humanos (Rothman A., 2011). En éstos ensayos las mutaciones realizadas en la región Fc del anticuerpo, eliminan el ADE en el ratón por lo que se considera que el receptor para Fc localizado en la membrana de la célula hospedera facilita la entrada del virión a la célula (Laughlin CA, et al.,2012). La otra teoría de la inmunopatogénesis de dengue se centra en la respuesta de las células T de memoria que se activan en infecciones heterólogas secundarias produciendo citocinas que alteran la permeabilidad vascular e incrementan la inflamación (Rothman A., 2011). 2.4 Diagnóstico del dengue La elección del método de laboratorio para el diagnóstico del dengue dependerá del día en que se tomó la muestra después de iniciados los síntomas (Figura 4). A los 4 o 5 días a partir de la aparición de los síntomas se puede realizar el diagnóstico en suero, plasma y células sanguíneas; los métodos empleados son: reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) para la detección del ácido nucleico, aislamiento del virus usando células de mosquito C6/36 ó células Vero y la detección serológica del antígeno NS1 (Métodos directos). A excepción de la detección de NS1, las demás son técnicas costosas que requieren personal especializado y que generalmente se emplean con fines epidemiológicos (WHO, 2009; Peeling RW et al, 2010). Posterior a los 5 días de iniciados los síntomas, el método para el diagnóstico deberá ser serológico para la detección de IgM/IgG contra el DENV (Métodos indirectos) (WHO, 2009; Peeling RW et al, 2010). Las técnicas empleadas son: inhibición de la hemaglutinación y el inmunoensayo enzimático (ELISA), ambos permiten detectar 15 anticuerpos totales contra los cuatro serotipos de DENV y clasificar las infecciones en primarias y secundarias. Figura 4. El gráfico muestra el tipo de pruebas que se pueden realizar para el diagnóstico confirmatorio de dengue una vez iniciado los síntomas. El día 0 (cero) corresponde al inicio de los síntomas. Imagen tomada de: WHO. Dengue: guías para el diagnóstico, tratamiento, prevención y control. [Internet]. Nueva Edición. Geneva: WHO [citado Dic 6, 2012]. Disponible en: http://www2.paho.org/hq/dmdocuments/2011/ndeng31570.pdf En México la Secretaria de Salud utiliza un algoritmo para el diagnóstico para el diagnóstico de una infección por el DENV en vigilancia epidemiológica de rutina. La técnica utilizada para la confirmación del caso sospechoso de dengue es la detección del antigeno NS1 por ELISA en los primeros 5 días de iniciada la fiebre, o la detección de IgM e IgG si NS1 es negativa. La identificacón del serotipo se realiza en el 10% de los casos confirmados de fiebre por dengue por medio de una RT-PCR o de un cultivo celular (Figura 5). 16 Figura 5. Propuesta de algoritmo para el diagnóstico de dengue en infecciones primarias o secundarias en vigilancia epidemiológica de rutina. Imagen proporcionada por la Secretaria de Salud, 2012. El buen funcionamiento de los sistemas de vigilancia epidemiológica depende de la capacidad de diagnóstico del laboratorio en la detección del inicio de un brote. En los estudios epidemiológicos los principales métodos de laboratorio utilizados son: RT-PCR para identificación de serotipo viral y ELISA para la detección de IgG. La sensibilidad y especificidad de los estuches de diagnóstico utilizados en la prueba de ELISA-Indirecta dependerán de la compañía que los fabrica. Groen y cols. En el 2000 publicaron la sensibilidad y especificidad de seis estuches de diagnóstico para la identificación cualitativa de anticuerpos IgG contra el DENV: los resultados mostraron que el estuche fabricado por la compañía Pan Bio cuenta con los niveles más altos de sensibilidad y especificidad con respecto a los otros estuches de diagnóstico analizados (Tabla 1). 17 Tabla 1. Sensibilidad y especificidad de seis estuches de diagnóstico para IgG indirecta (Groen et al.,2000). Compañía Antígeno Principio Duración del ensayo Sensibilidad Especificidad (%) (%) ᵏ MRL Diagnostics DENV 1, 2, 3, 4 Indirecta 120 min 100 88 0.830 PanBio DENV 1, 2, 3, 4 Indirecta 60 min 100 98 0.917 Progen Biotechnik DENV 2 Indirecta 90 min 77 86 0.785 INDX EIA DENV 2 Indirecta 45 min 97 98 0.913 DEN 1, 2, 3, 4 Indirecta 210 min 85 95 0.847 Genelabs Diagnostics En los estudios retrospectivos en los que se trata de identificar los serotipos que han circulado en una determinada población, se utiliza la prueba de neutralización de reducción en placa (PRNT) considerada por la OMS como el gold estándar para dengue, ya que detecta títulos de anticuerpos neutralizantes específicos por serotipo (Putnak JR et al., 2008; Roehrig JT, 2003; Russell PK, 1967; Thomas SJ et al.,2009). Esta prueba es realizada por muchos laboratorios alrededor del mundo desde 1967 cuando fue adaptada por Russell y cols.; desde entonces, ha sido modificada por cada laboratorio, lo que representa una desventaja cuando se desea comparar resultados entre laboratorios, ya que dependerán los resultados de las líneas celulares utilizadas así como de las cepas virales empleadas (Rainwater Lovett et al. 2012). Por lo anterior, la OMS e investigadores se han dado a la tarea de estandarizar la prueba (WHO, 2009). 2.5 Vacunación contra DENV Las iniciativas en el desarrollo de vacunas contra el dengue se han enfocado en modelos de vacunas con virus atenuados, inactivados y de subunidades. La proteína E se ha empleado como antígeno objetivo en vacunas atenuadas y en vacunas de sub18 unidades contra el dengue. En individuos inmunizados con vacunas vivas atenuadas contra el DENV, los títulos y especificidad de los anticuerpos y células T generadas son comparables con los producidos durante una infección natural. Rothman en el 2011 pone a consideración la administración de una vacuna tetravalente por la posibilidad de que se presenten complicaciones como ADE en individuos vacunados en los que no se logre una respuesta inmune protectora contra los cuatro serotipos (Rothman A., 2011). Sin embargo en los primeros resultados de eficacia del modelo de vacuna tetravalente desarrollado por Sanofi Pasteur en Tailandia en el grupo etario vacunado (4 a 11 años de edad) hasta el momento no se ha descrito que se haya presentado el fenómeno ADE (Zambrano-Mora, BM, 2010). Por otro parte, la eficacia reportada fue de 30.2% (IC-95% 13.4-56.6) después de aplicar la tercera dosis, la cual cambia con respecto al serotipo, dado que la eficacia para los serotipos DENV-1, DENV-3 y DENV-4 está por encima del 50% mientras que para DENV-2 la eficacia a los 28 días después de la aplicación de la tercera dosis es de 9.2% (IC-95% -75.0-51.3). Por el momento estos datos aún no se pueden considerar como concluyentes ya que el comportamiento epidemiológico es diferente en Tailandia con respecto al de Latinoamérica y quizá la eficacia de la vacuna podría también ser diferente (Sabchareon A et al. 2012). 2.6 Epidemiología La incidencia del dengue en el mundo en los últimos 50 años se ha incrementado 30 veces y se estima que aproximadamente 3 billones de personas que viven en regiones tropicales y subtropicales están en riesgo de infectarse (Kyle JL, et al., 2008; WHO, 2009). Al año se reportan 34 millones de casos febriles y más de 20,000 muertes asociadas a la enfermedad (Panhuis W G et al., 2010). Del 10% al 50% de las infecciones por este virus son sintomáticas y el resto asintomáticas, sin embargo sólo una fracción de las sintomáticas son reportadas, lo que hace pensar que la incidencia de los casos está subestimada (Kyle JL et al., 2008). Las tasas de mortalidad varía del 1% al 10% y depende en gran medida de la atención oportuna que se le dé al enfermo (Kohoa T D et al., 2011) (Figura 6). 19 Figura 6. Lugares en el mundo con mayor transmisión de DENV. Imagen tomada de: Simmons CP, Farrar JJ, Vinh Chau N, Wills B. Dengue. N ENGL L MED 2012;366:1423-32. En México, se cuenta con el reporte de casos de dengue desde 1978, en el cual se ha observado que los años en los que se presentan un mayor número de casos coinciden con la introducción de un nuevo serotipo (Figura 7). 20 Figura 7. Casos de dengue en México, 1978-2012 (SINAVE/DGE/SALUD/Sistema Especial de Vigilancia Epidemiológica de Dengue. Cierre preliminar, 2012). Los estados con mayor incidencia en los últimos 7 años corresponden a Campeche, Quinta Roo, Yucatán, Colima y Morelos, mientras que en Aguascalientes, Baja California, Chihuahua, México, Distrito Federal y Tlaxcala (Figuran 8). 21 ESTADO 2005 AGUASCALIENTES BAJA CALIFORNIA BAJA CALIFORNIA SUR CAMPECHE COAHUILA COLIMA CHIAPAS CHIHUAHUA DISTRITO FEDERAL DURANGO GUANAJUATO GUERRERO HIDALGO JALISCO MÉXICO MICHOACÁN MORELOS NAYARIT NUEVO LEÓN OAXACA PUEBLA QUERÉTARO QUINTANA ROO SAN LUIS POTOSI SINALOA SONORA TABASCO TAMAULIPAS TLAXCALA VERACRUZ YUCATÁN ZACATECAS TOTAL Figura 8. Incidencia por INCIDENCIA POR ENTIDAD FEDERATIVA (por 100,000 hab) 2006 2007 2008 2009 0 0 0 0 0.39 14.62 2010 2011 0 0 0.17 0.28 0.26 0.60 40.25 95.51 349.63 11.81 5.85 100.00 147.30 122.31 0 0 0 0 21.96 7.07 11.72 28.17 4.93 9.12 32.52 1.11 20.96 3.31 0.19 75.12 283.60 162.10 413.17 1252.40 219.05 63.47 49.37 16.78 66.32 35.85 97.69 24.86 18.18 0.00 0.00 0.03 0.09 0.00 0.06 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 7.97 21.58 4.21 19.41 1.16 0.77 0.00 0.00 12.77 0.28 3.91 0.00 0.00 45.39 145.06 145.73 145.09 209.81 242.91 30.50 29.92 9.23 1.88 25.24 56.62 1.97 2.21 1.44 27.15 13.81 20.60 799.62 26.26 3.27 0.00 0.05 0.31 0.40 1.81 0.28 0.04 0.92 10.74 58.10 66.11 122.22 44.72 15.10 17.71 173.42 82.20 488.50 75.11 105.01 56.48 48.72 61.06 114.39 36.09 1117.75 190.86 6.47 20.39 4.18 88.35 19.51 15.15 54.09 15.98 33.77 92.68 156.37 39.97 68.60 126.36 33.02 0.92 4.40 5.69 10.78 10.56 22.03 3.02 0.00 6.75 0.48 0.18 2.09 0.06 4.27 77.39 188.01 362.19 36.78 63.39 196.50 200.44 7.68 11.60 10.60 11.36 136.14 12.94 3.31 25.64 16.94 22.89 50.30 102.02 45.75 4.21 3.15 3.53 0.61 44.22 19.96 170.18 3.72 19.24 9.07 88.42 47.21 308.65 25.33 18.84 232.61 6.50 62.23 48.69 45.10 30.52 3.15 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 63.00 118.21 210.61 56.86 177.00 18.12 27.77 8.87 33.88 99.40 37.99 241.37 154.69 380.26 0.00 0.00 11.28 0.14 0.00 0.00 0.00 21.06 28.45 49.50 33.37 122.77 39.94 18.75 entidad federativa por cada 100,000 habitantes, 2005-2011 (SINAVE/DGE/SALUD/Sistema Especial de Vigilancia Epidemiológica de Dengue. Cierre preliminar, 2012). En las localidades de Axochiapan y Tepalcingo del Estado de Morelos durante el 2010 se registraron 144 casos de FD con una tasa de 528.03 casos/100,000 habitantes, cifras similares a las reportadas en el 2008 (Tabla 2). 22 Tabla 2. Tasas de incidencia de dengue por 100, 000 habitantes (2006-2010) en las localidades de Axochiapan y Tepalcingo (Fuente: Panorama epidemiológico de fiebre y fiebre hemorrágica por dengue en entidades federativas, Secretaria de Salud. 2011). 2006 2007 2008 2009 2010 Localidad Casos Tasa Casos Tasa Casos Tasa Casos Tasa Casos Tasa Axochiapan 148 910.5 13 80.0 22 135.3 92 560.0 103 633.7 Tepalcingo 48 435.7 97 880.5 7 63.5 51 463.0 41 372.2 Total 196 718.7 110 403.4 29 106.3 143 524.4 144 528.0 Al comprar las tasas registradas en Axochiapan y Tepalcingo con la media nacional y con las reportadas en el Estado de Morelos, se observan que en general están por encima de la media nacional y estatal (Tabla 3). Tabla 3. Tasas de incidencia de dengue por 100, 000 habitantes (2006-2010), a nivel nacional, estatal y local. (Fuente: Dirección General de Epidemiología). Año Nacional Morelos Axochiapan y Tepalcingo 2006 22.94 139.7 718.7 2007 40.6 67.7 403.4 2008 26.3 357.6 106.3 2009 112.2 64.1 524.4 2010 33.9 88.1 528.0 Con respecto a la circulación de los serotipos reportados en México desde 1984 se ha observado una relación entre la aparición de picos epidémicos y la presencia de un serotipo predominante (DENV-1, 2 ó 3). Actualmente los serotipos DENV-1, DENV-2 y DENV-3 se han reportado en Jalisco y Quintana Roo; DENV-1, DENV-2 y DENV-4 en 23 Michoacán, Guerrero, Tabasco, Veracruz y Yucatán. En Chiapas se ha reportado la circulación de los cuatro serotipos (Panorama epidemiológico de fiebre y fiebre hemorrágica por dengue en entidades federativas, Secretaria de Salud). 2.6.1. Seroprevalencia contra DENV La seroprevalencia determinada en algunas regiones de América entre el 2000 y el 2008 nos puede dar un panorama general de la población que ya ha estado expuesta a una infección por DENV en algún momento de su vida, en éstas regiones de América. En México los estudios realizados muestran una seroprevalencia entre el 9.1% para Tabasco en población de universitarios (población cerrada) de entre 18 y 39 años de edad y del 79.6 % en Veracruz para todas las edades, ubicando a ésta última como una población hiperendémica (Navarrete-Espinosa J, et al .2006). Colima registró una seroprevalencia del 32.8%, sin embargo está seroprevalencia parece estar subestimada ya que la inmunocromatografía usada en este estudio tiene baja sensibilidad para IgG, pero una especificidad del 98% comparada con la prueba de ELISA. Los hallazgos en éste estudio sugieren que en la ciudad de Colima el dengue es endémico manteniendo la transmisión continua para eventuales brotes epidémicos que se pueden presentar cuando la densidad vectorial alcanzan niveles elevados o cuando la cantidad de población susceptible aumenta (Espinoza-Gómez F, 2003) (Tabla 4). 24 et al. Tabla 4. Prevalencia de anticuerpos IgG contra DENV en varios países del Continente Americano. País y año Tamaño de la muestra Método de laboratorio Edad Seroprevalencia Referencias 36.9% Iturrino-Monge R, et al. 2006. 91% Balmaseda A, et al , 2006. 40% Brunkard JM.et al. 2007. 78% Brunkard JM.et al. 2007. 79.6% NavarreteEspinosa J, et al .2006. 9.1% Sánchez-Burgos G, et al. 2008. (años) Costa Rica (2002-2003) 206 ELISA (Pan Bio test ®) Nicaragua (2001-2002) 398 Inhibición ELISA EUA (Brownsville,2005) 600 ELISA Ig G Indirecta (Pan Bio test ®) México ) (Matamoros,2005) 600 ELISA Ig G Indirecta (Pan Bio test ®) México (Veracruz,2008) 500 ELISA (UMELISATECNOSUMA) México (Tabasco,2005) 273 ELISA Ig G Captura (Pan Bio test ®) 1 -10 4-16 > 15 > 15 Todas 18-39 La evidencia reportada en estudios de seroprevalencia por grupo etario indica que la presencia de anticuerpos IgG tiene una correlación positiva con respecto a la edad. (Tabla 5). En Singapur en el 2004, la seroprevalencia global encontrada fue de 59%; en los cuales en el grupo de 18 a 24 años mostró una seroprevalencia del 17.2% y el grupo de 55 a 74 años tuvo una seroprevalencia del 88.9% (Tabla 5). 25 Tabla 5. Estudios de seroprevalencia por grupo etario en poblaciones de Brasil, EUA y México. País y años de muestreo (n=Tamaño de la muestra) Brownsville, 2005 (n=600) (Brunkard JM. et al. 2007.) Matamoros, 2005 (n=600) (Brunkard JM. et al. 2007.) Veracruz , 2003 (n=500) (Navarrete-Espinosa J, et al. 2006.) Edad (Años) Seroprevalencia (%) 5-14 15-24 25-44 45-64 >64 5-24 25-34 35-44 45-54 55-64 65-74 >75 <1 1-4 5-14 15-24 25-44 45-64 65 + 0 16.7 56.2 13.5 42.8 79 75 72 80 79 95 90 17 66 69 79 86 86 94 Lo anterior es un comportamiento típico en poblaciones endémicas en donde la población ha estado expuesta a DENV desde su nacimiento, lo que explica el aumento en la seroprevalencia conforme aumenta la edad de la población (Weng Yew Y et al. 2009). Las poblaciones endémicas son capaces de mantener la transmisión del DENV porque de acuerdo a la historia natural de la enfermedad en lugares endémicos, se establece que las infecciones primarias le confieren inmunidad de larga duración contra el serotipo infectante y les da protección contra los otros serotipos por un periodo de varios meses, durante el cual, las infecciones heterólogas son asintomáticas y producen el nivel de viremia suficiente para que el mosquito adquiera el virus y lo mantenga en circulación (Sabin A, 1952; Whala MP, et al.,2011;Murphy BR, et al., 2011). Cabe resaltar que en poblaciones endémicas de México los estudios de seroprevalencia realizados no han sido representativos de toda la población lo que 26 limita la identificación de asociaciones entre las variables de edad, sexo, características demográficas y la presencia de anticuerpos IgG contra el DENV. 27 3. JUSTIFICACIÓN La inmunidad generada en la población contra los diversos serotipos del DENV es uno de los factores de la transmisión que se han estudiado con la finalidad de establecer su periodicidad y así poder predecir y controlar las epidemias, enfocándonos en áreas de mayor probabilidad de presentación de brotes. En estudios realizados por Wearing y Adams, se establece que la periodicidad de la transmisión del dengue sólo depende de la respuesta inmunitaria de reacción cruzada de corta duración, observando una sincronía en la aparición de DENV-2 y DENV-3, misma que no se observa con DENV-4; lo que hace pensar que los serotipos 2 y 3 podrían estar suprimiendo la transmisión de DENV-4. Por lo anterior se sugiere que uno de los factores que podría explicar el patrón secular de la transmisión del DENV es la inmunidad heterotípica neutralizante. Los estudios de inmunidad contra el DENV realizados en México son pocos y en su mayoría describen la seroprevalencia de población cerrada. En Veracruz la seroprevalencia reportada en una población cubierta por el Programa IMSS-Oportunidades fue de 79.6%, parecida a la seroprevalencia reportada en Matamoros (Brunkard JM.et al. 2007; Navarrete-Espinosa J, et al .2006). En Tabasco la prevalencia de anticuerpos IgG contra el DENV fue de 9.1%, sin embargo, el tipo de prueba diagnóstica no fue la óptima por lo que quizá podría estar subestimada (Sánchez-Burgos et al. 2008). Por otro lado, ese es el único estudio que reporta títulos de anticuerpos neutralizantes por serotipo mostrando la heterogeneidad de la respuesta inmune en un grupo expuesto al DENV (Sánchez-Burgos G, et al. 2008). Con la finalidad de contar con estudios seroepidemiológicos que representen a toda una población y contribuir a la identificación de factores que influyen en la transmisión, así como aportar la información para la toma de decisiones en la selección del grupo etario a vacunar, se decidió iniciar el presente estudio. Creemos además, que el conocer la frecuencia y títulos de anticuerpos neutralizantes por serotipo, nos ayudaría a sentar las bases para la realización de estudios futuros que ayuden a definir el título protector de anticuerpos para cada serotipo. El presente estudio determinó la seroprevalencia por serotipo del DENV de una población representativa de dos localidades de Morelos, México. 28 4. OBJETIVOS 4.1 OBJETIVO GENERAL Determinar la seroprevalencia de inmunoglobulinas G y la frecuencia de anticuerpos neutralizantes por serotipo de DENV en las poblaciones de Axochiapan y Tepalcingo del Estado de Morelos, México. 4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 4.2.1 Determinar la seroprevalencia de IgG específica para DENV por grupo etario en Axochiapan y Tepalcingo, Morelos. 4.2.2 Determinar la frecuencia de anticuerpos neutralizantes contra cada serotipo de DENV por grupo etario. 4.2.3 Evaluar la asociación entre la edad y los anticuerpos neutralizantes serotipo específico. 4.2.4 Determinar la proporción de respuestas neutralizantes y su asociación con los grupos etarios. 29 homotípicas y heterotípicas 5. METODOLOGÍA 5.1 Diseño Se realizó un estudio de corte transversal anidado en una cohorte de sujetos mayores de 5 años residentes en la localidad de Axochiapan y Tepalcingo (Martínez-Vega et al., 2012). 5.2 Población de estudio Los sujetos seleccionados pertenecen a una cohorte de personas mayores de 5 años, quienes son residentes en las localidades de Axochiapan y Tepalcingo de la jurisdicción número 3 del Estado de Morelos, México. A cada uno de los participantes de la cohorte mayores de 18 años se les solicitó la firma del consentimiento informado y a los sujetos de entre 7 y 17 años se les pidió firmaran el asentimiento informado y a sus padres o tutores se les solicitó la firma del consentimiento. Si el participante tenía entre 5 y 6 años únicamente se pidió la firma del consentimiento informado de los padres o tutores (Anexo 1). Una vez que aceptaron participar se les realizó una encuesta basal para el estudio sociodemográfico (Anexo 2) y se les tomó una muestra de sangre venosa, en la primera y segunda visita. La descripción general del estudio de cohorte al que está anidado el presente estudio se localiza en el anexo 3. La muestra de sangre que se tomó en la primera visita en la realización de la cohorte (muestra basal), fue la que se utilizó en éste estudio para determinar la seroprevalencia, por lo que el estudio se considera como una investigación sin riesgo, ya que se emplearon las muestras que se obtuvieron durante la cohorte. La información sociodemográfica de los participantes fue obtenida de las encuestas realizadas en la cohorte, dicha información es confidencial y se encuentra codifica por número de identificación y no por nombre. 30 La cohorte “Infección peridomiciliaria como determinante de la transmisión del dengue” (CI:986) y el presente estudio (CI:494) cuentan con el permiso de la Comisión de Ética del Instituto Nacional de Salud Pública. 5.3 Criterios de inclusión: Los criterios de inclusión para el estudio de corte transversal fueron los siguientes: • Sujetos mayores de 5 años de edad. • Firma del consentimiento informado. • Asentimiento en los sujetos entre 7 y 17 años de edad. 5.4 Criterios de exclusión Para el estudio se excluyeron a sujetos que declararon en la encuesta basal no haber vivido toda su vida en las comunidades de Axochiapan y Tepalcingo, Morelos, con la finalidad de que la información refleje la inmunidad que se ha adquirido en la región, así como los serotipos que han circulado en estas poblaciones. 5.5 Consideraciones para la clasificación de grupos etarios: Los sujetos que cumplieron con los criterios de inclusión y exclusión se clasificaron en tres grupos etarios, de acuerdo a los serotipos reportados que han circulado en Morelos desde 1984, de manera que el grupo entre 5 y 9 años han estado expuestos a alguno de los tres serotipos (DENV-1,2,3), el grupo entre 10 y 25 años han estado expuestos por lo menos en una ocasión a los cuatro serotipos, mientras que el grupo de mayores de 25 años ha estado expuesto en dos ocasiones a los tres serotipos (DENV1-3) y en una ocasión al DENV4 (Figura 9). 31 AÑO DENV 1 DENV 2 DENV 3 DENV 4 1995 - X - - 1996 - - - X 1997 X - X X 1998 X - X - 1999 - X X - 2000 - - - - 2001 - - X - 2002 - X X - 2003 - X X - 2004 - X - - 2005 X X - - 2006 X X X - 2007 X - X - 2008 X - X - 2009 X - - - 2010 X X - - 2011 X - - - Figura 9. Serotipos de DENV reportados desde 1995 hasta el 2011 en el Estado de Morelos, México ((x)=serotipo reportado, (-) =no hubo reporte de aislamiento). Fuente: Secretaria de Salud. 32 5.6 Determinación del tamaño de muestra Para la selección del tamaño de muestra de éste estudio transversal se consideró una prevalencia esperada en el grupo de menores de 10 años (grupo de menor exposición) del 15%, y una prevalencia del 30% en los otros grupos etarios (grupos de mayor exposición), con un poder del 80% y un nivel de confiabilidad del 95% se estimó evaluar 133 sujetos en cada grupo. Sin embargo, de acuerdo al censo de INEGI en el 2000 el grupo entre 5 y 9 años es del 11.6%, por lo que se esperaba obtener 136 niños de la cohorte (n=1197). Sin embargo en el estudio de cohorte sólo se obtuvieron 122 niños, por lo anterior, se decidió determinar la seroprevalencia en todos los sujetos de la cohorte que cumplieron con todos los criterios de inclusión y exclusión establecidos para el estudio transversal (n=929). Para la determinación de la seroprevalencia por serotipo del DENV se realizó en 137 sujetos seropositivos para DENV, en los cuales se consideró todos los niños de entre 5 y 9 años de edad (n=40) y los primeros 97 sujetos captados, por motivos de disponibilidad de reactivos en la University of Texas Medical Branch (UTMB). 5.7 Variables Variable dependiente o de resultado: Detección de anticuerpos IgG contra DENV. Otra variable dependiente: Detección de anticuerpos neutralizantes contra los diferentes serotipos de DENV. Variable independiente principal o explicativa: Edad de los sujetos como medida indirecta de la exposición a los diferentes serotipos durante su vida. Otras variables independientes: Sexo, nivel de educación, ocupación. 33 5.8 Ensayos de laboratorio 5.8.1 Prueba indirecta de ELISA para IgG La seroprevalencia se determinó con la prueba indirecta de ELISA para IgG con el kit de Panbio E-DEN 01G siguiendo las indicaciones del fabricante. Las muestras fueron clasificadas de acuerdo al punto de corte de cada estuche en: positivas, negativas e indeterminadas. Sólo una muestra fue indeterminada y no se consideró para el análisis estadístico. Además fueron verificados los criterios de calidad de cada estuche, siguiendo las recomendaciones del fabricante. El kit no discrimina entre los cuatro serotipos de DENV (Figura 10). 1 2 3 4 A B Figura 10. Placa para ELISA ya revelada. 1A Control positivo; 2B Control negativo; 2A, 3A y 4A calibradores; El resto de los pozos son muestras de los individuos seleccionados. 5.8.2 PRNT60% Los sueros de los sujetos seropositivos fueron evaluados para la determinación de títulos de anticuerpos neutralizantes, así como su serotipificación, mediante el ensayo de PRNT60%, siguiendo el protocolo establecido por el Dr. Nikos Vasilakis de la UTMB (Anexo 4) (Figura 11). El límite de cuantificación de la prueba fue la dilución 1:20, por lo que las muestras que fueron negativas a la dilución1:20 fueron consideradas como 34 indetectables y para el análisis se les asignó la dilución de 1:10. Las cepas de referencia fueron para DENV1 Hawaii, DENV2 16681, DENV3 FSP032 y DENV4 H241. Dilución 10 -2 10 -4 10 -8 10 -16 10 -32 10 - 64 10 -2 10 -2 -2 la figura se muestra una prueba de PRNT por duplicado, en la cual se observan las placas Figura 11. 10En de color carmín que se forman en ausencia de anticuerpos neutralizantes. 5.9 Análisis estadístico Se realizó una descripción por grupo etario de las características de la muestra seleccionada utilizando la prueba de Mann-Whitney para las variables continuas y la prueba de ji cuadrada para las variables categóricas. Posteriormente, se determinó la seroprevalencia de anticuerpos IgG por grupo etario y se realizó un análisis bivariado con Mann-Whitney para las variables continuas y la prueba de ji cuadrada para las variables categóricas. Las variables que presentaron una p<0.20 fueron utilizadas para el análisis multivariado con un modelo de regresión logística. El modelo final incluyó aquellas variables con un p<0.05 o aquellas que modificaban el OR de la variable independiente principal (grupo etario) en más de un 20%. El modelo final se ajustó por sexo aunque esta variable no cumplió con las condiciones mencionadas anteriormente, sin embargo es una variable que se considera en la mayoría de los estudios. Adicionalmente, se calculó la frecuencia de anticuerpos IgG específicos para los cuatro serotipos de DENV y el logaritmo de los títulos de anticuerpos neutralizantes contra cada serotipo, así como la frecuencia de reacciones homotípicas y heterotípicas. Se 35 comparó la frecuencia y los títulos de anticuerpos entre los grupos utilizando la prueba de ji cuadrada y de Mann-Whitney respectivamente. Finalmente se compararon los títulos de anticuerpos neutralizantes por serotipo según la ocurrencia de infección reciente por DENV sin considerar el grupo etario. La infección reciente fue detectada en la cohorte, por lo que en los sujetos que fueron considerados para el estudio transversal también se contaba con la información de infección reciente en la muestra basal, ya que habían sido positivos para IgM o IgG de captura en la prueba de ELISA. El análisis estadístico se realizó usando el paquete estadístico Stata SE 12®. 5.10 Fuente de financiamiento El proyecto contó con los siguientes financiamientos externos: - Premio en Epidemiología del fondo de investigación 2010 del Instituto Científico Pfizer. - Fondo Sectorial de Investigación en Salud y Seguridad Social de CONACYT 2010. 36 6. RESULTADOS 6.1 Características demográficas de la población De los 1197 sujetos de la cohorte se analizaron encuestas y muestras serológicas basales de 929 sujetos que cumplieron con los criterios de inclusión y exclusión previamente señalados. Las encuestas y las muestras serológicas basales fueron obtenidas entre junio y noviembre del 2011 en las localidades de Axochiapan y Tepalcingo, Morelos. Axochiapan es una localidad a 1030 metros de altitud, situada en el municipio de Axochiapan en el Estado de Morelos, con 17 508 habitantes (2010), de los cuales el 48.9% son hombres. La localidad de Tepalcingo está a 1160 metros de altitud, situada en el municipio de Tepalcingo en el Estado de Morelos, con 12 053 habitantes (2010). El 48.1% son hombres. De acuerdo a la información demográfica reportada por el Instituto Nacional de Estadística y Geografía (INEGI) en las localidades de Axochiapan y Tepalcingo en el 2005, el 11.9%, 35.3% y 53.12% correspondió al grupo de 5 a 9 años, de 10 a 25 años y de mayores de 25 años respectivamente, por lo que nuestros grupos etarios son representativos de las localidades si consideramos que el 12.1%, 33.6% y 54.4% corresponden al grupo de 5 a 9 años, de 9 a 10 años y de mayores de 25 años respectivamente. Consistente con el grupo etario, la ocupación principal para el primero y el segundo grupo, es el ser estudiante, mientras que para el tercer grupo etario lo constituyen los sujetos que trabajan ya sea en el hogar o fuera del hogar. El 53.2% de los sujetos considerados para el presente estudio pertenecieron al grupo de expuestos de la cohorte, es decir pertenecen a al grupo que estaba cerca de un caso confirmado por dengue. El 85.8% declaró tener algún tipo de derechohabiencia del cual el 74.65% contaba con seguro popular en el momento de la encuesta. Por otra parte, al 17.1% se 37 les detectó una infección reciente pre-reclutamiento por DENV, dicha infección fue detectada en el estudio de cohorte (Tabla 6). Tabla 6. Datos demográficos de los participantes del estudio de las localidades de Axochiapan y Tepalcingo, Morelos, México, 2011. Total n=929 5-9 años n=112(12.1%) 10-25 años n=312(33.6%) >25 años n=505(54.4%) Edad Mediana(rango) 28 (5-86) 7 17 47 Sexo Hombre (%) 381 (40.1) 65 (58.0) 129 (41.3) 187 (37.0) <0.001 Expuestos* (%) 494(53.2) 66(58.9) 166(53.2) 262(51.9) 0.401 Localidad (%) Tepalcingo 325 (35) 38 (33.9) 89(28.5) 198(39.2) 0.008 Estudia (%) 278 (30) 108 (96.4) 164(52.6) 6(1.2) <0.001 Variable Nivel de educación (%) <0.001 Analfabeta 111(12) 21(18.8) 6(1.9) 84(16.6) Lee o escribe 260(28) 91(81.3) 59(18.9) 110(21.8) Básica 188(20.2) 0(0) 81(26) 107(21.2) Secundaria 240(25.8) 0(0) 110(35.3) 130(25.7) Preparatoria 70(7.5) 0(0) 44(14.1) 26(5.1) Licenciatura 25(2.7) 0(0) 7(2.2) 18(3.6) Post-grado 35(3.8) 0(0) 5(1.6) 30(5.9) Ocupación (%) Estudiante Estudia y trabaja Empleado p <0.001 246(26.5) 106(94.6) 139(44.6) 1(0.2) 28 (3) 2(1.8) 24(7.7) 2(0.4) 170(18.3) 0(0) 50(16) 120(23.8) 38 Total n=929 5-9 años n=112(12.1%) 10-25 años n=312(33.6%) >25 años n=505(54.4%) 140 (15.1) 0(0) 17(5.5) 123(24.4) 277 (29.8) 0(0) 63(20.2) 214(42.4) 68(7.3) 4(3.6) 19(6.1) 45(8.9) Derechohabiencia 797(85.79) 104(92.86) 262(83.9) 431(85.35) 0.211 Infección prereclutamiento*** 159 (17.1) 19(17) 78(25) 62(12.3) <0.001 Variable Independiente Ama de casa Otros** p *Grupo expuesto de los sujetos de cohorte; **desempleados, jubilados, personas de la tercera edad sin sueldo, discapacitados; ***grupo de infectados de la cohorte. 6.2 Seroprevalencia de anticuerpos IgG contra DENV. La seroprevalencia global para el DENV fue 76.6% (IC-95% 73.6-79.2), con una seroprevalencia mayor al 90% a partir de los 30 años (p<0.001), lo que indica que la mayoría de la población ya había estado en contacto con el DENV. Así mismo, se observa a partir de los 40 años, una seroprevalencia superior al 90%, excepto en el último quinquenio, en el cual la seroprevalencia fue de 83.3%, sin embargo el intervalo es muy amplio (IC-95% 35.8-99.6) (Figura 12). 39 Figura 12. Seroprevalencia global de inmunoglobulina IgG contra DENV de las localidades de Axochiapan y Tepalcingo, Morelos, México, 2011*. *En las barras se indica el IC del 95%. En Tepalcingo se encontró una seroprevalencia de 72.8% (IC-95% 67.6-77.6) y en Axochiapan de 78.4% (IC-95% 74.9-81.6) (p=0.112). En ambas localidades se observó un incremento de la seroprevalencia con la edad (Figura 13). Figura 13. Seroprevalencia de inmunoglobulinas IgG contra DENV por grupo etario para Axochiapan y Tepalcingo, Morelos, México, 2011. 40 Las características demográficas asociadas a la seroprevalencia para DENV fueron analizadas en 928 sujetos de los 929, ya que uno de los sujetos fue reportado en la prueba de ELISA para IgG como indeterminado, por tal motivo no fue considerado para este análisis. El análisis bivariado mostró asociación entre la seroprevalencia global y las variables de edad, localidad, ocupación, el nivel de educación y el ser estudiante en el momento en que se realizó la encuesta (Tabla 7). El modelo final del análisis multivariado se ajustó por las variables de edad, sexo, localidad y ocupación; en el análisis se observó que la posibilidad de ser seropositivo en el grupo de mayores de 25 años es de 17.76 veces con respecto al grupo de 5 a 9 años; en cuanto a la ocupación, los grupos con mayor posibilidad de ser seropositivos con respecto al grupo de estudiantes correspondieron a aquellos que declararon tener una ocupación independiente (Tabla 7). Tabla 7. Características asociadas a la seroprevalencia para DENV de las localidades de Axochiapan y Tepalcingo, Morelos, México. Variable Total n=928 Seronegativos n=215 Seropositivos n=713 OR (IC 95%) Grupo etario (5 a 9 años) 112(12.1) 72(33.5) 40(5.6) 1.0 Grupo etario (10 a 25 años) 311(33.5) 117(54.4) 194(27.21) 2.98 (1.9-4.68) 2.17 (1.30-3.62) 33.16 (19.09-57.62) 17.76 (8.40-37.54) Grupo etario (> 25 años) Sexo Mujeres (%) Hombre (%) 505(54.4) 26(12.1) 479(67.2) 547 (58.9) 381(41.6) 115(53.5) 100(46.5) 432(60.6) 281(39.4) Expuestos* (%) 493(53.1) 113(52.6) 380(53.3) Localidad (%) Tepalcingo Axochiapan 325(35.0) 603 (65) 88(40.9) 127(59.1) 237(33.2) 476(66.7) Estudia (%) 278 (30) 147 (68.4) 131(18.4) 41 1.0 0.75 (0.55-1.02) 1.03 (0.76-1.40) 1.0 1.39 (1.02-1.90) 0.10 (0.07-0.14) OR aᵻ (IC 95%) 1.08 (0.71-1.63) 2.07 (1.41-3.05) Total n=928 Seronegativos n=215 Seropositivos n=713 OR (IC 95%) Analfabeta 90(9.7) 6(2.8) 84(11.8) 1.0 Niños que aún no leen ni escriben 21(2.3) 11(5.1) 10(1.4) 0.06 (0.02-0.21) Lee o escribe 259(27.9) 89(41.4) 170(23.8) 0.14 (0.06-0.32) Primaria y Secundaria 428(46.1) 90(41.9) 338(47.4) 0.27 (0.11-0.63) 130(14) 19(8.8) 111(15.6) 0.42 (0.16-1.09) 246(26.5) 135(62.8) 111(15.6) 1.0 28 (3) 12(5.6) 16(2.2) 1.62 (0.74-3.57) 1.11 (0.47-2.58) 170(18.3) 23(10.7) 147(20.6) 140(15.1) 10(4.7) 130(18.2) 7.77 (4.69-12.9) 15.81 (7.92-31.54) 1.86 (1.00-3.47) 2.31 (1.01-5.28) 276 (29.7) 29(13.5) 247(34.6) 10.36 (6.54-16.40) 2.29 (1.25-4.19) Otros** 68(7.3) 6(2.8) 62(8.7) 12.57 (5.24-30.14) 4.09 (1.59-10.50) Seguro 797(85.8) 197(91.6) 600(84.2) 0.99 (0.99-1) Variable OR aᵻ (IC 95%) Nivel de educación (%) Preparatoria, técnico y licenciatura. Ocupación (%) Estudiante Estudiante y empleado. Empleado Independiente Ama de casa * Grupo expuesto de la cohorte;** Desempleados, jubilados, personas de la tercera edad sin sueldo y discapacitados. ᵻ Modelo multivariado de regresión logística 42 6.3 Seroprevalencia de anticuerpos neutralizantes serotipo específico contra DENV por grupo etario La seroprevalencia de anticuerpos neutralizantes en el primer grupo etario (n=40) fue de 82.5% (IC-95% 67.22-92.66), 45% (IC-95% 29.25-61.50) y 65% (IC-95% 48.31-79.37) para DENV 1 a DENV 3 respectivamente, además es importante señalar que el 2.5% (IC-95% 0.06-13.15) de seroprevalencia encontrada para DENV4 está relacionado a una respuesta inmune de reacción cruzada ya que fueron individuos que se infectaron recientemente y que no habían estado expuestos a una infección por DENV4 (Figura 13). En el segundo grupo etario (n=27) se observó una seroprevalencia por encima del 60% para los tres serotipos excepto para DENV4 (42.9%, IC 95% 24.46-62.82); en cambio para el tercer grupo etario (n=70) la seroprevalencia fue mayor al 65% para los cuatro serotipos. Adicionalmente se observa una diferencia estadísticamente significativa entre DENV2 y DENV4 en los tres grupos etarios, lo que no sucede con DENV1 y 3 (Figura 13). Figura 13. Seroprevalencia por serotipo contra DENV por grupo etarios de las localidades de Axochiapan y Tepalcingo, Morelos, México, 2011. Con respecto a los títulos de anticuerpos neutralizantes podemos observar que se * * refleja el patrón de exposición de los serotipos que han circulado * en ésta región, como es el caso para el grupo de entre 5 y 9 años, el cual ha estado expuesto por lo menos a uno de los tres serotipos (DENV1-3). En cambio para el segundo y tercer grupo, * * podemos observar que han estado expuestos en más de una ocasión a alguno de los cuatro serotipos de DENV. DENV-3 ha circulado en la última década en más ocasiones que DENV-4 mismo que sólo se ha reportado en 1996 y 1997 en la región de Morelos. Sin embargo, los títulos de anticuerpos neutralizantes para DENV-3 en el grupo de mayores de 25 años son más bajos con respecto a DENV-4 (Figura 14). Además se * puede observar como los títulos de anticuerpos neutralizantes para DENV-2 y DENV-4 tienen un comportamiento similar a diferencia de DENV-1 y DENV-3 en los tres grupos etarios (Tabla 8). 43 Figura 14. Logaritmo de anticuerpos neutralizantes contra los cuatro serotipos de DENV, de los sujetos participantes de las localidades de Axochiapan y Tepalcingo, Morelos, México, 2011 (PRNT 60%). 1 1.5 2 2.5 3 Log de anticuerpos neutralizantes contra todos los serotipos de DENV 5-9 años 10-25 años > 25 años Grupo etario DENV1 DENV3 DENV2 DENV4 Tabla 8. Asociación entre el título de anticuerpos neutralizantes y el grupo etario. Grupo etario* Mediana (25%-75%) 1 vs 2 1 vs 3 2 vs 3 DENV1 1.9(1.6-2.2) 0.91 0.0017 0.0152 DENV2 1.9(1.3-2.5) <0.0001 <0.0001 0.37 DENV3 1.3(1-1.6) 0.46 0.17 0.05 DENV4 1(1-1.6) <0.0001 <0.0001 0.0004 *El primer grupo etario corresponde al grupo de 5 a 9 años, el segundo al grupo de 10 a 25 años y el tercer grupo a los mayores de 25 años. Prueba de Mann-Whitney. Considerando que se ha observado en la literatura el incremento de los anticuerpos posterior a una infección, se estudió la asociación entre los títulos de anticuerpos neutralizantes y la infección reciente pre-reclutamiento de la cohorte. El título de anticuerpos neutralizantes contra el DENV-1 fue mayor en los sujetos con infección 44 reciente, como era de esperarse ya que éste serotipo circuló durante el periodo de muestreo (Figura 15). 3 Figura 15. Logaritmo de anticuerpos neutralizantes contra los cuatro serotipos de DENV, de acuerdo al tipo de respuesta inmune (PRNT 60%). 1 1.5 2 2.5 * No Infectados Infectados DENV1 DENV3 DENV2 DENV4 * p=0.0005 para DENV1de infectados (n=38) vs DENV1(n=99) no infectados recientemente. Prueba de Mann-Whitney El 81.62% (n=111) de la respuesta inmune fue heterotípica y su frecuencia aumentó conforme la edad. Tabla 9. Porcentaje de respuesta homotípica y heterotípica por grupo etario. Grupo etario Respuesta homotípica (%) Respuesta heterotípica (%) 5 a 9 años 40 60 10 a 25 años 22.2 77.78 > 25 años 4.35 95.65 45 p <0.001 Lo anterior es un comportamiento típico de comunidades endémicas, dado que la edad es un reflejo del tiempo en que han estado expuestos los individuos a la circulación de los diferentes serotipos de DENV (Figura 16). 3 Figura 16. Títulos de anticuerpos neutralizantes por serotipo de DENV con respecto al tipo de respuesta de los individuos. 2.5 * ** 2 * 1 1.5 * Respuesta Homotípica Respuesta Heterotípica DENV1 DENV3 DENV2 DENV4 *p<0.0001 para R. Homotípica (n=25) vs R. Heterotípica (n=111); ** p<0.005 para R. Homotípica para DENV3(n=25) vs R. Heterotípica para DENV3 (n=111). Prueba de Mann-Whitney. 46 7. DISCUSIÓN La seroprevalencia en este estudio fue de 76.58%, similar a la reportada en otras poblaciones endémicas. Con respecto a la seroprevalencia por grupo etario se puede comparar con la de República Dominicana (97%) en sujetos mayores de 20 años, así mismo la seroprevalencia del grupo de 5 a 9 años es del 35.70% menor a la reportada en Bangkok (53%) en un grupo de 7 a 9 años y con respecto a la reportada en el Sur de Vietnam (86%) en niños de 13 años. En población mexicana, la seroprevalencia es semejante a la reportada en Veracruz y Matamoros (Brunkard JM.et al. 2007., Espinoza-Gómez F, et al. 2003). En general, en los estudios de seroprevalencia se observa un aumento con respecto a la edad como resultado de un mayor tiempo de exposición a la circulación del DENV en las regiones endémicas (Espinoza-Gomez et al., 2003; Navarrete-Espinosa J et al., 2006; Brunkard JM et al., 2007; Weng Yew Y et al. 2009; Braga C et al., 2010; Sissoko D et al., 2010). La seroprevalencia encontrada en estas poblaciones de Axochiapan y Tepalcingo así como la presencia de casos de dengue en los últimos cinco años las ubican como zonas endémicas de México. En Axochiapan las tasas de incidencia son más altas que en Tepalcingo, sin embargo, la seroprevalencia en ambas comunidades no fue estadísticamente diferente, lo que nos habla de una misma tendencia pero con una magnitud diferente y que podría explicarse por la diferencia en la densidad poblacional (Axochiapan 0.193 hab/km²; Tepalcingo 0.072 hab/km²) (INEGI, 2010). La proporción de hombres y mujeres seropositivos para DENV fue similar a lo que se ha reportado en otros estudios (Braga C, et al., 2010; Teixeria MG, et al., 2002; van Benthem BH, et al., 2005; Trravassos da R, et al., 2000). Así mismo, ajustando por edad y sexo la ocupación estuvo asociada a la seropositividad. Los trabajadores independientes, personas de la tercera edad sin sueldo, discapacitados y jubilados así como las amas de casa estuvieron asociados a una mayor seroprevalencia comparado con el grupo de estudiantes. En Singapur ya se había reportado la asociación entre seroprevalencia y amas de casa (Weng Yew Y et al. 2009). Estas observaciones 47 pueden tener dos explicaciones, una de ellas es la asistencia de los estudiantes a las instituciones educativas por largos periodos de tiempo, lo que los hace estar menos expuestos al vector por la ausencia de potenciales criaderos de mosquitos en las escuelas, algo que no ocurre en los hogares. La otra explicación está bajo el supuesto de que el mosquito infectado vive cerca del hogar, por lo que en las horas en las que el mosquito pica coinciden con los horarios escolares, algo que no sucede con las amas de casa, los jubilados, discapacitados y en cuanto a los empleados estos están en el mismo lugar en las horas de picadura de mosquito (Iturrino-Monge et al., 2006; Weng Yew Y et al. 2009). Con respecto a la frecuencia de los anticuerpos neutralizantes por serotipo, se observaron diferencias para DENV-2 y DENV-4 entre los grupos etarios, pero no para DENV-1 y DENV-3. Lo anterior podría explicarse por el hecho de que DENV-1 ha circulado predominantemente en el área en los últimos 3 años y esta circulación tiende a homogenizar la frecuencia entre los grupos etarios. Para el caso de DENV-3 se ha reportado una relación filogenética entre los serotipos 1 y 3, que se refleja en una relación antigénica entre ellos, de tal forma que la frecuencia de anticuerpos contra DENV-3 será proporcional a los de DENV-1 (Kyle JL, et al., 2008; Twiddy SS et al., 2003; Zanotto C, et al., 1996; Lewis JA, et al., 1993). Estas observaciones coinciden con estudios realizados in vitro con anticuerpos monoclonales del tipo IgG los cuales mostraron alta actividad neutralizantes contra DENV-1 y DENV-3, en comparación contra DENV-2 y DENV-4 (Schieffelin J et al., 2010). Otros estudios detectaron anticuerpos neutralizantes en infecciones primarias y secundarias, en las que se observó que ante una infección por el serotipo 1 el siguiente serotipo con títulos más altos de anticuerpos correspondió al serotipo 3 (Graham RR et al.,1999; Kuno G, et al., 1993; Murphy BR et al.,2011). La respuesta heterotípica encontrada se asoció positivamente con la edad por la diversidad de anticuerpos generados ante una constate exposición, además de desencadenar un incremento de los títulos contra los otros por una respuesta de reacción cruzada. Lo anterior se pudo observar en el presente estudio, en donde los 48 títulos más altos de anticuerpos neutralizantes para los cuatro serotipos correspondían a los de la respuesta heterotípica (Murphy BR et al.,2011; Midgley CM, et al., 2010; Simmons M, et al., 2010). Por otra parte, la identificación del serotipo que infectó por primera vez a los participantes del estudio no se puede conocer con certeza. Se podría hacer una relación entre el serotipo del DENV que circuló los primeros años de vida de los participantes y la magnitud de los títulos de anticuerpos neutralizantes contra alguno de los cuatro serotipos de acuerdo a la teoría del pecado original antigénico, que establece que durante una infección secundaria por DENV los títulos de anticuerpos neutralizantes del serotipo que infectó la primera vez serán más altos con respecto a los del serotipo que infecta por segunda ocasión. Halstead y cols. detectaron éste fenómeno en individuos febriles a los que se les tomó una muestra de suero en la fase aguda y en la fase convaleciente, los hallazgos mostraron un aumento en los títulos de anticuerpos del serotipo que en la fase aguda contaba con los títulos más altos (Halstead SB, et al., 1983). Sin embargo, existen otros estudios en los que los títulos de anticuerpos más altos correspondieron al serotipo de la infección secundaria (Kuno G, et al., 1993; Graham RR et al.,1999). Estas posibles discrepancias se pueden deber a la diferencia de edad entre los individuos, a los intervalos entre la primera y segunda infección y a la variación de la respuesta inmune de los individuos, por lo que es difícil identificar con certeza el serotipo que infectó por primera vez si en su momento no se realizó un aislamiento viral (Kuno G, et al., 1993). El presente estudio es el primero en reportar la seroprevalencia global y por serotipo del DENV en una población endémica mexicana con un intervalo de edad amplio. En vista de los resultados de la vacuna de SANOFI, la protección determinada por anticuerpos neutralizantes queda en entre dicho, sin embargo, estudios como el que aquí se presentan son necesarios para establecer la diversidad de las respuestas de anticuerpos contra DENV en un contexto endémico, lo cual permitirá en primera instancia, conocer la población susceptible y sentar las bases para realizar estudios que permitan establecer la relación entre títulos neutralizantes y protección. 49 8. LIMITACIONES Una de las limitaciones del estudio es el muestreo inicial (posible sesgo de selección), el cual fue por conveniencia y según las condiciones de la cohorte. Esto no representa ningún problema dado que la muestra fue representativa de la población (La distribución etaria fue similar a la reportada por el INEGI) y la seroprevalencia entre el grupo expuesto y no expuesto de la cohorte no fue estadísticamente diferente. Sin embargo, se debe de tener en cuenta que los resultados de este estudio sólo son aplicables a los mayores de 5 años, debido a que el grupo de menores de 5 años, no se consideró en el muestreo por el ser el quinquenio de edad menos afectado y por cuestiones éticas establecidas en el proyecto inicial. Un posible sesgo podría ser el de medición, particularmente el de mala clasificación del estado inmune del paciente. Para evitar este sesgo se decidió utilizar el estuche de diagnóstico de Panbio IgG indirecto para la prueba de ELISA, la cual en una evaluación de seis estuches de diagnóstico para IgG contra DENV resultó ser el de mayor especificidad (98%) y sensibilidad (100%) (Groen J., et al., 2000). 50 9. CONCLUSIÓN En el presente estudio se pudo observar la asociación de la edad, localidad y ocupación con la seropositividad. La seroprevalencia aumentó con respecto a la edad. En Axochiapan se reportó un OR más alto para seropositividad. Por otro lado el ser estudiante fue la variable asociada a protección. Además, la seroprevalencia por serotipo permitió definir el título de anticuerpos neutralizantes y estudiar la posible historia de exposición a la circulación del DENV en las localidades de Axochiapan y Tepalcingo, corroborando que ante exposiciones repetidas los títulos de anticuerpos aumentan por un efecto de reforzamiento continuo. Los datos generados en este estudio podrán servir como base para la generación de modelos matemáticos que permitan identificar el momento de aparición y la magnitud de un brote en zonas endémicas de México. Además se podrán emplear para la toma de decisiones en cuanto a la selección del grupo etario blanco para vacunar. 51 10. REFERENCIAS Adams B. Cross-protective immunity can account for the alternating epidemic pattern of dengue virus serotypes circulating in Bangkok. Proc Natl Acad Sci USA 2006; 103(38): 14234-39. Balmaseda A, Hammond SN., Tellez Y, Imhoff L, Rodriguez Y, Saborı S, et al. High seroprevalence of antibodies against dengue virus in a prospective study of schoolchildren in Managua, Nicaragua. Tropical Medicine and International Health 2006; 11(6): 935-42. Braga C, Feitosa-Luna C, Turchi-Mertelli CM, Vieira de Souza W, Cordeiro M, Alexander N, et al. Seroprevalence and risk factors for dengue infection in socioeconomically distinct areas of Recife, Brazil. Acta Tropica 2010; 113: 234-240. Brunkard JM, Robles López JL, Ramirez J, Cifuentes E, Rothenberg SJ, Hunsperger EA, et al. Seroprevalence and risk factors for dengue fever on the Texas–Mexico border, 2004. Emerg Infect Dis 2007. Chambers TJ, Hahn CS, Galler R, Rice CM. Flavivirus genome organization, expression, and replication. Annu Rev Microbiol 1990; 44:649–688. Díaz-Quijano FA, Martínez-Vega RA, Ocazionez RE y Villar-Centeno LA., Evaluación de la prueba Ig M en suero agudo para el diagnóstico del dengue en un área endémica. Enferm Infecc Microbiol Clin 2006; 24(2):90-2. Espinoza-Gómez F, Hernández-Suárez CM, Rendón-Ramírez R, Carrillo-Alvarez ML, Flores-Gonzáles JC. Transmisión interepidémica del dengue en la ciudad de Colima, México. Salud Pública de México 2003; 45: 365-70. Falcón-Lezama J, Sánchez-Burgos G, Ramos-Castañeda J. Genética de las poblaciones virales y transmisión del dengue. Salud pública Méx 2009; 51(3):403-409. Goncalvez AP, Engle RE, St Claire M, Purcell RH, Lai CJ. Monoclonal antibodymediated enhancement of dengue virus infection in vitro and in vivo and strategies for prevention. Proc Natl Acad Sci U S A.; 2007 29;104 (22):9422-7. Gubler DJ., Kuno G. Factors influencing the transmission of dengue viruses in Dengue and dengue hemorrhagic fever. CAB International, New York, N.Y 1997; 61–88. 52 Graham RR, Juffrie M, Tan R, Hayes CG, Laksono I, Ma’roef C, et al. A prospective seroepidemiologic study on dengue in children four to nine years of age in Yogyakarta, Indonesia I. Studies in 1995-1996. Am. J. Trop. Med. Hyg 1999; 61(3): 412-419. Groen J, Koraka P, Velzing J, Copra C y Osterhaus A. Evaluation of Six Immunoassays for Detection of Dengue Virus- Specific Immunoglobulin M and G Antibodies. Clin Diagn Lab Immunol, 2000; 7(6): 867–871. Gubler DJ, Epidemic dengue/dengue hemorrhagic fever as a public health, social and economic problem in the 21st century. Trends Microbiol, 2002 10:100–103. Guzman MG, Kouri G. Dengue: an update. Lancet Infect Dis, 2002; 2:33–42. Hadinegoro SR. The revised WHO dengue case classification: does the system need to be modified? Pediatr Int Child Health. 2012; 32(s1): 33–38. Hales S, Wet Nd, Maindonald J, Woodward A. Potential effect of population and climate changes on global distribution of dengue fever: an empirical model. Lancet, 2002; 360:830–834. Halstead AB, Rojanasuphot S, Sangkawibha N. Original antigenic sin in dengue. Am J Trop Med Hyg 1983; 32(1): 154-156. Hopp MJ, Foley JA. Worldwide fluctuations in dengue fever cases related to climate variability. Clim Res 2003; 25:85–94. Huu Tran N, Quang Luong C, Huong Vu TQ, Lang J, Dat Vu Q, Bouckenooghe A et al. Safaty ans Immunogenicity of Recombinant, Live Attenuated Tetravalent Dengue Vaccine (CYD-TDV) in Healthy Vietnamese Adults and Children. Vaccines Vaccin 2012; 3:7. Iturrino-Monge R, Avila-Agüero ML, Avila-Agüero CR, Moya-Moya T, Cañas-Coto A, Camacho-Badilla K. Seroprevalence of dengue virus antibodies in asymptomatic Costa Rican children, 2002–2003: a pilot study. Rev Panam Salud Publica 2006; 20(1). Khoa TD, Anders KL. The role of climate variability and change in the transmission dynamics and geographic distribution of dengue. Experimental Biology and Medicine 2011; 236: 944–954. 53 Kuno G, Gubler DJ, Oliver A. Use of original antigenic sin´theory to determine the serotypes of previous dengue infections. Am. J. Trop. Med. Hyg 1993; 87: 103-105. Kyle JL, y Harris E., Global Spread and Persistence of Dengue, Annu Rev Microbiol 2008; 62: 71-92. Lanata CF, Andrade T, Gil AI, Terrones C, Valladolid O, Zambrano B et al. Immunogenicity and safety of tetravalent dengue vaccine in 2 – 11 years- olds previously vaccinated against yellow fever: Randomized, controlled, phase II study in Piuria, Peru. Vaccine 2012; 30: 5935-5941. Laughlin CA, Morens DM, Cassetti MC, Costero-Saint Denis A, San Martin JL, Whitehead S et al. Dengue Research Opportunities in the Americas. Journal of Infectious Diseases 2012. Lewis JA, Chang GJ, Lanciotti RS, Kinney RM, Mayer LW, relationships of dengue-2 viruses. Virology 1993;197:216-224. et al. Phylogenetic Lin H-E, Tsai W-Y, Liu I-J, Li P-C, Liao M-Y, et al. (2012) Analysis of Epitopes on Dengue Virus Envelope Protein Recognized by Monoclonal Antibodies and Polyclonal Human Sera by a High Throughput Assay. PLoS Negl Trop Dis 6(1): e1447. Rothman A. Immunity to dengue virus: a tale of original antigenic sin and tropical cytokine storms. Nature Reviews Immunology, 2011. Midgley CM, Bajwa-Joseph M, Vasanawathana S, Limpitikul W, Wills B, Flanagan A, et al. An In-Depth Analysis of Original Antigenic Sin in Dengue Virus Infection. Virology 2011; 85: 410-421. Morrison J, Aguirre S, Fernandez-Sesma A. Innate Immunity Evasion by Dengue Virus. Viruses 2012; 4:397-413. Murphy BR, Whitehead. Immune Response to Dengue Virus and Prospects for a Vaccine. Annu. Rev. Immunol. 2011; 29: 587-619. Navarrete-Espinosa J, Acevedo-Vales JA, Huerta-Hernández E, Torres-Barranca J, Gavaldón-Rosas DG. Prevalencia de anticuerpos contra dengue y leptospira en la población de Jáltipan, Veracruz. Salud Publica Mex 2006; 48(3): 220-28. 54 Panhuis WG, Gibbons RV, Endy TP, Rothman AL, Srikiatkhachorn A, Nisalak A, et al. Inferring the serotype associated with dengue virus infections on the basis of pre- and postinfection neutralizing antibody titer. JID 2010; 202: 1002-10. Patz JA, Campbell-Lendrum D, Holloway T, Foley JA Impact of regional climate change on human health. Nature 2005; 438:310–317. Peeling R W. Artsob H, Pelegrino JL, Buchy P, Cardosa MJ, Devi S et al. Evaluation of diagnostic tests: dengue. Nat Rev Micro, 2010; S30-S37. Pessanha JEM, Caiaffa WT, Kroon EG, Proietti FA. Dengue em três distritos sanitários de Belo Horizonte, Brasil: inquérito soroepidemiológico de base populacional, 2006 a 2007. Rev Panam Salud Pública 2010; 27: 252–8. Putnak R, De la Barrera R, Burgess T, Pardo J, Dessy F, Gheysen D et al. Comparative Evaluation of Three Assays for Measurement of Dengue Virus Neutralizing Antibodies. Am. J. Trop. Med. Hyg. 2008; 79(1): 115–122. Raghwani J, Rambaut A, Holmes EC, Hang VT, Hien TT, et al. Endemic Dengue Associated with the Co-Circulation of Multiple Viral Lineages and Localized DensityDependent Transmission. PLoS Pathog 2011; 7(6): e1002064. Rainwater Lovett K, Rodriguez-Barraquer I, Cummings D, Leesler J. Variation in dengue virus plaque reduction neutralization testing: systematic review and pooled analysis. BMC Infectious Diseases 2012; 12:233. Roehrig JT, Hombach J, Barret AD. Guidelines for plaque-reduction neutralization testing of human antibodies to dengue virus. Viral Immunol 2008; 21:123-132. Russell PK, Nisalak A, Sukhavachana P, Vivona S. A plaque reduction test for dengue virus neutralizing antibodies. J Immunol 1967; 99:285–290. Sabchareon A, Wallace D, Sirivichayakul K, Chanthavanich P, Suvannadabba S, Jiwariyavej V, et al. Protective efficacy of the recombinant, live-attenuated, CYD tetravalent dengue vaccine in Thai schoolchildren: a randomized, controlled phase 2b trial. The Lancent, 2012. Sabin AB. Research on dengue during World War II. Am. J. Trop. Med. Hyg. 1952; 1:30-50. 55 Sa-Ngasang A, Anantapreecha S, A-Nuegoonpipat A, Chanama S, Wibulwattanakij S, Pattanakul K, Sawanpanvalert P, Kurane I. Specific IgM and IgG responses in primary and secondary dengue virus infections determined by enzyme-linked immunosorbent assay. Epidemiol Infect 2006;134:820–5. Sánchez-Burgos G, López-Alvarado MA, Castañeda-Desales D, et al. Prevalencia de anticuerpos neutralizantes contra los serotipos del virus dengue en universitarios de Tabasco México. Salud Pública Mex 2008; 50: 362-66. Schieffelin JS, Costin JM, Nicholson CO, Orgeron NM, Fontaine KA, Isern S et al. Neutralizing and non-neutralizing monoclonal antibodies against dengue virus E protein derived from a naturally infected patient. Virology 2010; 7:28. Simmons CP, Farrar JJ, Vinh Chau N, Wills B. Dengue. N ENGL L MED 2012;366:1423-32. Simmons M, Burgess T, Lynch J, Putnak R. Protection against dengue virus by nonreplicating and live attenuated vaccines used together in a prime boost vaccination strategy. Virology 2010; 396: 280-288. Sissoko D, Ezzedine K, Giry C, Moendandza A, Lernout T, D’Ortenzio E,et al., Seroepidemiology of Dengue Virus in Mayotte, Indian Ocean. PLOS ONE 2006; 5(11):e14141. Tan GK y Alonso S, Pathogenesis and prevention of dengue virus infection: state-ofthe-art, Curr Opin Infect Dis 2009; 22:302–308. Texeira MG, Barreto ML, Costa MC, Ferreira LD, Vasconcelos PF, et al., Dynamics of dengue virus circulation: silent epidemic in a complex urban area. Trop Med Int Health 2002; 7: 757-762. Thai KTD y Anders KL., The role of climate variability and change in the transmission dynamics and geographic distribution of dengue. Experimental Biology and Medicine 2011; 236:944-954. Thomas SJ, Nisalak A, Anderson KB, Libraty DH, Kalayanarooj SK, Vaughn DW et al., Dengue Plaque Reduction Neutralization Test (PRNT) in Primary and Secondary Dengue Virus Infections: How Alterations in Assay Conditions Impact Performance. Am J Trop Med Hyg. 2009; 81(5): 825–833. 56 Torres-Muñoz A. Yellow fever in Mexico. The eradication of Aedes aegypti. 1966. Salud Publica Mex 1995; 37:S103-10. Trravassos da Rosa AP, Vasconcelos PF, Travassos Da Rosa ES, Rodrígues SG, Mondet B et al., Dengue epidemic in Belm, Para Brazil, 1996-97. Emerg Infect Dis 2000; 6:298-301. Twiddy SS, Holmes EC, Rambaut A. Inferring the rate and time-scale of dengue virus evolution. Mol Biol Evol 2003; 20: 122-29. Van Benthem BH, Vanwambeke SO, Khantikul N, Burghoorn-Maas C, Panart K, et al., Sapatial patterns of and risk factors for seropositivity for dengue infection 2. Am J Trop Med Hyg 2005; 72: 201-208. Vázquez-Pichardo M, Rosales-Jiménez C, Núñez-León A, Rivera-Osorio P, De La Cruz-Herrera S, Ruiz-López A, et al.,Serotipos de dengue en México durante 20092010. Bol Med Hosp Infant Mex 2011; 68(2):103-110. Vasilakis N, Dubin AP, Travassos da Rosa APA, Munoz-Jordan JL, Tesh RB y Weaver SC. Short Report: Antigenic Relationships between Sylvatic and Endemic Dengue Virus. Am. J. Trop. Hyg., 2008; 79(1):128-132. Wahala WMPB, Donaldson EF, de Alwis R, Accavitti-Lopez MA, Baric RS, et al. Natural Strain Variation and Antibody Neutralization of Dengue Serotype 3 Viruses. PLoS Pathog 2010; 6(3). Wahala WMPB, de Silva Aravinda. The Human Antibody Response to Dengue Virus Infection. Viruses 2011, 3 2374-2395. Wearing HJ, Rohani P. Ecological and immunological determinants of dengue epidemics. Proc Natl Acad Sci USA 2006; 103(31): 11802-07. Weaver SC, Vasilakis N. Molecular evolution of dengue viruses: Contributions of phylogenetics to understanding the history and epidemiology of the preeminent arboviral disease. Infection, Genetics and Evolution, 2009; 9(4): 523-40. World Health Organization. Dengue guidelines, 2010; [citado 9 Julio 2011] Disponible en: http://www.health.gov.bz/www/index.php/publications/environmental-health/160environmental-health/322-guidelines-for-dengue-diagnosis-treatment-prevention-andcontrol. 57 Wen Ywe Yik, Ye Tu, Wei Ang L, Ching Ng L, Yap G, James L, et al. Seroepidemiology of Dengue Virus Infection Among Adults in Singapore. Ann Acad Med Singapore 2009;38:667-675. Zambrano-Mora BM. Estado actual de las vacunas contra el Dengue. Perspectivas. Rev Biomed 2010;21:197-211. Zanotto PM, Gould EA, Gao GF, Harvey PH, Holes EC. Population dynamics of flaviviruses revealed by molecular phylogenies. Proc Natl Acad Sci USA1996; 93:54853. 58 ANEXO 1 Consentimientos informados 59 60 61 62 63 64 65 66 ANEXO 2 Formulario de evaluación basal para sujetos a seguir (F2A) de la cohorte. 67 A. DATOS DE IDENTIFICACIÓN: 1. Código: 2. Exposición a CR: No Si 3. Código del CR correspondiente : 1 4. Código casa : 2 5. Fecha de encuesta: 3 CR 4 5 Día Mes Año 6. Nombre completo: 7. Apellido paterno: 8. Apellido materno: 9. Fecha de Nacimiento: Día Mes Año 10. Estado de nacimiento: 11. CURP: 12. Edad: 13. Sexo: F M 14. Nivel de educación: Analfabeta Lee o escribe Básica Secundaria Preparatoria Técnico Licenciatura Post-grado No evaluado 15. Estudia actualmente: 16. Ocupación: Si Estudiante Desempleado No No evaluado Empleado Pensionado Independiente Otro Ama de casa No evaluado 17. ¿Cuál otra ocupación?: 18. Derechohabiencia: IMSS ISSSTE 19. Localidad donde está ubicada la vivienda: SEDENA Tepalcingo 20. Colonia: 68 SP Ninguno Axochiapan No evaluado 21. Dirección de vivienda (Calle y #): 22. Código postal: 23. Teléfono fijo de la vivienda: 24. Teléfono celular: 25. Otro teléfono: 26. Ha vivido toda su vida en Morelos: Si No 27. Desde que año ha vivido en Morelos: B. ENFERMEDAD FEBRIL EN LOS ÚLTIMOS DOS MESES: 28. Ha presentado fiebre en los últimos dos meses: 29. Consultó al médico por la fiebre: Si Si No No NE NE 30. ¿En cuál localidad está ubicado el centro médico/consultorio médico? 31. ¿A cuál centro médico?: 32. Fecha aproximada de consulta: 33. Manejo médico: Día Ambulatorio Mes Año Hospitalización C. SINTOMATOLOGÍA EN LOS ÚLTIMOS 15 DÍAS: 34. ¿Se ha sentido enfermo en los últimos 15 días?: No Si NE ¿En los últimos 15 días ha presentado? 35. 36. 37. 38. Fiebre Dolor detrás de los ojos o al movilizarlos Dolor en las articulaciones Dolor en los músculos No No No No 69 Si Si Si Si NE NE NE NE 39. 40. 41. 42. 43. 44. 45. 46. 47. 48. Dolor de cabeza Tos Secreción u obstrucción nasal (mocos) Dolor o ardor en la garganta espontáneo o al pasar alimentos Color rojo en la piel (exantema, brote) Vómito Deposiciones líquidas (diarrea) Sangrado espontáneo de encías Sangrado nasal espontáneo Otro tipo de sangrado espontáneo No No No No No No No No No No Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si NE NE NE NE NE NE NE NE NE NE 49. ¿Cuál otro tipo de sangrado?: D. CARACTERÍSTICAS DE LA MOVILIDAD 50. ¿Trabaja fuera de su localidad?: No Si No aplica No evaluado 51. ¿En qué municipio está ubicada la localidad donde trabaja?: 52. ¿Dónde, en cuál localidad?: 53. ¿En cuál colonia está ubicado su lugar de trabajo?: 54. ¿Estudia fuera de su localidad?: No Si No evaluado 55. ¿En qué municipio está ubicada la localidad donde estudia?: 56. ¿Dónde, en cuál localidad?: 57. ¿En cuál colonia está ubicado su colegio/escuela?: 58. ¿Cómo se llama el colegio/escuela donde estudia?: 59. ¿En los últimos 15 días ha estado fuera de su localidad?: No Si No recuerda No evaluado 60. ¿Dónde?: 61. ¿En un día hábil cuántas horas del día (24 horas) permanece usted en la casa?: 62. ¿En un día feriado (domingo o festivo), cuántas horas del día permanece usted en la casa?: 63. Cuál es el lugar, diferente de su casa, donde permanece más tiempo: Escuela/colegio 64. ¿Cuál otro lugar?: 70 Trabajo ¿Otro? ¿Cuáles son los 5 lugares que usted más frecuenta dentro de su localidad?: 65. 66. 67. 68. 69. Lugar 1: Lugar 2: Lugar 3: Lugar 4: Lugar 5: ¿Cuáles son los 5 lugares que usted más frecuenta fuera de su localidad?: 70. 71. 72. 73. 74. Lugar 1: Lugar 2: Lugar 3: Lugar 4: Lugar 5: E. MUESTRAS SANGUÍNEAS RECOLECTADAS 75. Se tomó muestra de sangre venosa: 76. Fecha de toma de muestra de sangre: Si No Día Mes 77. ¿Por qué no se tomó?: 78. OBSERVACIONES: 71 Año ANEXO 3 Descripción general del estudio de cohorte: Infección peridomiciliaria como determinante de la transmisión del dengue. 72 Descripción general del estudio de cohorte: Infección peridomiciliaria como determinante de la transmisión del dengue. Los programas de control vectorial, que principalmente se han dirigido al domicilio y peridomicilio de los casos de dengue, no han tenido el impacto esperado sobre su transmisión. Este proyecto se evalúa el supuesto de que la transmisión endémica/epidémica del dengue se inicia en el peridomicilio de los casos primarios. El objetivo es estimar la asociación existente entre la exposición a un caso sintomático de dengue y la incidencia de infección peridomiciliaria. Metodología: Se realizó una cohorte prospectiva (Tepalcingo y Axochiapan, Morelos) utilizando el sistema de vigilancia estatal para detección de casos incidentes de dengue. A los cohabitantes mayores de 5 años y a una muestra de sujetos que viven 50m a la redonda (cohorte expuesta) se les tomó muestras pareadas de sangre para medir anticuerpos específicos contra dengue con una diferencia de entre 3 y 4 meses (ELISA IgM e IgG de captura). Además, se seleccionaron sujetos de zonas que no habían presentado casos incidentes a 200m a la redonda en los dos meses previos al muestreo (cohorte no expuesta). Se consideró como variable dependiente la infección incidente sintomática/asintomática, como independiente principal la exposición al caso confirmado de dengue y como otras variables explicatorias sociodemográficas, ambientales y socio-culturales. 73 ANEXO 4 PROTOCOLO PRNT 74 PROTOCOLO PRNT A) Materiales 1) DMEM – high glucose 2) FBS 3) Pen/strep 4) PBS w/o Ca2+, Mg2+ 5) Cajas de cultivo de T150 o T175 6) Placas de 24 pozos 7) Metil- ceulosa sigma-aldrich, cat. no. M0512-250G 8) Células VERO 9) Sustrato de peroxidasa B) Procedimiento para la realización de PRNT Las células utilizadas son células VERO en medio DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium, Gibco, Invitrogen Corporation) suplementado con 10 % de suero fetal bovino, 1 % de pen/strep (P/S) y 1% de TBP. Virus: Las cepas virales empleadas en el ensayo son las siguientes: DENV-1 (Hawai), DENV2 (16681), DENV-3 (FSP032) y DENV-4 (H-241), Ensayo de PRNT: Para la realización de PRNT se requiere inactivar los sueros de los sujetos en un baño de agua a una temperatura de 56°C durante 30 min. El suero es diluido en medio DMEM. Las diluciones son 1:20,1:40, 1:80, 1:160, 1:320 y 1:640. Una vez realizadas las diluciones de los sueros inactivados se toman 75 µl de 75 cada dilución del suero y 75 µl del virus y se colocan en una placa de 96 pozos y se incuban a 37°C por una hora en constante agitación. Al finalizar la incubación del suero con el virus se toman 100 µl y se colocaran sobre el cultivo de las células VERO en placas de 24 pozos por una hora a 28°C, 5% CO2. Al terminar el periodo de incubación se aspirara el sobrenadante y se realizan 2 lavados con 1 ml de PBS 1X (Solución salina de buffer de fosfatos) para cada pozo. Una vez realizados los lavados se añade 1ml de metil-celulosa con medio DMEM a cada pozo y se deja incubando a 28°C, 5% CO2 durante 5 días. Después de los 5 días se lava con PBS 1X, se le agrega 1ml de la solución metil alcohol:acetona y se deja a temperatura ambiente (TA) por 30 min. Se descarta la solución de metil alcohol:acetona y se deja secar al aire libre. Para el revelado, es necesario hacer lo siguiente: • Realizar dos lavados con PBS 1X. • Agregar la solución de bloqueo e incubar a TA por 30 min. En seguida se le agregan 100 µl de anticuerpo de DENV por pozo y se incuba por 1hr. • Se realizan 3 lavados con PBS 1X a TA. • Se agrega el anticuerpo secundario conjugado a HRP (100 µl por pozo) y se deja incubar por 1 hr. • Se aspira y se lava 3 veces con PBS 1X a TA. • Se agregan 100 µl de la solución reveladora del kit de sustrato de peroxidasa (ENZO biochem, cat no 43825) y se incuba en la obscuridad durante 10 a 15 min. • Finalmente se cuentan las unidades formadoras de placas. La determinación de PRNT60% se determina considerando la dilución en la cual el número de placas es menor al 60% de las placas contadas en el control. Para la realización del control, se sigue con el mismo procedimiento, excepto que no se incuba con suero, únicamente se incuba el virus. 76