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El gen de la alergia. Cómo una mutación en una proteína de la
piel reveló la relación entre el eczema y el asma.
Por W. H. Irwin McLean - Professor of Human Genetics and head of the Division of
Molecular Medicine, University of Dundee, Scotland.
(Traducido Por Nicolás Jouve – Catedrático de Genética, Miembro de Cívica).
Publicado en TheScientist, el 1 de Diciembre de 2010
Era una tarde tensa de viernes en octubre de 2005. Cuatro de nosotros en el laboratorio
habíamos estado trabajando intensamente esa semana en la esperábamos con temor los
resultados de nuestro trabajo -una preocupación infundada, pero no teníamos ninguna
manera de saberlo entonces-. Recientemente, habíamos encontrado la primera mutación de
un gen asociado a una enfermedad relativamente común de la piel, pero nuestros resultados
no tenían sentido y sospechamos que debía haber una segunda mutación oculta de ese gen.
Algunos meses antes, habíamos comenzado a secuenciar una proteína gigantesca
codificada por el gen FLG, la “filagrina”, que se expresa en grandes cantidades en las capas
exteriores de la epidermis. La secuencia del gen de la filagrina era uno de los últimos para
completar el proyecto genoma humano, por una razón, es un gen inusualmente grande y con
repeticiones en su secuencia, haciendo muy difícil el análisis de la secuencia. Ordenarlo era
un esfuerzo y un desafío que llevaría años. Después de meses de perseverancia Frances
Smith, un investigador senior visitante en el laboratorio, había decidido diseñar un método
para la secuenciación de una fracción del gen. Esto permitió la identificación de una
mutación sin sentido en algunos de nuestros pacientes de ictiosis vulgaris, una patología
hereditaria caracterizada por la formación de escamas severas en la piel.
Previamente, Beverly Dale y sus colegas de la Universidad de Washington en Seattle habían
identificado la proteína filagrina en los años 80, y habían tratado de estudiar su secuencia,
pero su información era contradictoria con respecto a su papel en la ictiosis vulgaris. Tres
laboratorios importantes se habían lanzado al esfuerzo de su secuenciación, pero sin éxito.
Parte de la razón de la dificultad del análisis es que la filagrina aparece bajo la forma de un
precursor enorme, la profilagrina, que tiene un peso molecular de más de 400.000 daltons –
ocho a nueve veces mayor que la mayoría de las proteínas. En sí mismo no había
problemas desde el punto de vista del análisis genético, pero la estructura del gen también
es inusual. El ARN mensajero es enorme, al contar con cerca de 13.000 bases, codificadas
por un solo exón. El desafío verdadero era que la proteína es un polímero hecho de 10 o
más subunidades idénticas con la misma secuencia de la proteína. Por lo tanto, dentro de
ese exón gigante hay bloques de un kilobase de secuencia idénticos, ordenados en tándem
uno a continuación de otro. Este es el verdadero problema. Cuando los investigadores
intentaron amplificar un segmento particular del gen usando una reacción de PCR, los
cebadores (primers) que marcan el comienzo y el final de la secuencia del ADN no eran
bastante específicas para distinguir un segmento del gen polimérico de otro. De esta manera
cuando los investigadores intentaban secuenciar el gen para buscar las mutaciones, nunca
estaba claro si secuenciaban una región única del gen, o una de las otras nueve regiones
simultáneamente. Era como si la naturaleza nos gastara una broma.
1
Mi laboratorio comenzó a secuenciar el gen FLG, a partir de ADN de familias americanas,
escocesas e irlandesas que sufren de la ictiosis vulgaris. Frances Smith y yo habíamos
aprendido algunos trucos que nos permitieron secuenciar una región grande de otro gen con
repeticiones en su secuencia a mitad de los años 90, así que cuando comenzamos a
trabajar con el de la filagrina, encontramos bastante rápidamente la primera mutación en
este enorme gen. Esta mutación, estaba presente en alguno, pero no en todas las muestras
de nuestros pacientes de ictiosis vulgaris. Pero extrañamente, cuando mirábamos nuestros
controles “normales”, que deben carecer de la mutación, cerca de 4-5 % también tenían el
gen defectuoso. Cuando mi colaborador clínico Alan Irvine, del Hospital Pediátrico de
Nuestra Señora en Irlanda, echó una ojeada más rigurosa a los expedientes de los
pacientes, observó un patrón. Los pacientes con ictiosis parecían sufrir una forma severa o
una forma suave de la enfermedad.
De hecho, cerca de uno de cada diez personas de la población normal también tenían
ictiosis, pero en una versión tan suave, subclinica, que había de ser tratada con una crema
hidratante de la piel para revelar sus síntomas.
Ese simple experimento demostró que en el nivel molecular hay dos tipos de asma.
Fue entonces cuando comenzamos a buscar en serio una segunda mutación. Pensamos
que los pacientes con una mutación en un alelo del gen tendrían una segunda copia no
alterada del gen en su otro alelo (serían heterocigóticos), produciendo la filagrina en
cantidad moderada, lo que podría explicar la forma suave de la enfermedad. Una segunda
mutación invalidaría ambas copias del gen, explicando los casos más severos de la
enfermedad. Por medio de la PCR habíamos amplificado un fragmento del gen de unos
12.000 p.b., que contenía una copia de la mutación de un paciente americano con ictiosis
severa, y asumimos que el otro alelo del paciente llevaría una segunda mutación.
Reprodujimos los fragmentos de PCR, y secuenciamos una copia que carecía de la primera
mutación. No teníamos cebadores que lo secuenciaran completamente, así que
simplemente diseñamos un conjunto de cebadores para amplificar fragmentos de este alelo,
y tuvimos suerte, se reveló la segunda mutación. En esa tarde profética de viernes, vimos la
primera prueba indirecta de la segunda mutación. Por la tarde del sábado, después de un
experimento de noche, lo habíamos corroborado.1
Podría haber sido bastante para comenzar a celebrar el hallazgo, pero había algo más.
Cuando Alan repasó los expedientes de sus pacientes, notó que las víctimas de la ictiosis
vulgaris también exhibían otra enfermedad muy común de la piel, ezcema, con más con
frecuencia que la población en general. Al lunes siguiente, hicimos una reunión de urgencia
para discutir la posibilidad de que teníamos entre manos no una explicación de una
enfermedad sino de dos. Existía la posibilidad de que esta proteína extraña y enorme de la
piel fuese responsable de la piel escamosa, pero además ofrecía una nueva explicación
genética y celular para el eczema,2 así como para otras alergias comunes.
2
Figura:
Piel
normal
(izquierda): En la capa
granular de piel normal, la
proteína profilagrina está
defosforilada y mediante
corte enzimático da 10-12 moléculas más pequeñas de filagrina (1). Mientras que estas células mueven hasta formar el
stratum corneum, aplanan su forma valiéndose de la queratina ayudado por la interacción con las proteínas de filagrina (2).
En el stratum corneum la filagrina se degrada en aminoácidos esenciales para aportar la humedad que se mantiene en las
capas externas de la piel (3). La barrera intacta de la piel sana guarda los alergénicos, los patógenod (las bacterias y los
virus) y los irritantes químicos quedan fuera del cuerpo (4).
Eczema (derecha): Las mutaciones en el gen de la filagrina reducen grandemente la cantidad de proteína de la filagrina en
la piel o conducen a su ausencia completa (1), dando por resultado las grietas en la barrera de la piel (2) esa exposición las
capas más bajas a los alergénicos que se guardan generalmente hacia fuera, causan eczema (3). El material extraño, tal
como un alergénico, pasa a través de la barrera defectuosa de la piel, es atacado por las células del sistema inmune,
conduciendo a la inflamación de la piel y de otras respuestas alérgicas (4).
Si se expone a un niño a los alergénicos a través de la piel, esa exposición va a preparar el sistema inmune para reaccionar
agresivamente a ese alergénico más adelante en la vida, explicando la coincidencia del asma y del eczema.
La caza
Había pensado en la filagrina durante años. Como postdoctoral en el laboratorio del Birgit
Lane’s en Dundee en 1995, había trabajado en una proteína de la piel parecida en su
tamaño grande, la plectina. Esta proteína tenía seis regiones repetidas, que tenían
repeticiones internas pequeñas adicionales. El gen tenía un exón grande de 7,000 p.b., que
no se parecía a cualquier otro caso conocido anteriormente. Era la gran ballena blanca de mi
trabajo postdoctoral. Era un reto que a base técnicas y trucos pudimos resolver hasta el
conocimiento de la estructura de la plectina.
Mi interés en la plectina comenzó durante mi trabajo postdoctoral, que versó sobre patología
genéticas debidas a alteraciones en los genes de la queratina. Las queratinas forman el
citoesqueleto filamentoso dentro de las células epiteliales de la epidermis. Las capas
apiladas de células que forman la capa exterior de la piel funcionan como una barrera
3
protectora entre el organismo y su ambiente. Las células epiteliales ganan su fuerza
mecánica gracias al citoesqueleto resistente que proporciona la queratina en su citoplasma.
Los defectos en genes de la queratina hacen la piel más frágil. En el caso de las queratinas
epidérmicas, esto se manifiesta como ampollas en la piel en respuesta a un trauma tan
suave como el frotamiento, acompañado a menudo crecimiento excesivo y espesamiento de
la piel, pues la epidermis intenta de forma inútil compensar la fragilidad de las células. Se
conoce la existencia de 23 de los 54 genes de la queratina asociados a las varias
manifestaciones de estas enfermedades genéticas humanas.
Después de trabajar con genes de queratina durante años, habíamos logrado caracterizar y
secuenciar los genes que codifican proteínas tales como la plectina, que a la vez se unen a
las queratinas y anclan al citoesqueleto a membranas, o modifican a las queratinas dando a
las células de la una plétora de propiedades, como la elasticidad, consistencia y resistencia
al agua. Una de estas proteínas, la filagrina, era de una complejidad semejante a la plectina.
Dada la posibilidad de su implicación en la ichthyosis vulgaris, a mediados de los 90 fue
cuando me interesé por la secuenciación del gen y la prospección de mutanciaones
implicadas en enfermedades. Yo consideré a Beverly Dale y sus colegas de Seattle (que
habían identificado recientemente la proteína) rivales amistosos, y supe que en su
laboratorio estaban trabajando en la secuenciación del gen FLG. Era su trabajo, así que
decidimos respetarlo.
En 2004 en una reunion en Utah, Frances Smith y yo hablamos con un colega dermatólogo
de Beverly, Phil Fleckman. Comentamos que durante años muchos laboratorios habían
tratado de descifrar la estructura de la filagrina sin conseguirlo. Tal vez era nuestro turno.
Phil nos envió sus muestras de ADN y unos meses más tarde habíamos descubierto la
primera mutación, y teníamos la segunda mutación enfilada y a punto de desvelarse.
Cuando miramos los records de los pacientes de diferentes formas de ichthyosis vulgaris,
Alan se dio cuenta de que los pacientes analizados frecuentemente padecían eczema
atópico, la enfermedad más común de la piel. El eczema atópico o alergia afecta a alrededor
de uno de cada cinco niños nacidos en las naciones industrializadas. Se trata de una
inflamación de la piel, usualmente desde la infancia o la pubertad, acompañada de síntomas
de enrojecimiento y piel intensamente inflamada. El eczema viene acompañado a menudo
de una plétora de alergias, incluyendo a los alimentos y a animales de compañía, asma y
fiebre del heno.
Una segunda mutación pudo explicar los patrones genéticos extraños que habíamos
visto en familias afectadas, y también parecía hacer alusión a una historia mucho más
grande.
Inmediatamente, fuimos a la literatura y encontramos un estudio de 2001 de Bill Cookson y
sus colegas, ahora en el Imperial College de Londres. Habían demostrado que había una
región en el cromosoa 1 relacionada con la susceptibilidad al eczema. Exploramos aquella
región del genoma humano en las bases de datos –una región muy grande- y allí estaba el
gen de la filagrina.
Fuimos de nuevo a nuestra colección de muestras de ADN de cerca de 50 pacientes
irlandeses de la ictiosis vulgaris y de 200 miembros de la población en general. Era un
tamaño de muestra realmente minúsculo para un estudio de caso-control. La mayoría de
tales estudios genéticos epidemiológicos para caracteres complejos requieren millares de
muestras entre pacientes y controles, así es que no éramos demasiado optimistas sobre si
4
encontraríamos un ajuste estadístico significativo entre la ictiosis vulgaris y el eczema.
Contamos el número de gente con una mutación de la filagrina en el grupo de pacientes con
eczema y en la población en general, y comparamos los resultados usando una prueba
estadística. Si las mutaciones eran más frecuentes en pacientes con el eczema comparado
con el grupo control, entonces habíamos encontrado un gene del eczema. Se considera una
diferencia significativa entre los casos y los controles cuando la desviación entre lo
observado y lo esperado tiene una frecuencia inferior al 5% (p<0,05). En genética se
considera además altamente significativo cuando p<0,001. Nuestro resultado corroboró que
el gen de la filagrina está implicado en el eczema. Los estudios más recientes, nos permiten
demostrar que en hasta un 50% de niños con eczema severo son portadores de una a dos
mutaciones en el gene de la filagrina.3
Un laboratorio vecino en Dundee (Escocia), dirigido por Colin Palmer, tenía un estudio en
curso de la genética del asma. Analizábamos sus muestras de 600 niños de la escuela de
Dundee, todos los cuales tenían asma, así como 1000 controles al azar de la población, para
las dos mutaciones de la filagrina. Clasificamos a los niños que tenían a la vez eczema y
asma y a los que solo tenían asma. De este modo la población se dividió en dos grupos casi
exactamente de igual tamaño, de 300 niños cada uno. Los niños con asma solo no
demostraron ninguna asociación con las mutaciones de la filagrina, pero los niños con
ambas enfermedades demostraron otra vez una asociación estadística de gran alcance.
Este simple experimento demostraba que en el nivel molecular hay dos tipos de asma: un
asma producido por un mecanismo de deficiencia de la barreda en la piel, que da lugar al
eczema, y un asma debido a un mecanismo distinto. Publicamos nuestros resultados
iniciales del asma junto con el trabajo del eczema. Seis meses más tarde habíamos
conseguido el modo de abordar el conocimiento completo del gen de la filagrina y habíamos
descubierto que hay un número de mutaciones comunes en el gen que se presentaron hace
millares de años en las primeras poblaciones humanas, además de muchas mutaciones
raras que se han presentado más recientemente. No sólo había una asociación entre una
mutación en el gen y la enfermedad en europeos, sino que también encontramos
mutaciones raras específicas y comunes en otras poblaciones no blancas de Asia.4
La base genética de la alergia
Lo qué parecía al principio ser una asociación que sorprendía comenzó a tener sentido en
un nivel celular y molecular a medida que continuamos estudiando la proteína. La filagrina es
crucial para la formación del stratum corneum, la capa de células muertas en la superficie de
la piel, y también para la hidratación de esta capa crucial de barrera. La gente que tiene
mutaciones en una o ambas copias del gen de la filagrina posee una piel seca y escamosa
que es permeable a los alergénicos o a los irritantes químicos. Cuando la barrera está
agrietada, el material extraño puede pasar a través de estas capas de la piel. Pensamos que
en la niñez,dentro de los meses primeros vida, puede ocurrir que los patógenos y los
irritantes extraños atraviesen una capa anormalmente porosa de la piel, activando una
respuesta inmunológica alérgica fuerte, y preparando así el cuerpo para reaccionar a los
antígenos que no entrarían normalmente por esa ruta. Más adelante en la vida, cuando el
sistema inmune del niño entra en el contacto con esos mismos alergénicos, quizás a través
de los pulmones, reacciona agresivamente, causando la inflamación en los pulmones lo que
da lugar a los cortes de respiración. De hecho, muchos niños con eczema tienen alergias
múltiples frente al polvo, pelo de animales domésticos y otras sustancias.
5
Durante los 20 años precedentes, el estudio del eczema y el asma habían sido dominados
por teorías inmunológicas. La hipótesis predominante dictó que estas enfermedades estaban
causadas por un cierto malfuncionamiento del sistema inmune.
De hecho, pacientes que sufren de eczema y asma tiene un sistema inmune Th2
sobreactivado. La respuesta conduce a la sobreproducción de anticuerpo IgE contra los
alergénicos. Las citokinas Th2 están de hecho presentes. Lo que ahora hemos demostrado
es en estos casos no hay un malfuncionamiento primario en el sistema inmune, sino un mal
funcionamiento genético en la piel que provoca el eczema y, en algunos casos, el asma. La
función de la barrera de piel es ahora el centro de atención en la investigación del eczema.
Sin embargo, debe observarse que el gen de la filagrina no es el único de la predisposición
para el eczema, y es probable que emerjan otros, algunos de las cuales estarán
probablemente implicados en el malfuncionamiento del sistema inmune.
Animados por estos resultados, hemos alertado a nuestros colegas sobre la posibilidad de
que la filagrina esté implicada en otras enfermedades. El blanco natural siguiente es la
psoriasis, otra enfermedad caracterizada por los problemas de escamación y enrojecimiento
de la piel. No encontramos ninguna asociación con ninguna mutación de la filagrina, aunque
parece que un gen próximo está implicado en susceptibilidad a la psoriasis.
¿Curar una alergia genética?
La pregunta ahora es cómo evitar que el eczema, el asma, y las alergias ocurran en
pacientes con las mutaciones de la susceptibilidad en su gen de la filagrina. ¿Si fuera
posible encontrar una curación para el eczema en adultos, podríamos también curar el
asma, o sería demasiado tarde, con un sistema inmune preparado permanentemente contra
los alergénicos? Al menos puede ayudar. Si la barrera de la piel no se repara, entonces el
sistema inmune producirá constantemente más anticuerpos en respuesta a los alergénicos
que atravesaran la barrera. Parar ese asalto puede tener algunos efectos beneficiosos. La
posibilidad es que podemos prevenir el eczema en niños jóvenes antes de que se
sensibilicen.
Hemos publicado recientemente un trabajo sobre un modelo del ratón con una mutación en
el gen murino de la filagrina, que es altamente análogo al humano incluso en sus
mutaciones. Estos ratones tienen muchos de los sellos del eczema, incluyendo las
respuestas elevadas de IgE y de cytokine Th2, proporcionando así la evidencia experimental
que corrobora la hipótesis de la piel-barrera. El plan es crear un modelo de ratón en el cual
poder desactivar y activar el gen de la filagrina con el finalidad de definir el período más
eficaz para el tratamiento preventivo frente al eczema.
También hemos comenzado a buscar maneras de ayudar al organismo a substituir la
filagrina en el nivel celular. Estamos buscando actualmente en bibliotecas químicas,
moléculas pequeñas para nuevas clases de compuestos que pudieran inducir a las células
de la piel a la producción de más proteína filagrina. Los resultados parecen prometedores,
por lo que estamos esperanzados que en algunos años, se encuentren nuevos fármacos
para tratar estas enfermedades comunes.
Referencias
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1. F.J. Smith et al., “Loss-of-function mutations in the gene encoding filaggrin cause ichthyosis vulgaris,” Nat
Genet, 38:337-42, 2006.
2. C.N. Palmer et al., “Common loss-of-function variants of the epidermal barrier protein filaggrin are a major
predisposing factor for atopic dermatitis,” Nat Genet, 38:441-46, 2006.
3. A. Sandilands et al., “Comprehensive analysis of the gene encoding filaggrin uncovers prevalent and rare
mutations in ichthyosis vulgaris and atopic eczema,” Nat Genet, 39:650-54, 2007.
4. P.G. Fallon, “A homozygous frameshift mutation in the mouse FLG gene facilitates enhanced percutaneous
allergen priming,” Nat Genet, 41:602-08, 2009.
5. A. Sandilands et al., “Filaggrin in the frontline: role in skin barrier function and disease,” J Cell Sci, 122:128594, 2009.
Leer más: The Allergy Gene - The Scientist - Magazine of the Life Sciences http://www.thescientist.com/article/display/57833/#ixzz173DvimyD
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