Download vacunas que contienen bacterias atenuadas.

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OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
11 Número de publicación: 2 230 729
51 Int. Cl. : A61K 39/02, A61K 39/112
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A61K 39/108, A61K 39/106
A61K 39/102, A61K 39/095
A61K 39/10
// (C12N 1/21, C12N 1:36
C12R 1:42)
ESPAÑA
12
TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA
T3
86 Número de solicitud europea: 98959023 .7
86 Fecha de presentación: 10.12.1998
87 Número de publicación de la solicitud: 1037664
87 Fecha de publicación de la solicitud: 27.09.2000
54 Título: Vacunas que contienen bacterias atenuadas.
30 Prioridad: 11.12.1997 GB 9726233
73 Titular/es: Celltech Pharma Europe Limited
208 Bath Road
Slough, Berkshire SL1 3WE, GB
45 Fecha de publicación de la mención BOPI:
01.05.2005
72 Inventor/es: Chatfield, Steven N.;
Sydenham, Mark y
Dougan, Gordon
45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:
74 Agente: Ungría López, Javier
ES 2 230 729 T3
01.05.2005
Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de
la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea
de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se
considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del
Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
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DESCRIPCIÓN
Vacunas que contienen bacterias atenuadas.
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La invención trata de vacunas que contienen bacterias atenuadas.
Antecedentes de la invención
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El principio de la vacunación es inducir una respuesta inmune en el hospedador, de manera que proporciona
protección frente a una posterior estimulación con un patógeno. Esto se puede conseguir con una cepa viva atenuada
del patógeno (es decir, una cepa que tiene virulencia reducida de modo que no causa la enfermedad que causa el
patógeno virulento).
Clásicamente, las vacunas de cepas vivas atenuadas de bacterias y virus, se han seleccionado usando una de las
dos metodologías diferentes. Los mutantes se han creado bien por tratamiento del organismo usando compuestos
químicos mutagénicos o por pases repetidos del organismo in vitro. Sin embargo, el uso de cualquier método produce
un aumento de las cepas atenuadas en las que el modo de atenuación no está claro. Estas cepas son particularmente
difíciles de caracterizar en términos de posible reversión a la cepa de tipo silvestre ya que la atenuación puede reflejar
resultantes de mutación individual (fácilmente reversible) o múltiple.
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Usando las técnicas genéticas modernas, ahora es posible construir genéticamente cepas de bacterias atenuadas
definidas en las que pueden crearse deleciones atenuantes estables. Varios mutantes de sitio dirigidos de Salmonella se
han creado usando este tipo de tecnología (2, 5, 6, 12, 22, 35, 36, 37). Entre las lesiones atenuantes más estudiadas de
forma exhaustiva están aquellas en las que se han creado mutaciones en las rutas biosintéticas, lo que se traduce en bacterias auxótrofas (por ejemplo los genes aro). Las mutaciones en estos genes se describieron por primera vez en 1950
(1) como las responsables de volver a Salmonella menos virulenta para ratones. Varias mutaciones auxótrofas diferentes tales como galE, aroA o purA también se han descrito previamente (6, 12). Mutantes de Salmonella aroA ahora
han sido bien caracterizadas y han mostrado ser excelentes vacunas vivas contra la salmonelosis en varias especies
animales. Además, para reducir las oportunidades de reversión a la virulencia por una recombinación de mutaciones
resultantes, ahora se han introducido en dos genes independientes tales como aroA/purA y aroA/aroC. También se
han dado mutaciones idénticas en cepas de Salmonella adaptadas al hospedador tales como S. typhi (humanos) y S.
dublin (ganado vacuno) como resultado de la creación de varias vacunas de dosis única que se han probado con éxito
en pruebas clínicas (11, 17) y prácticas (15).
En estudios animales, se han usado S. typhimurium atenuadas como vehículo para la liberación de antígenos heterólogos para el sistema inmune (3, 8, 32). Esto aumenta el potencial de desarrollo de vacunas multivalentes para su
uso en el hombre (9).
Sumario de la invención
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El propósito original del trabajo que condujo a la invención fue la identificación de nuevos genes que están implicados en las rutas de virulencia de las bacterias patógenas, la identificación y deleción de aquellos que pueden volver
a la bacteria no virulenta y apropiada para su uso como vacunas. Para identificar las lesiones atenuantes, se introdujeron mutaciones al azar en el cromosoma de S. thyphimurium usando el transposón TnphoA (18). Este transposón es
único en el sentido de que está manipulado para identificar proteínas que se expresan en o hacia la membrana exterior
bacteriana; tales proteínas pueden estar implicadas en la interacción con y la captación por los tejidos del hospedador. Mediante el uso de la ruta oral natural de infección para investigar estos mutantes, se identificaron aquellos con
lesiones importantes, inducidas in vivo, y atenuantes en genes.
Uno de tales genes identificado a través de este trabajo es surA. Se sabe que el producto del gen surA promueve
el plegamiento de proteínas extracitoplásmicas. De acuerdo con esto, la invención proporciona una vacuna que comprende un vehículo o diluyente y una bacteria atenuada por una mutación no reversible en un gen que codifica una
proteína que promueve en plegamiento de proteínas extracitoplásmicas. La vacuna tiene la capacidad de proporcionar
protección frente a una estimulación oral de tipo homólogo al silvestre con la bacteria virulenta. Además, la bacteria
usada en la vacuna puede comportarse como vehículo para antígenos heterólogos tales como el fragmento C de la
toxina del tétanos.
Descripción detallada de la invención
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Proteínas que promueven el plegamiento de proteínas extracitoplásmicas
Las proteínas de las membranas periplásmica y externa se secretan a través de la membrana citoplasmática (interna) en un estado desplegado en su mayor parte, y después se pliegan tras la secreción. El plegamiento a menudo
tiene ayuda enzimática para catalizar la formación de los enlaces necesarios para que la proteína alcance su estado
plegado. Por ejemplo, el plegamiento a menudo requiere la participación de enzimas que catalizan la formación de
enlaces disulfuro o enzimas que catalizan la isomerización de los enlaces prolilo (peptidil-prolil cis-trans isomerasas o
PPiasas).
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Una PPiasa conocida es SurA. Ahora se ha mostrado que una mutación del gen surA causa atenuación de la bacteria
virulenta y que las bacterias atenuadas son útiles como vacunas.
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SurA se describió en principio como esencial para la supervivencia de E. coli en la fase estacionaria (33). Es una
proteína periplásmica. Más recientemente, SurA se ha descrito como una tercera y nueva familia de PPiasas (30), la
familia de las parvulinas. Estudios adicionales han mostrado que SurA está implicada en el plegamiento correcto de
proteínas de la membrana exterior tales como OmpA, OmpF, y LamB (16, 24, 29).
Las PPiasas están divididas en tres familias, las ciclofilinas, las proteínas de unión FK506 (FKBP) y las parvulinas.
Todos los miembros de las tres familias se han encontrado en E. coli. A parte de SurA, la familia de las parvulinas
incluye varias proteínas tales como NifM, PrsA y PrtM.
Bacterias útiles en la invención
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Las bacterias que se han usado para hacer las vacunas de la invención son generalmente aquellas que infectan
mediante la ruta oral. Las bacterias pueden ser aquellas que invaden y crecen en células eucarióticas y/o colonizan
superficies de la mucosa. Las bacterias son generalmente Gram-negativas.
Las bacterias pueden ser del género Salmonella, Escherichia, Vibrio, Haemophilus, Neisseria, Yersinia, Bordetella
o Brucella. Ejemplos de tales bacterias son Salmonela typhimurium - la causa de la salmonelosis en varias especies
animales; Salmonella typhi - la causa de la fiebre tifoidea humana; Salmonella enteritidis - la causa de la intoxicación
alimentaria en humanos; Salmonella choleraesuis - una causa de la salmonelosis en cerdos; Salmonella dublin - una
causa de ambas enfermedades diarreica y sistémica en ganado, especialmente en terneros recién nacidos; Escherichia
coli - una causa de la diarrea y la intoxicación alimentaria en humanos; Haemophilus influenzae - una causa de la
meningitis; Neisseria gonorrhoeae - una causa de la gonorrea; Yersinia enterocolitica - la causa de un intervalo de
enfermedades que abarca desde la gastroenteritis hasta la enfermedad septicémica mortal; Bordetella pertussis - la
causa de la tos ferina; o Brucella abortus - una causa del aborto y la infertilidad en ganado y una enfermedad conocida
como brucelosis en humanos.
Las bacterias de Salmonella son particularmente útiles en la invención. Así como son vacunas en sí mismas, buenas
contra la infección por Salmonella, se pueden usar bacterias de Salmonella atenuadas como vehículos de antígenos
heterólogos de otros organismos para el sistema inmune mediante la ruta oral. Las bacterias de Salmonella son potentes
inmunógenos que son capaces de estimular respuestas celulares locales y sistémicas. Se conocen los sistemas para
dirigir la expresión de antígenos heterólogos en Salmonella in vivo; por ejemplo, se sabe que los promotores de nirB
y htrA son eficaces para dirigir la expresión de antígenos in vivo.
La invención es también particularmente aplicable a E. coli, especialmente a E. coli enterotoxigénico (“ETEC”).
ETEC es una clase de E. coli que causa diarrea. Colonizan el intestino delgado proximal. Una cepa estándar ETEC es
ATCC H10407.
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Las infecciones de ETEC son la causa más frecuente y única de la diarrea de los viajeros, que causan 3-9 millones
de casos por año entre los visitantes de países en desarrollo. En áreas endémicas, las infecciones de ETEC son una
causa importante de la diarrea deshidratante de niños y jóvenes, que da como resultado 800.000 muertes al año en
los menores de 5 años del mundo. En países en desarrollo, la incidencia de las infecciones de ETEC lleva a una
disminución de las enfermedades clínicas con la edad, lo que indica que la inmunidad frente a infecciones de ETEC se
puede adquirir. En contraste, los adultos ingenuos de países industrializados que visitan áreas endémicas son altamente
susceptibles a las infecciones de ETEC. Sin embargo, con visitas prolongadas o repetidas a las áreas endémicas,
disminuye la susceptibilidad a infecciones de ETEC, lo que sugiere que se puede probar con éxito una propuesta de
vida atenuada para vacunación de ETEC.
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La Sec. Id. Nº 1 muestra la secuencia del tramo de lectura abierta surA en Salmonella typhimurium, y la Sec. Id.
Nº 2 muestra la secuencia del tramo de lectura abierta de surA en E. coli.
Mutaciones secundarias
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Las bacterias usadas en la invención contienen preferiblemente una mutación en uno o más genes además de la
mutación en el gen que codifica una proteína que promueve el plegamiento de proteínas extracitoplásmicas. Esto es
para minimizar el riesgo de que la bacteria revierta al estado de virulencia, que es claramente importante para el
uso de la bacteria como vacuna humana o animal. Aunque se atenúan las bacterias que contienen sólo una mutación
en una proteína que promueve el plegamiento de proteínas extracitoplásmicas y el riesgo de reversión es pequeño,
generalmente será deseable introducir al menos una mutación adicional para reducir el riesgo de atenuación aún más.
Se conocen varios genes que son candidatos para mutaciones secundarias y adicionales (véase por ejemplo ref.
39). Estos incluyen los genes aro (35), los genes pur, el gen htrA (37), el gen ompR (36), el gen galE, el gen cya,
el gen crp o el gen phoP. El gen aro puede ser aroA, aroC, aroD o aroE. El gen pur puede ser purA, purB, purE o
purH. El uso de mutantes aro, especialmente los mutantes aro dobles, se prefieren porque tales mutantes han mostrado
se particularmente eficaces como vacunas. Combinaciones apropiadas de mutaciones aro son aroAaroC, aroAaroD y
aroAaroE.
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La naturaleza de la mutación
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Las mutaciones introducidas en la vacuna bacteriana generalmente suprimen la función del gen completamente.
Esto se puede conseguir bien mediante supresión de la síntesis de cualquier polipéptido por completo a partir del gen o
bien haciendo una mutación que da como resultado la síntesis de un polipéptido no funcional. Para suprimir la síntesis
de cualquier polipéptido, bien se puede delecionar el gen completo o bien su extremo 5’. Una deleción o inserción
en la secuencia codificante de un gen puede usarse para crear un gen que sintetice sólo polipéptidos no funcionales
(por ejemplo un polipéptido que contiene sólo la secuencia N-terminal de la proteína de tipo silvestre). En el caso
de mutaciones en genes que codifican proteínas que promueven el plegamiento de proteínas extracitoplásmicas, la
mutación generalmente suprime la capacidad de la proteína para promover dicho plegamiento de la proteína.
15
Las mutaciones son mutaciones no reversibles. Estas son mutaciones que esencialmente no muestran reversión
al tipo silvestre cuando la bacteria se usa como vacuna. Tales mutaciones incluyen inserciones y deleciones. Las
inserciones y deleciones son preferiblemente grandes, típicamente de al menos 10 nucleótidos de longitud, por ejemplo
de 10 a 600 nucleótidos.
20
La bacteria usada en la vacuna contiene preferiblemente sólo mutaciones definidas, es decir, mutaciones que están
caracterizadas. Es claramente no deseable el uso de una bacteria que tiene mutaciones no caracterizadas en su genoma
como una vacuna porque puede ser un riesgo ya que las mutaciones no caracterizadas pueden conferir propiedades a
la bacteria que causen efectos secundarios no deseables.
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Las mutaciones atenuantes se pueden construir mediante métodos bien conocidos por los especialistas en la técnica
(véase ref. 31). Un medio para introducir mutaciones no reversibles en proteínas extracitoplásmicas es el uso del
transposón TnphoA. Este puede introducirse en la bacteria para generar fusiones de proteínas de fosfatasa alcalina
enzimáticamente activas como proteínas extracitoplásmicas. El transposón TnphoA lleva un gen codificante de la
resistencia a kanamicina. Se seleccionan los transductantes que son resistentes a kanamicina mediante colonias que
crecen en un medio de selección apropiado.
Métodos alternativos incluyen la clonación de secuencias de ADN de tipo silvestre en un vector, por ejemplo
un plásmido o un cósmido, e inserción de un marcador seleccionable en la secuencia de ADN clonada o deleción
de una parte de la secuencia de ADN, lo que da como resultado su inactivación. Una deleción se puede introducir
mediante, por ejemplo, el corte de la secuencia de ADN usando enzimas de restricción que cortan en dos puntos de la
secuencia codificante y ligando juntos los dos extremos de la secuencia que queda. Un plásmido que lleva la secuencia
de ADN inactivada se puede transformar en una bacteria mediante técnicas conocidas. Entonces, mediante selección
apropiada, es posible identificar un mutante donde la secuencia de ADN inactivada ha recombinado en el cromosoma
de la bacteria y la secuencia de tipo silvestre se ha vuelto no funcional en un proceso conocido cono recombinación
homóloga.
Expresión de los antígenos heterólogos
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La bacteria atenuada usada en la vacuna de la invención puede manipularse genéticamente para expresar un antígeno de otro organismo (un “antígeno heterólogo”), de modo que la bacteria atenuada funcione como un vehículo
del antígeno de otro organismo. En este sentido es posible crear una vacuna que proporciona protección frente al otro
organismo. Se puede producir una vacuna multivalente que no sólo proporciona inmunidad frente al precursor virulento de la bacteria atenuada sino que también proporciona inmunidad frente a otro organismo. Además, la bacteria
atenuada se puede manipular para que exprese más de un antígeno heterólogo, en cuyo caso los antígenos heterólogos
pueden ser de los mismos o de diferentes organismos.
Los antígenos heterólogos pueden ser una proteína completa o una parte de una proteína que contiene un epítopo.
El antígeno puede ser de otra bacteria, un virus, una levadura o un hongo. Más especialmente, la secuencia antigénica
puede ser de virus del tétanos, de la hepatitis A, B o C, de rinovirus de humanos tales como tipo 2 o tipo 14, del virus
de herpes simple, de poliovirus tipo 2 o 3, de virus de la fiebre aftosa, del virus de la influenza, del virus coxsakie o de
Chlamydia trachomatis. Los antígenos útiles incluyen la subunidad de la toxina B inestable al calor de E. coli (LT_B),
los antígenos K88 de E. coli, la proteína P.69 de B. pertusis y el fragmento C de la toxina del tétanos.
55
El ADN que codifica el antígeno heterólogo se expresa a partir de un promotor que es activo in vivo. Dos buenos
promotores son el promotor de nirB (38, 40) y el promotor de htrA (40).
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Una construcción de ADN que comprende el promotor operable unido al ADN que codifica el antígeno heterólogo
puede hacerse y transformarse en la bacteria atenuada usando técnicas convencionales. Los transformantes que contienen la construcción de ADN se pueden seleccionar, por ejemplo, mediante selección de un marcador seleccionable
en la construcción. La bacteria que contiene la construcción puede hacerse crecer in vitro antes de formularla para la
administración al hospedador con propósitos de vacunación.
Formulación de la vacuna
La vacuna se puede formular usando técnicas conocidas para la formulación de vacunas de bacterias atenuadas. La
vacuna se presenta ventajosamente para administración oral, por ejemplo en una forma encapsulada liofilizada. Tales
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cápsulas se pueden proporcionar con un recubrimiento entérico que comprende, por ejemplo, Eudragate “S” (Marca
Comercial), Eudragate “L” (Marca Comercial), acetato de celulosa, ftalato de celulosa o hidroxipropilmetilcelulosa.
Estas cápsulas se pueden usar como tales, o como alternativa, se puede reconstituir el material liofilizado antes de la
administración. La reconstitución se puede efectuar ventajosamente en un tampón a un pH apropiado para asegurar la
viabilidad de la bacteria. Para proteger la bacteria atenuada y la vacuna de la acidez gástrica, se administra ventajosamente una preparación de bicarbonato sódico antes de cada administración de la vacuna. Como alternativa, la vacuna
se puede preparar para administración parenteral, administración intranasal o administración intramuscular.
La vacuna se puede usar en la vacunación de un hospedador, particularmente un hospedador humano pero sólo un
hospedador animal. Por lo tanto una infección causada por un microorganismo, especialmente un patógeno, se puede
prevenir mediante administración de una dosis eficaz de una vacuna preparada de acuerdo con la invención. La dosis
empleada dependerá de varios factores que incluyen el tamaño y peso del hospedador y el tipo de vacuna formulada.
Sin embargo, una dosis que comprende la administración oral de 107 a 1011 bacterias por dosis puede ser conveniente
para un hospedador adulto humano de 70 kg.
15
Ejemplos
Los siguientes Ejemplos sirven para ilustrar la invención.
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Breve descripción de los dibujos
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Figura 1: Transferencia de Southern que confirma la deleción creada en surA en la cepa BRD1115. Los carriles 1
y 2 se han restringido usando la enzima PstI, los carriles 3-10 se han restringido con SalI. Los filtros se han sondeado
usando un producto de PCR de 500 pb que contiene un fragmento de 500 pb del centro del gen surA. Los carriles 2
y 4 muestran hibridación de esta sonda en una banda de 500 pb más pequeña que la que corresponde a los carriles
1 y 3 de tipo silvestre. El transposón mutante BRD441 muestra hibridación en 2 bandas ya que la enzima SalI corta
el transposón en dos. HB101 no muestra hibridación mientras que las otras cepas de Salmonella de tipo silvestre
muestran la misma hibridación que C5 cuando se restringen con SalI.
30
Figura 2: Esta figura muestra la colonización y persistencia de BRD1115, BRD441 y el C5 de tipo silvestre en
los nódulos linfáticos mesentéricos (gráfica superior izquierda), en las placas de Peyer (inferior derecha), en los bazos
(inferior izquierda) y los hígados (superior derecha) en ratones BALB/c después de inoculación oral. El eje x es el
tiempo en días y el eje y es el log10 CFU/ml (CFU mide unidades formadoras de colonias).
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Figura 3: Se construyeron 3 cepas para evaluar la capacidad de cepas mutantes de Salmonella para liberar el
antígeno heterólogo Fragmento C en el ratón. BRD1115 es la cepa precursora. Se introdujeron dos plásmidos que
codifican el gen del Fragmento C de la toxina del tétanos bajo el control bien del promotor de htrA o bien del promotor
de nirB en la cepa BRD1115 para dar las cepas BRD1127 y 1126 respectivamente. La expresión del fragmento C
se determinó in vitro mediante transferencia de Western. Estas cepas se usaron después en un experimento in vivo
usando ratones BALB/c. Grupos de 10 ratones se inmunizaron por vía oral con log10 8 organismos de cada una de las
3 cepas. Se tomaron semanalmente muestras de suero y se analizaron para anticuerpos totales frente al fragmento C
de la toxina del tétanos. Se determinó la titulación de anti-fragmento C como la muestra de mayor dilución que da un
valor de absorbancia de 0,3 por encima del suero de ratón normal. La muestra de mayor dilución que se analizó fue
1/6250. Todos los ratones inmunizados con BRD1126 mostraron títulos de anticuerpo mayores que 6250.
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Figura 4: Esquema que muestra un mapa de plásmido de pLG339/surA.
Figura 5: Gráfico que muestra la supervivencia de ratones Balb/c después de estimulación oral con log10 8 bacterias
de las tres cepas C5, BRD1115 y K2.
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Ejemplo 1
55
Este ejemplo muestra la identificación de mutaciones en surA como mutaciones atenuantes, la construcción de una
mutación surA definida y la evaluación de una mutación surA como vacuna (ambas frente a estimulaciones homólogas
y como vehículos para antígenos heterólogos).
Materiales y métodos
1.1. Bacterias, bacteriófagos, plásmidos y condiciones de crecimiento
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Las bacterias usadas en este estudio están enumeradas en la Tabla 1. Las bacterias se cultivaron rutinariamente en
agar-L o caldo-L que contiene 10 µg/ml de ampicilina o 50 µg/ml de kanamicina donde corresponda. El bacteriófago
P22HT105/1int es un bacteriófago de alta frecuencia de transducción obtenido del Dr. Tim Foster (Trinity College,
Dublin). Se diseña el plásmido pGEM-T (Promega Corporation, EEUU) para clonación directa de fragmentos de
PCR y pBluescriptºII SK+ (Stratagene Ltd, Cambridge, Reino Unido) es un vector de clonación general. Los otros
plásmidos se describen en el texto.
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1.2. Purificación de ADN y técnicas de manipulación de ADN
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Toda manipulación de ADN que incluye transferencia de Southern se llevaron a cabo como lo describe Sambrook
et al (31). Las enzimas de restricción y la ligasa de ADN T4 se adquirieron de Boerhringer Mannheim (Lewes, Reino
Unido) y se usaron de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. La preparación del ADN cromosómico se
preparó de acuerdo con el método de Hull (13).
1.3. Secuenciación de ADN
10
La secuenciación del plásmido de doble cadena se llevó a cabo usando el equipo Sequenase (Marca Comercial,
United Sates Biochemical Corporation) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. El marcaje del ADN se
llevó a cabo usando dATP-35 S (Amersham, Reino Unido) y los fragmentos se separaron en un gel de 8% acrilamida/bisacrilamida que contiene 7M urea, durante 2 horas a 35 mA.
15
1.4. Amplificación de ADN mediante la reacción en cadena de la polimerasa
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Las reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) se llevaron a cabo con la Taq polimerasa de ADN usando el
equipo GeneAmp (Marca Comercial, Perkin Elmer Cetus, EEUU) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes.
Los oligonucleótidos se adquirieron de la Unidad de Medicina Molecular, Kings College, Londres y las secuencias
se muestran en la Tabla 1. Las mezclas de ADN y los cebadores específicos se sometieron a múltiples rondas de
desnaturalización, hibridación y extensión en presencia de la enzima Taq polimerasa. Se añadieron 10 ng de ADN
de plásmido y 1 mg de ADN cromosómico a una mezcla que contiene 5 µg de tampón 10 x (100 mM Tris-HCl, pH
8,3; 500 mM KCl; 15 mM MgCl2 ; 0,01% gelatina (v/v)); 8 µl de mezcla de desoxinucleótidos (1,25 mM de cada
desoxinucleótido trifosfato; dATP, dCTP, dGTP y dTTP); 1 µl de un cebador con sentido 10 µM; 1 µl de un cebador
antisentido 10 µM y 2,5 unidades de Taq polimerasa. Esta mezcla se cubre con 50 µl de aceite mineral ligero (Sigma)
para prevenir la evaporación y los tubos se incuban en un aparato de Ciclo Térmico Omnigene (Marca Comercial,
Hybaid). La amplificación del ADN se llevó a cabo usando el siguiente programa: 1 ciclo de 95ºC durante 5 minutos,
50ºC durante 1,5 minutos, 74ºC durante 2 minutos; 19 ciclos de 95ºC durante 1,5 minutos, 50ºC durante 2 minutos,
74ºC durante 3 minutos; 10 ciclos de 95ºC durante 2 minutos, 50ºC durante 2 minutos, 74ºC durante 7 minutos.
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1.5. Transformación de las bacterias
1.5.1. Choque por calor
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Las bacterias se vuelven competentes a la aceptación de ADN mediante el método de cloruro de calcio. Se usó un
cultivo bacteriano nocturno para sembrar 25 ml de cultivo en caldo LB (una dilución 1:100) que creció aeróbicamente
con agitación hasta que las células alcanzaron la mitad de la fase logarítmica de crecimiento (DO 650 nm = 0,4 a 0,6).
Las células se recolectaron mediante centrifugación a 3000 x g durante 10 minutos a 4ºC. El sobrenadante se descartó
y el precipitado se resuspendió en 25 ml de CaCl2 75 mM enfriado con hielo. El proceso se repitió y las células se
incubaron en hielo durante 30 minutos. Las células se precipitaron mediante centrifugación a 3000 x g durante 10
minutos a 4ºC. El precipitado celular se resuspendió en 1,2 ml de CaCl2 74 mM enfriado con hielo y se guardó en
hielo hasta que se necesitó. Las células eran entonces competentes para la aceptación del ADN. Se añadió un máximo
de 20 µl de mezcla de ligación a 200 µl de las células competentes y la mezcla se guardó en hielo durante 30 minutos.
Entonces las células se sometieron a choque por calor mediante incubación en un baño de agua a 42ºC durante 2
minutos. Entonces las células se transfirieron de vuelta al hielo durante otros 2 minutos. Se añadió 1 ml de caldo LB
a la mezcla y las células se incubaron a 37ºC durante al menos 60 minutos para permitir la expresión del marcador
de antibiótico en el plásmido. Se sembraron alícuotas de células de 100 µl en placas de agar LB que contienen los
antibióticos apropiados y se incubaron durante la noche a 37ºC.
1.5.2. Electroporación
Se introdujo el plásmido de ADN en cepas bacterianas usando electroporación. Se generaron cultivos en la mitad
de la fase logarítmica de crecimiento como para el método de choque por calor y se hicieron precipitar las células
mediante centrifugación a 3000 x g durante 10 minutos a 4ºC. El precipitado de células se lavó dos veces con un
volumen igual de glicerol 10% enfriado con hielo y se hicieron precipitar como antes. Se resuspendió el precipitado
de células en 300-500 µg de glicerol 10% enfriado con hielo. Se añadieron aproximadamente 100 ng de plásmido (o
1µg de vector suicida) en un volumen de agua estéril de no más de 6 µl a 60 µl de células competentes en una cubeta
preenfriada en hielo. Se electroporó el plásmido en la bacteria usando un Bio-Rad Gene Pulser (Marca Comercial)
con las siguientes condiciones 1,75 kV, 600 Ω, 25 µF. Entonces se añadió 1 ml de caldo LB a los contenidos de la
cubeta de electroporación y la mezcla se incubó a 37ºC durante 90 minutos para permitir a las células recuperarse. Se
sembraron alícuotas de 100 µl de la mezcla de electroporación en medio de selección y se incubó a 37ºC durante la
noche.
1.6. Tansducción a P22
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Los experimentos de transducción se llevaron a cabo usando el bacteriófago P22 HT105/1 int− . Los fagos líticos se
prepararon usando LB5010 como cepa donante. Se hicieron crecer 5 ml de un cultivo nocturno de LB2010 en caldoL que contiene glucosa 0,2% y galactosa para incrementar la expresión de los receptores del fago en la superficie
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15
celular. Se hicieron diluciones en serie de diez veces de la solución madre de P22 en TMGS hasta 10−8 (la solución
madre es de aproximadamente 1010 pfu/ml). Se añadieron 10 µl de cada dilución a 100 µl de la solución madre
nocturna de células y se incubaron a 37ºC durante 30-45 minutos para permitir la adsorción del fago a las células.
Se añadieron 3 ml de agar superior a cada incubación y se extendieron sobre las placas de agar-L que contienen
100 µg/ml de ampicilina. Las placas se incubaron a 37ºC durante aproximadamente 4-5 horas hasta que las placas
se hicieron visibles. La dilución que dio placas casi confluyentes tras este espacio de tiempo fue la que se escogió
en la recolección. Las placas se recolectaron mediante retirada del agar superior en 2 ml de tampón de fago con un
portaobjetos de vidrio de microscopio. Se añadieron unas pocas gotas de cloroformo y la solución madre del fago
se guardó a 4ºC hasta que se necesitó. Se hizo crecer la cepa receptora C5 durante el día en caldo-L a 37ºC hasta el
final de la fase logarítmica/estacionaria. Se añadieron alícuotas de 1 µl, 5 µl, 10 µl, 20 µl y 50 µl de la nueva solución
madre del fago a alícuotas de 100 µl de la cepa receptora y se incubaron a 37ºC durante 1 hora. Entonces las células
se sembraron en placas de agar-L y ampicilina que contienen EGTA 5mM (para prevenir la replicación del fago) y se
incubaron a 37ºC durante la noche. Las colonias se volvieron a sembrar 3 veces en placas de agar-L y ampicilina que
contienen EGTA 5 mM para asegurar que estaban libres del fago. Las colonias no tuvieron más un aspecto dentado
indicando, de este modo, una ausencia de fagos.
1.7. Análisis in vitro de cepas bacterias
1.7.1. Aglutinación con antisuero
20
25
Se puede usar la aglutinación con antisuero provocado frente al antígeno O de Salmonella como un ensayo rápido
no sólo para la integridad del LPS bacteriano sino también como un diagnóstico de la cepa, por ejemplo, antisuero
frente a los antígenos 04 y 05 para S. typhimurium. Estos se obtuvieron de Murex Diagnostics Ltd (Dartford, Reino
Unido). Se recolectó una extensión de colonias a partir de la zona de crecimiento en una placa incubada durante la
noche, y se resuspendieron en 100 µl de PBS. Esta muestra se mezcló con una gota de antisuero en un portaobjetos de
vidrio y la aglutinación se comparó con una muestra positiva y una negativa.
1.7.2. Ensayo de invasión con HEp-2
30
35
40
45
La línea celular HEp-2 es un carcinoma epidérmico adherente derivado de laringe humana (ATCC CCL23). Se
puede cultivar como una monocapa en medio de Eagle modificado por Dulbecco con FCS 10%, glutamina y penicilina/estreptomicina a 37ºC en presencia de CO2 5%. Se separaron las células confluyentes a partir de los matraces de
cultivo tisular mediante el uso de tripsina/EDTA. Primero, las células se lavaron en PBS para retirar cualquier suero
que pudiera afectar la acción de la tripsina. Entonces, se añadió tripsina/EDTA a la monocapa y las células se incubaron a 37ºC durante 5 minutos. Las células se retiraron del plástico mediante punción moderada en el borde del matraz.
La tripsina se neutralizó con 1,5 volúmenes de DMEM. Las células se recogieron mediante centrifugación a 1000 x g
durante 5 minutos. El sobrenadante se retiró y el precipitado de células se resuspendió en DMEM. El precipitado de
células se contó y se ajustó la concentración para dar 2 x 105 células por ml.
Se añadió 1 ml de la suspensión celular a un pocillo de una placa de cultivo de 24 pocillos (Costar 3524), tres pocillos para cada cepa bacteriana que se estaba investigando. Las células se incubaron durante la noche para formar una
monocapa confluyente en el pocillo. Las células se lavaron 5 veces en PBS para asegurar la retirada de los antibióticos
y se añadió 1 ml de DMEM (sin antibióticos). Se añadieron 1 x 107 bacterias a cada pocillo y se incubaron a 37ºC
durante 3 horas. Se lavaron las células 3 veces en PBS para retirar cualquier bacteria extracelular. Se añadió 1 ml de
DMEM que contiene 100 µg/m de gentamicina y se incubaron las células durante 1 hora más. Las células se lavaron 5
veces con PBS. Las células se lisaron mediante la adición de 1 ml de Triton-X-100 0,1% a 37ºC durante 15 minutos.
Las células también se lisaron mediante agitación con una punta de pipeta azul y el lisado se transfirió a un tubo de
centrífuga de 1,5 ml. Las bacterias viables que habían invadido las células se contaron usando el método de ensayo de
gota Miles-Misra (19).
50
1.8. Análisis in vivo de cepas bacterianas
1.8.1. Preparación de bacterias vivas para ratones inmunizados
55
60
Se descongeló en nitrógeno líquido un vial de la cepa apropiada y se usó para inocular 250 ml de cultivo de
caldo LB que contiene el antibiótico apropiado. El cultivo se hizo crecer durante la noche a 37ºC sin agitación.
Las bacterias se recolectaron mediante centrifugación a 3000 x g durante 10 minutos y se lavaron una vez en PBS
estéril. Las bacterias se recolectaron de nuevo mediante centrifugación y se resuspendieron en 5 ml de PBS estéril.
La concentración de bacterias se estimó por densidad óptica a 650 nm usando una curva de crecimiento estándar para
la cepa. Basados en esta estimación, la concentración se ajustó con el PBS que se requería para la inmunización. Se
preparó una cuenta viable para cada inóculo para dar un número exacto de unidades formadoras de colonias por ml
(cfu/ml) administradas a cada animal.
1.8.2. Inmunización oral de ratones con bacterias vivas
65
Los ratones se anestesiaron ligeramente con una mezcla de halotano y oxígeno y se administró la bacteria mediante
alimentación por sonda en volúmenes de 0,2 ml usando una aguja de alimentación por sonda unida a una jeringuilla
de 1 ml.
7
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1.8.3. Inmunización intravenosa (i.v.) de ratones con bacterias vivas
Los ratones se colocaron en una cámara templada y se inyectaron volúmenes de 0,2 ml en la vena de la cola de
cada ratón usando una aguja de alimentación por sonda 27.
5
1.8.4. Enumeración de bacterias viables en órganos de ratones
10
Se sacrificaron grupos de cuatro o cinco ratones 7 semanas después de la inmunización oral con tres cepas bacterianas. Se extrajeron los bazos, hígados, nódulos linfáticos mesentéricos y placas de Peyer y se homogeneizaron en
10 ml de PBS estéril usando un homogeneizador tipo digestor (Colworth, Reino Unido). Se sembraron diluciones de
estos homogeneizados en agar LB con kanamicina si se requería y se incubó durante la noche a 37ºC. Entonces, se
calculó el número de bacterias viables en cada homogeneizado a partir de la dilución.
1.9. Determinación de títulos de anticuerpos frente al fragmento C
15
20
Las respuestas de los anticuerpos del suero frente al fragmento C se midieron mediante ensayo con sustancias
inmunoabsorbentes unidas a enzima (ELISA) como se describió previamente (28) usando placas EIA/RIA de 96
pocillos (Costar 3590). Los valores de absorbancia se leyeron a A490 y se trazaron como función de las diluciones
(datos no mostrados). Se añadió un control de suero de ratón normal a cada placa ELISA y se usó para definir el nivel
de respuesta antecedente.
1.10. Estimulación con la toxina del tétanos
25
Se estimularon los ratones con 0,05 µg (50 x 50% dosis letales) de toxina del tétanos purificada como se describió
previamente (7), y se registraron las muertes durante 4 días.
Resultados
2.1. Clonación y mapeo de los sitios de inserción de TnphoA
30
35
40
45
Se identificaron previamente varios mutantes de inserción S. typhimurium TnphoA como atenuantes cuando se
administraron oralmente a ratones BALB/c. Además varios de estos mutantes también mostraban una capacidad reducida para invadir líneas celulares epiteliales HEp-2 en cultivo. Para identificar los genes que habían sido interrumpidos
por la inserción TnphoA, se digirió el ADN genómico usando Sau3A y series de cósmidos preparados para cada cepa.
Estas series fueron seleccionadas usando sondas TnphoA y los cósmidos que mostraban homología con las sondas 3’
y 5’ se examinaron. Los fragmentos de estos cósmidos se clonaron en el vector pBluescriptºII SK+. La secuencia de
nucleótidos de alrededor de los sitios de inserción se determinaron y se identificaron los genes. Se encontraron dos
inserciones en el gen htrA (14), una en el gen osmZ (10) y una en el gen surA.
El tramo de lectura abierta del gen surA de Salmonella typhimurium mostrado en Sec. Id. Nº 1 es de 1281 bases de
longitud, y codifica una proteína de 427 aminoácidos con un peso molecular de 47,2 Kd. Esta proteína es prácticamente
idéntica a la que se encuentra en E. coli (34), y se describe como esencial para la supervivencia en cultivos de largo
periodo (33). El gen surA contiene un sitio de escisión por peptidasa líder, lo que indica que esta es una proteína
transportada. Ahora se ha descrito como perteneciente a una familia de peptidilprolilisomerasas, con una función para
ayudar al plegamiento correcto de proteínas de la membrana exterior (16, 24, 29).
2.2. Introducción de una deleción definida en el gen surA
50
El análisis de restricción y la secuenciación del ADN del gen surA pusieron de manifiesto la presencia de sitios
únicos de enzimas de restricción HpaI y SmaI en la región codificante del gen que podría usarse para generar una
deleción de 400 bases. El plásmido pGEM-T/212/213 se construyó para contener una región de 3 Kb que abarca todo
el gen surA y la región flanqueante. La digestión del plásmido con las enzimas HpaI y SmaI, la purificación en gel del
fragmento extenso de 5,5 Kb y la religación dio como resultado un plásmido que contiene una deleción de 419 pb en
el gen surA. Este plásmido se denominó pGEM-T/∆surA.
55
2.3. Introducción de la deleción surA en el cromosoma de S. typhimurium C5
60
65
Se digirió el plásmido pGEM-T con las dos enzimas de restricción SphI y SalI. El fragmento de 2,6 kb que contiene
el gen surA delecionado se purificó en gel y se ligó en el replicón suicida pGP704 que había sido digerido previamente
con las mismas enzimas. El replicón suicida pGP704 se había usado previamente para introducir deleciones en el cromosoma de S. typhi (4) y S. typhimurium (26) que carece del gen pir, el producto del cual es esencial para la replicación
de pGP704. La mezcla de ligación se usó para transformar la cepa SY327, una cepa de E. coli que contiene el gen
pir, y un plásmido del tamaño esperado mediante análisis de restricción. Este plásmido se denominó pGP704/∆surA.
Como los replicones suicidas no pueden replicarse en S. typhimurium el marcador de resistencia a fármaco sólo se
expresa si hay un único suceso de recombinación homóloga, que incorpora el plásmido en el cromosoma bacteriano.
El plásmido pGP704/∆surA se usó para transformar la cepa de S. typhimurium semielaborada LB5010 mediante
el método de cloruro de calcio. Se seleccionaron tres transformantes en agar que contiene ampicilina. Estos tres
8
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5
10
15
convergentes individuales se movieron desde la cepa intermedia a la cepa de tipo silvestre C5 usando transducción
P22 (20). Los lisados P22 se prepararon a partir de los tres transductantes y se introdujeron en C5. Se obtuvo una
colonia resistente a ampicilina por este proceso. Este transformante se subcultivó dos veces en caldo-L que no contiene
selección y se hizo crecer durante 48 horas. Se hicieron diluciones en serie de este cultivo y la dilución 10−6 se sembró
en placas de agar-L que no contienen selección. Se rayaron 500 colonias a mano en placas duplicadas, una que contiene
agar, la otra de agar con ampicilina. Se encontró que una colonia era sensible a ampicilina, lo que indica la pérdida del
marcador de resistencia a fármaco del plásmido tras un suceso de recombinación homóloga.
El mutante surA potencial se confirmó como una cepa de S. typhimurium mediante aglutinación con antisuero 04
y 05. La deleción se confirmó mediante PCR usando los cebadores MGR92 y MGR93, dando un producto de 1 kb.
La deleción también se confirmó mediante clonación del producto de PCR en el vector pGEM-T para dar el plásmido
pGEM-T/92/93, y secuenciación a lo largo de la deleción usando cebadores MGR130y 135. La Figura 1 muestra los
resultados de sondear el ADN genómico de C5 digerido con PstI y SalI y la cepa mutante surA con un producto de
PCR obtenido del C5 de tipo silvestre. La banda que se ve en el rastro del mutante surA es aproximadamente 400
bases más pequeña que la que se ve en el de tipo silvestre. Esta cepa delecionada se denominó BRD1115.
2.4. Caracterización de la cepa BRD1115
2.4.1. Análisis in vitro de la invasión de células epiteliales en cultivo
20
La cepa BRD1115 se ensayó para su capacidad de invadir la línea de células epiteliales HEp-2 en cultivo. Se
encontró que los niveles de invasión estaban reducidos un 80% en comparación con la cepa C5 de tipo silvestre. El
mutante transposón BRD441 mostró una reducción del 90% de invasión en comparación con C5.
25
2.4.2. Evaluación de las propiedades in vivo de BRD1115 en ratones BALB/c
2.4.2.1. Determinación de LD50 oral e i.v
30
35
40
Se calcularon los LD50 oral e i.v. de BRD1115, C5 y BRD441 usando la cepa susceptible de ratón BALB/c. Se
inocularon 5 ratones por grupo bien por vía oral o bien i.v. con dosis en el intervalo log10 4 a log10 10 por vía oral y
log10 1 a log10 5 i.v. Se registraron las muertes durante 28 días y se calcularon los LD50 mediante el método de Reed y
Meunch (27). Se determinó que BRD1115 mostraba cerca de 5 log de atenuación por vía oral y 3,5 log i.v. comparado
con C5. BRD441 mostró 4,5 log de atenuación por vía oral y 1 log i.v. Los resultados se encuentran en la Tabla 2.
2.4.2.2. Persistencia de las cepas en los órganos de ratones BALB/c tras inoculación oral
Se inocularon por vía oral grupos de 4 ratones BALB/c con log10 8 organismos de las tres cepas. Se mataron los
ratones a los 0, 1, 4, 7, 10, 16, 21 y 28 días y se examinaron los órganos para la carga bacteriana. La cepa C5 de
tipo silvestre colonizó el bazo, el hígado, los nódulos linfáticos mesentéricos y las placas de Peyer en altas cantidades
(>log10 4 cfu/ml), finalmente daban como resultado la muerte de los animales. Por otro lado, BRD1115 y BRD441
persistieron en el hígado y el bazo durante más de 40 días en bajas cantidades (<log10 2 cfu/ml). Estos resultados se
encuentran en la Figura 2.
2.5. Evaluación de BRD1115 como una cepa de vacuna potencial
45
2.5.1. BRD1115 protege frente a estimulaciones homólogas
50
Se inmunizaron por vía oral grupos de ratones BALB/c con log10 8 organismos de BRD1115 y se estimularon con
la cepa C5 de tipo silvestre a 4 semanas y 10 semanas después de la inoculación. Los ratones fueron estimulados con
log10 4 a log10 10 organismos C5 y se calculó un nuevo LD50 oral. Los niveles de protección se encuentran en la Tabla
3, que muestra log10 4 de protección tras 4 semanas y log10 5 tras 10 semanas.
2.5.2. BRD1115 como una cepa de vehículo potencial de antígenos heterólogos
55
60
65
Se introdujeron dos plásmidos codificantes del fragmento C de la toxina del tétanos en dos aislados de BRD1115
mediante electroporación. Los plásmidos son pTETnir15 (38) en el que el fragmento C está bajo el control del promotor de nirB, y pTEThtrA en el que el fragmento C está bajo el control del promotor de htrA. Se encontró que
los plásmidos se mantenían a niveles mayores del 90% en BRD1115 incluso cuando la presión de selección de la
ampicilina se retiraba del medio de crecimiento. La expresión in vitro del fragmento C se determinó mediante transferencia de Western. Las cepas se cultivaron tanto bajo condiciones inductoras (42ºC para BRD1126 y anaerobiosis
para BRD1127) y condiciones no inductoras (37ºC para BRD1126 y aerobiosis para BRD1127). Se vio un alto nivel
de expresión en ambas cepas bajo condiciones inductoras con BRD1127 que muestra mayores niveles de expresión
del fragmento C que BRD1126.
Se inmunizaron grupos de 10 ratones BALB/c por vía oral con log10 8 organismos y se sangraron semanalmente.
Los títulos de anticuerpos anti-fragmentos C presentes en el suero de cada animal se determinaron mediante ensayo
ELISA. Los títulos se determinaron como el recíproco de la muestra de mayor dilución que daba una absorbancia de
0,3 por encima del suero de ratón normal. Los resultados se encuentran en la Figura 3.
9
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5
Cuatro semanas después de la inmunización se estimularon los ratones con 50 LD50 de toxina del tétanos por vía
subcutánea y las muertes se anotaron durante 4 días. Los resultados se encuentran en la Tabla 4, que muestran que
se dio una protección del 100% tras la inmunización con BRD1127 (fragmento C bajo el control del promotor de
htrA) y una protección del 60% tras la inmunización con BRD1126 (bajo el promotor de nirB). No sobrevivieron a la
estimulación los ratones sin tratamiento previo.
Ejemplo 2
10
Este ejemplo confirma que la mutación en surA es responsable de la atenuación. Esto se determinó mediante complementación del gen delecionado con una versión intacta del gen expresado en un plásmido. La cepa complementada
era tan virulenta como el organismo de tipo silvestre dados por vía oral a los ratones.
Materiales y Métodos
15
3.1. Construcción del plásmido que contiene el gen surA intacto
pLG339 (41) es un plásmido de bajo número de copias basado en pSC105. Se clonó un fragmento de 3 kb del plásmido pGEM-T/212/213 (sección 2.2) que contiene el gen surA intacto y la región flanqueante en los sitios SphI/SalI
del plásmido pLG339 para crear el plásmido pLG339/surA. Se muestra un esquema de este plásmido en la Figura 4.
20
3.2. Introducción del plásmido pLG339/surA en la cepa mutante definida BRD1115
25
Se electroporó el plásmido en un BRD1115 electrocompetente como se describió previamente en la sección 1.5.2.
Los transformantes que contienen el plásmido se seleccionaron mediante siembra de la mezcla de electroporación en
placas de agar que contienen 15 µg/ml de kanamicina. El plásmido de ADN se recuperó a partir de una única colonia
de esta transformación y se revisaron para la identidad mediante análisis de restricción. Se llamó a esta cepa K2.
3.3. Estabilidad del plásmido en la cepa K2
30
La capacidad del gen surA intacto en el plásmido para complementar la acción del gen surA delecionado en el
cromosoma depende de que el plásmido sea retenido en la cepa bacteriana. El plásmido contiene el gen codificante de
resistencia al antibiótico kanamicina. Cultivar la cepa en presencia del antibiótico debería asegurar que el plásmido es
retenido. Sin embargo, es importante que el plásmido sea retenido en ausencia del antibiótico de selección ya que el
antibiótico de selección no es posible in vivo.
35
40
Se inoculó una única colonia de la cepa k2 en cultivos duplicados de 10 ml de caldo-L con y sin kanamicina. Los
cultivos se hicieron crecer con agitación a 37ºC durante un total de 72 horas. Se tomaron muestras a 30 y 48 horas
después de la inoculación y se sembraron diluciones en serie en placas de agar-L con y sin kanamicina. Los cultivos
se diluyeron 1/100 en caldo Fresh L con y sin kanamicina y se cultivaron durante otras 24 horas. Las diluciones del
cultivo se plaquearon de nuevo en placas de agar-L con y sin kanamicina. Se registraron varias unidades formadoras
de colonias (cfu) y se informa acerca de ellas en la Tabla 5.
3.4. Inmunización oral de ratones con la cepa K2
45
La cepa K2 se hizo crecer como se describió en 1.8. y se usó para estimular por vía oral grupos de 5 ratones Balb/c
(como se describió previamente) con un intervalo de dosis de 104 a 1010 /dosis. Se registraron las muertes durante 28
días y se calculó el LD50 de acuerdo con el método de Reed y Meunch (descrito en 2.3.2.).
Resultados
50
4.1. Cepa
55
Se recuperó el plásmido pLG339/surA a partir de la cepa K2 digerida con las dos enzimas SphI y SalI. La separación de las bandas resultantes mediante electroforesis en gel de agarosa puso de manifiesto el tamaño correcto de las
bandas de 6,2 y 3 kb.
4.2. Estabilidad del plásmido
60
Se investigó la presencia del plásmido pLG339/surA en la cepa K2. Los resultados muestran que en ausencia de
antibióticos el plásmido es retenido por las bacterias. En estos estudios, al menos el 82% de las bacterias retienen el
plásmido cuando crece sin antibióticos. Esto sugiere que este plásmido debería mantenerse cuando la bacteria se usa
para infectar ratones.
4.3. Datos de complementación
65
Se estimularon por vía oral grupos de 5 ratones Balb/c con varias dosis de la cepa K2 supuestamente complementada. El LD50 oral de la cepa K2 complementada se calculó que era log10 4,35 comparado con que es log10 4,17 para la
cepa C5 precursora.
10
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Se encuentran representadas en la Figura 5 las muertes de los ratones en el grupo de los ratones estimulados
con log10 8 bacterias de las tres cepas C5, BRD1115 y K2. Aunque el gen surA expresado en el plásmido parece
complementar la mutación definida in vivo, el aparente retardo de la muerte en el tiempo (cuando se compara con la
cepa precursora de tipo silvestre) sugiere que el nivel de expresión de surA puede reducirse en la cepa K2.
5
Tablas
TABLA 1
10
15
20
Cepas bacterianas, plásmidos y cebadores de oligonucleótidos usados en este estudio
Cepas bacterianas
E. coli
SY327
Propiedades
Fuente o referencia
λpir lisógeno
Miller V.L. (23)
semielaborada
tipo silvestre
mutante TnphoA, kanR
S. typhimurium
LB5010
C5
BRD441
BRD1115
BRD1126
BRD1127
ampR
ampR
laboratorio de la invención
C. Hormaeche, Cambridge, Reino Unido
Miller I (21)
este estudio
Oxer M.D. (25)
en bibliografía
Plásmidos
pBluescriptºII SK+
pGEM-T
pGP704
pGEM-T/212/213
pGEM-T/∆surA
pGP704/∆surA
pGEM-T/92/93
pTETnir15
pTEThtrA
ampR
ampR
ampR
ampR
ampR
ampR
ampR
ampR
ampR
Stratagene Ltd
Promega Corp.
Miller V.L. (23)
este estudio
este estudio
este estudio
este estudio
Oxer M.D. (25)
en bibliografía
25
30
35
40
45
Oligocebadores
MGR 92
MGR 93
MGR 130
MGR 135
TCGGCACGCAAGAAATGT
AGACGACCAGTTCAATCG
CGATGGGCTGAACTATTC
TATGCAGCTTCGTTAGCG
Kings College, Londres
”
”
”
”
”
”
”
”
”
TABLA 2
50
55
60
65
Se determinaron los LD50 oral e i.v. de las tres cepas C5, BRD441 y BRD1115 en ratones BALB/c. Se inmunizaron
grupos de 5 ratones con dosis en el intervalo de log10 4 a log10 10 cfu de las cepas BRD441 y BRD1115, y dosis de
log10 1 a log10 5 de la cepa C5. Los resultados se muestran en la siguiente tabla.
Cepa
LD50 oral (log10 cfu)
LD50 i.v. (log10 cfu)
C5
BRD441
BRD1115
4,16
8,62
8,98
<1,87
2,46
5,22
TABLA 3
Se determinó la capacidad de la cepa mutante de surA definida para conferir protección frente a estimulaciones
homólogas con la cepa C5 de tipo silvestre. Se inmunizaron por vía oral grupos de 5 ratones BALB/c con log10 8
organismos de la cepa BRD1115, entonces se estimularon con log10 4 a log10 10 de la cepa C5 virulenta de ratón bien
4 o bien 10 semanas después de la inoculación. Entonces se calculó el nuevo LD50 y los resultados se muestran en la
tabla a continuación.
11
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Cepa inmunizante
5
LD50 oral de C5
4 semanas después
de la inmunización
8,58
4,74
BRD1115
Ninguna
BRD1115
ninguna
Protección (no de LD50 )
10 semanas después
de la inmunización
∼3800
∼4800
9,51
4,68
10
TABLA 4
15
Se inmunizaron tres grupos de 10 ratones con las cepas BRD1115, BRD1126 y BRD1127 y entonces se estimularon 4 semanas después de la inmunización con 50 dosis LD50 de toxina del tétanos por vía subcutánea. Se anotaron las
muertes durante 4 días. El número de ratones supervivientes a la estimulación se muestran en la tabla a continuación.
20
Cepa
Supervivientes tras la estimulación
BRD1115
BRD1126 (nirB)
BRD1127 (htrA)
0/10
6/10
10/10
25
TABLA 5
30
Se calcularon las cantidades de bacterias (cfu) presentes en los cultivos de la cepa K2 complementada tras el
cultivo en caldo-L con y sin el antibiótico kanamicina. Entonces, los cultivos se sembraron en placas de agar-L con y
sin kanamicina para mostrar la presencia del plásmido pLG339/surA. Los resultados se muestran como una cantidad
total y también las colonias resistentes a kanamicina como un porcentaje del total de bacterias presentes.
35
40
45
50
55
Bibliografía
60
1. Bacon, G.A., Burrows, T.W. y Yates, M. (1950) Br. J. Exp. Patol.., 31, 714-24.
2. Chatfield, S.N., Charles, I.G., Makoff, A. J. Et. Al. (1992a) Biotech, 10, 888-892.
65
3. Chatfield, S. N. Strahan, K., Pickard, D., Charles, I. G., Hormaeche, C. E. y Dougan, G. (1992b) Microbiol.
Pathog., 12, 145-151.
4. Chatfield, S. N. Fairweather, N., Charles, I., Pickard, D., Levine, M. Hone, D., Posanda, M., Stugnell, R.
A. y Dougan, G. (1992) Vaccine, 10, 53-60.
12
ES 2 230 729 T3
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5
7. Fairweather, N. F., Lyness, V. A., y Maskell, D. J., (1987) INfect. Immun. 55, 2541-2545.
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y Dougan, G., (1994) Mol. Micro., 13, 133-140.
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20
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13
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36. documento EP-B-0400958 (Dougan et al).
37. documento EP-B-0524205 (Dougan et al).
10
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15
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REIVINDICACIONES
5
1. Una vacuna que comprende un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable y una bacteria atenuada mediante mutación no reversible en un gen que codifica una proteína que promueve el plegamiento de proteínas extracitoplásmicas.
2. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 1, donde la proteína codificada por el gen mutante es una proteína
periplásmica.
10
15
3. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, donde la proteína codificada por el gen mutante promueve
el plegamiento de proteínas secretadas.
4. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 1, 2 o 3, donde la proteína codificada por el gen mutante es una
peptidil-prolil cis-trans isomerasa (PPiasa).
5. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 4, donde la PPiasa es un miembro de la familia de las parvulinas
de PPiasas.
20
6. Una vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la proteína codificada por el gen
mutante es SurA.
7. Una vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la bacteria se atenúa adicionalmente mediante una mutación no reversible en un segundo gen.
25
8. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 7, donde el segundo gen es un gen aro, un gen pur, el gen htrA, el
gen ompR, el gen galE, el gen cya, el gen crp o el gen phoP.
9. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 8, donde el gen aro es aroA, aroC, aroD o aroE.
30
35
10. Una vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la mutación en el gen que
codifica una proteína que promueve el plegamiento de proteínas extracitoplásmicas y/o la mutación en el segundo gen
es una mutación definida.
11. Una vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la bacteria no tiene mutaciones
no caracterizadas en el genoma de la misma.
12. Una vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la bacteria es una bacteria que
infecta por vía oral.
40
45
13. Una vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la bacteria es del género
Salmonella, Escherichia, Vibrio, Haemophilus, Neisseria, Yersinia, Bortedella o Brucella.
14. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 13, donde la bacteria es Salmonella typhimurium, Salmonella
typhi, Salmonella enteritidis, Salmonella choleraesuis, Salmonella dublin, Escherichia coli, Haemophilus influenzae,
Nisseria gonorrhoeae, Yersinia enterocolitica, Bortedella pertusis o Brucella abortus.
15. Una vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la bacteria está manipulada
genéticamente para expresar un antígeno de otro organismo.
50
16. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 15, donde el antígeno es el fragmento C de la toxina del tétanos.
17. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 15 o 16, donde la expresión del antígeno está dirigida por el
promotor de nirB o el promotor de htrA.
55
60
18. Una bacteria atenuada mediante una mutación no reversible como se define en cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso en un método de vacunación de un ser humano o animal.
19. El uso de una bacteria como se define en cualquiera de las reivindicaciones anteriores para la fabricación de un
medicamento para vacunar un ser humano o animal.
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LISTA DE SECUENCIAS
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
5
(i) SOLICITANTE:
(A) NOMBRE: Medeva Europe Limited
(B) CALLE: 10 St Jame’s Street
10
(C) CIUDAD: Londres
(D) ESTADO: no aplicable
(E) PAÍS: Reino Unido
(F) CÓDIGO POSTAL: SW1A 1EF
15
(ii) TÍTULO DE LA INVENCIÓN: VACUNAS QUE CONTIENEN BACTERIAS ATENUADAS
(iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 4
(iv) FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
20
(A) TIPO DE MEDIO: Disco flexible
(B) ORDENADOR: PC IBM compatible
(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
25
(D) SOFTWARE: PatentIn Release Nº1.0, Versión Nº1.30 (EPO)
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:
30
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 1287 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CADENA: doble
35
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
(vi) FUENTE ORIGINAL:
40
(A) ORGANISMO:Salmonella typhimurium
(ix) CARACTERÍSTICAS:
(A) NOMBRE/CLAVE: CDS
45
(B) LOCALIZACIÓN: 1..1281
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:
50
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2
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5
10
15
20
25
30
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40
45
50
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 427 aminoácidos
55
(B) TIPO: aminoácido
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína
60
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:
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3
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5
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65
4
ES 2 230 729 T3
5
10
15
20
25
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
30
(A) LONGITUD: 1287 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CADENA: doble
35
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
(vi) FUENTE ORIGINAL:
40
(A) ORGANISMO: E. coli
(ix) CARACTERÍSTICAS:
(A) NOMBRE/CLAVE: CDS
45
(B) LOCALIZACIÓN: 1..1284
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:
50
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5
ES 2 230 729 T3
5
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ES 2 230 729 T3
5
10
15
20
25
30
35
40
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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
50
(A) LONGITUD: 428 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína
55
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:
60
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7
ES 2 230 729 T3
5
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ES 2 230 729 T3
5
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