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Proyecto Nº SC93-158
MECANISMOS DE PROTECCION FRENTE AL VIRUS DE LA PESTE
EQUINA AFRICANA: EVALUACION DE UNA VACUNA
RECOMBINANTE Y PUESTA A PUNTO DE UN METODO DE
DIAGNOSTICO DIFERENCIAL
Equipo Investigador:
José Manuel Sánchez-Vizcaíno (Dr. Vet.)
María Díaz-Laviada Martiret (Dra. Far.)
Mª Luísa Arias Neira (Dra. C.Q.)
María Castaño Rosado (Dra. Vet.)
Francisco Javier Domínguez Juncal (Dr. Med.)
Equivalente de jornada completa: 2,60
Centro de Investigación:
Centro de Investigación en Sanidad Animal (C.I.S.A.). INIA.
28130 VALDEOLMOS (MADRID)
Tel: 91/620 23 00 - Fax: 91/620 22 47
Duración:
Enero 1993 - Diciembre 1995
Coste:
Miles de pesetas: 18.022
Financiación INIA 100 %
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PLANTEAMIENTO Y OBJETIVOS
La Peste Equina Africana es una enfermedad vírica aguda, transmitida por
mosquitos del género Culicoides, que causa una elevada mortalidad en caballos.
La aparición de varios brotes de la enfermedad entre 1987 y 1990 en
España, Marruecos y Portugal ha actualizado la importancia de esta enfermedad y
ha puesto de manifiesto la necesidad de aumentar e intensificar la investigación
sobre ella.
Durante años, los países africanos afectados por la enfermedad han
utilizado la vacunación para proteger a los caballos de la infección por Peste
Equina. Estas vacunas, monovalentes o polivalentes, se han obtenido por sucesivos
pases de virus virulento en cultivos celulares. Aunque eficaces en la protección,
tienen el gran inconveniente de que utilizan el virus atenuado, lo que supone la
introducción de virus infectivo, con los posibles riesgos que ello implica,
impidiendo además el movimiento de los caballos vacunados de unos países a otros.
Recientemente los Laboratorios Rhône Merieux han desarrollado una vacuna
inactivada que contiene el virus purificado. Esta vacuna tiene la ventaja de que
disminuye los niveles y tiempo de viremia en los caballos infectados, con lo que el
riesgo de transmisión del virus a otros équidos es menor.
La partícula vírica está formada por un core de simetría icosaédrica,
compuesto por dos proteínas estructurales mayoritarias (VP3 y VP7) que contiene
el genoma vírico (10 segmentos de dsRNA) y tres proteínas minoritarias (VP1,
VP4, VP6). El core está rodeado de otra capa proteica formada por dos proteínas.
Se han descrito tres proteínas no-estructurales, dos de las cuales, NS1 y NS2, se
encuentran asociadas con estructuras características de las células infectadas,
túbulos y cuerpos de inclusión, lo que hace muy difícil su eliminación de las
preparaciones de virus purificado. La 3ª proteína no-estructural, NS3, por el
contrario, se elimina más fácilmente, y sus características inmunológicas la
convierten en candidata idónea para ser utilizada como antígeno en un test de
diagnóstico diferencial de animales vacunados e infectados.
Los diferentes trabajos de investigación desarrollados en los últimos años,
en colaboración con otros grupos de investigación nacionales y extranjeros, han
permitido el clonaje y la expresión en baculovirus de tres proteínas estructurales
del virus (VP2, VP5 y VP7). Estas proteínas pueden ser utilizadas como vacuna
recombinante, libre, por tanto, de material genético e infeccioso del virus, lo que
permitiría un tránsito totalmente libre de los animales vacunados. Además, al estar
formada únicamente por proteínas víricas, ofrece la posibilidad de desarrollar test
de diagnóstico diferencial usando como marcador una proteína vírica no presente
en la vacuna. Por otro lado, al ser una vacuna obtenida por Ingeniería Genética,
ofrece las ventajas de la estandarización total en la producción y bajo coste.
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Los objetivos del proyecto han sido:
1.- Utilización y prueba de la eficacia de una vacuna recombinante experimental
formada por 3 proteínas estructurales del virus de la PEA obtenidas por clonaje y
expresión en baculovirus.
2.- Estudio de los mecanismos inmunológicos humorales que intervienen en la
protección frente a la infección por el virus de la PEA y caracterización de las
proteínas implicadas.
3.- Clonaje y expresión de la proteína no-estructural NS3 para el desarrollo de un
test diferencial de diagnóstico que permita diferenciar entre animales vacunados e
infectados.
RESULTADOS
Las proteína estructurales VP2, VP5 Y VP7, Obtenidas por expresión de un
sistema de baculovirus recombinante, se han utilizado para inmunizar caballos. Se
han llevado a cabo tres experimentos de vacunación. En el primero, se emplearon
las proteínas purificadas, en diferentes combinaciones (VP2 sola, VP2 y VP5, y las
tres proteínas juntas). Los tres caballos desarrollaron anticuerpos específicos frente
a las proteínas con las que habían sido inmunizados, y la segunda dosis aumentó
significativamente los títulos de ELISA en todos los casos. Los niveles más altos de
anticuerpos se obtuvieron en el caballo inmunizado con las tres proteínas, que fue
el único en el que se detectaron anticuerpos neutralizantes y el único que resistió al
desafío con el virus virulento, no mostrando ningún signo clínico y una viremia
muy limitada durante dos días.
El segundo grupo de caballos se utilizó para corroborar la protección
obtenida en el caballo del grupo anterior, así como para probar nuevas
combinaciones de proteínas que podrían simplificar la producción. Se utilizaron
también proteínas no purificadas, ya que se había observado que se producía una
modificación antigénica durante el proceso de purificación. Sólo los caballos
vacunados con las proteínas no purificadas desarrollaron anticuerpos
neutralizantes frente al virus.
Para confirmar la inmunidad protectora conferida por las tres proteínas no
purificadas, se inmunizó un tercer grupo de caballos con esta combinación de
proteínas. Se detectaron altos títulos de anticuerpos específicos en todos los
caballos vacunados, especialmente frente a la proteína VP2. Tras el desafío con el
virus virulento, todos los caballos vacunados permanecieron completamente sanos
sin mostrar ningún síntoma clínico, ni se detectó viremia. Los niveles de
anticuerpos específicos no aumentaron, indicando la ausencia de replicación vírica.
Las conclusiones de estos experimentos fueron las siguientes:
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1ª.- El uso de extractos celulares conteniendo las tres proteínas estructurales
recombinantes expresadas en baculovirus VP2, VP5 y VP7, ha resultado ser una
combinación muy eficaz para inducir una protección total frente a la infección por
el VPEA, impidiendo el desarrollo de síntomas clínicos y la viremia, lo cual es de
gran importancia para evitar la propagación del virus por el mosquito vector. La
reproductibilidad de los resultados ha sido muy alta en los cinco caballos
vacunados de este modo.
2ª.- Los experimentos de vacunación utilizando distintas combinaciones de las tres
proteínas, purificadas y sin purificar, permiten concluir lo siguiente:
La proteína recombinante VP2 expresada en baculovirus y purificada, sola
o en combinación con la VP5, no induce una inmunidad capaz de proteger a
los caballos frente a la infección por el VPEA, al menos cuando se utilizan
las dosis y pautas de inmunización habituales en cualquier vacuna
convencional.
Las proteínas VP2 y VP5 purificadas son pobres inmunógenos y además son
inestables. En cambio, la proteína VP7 parece más inmunógena cuando está
purificada.
El uso de extractos celulares en lugar de proteínas purificadas mejora
ostensiblemente la inducción de anticuerpos neutralizantes (de 101 a 104),
especialmente cuando la VP2 se expresa conjuntamente con la VP5.
Para el desarrollo del test de diagnóstico diferencial de animales vacunados
e infectados, se ha clonado el gen S10 que codifica la proteína no-estructural NS3.
Tras su secuenciación, dicho gen se ha expresado en E. coli. La proteína
recombinante, parcialmente purificada, se ha utilizado como antígeno en un
ELISA. Para su evaluación se han empleado los siguientes grupos de sueros de
campo:
1.- Un grupo de 100 sueros de caballos vacunados con la nueva vacuna
comercial de virus purificado e inactivado.
2.- Un grupo de 20 sueros de caballos infectados convalecientes.
3.- Un grupos de 40 sueros de caballos vacunados con la vacuna de virus
vivo atenuado.
En general, la reacción con la proteína NS3 fue como se esperaba en cada
caso: los sueros del grupo 1 dieron una respuesta nula o muy baja, aunque un 10%
de los sueros mostraron cierta reactividad. Por el contrario, los sueros de los
grupos 2 y 3 dieron una respuesta positiva. Un 2-5% dieron una reacción
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inespecífica significativa, que puede ser distinguida mediante el uso de otras
técnicas como el Immunoblotting.
Este test puede ser de gran utilidad para poder distinguir los caballos que
no han sufrido infección por el virus de la peste equina, y así permitir su movilidad
aunque procedan de una zona infectada o endémica. El pequeño porcentaje de
falsos positivos puede ser confirmado por Immunoblotting.
INFORMACION CIENTIFICA Y TECNICA PROPORCIONADA POR EL
PROYECTO. POSIBLES APLICACIONES.
El clonaje del gen de la proteína NS3 y su expresión ha hecho posible la
puesta a punto de un método de diagnóstico para diferenciar animales vacunados
de infectados. Este método tendría una gran aplicación en un nuevo brote de Peste
Equina, en situaciones en las que la enfermedad es endémica, y siempre que se
deseara diferenciar anticuerpos vacunales de los procedentes de una infección por
el virus vivo.
Este test de diagnóstico podría ser patentado.
Se ha obtenido también la secuencia del gen de la NS3 del virus del serotipo
4. Este gen parece ser que está implicado en la virulencia del virus. Los estudios
sobre su secuencia y la comparación con otros serotipos y otros virus relacionados
podrían aportar datos interesantes sobre virulencia y epidemiología de este virus.
Los experimentos de vacunación con las proteínas recombinantes
estructurales han llevado a la obtención de una combinación de proteínas
altamente eficaz para inducir una protección total frente a la infección por el virus
de Peste Equina. Estas tres proteínas estructurales sin purificar, en forma de
extractos celulares, podrían ser utilizadas como vacuna, mucho más eficaz y segura
desde el punto de vista de prevención de la infección y consecuencias
epidemiológicas que las que existen actualmente en el mercado.
Esta nueva vacuna recombinante podría ser patentada.
FORMACION DE PERSONAL
Elaboración y presentación de la tesis doctoral de Carmen P. SánchezMascaraque, titulada “Peste Equina Africana experimental: estudio clínicopatológico en caballos infectados con el serotipo 4”, en la Facultad de Patología
Animal II de la Universidad Complutense de Madrid.
PUBLICACIONES
Artículos científicos
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Laviada, M.D., Roy, P., Sánchez-Vizcaíno, J.M. and Casal, J.I. 1995. The Use of
African horsesickness virus NS3 protein, expresed in bacteria, as a marker to
differentiate infected from vaccinated horses. Virus Research. 38. 205-218.
Martínez-Torrecuadrada, J.L., Díaz-Laviada, M., Roy, P., Sánchez-Viscaíno, J.M.
and Casal, J.I. 1996. Full protection against African horsesickness (ASH) in horses
induced by baculovirus-derived AHS virus serotype 4 VP2, VP5 and VP7. Journal
of General Virology. 77. 1211-1221.
Trabajos presentados a congresos, reuniones o simposios
Sánchez-Mascaraque, C., Carrasco, L., Gómez-Villamandos, J.C., Díaz-Laviada,
M., Castaño, M., Sánchez-Vizcaíno, J.M. y Sierra, M.A. Lesiones
ultraestructurales del corazón en Peste Equina Africana Experimental. VIII
Reunión de la Sociedad Española de Anatomía Patológica Veterinaria. Córdoba
(España). Junio, 1995.
Sánchez, C., Carrasco, L., Gómez-Villamandos, J.C., Hervas, H., Laviada, M.D.,
Castaño, M., Sánchez-Vizcaíno, J.M. and Sierra, M.A. Ultrastructural lesions of
the capillaries of horses experimentally infected with African Horsesickness virus
tipe 4. Joint Meeting of the European Society of Veterinary Pathology and
Gesellschaft fue Toxikologische Pathology. Gante (Bélgica). Septiembre, 1996.
Laviada, M.D., Casal, Y., Vela, C. and Sánchez-Vizcaíno, J.M. Use of nonstructural protein NS3 of African Horsesickness virus for differentiation of
vaccinated animals and infected horses. OIE Scientific Conference on the Control of
Foor and Mouth Disease, African Horse Sickness and Contagious Bovine
Pleuropneumonía. Gaborone (Botswana). Abril, 1994.
Laviada, M.D., Casal, Y., Vela, C. and Sánchez-Vizcaíno, J.M. Expression of nonstructural protein NS3 of African Horsesickness virus in E. coli and infected
horses. 12 th European Immunology Meeting. Barcelona (España). Junio, 1994.
Díaz-Laviada, M., Arias, M. and Sánchez-Vizcaíno, J.M. New developments in
African Hosesickness diagnosis. International Workshop on African Horsesickness
and related orbiviruses. Tokio (Japón). 1995.
Sánchez-Mascaraque, C., Carrasco, L., Gómez-Villamandos, J.C., Castaño, M.,
Sánchez-Vizcaíno, J.M. y Sierra, M.A. Estudio clínico y morfológico de caballos
infectados experimentalmente con el virus de la Peste Equina Africana. VII
Reunión de la Sociedad Española de Anatomía Patológica Veterinaria. León
(España). Junio, 1995.
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