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GENETICA
Acta Científica Venezolana, 50: 24–28, 1999
El ANALISIS DE ADN PARA PRUEBAS DE PATERNIDAD E
IDENTIFICACION FORENSE
Lennie Pineda Bernal
Laboratorio de Genética Molecular. Unidad de Genética Médica. Facultad de Medicina.
Universidad del Zulia. Apartado 15374. Maracaibo, Venezuela. Teléfonofax: 061-519496.
e-mail: [email protected]; [email protected]
Recibido: 07/07/98; Revisado: 07/09/98 ; Aceptado: 29/09/98
RESUMEN: Del ADN no codificante del genoma humano, gran parte corresponde a ADN repetitivo en tandem, el cual
en los ultimos años ha tenido una extensa aplicación para resolver objetivamente, por encima de los marcadores clásicos,
casos de paternidad biológica y de identificación de individuos. Una clase particular de este ADN son los loci minisatélites y
microsatélites los cuales están constituídos por arreglos de repeticiones en tándem y con una gran variabilidad alélica que
los hace marcadores genéticos ideales para esos fines. Este trabajo presenta una revisión sobre estos loci, las técnicas
actuales para caracterizarlos, discute su utilidad y plantea algunas consideraciones que deben tenerse en cuenta cuando
van a seleccionarse los marcadores para realizar pruebas para determinar paternidad biológica o la identificación de un
individuo en el campo de la genética forense. Palabras clave: Minisatélites, microsatélites, perfil de ADN, Huella digital de
ADN, paternidad, identificación forense, marcadores genéticos.
DNA ANALYSIS FOR PATERNITY TESTING AND FORENSIC IDENTIFICATION
ABSTRACT: Non coding DNA of human genome contains an important part of tandem repetitive DNA which last years has
been extensively applied to solve paternity disputes and individual identification cases. A class of this DNA are minisatellites
and microsatellites loci. Such loci are highly polimorphics because they have a multiple of different alleles to make them
ideals genetic markers for these purposes. This article is a review about these loci, methods of their analysis and practical
aspects about their applications to determine biological paternity or individual identification in the forensic genetic field
are considered. Key Words: Minisatellites, microsatellites, DNA profiling, DNA fingerprinting, paternity testing, forensic
identification, genetic markers.
INTRODUCCION
A excepción de los gemelos idénticos, el material genético de cada individuo es único. Se ha estimado que dos
genomas humanos, escogidos al azar, difieren aproximadamente en uno cada 500 nucleótidos. Si el genoma humano contiene 3 109 bases, existen entonces, 6 106
bases diferentes entre dos personas20 . Esa variabilidad
interindividual puede ser estudiada a nivel fenotípico, es
decir, a través del producto génico, o a nivel genotípico
mediante el análisis directo del ADN. Uno de los objetivos
del estudio de la variabilidad humana de interés cada vez
mayor con el curso de los años, es su aplicación en pruebas de paternidad y otras relaciones genéticas y para la
identificación de seres humanos involucrados en hechos
delictivos, ya sea como víctimas o criminales. El tipeaje
genético para estos fines empezó con el análisis morfológico, bioquímico o inmunológico, correspondientes éstos
ultimos a productos de genes ubicados en una fracción
del genoma menor del 10%, quedando un 90% de ADN,
no codificador, cuyo potencial para el estudio de la variabilidad humana empezó ha ser descubierto a partir de los
años 80, cuando se reconoció que estaba repleto de polimorfismos de secuencia que fueron puestos en evidencia
con el uso de las enzimas de restricción y los fragmentos
de longitud variable que éstas generaban (RFLP)3;20 .
El genoma humano nuclear extragénico está constituído por secuencias únicas y repetidas. Un subgrupo de secuencias repetidas que representan aproximadamente el 60% de ellas, son las secuencias repetidas
en tandem, que constituyen un ADN altamente polimórfico y que abrieron nuevas posibilidades, inimaginables para la identificación de marcadores con elevado poder de
discriminación24;26 .
El ADN repetitivo en tandem está constituído por secuencias que no incluyen genes funcionales y que se
disponen en arreglos de repeticiones, una al lado de la
otra y cada una de ellas contiene una secuencia central
básica16 . Se subdivide de acuerdo al tamaño promedio
del arreglo en: ADN satélite, ADN minisatélite y ADN microsatélite. (Figura 1). De estos tipos de ADN, el minisatélite y el microsatélite son los que mayor importancia tienen
hoy dia para resolver problemas en identificación humana
y pruebas de paternidad1;3,5;11;12;24;26 .
ADN MINISATELITE: ANALISIS MEDIANTE SONDAS
MULTILOCUS, UNILOCUS Y PCR
Los loci más variables descubiertos en el genoma humano son las secuencias minisatélites, conocidas como regiones hipervariables (HVR) y posteriormente, como repeticiones en tandem de número variable (VNTR). Su hi-
El análisis de ADN en genética forense
pervariabilidad es debida a la diversidad en el número de
reiteraciones de determinadas secuencias de nucleótidos
las cuales para estos loci, oscilan entre 7 y unos 100 nucleótidos. Existen grandes similitudes en las secuencias
de la unidad central que se repite en un gran número de
minisatélites. Esta similaridad le sugirió a Alec Jeffreys,
en Inglaterra, que si se empleaban sondas que contuvieran repeticiones de esa unidad central se podrían detectar
fragmentos de ADN de longitud variable a través del método de transferencia de Southern y producir, para cada
individuo un patrón específico de bandas de ADN al cual
denominó "DNA fingerprinting" o huella digital de ADN15 .
Este proceso involucra la digestión del ADN por una enzima de restricción, seguida por la separación de los fragmentos en geles de agarosa, transferencia del ADN y la
hibridación con una sonda marcada. (Figura 2). Estas
sondas detectan entre 15 y 20 fragmentos variables de
ADN en el individuo, con rangos de tamaño mayores de
3.5 Kb, más múltiples fragmentos, mucho más pequeños,
tan complicados para resolver electroforéticamente que
no son considerados en la evaluación estadística de los
casos3;13;15;22 .
Las sondas multilocus han probado su utilidad en paternidad y otros tipos de relación familiar, inclusive hermanos,
y en casos donde pueda faltar la madre3;14 . Sin embargo,
su aplicación para pruebas forenses ha presentado algunos problemas, debido entre otras cosas, a dificultades en
la interpretación de patrones incompletos que resultan de
degradación parcial o a pobre recuperación de ADN en la
muestra, y a la inhabilidad de detectar muestras con ADNs
mezclados que se originan de más de una persona como
ocurre en casos de violación16 . Por otro lado, su análisis que no se realiza locus por locus, por la imposibilidad
de identificar a cada uno de ellos, sino más bien, banda
por banda, hace que su análisis estadístico, basado en la
proporción de bandas compartidas por personas no emparentadas en la población y no en la genética mendeliana
sea poco familiar y poco aceptado, particularmente en Estados Unidos y gran parte de los países europeos, donde
se prefiere el análisis con sondas unilocus23 o el análisis
de microsatélites7;11 .
Con la huella digital de ADN se obtienen fenotipos más
no genotipos y es por ello que se han desarrollado una
serie de sondas locus específica para proveer información
genotípica. De esta manera, por transferencia Southern
se detecta una banda por alelo y por ende, comportarse
como cualquier locus codominante. Así, los individuos homocigotos y heterocigotos presentarán una o dos bandas,
respectivamente, por locus analizado. (Figura 2). Deben
tener un buen balance entre variabilidad y estabilidad. Para casos forenses, las sondas minisatélites unilocus escogidas deben tener un extraordinario nivel de variabilidad
alélica.
Las sondas unilocus son una herramienta poderosa en
análisis forenses y de paternidad, sin embargo, al igual
que las sondas multilocus, su caracterización metodológica es compleja y laboriosa y el límite de concentración de
ADN genómico es de 10 ng. Por estas razones, en algu-
25
Figura 1. Repeticiones en tandem de número variable: locus
micro o minisatélite
nos casos forenses su aplicación pueda verse restringida.
A diferencia del análisis por sondas multilocus, su estudio
se denomina perfil de ADN o "DNA profiling"16 .
En los casos de minisatélites de menor tamaño, con alelos no mayores de 1Kb, se ha recurrido a la PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) utilizando iniciadores diseñados de secuencias únicas de ADN vecinas al arreglo
repetido en tandem (Figura 1). Sin embargo, si se aumenta el número de ciclos, alelos hasta de 6 Kb pueden detectarse directamente con bromuro de etidio en geles de
agarosa, sin necesidad de hibridación con sondas. Loci
con estas características pueden ser analizados con poca
muestra lo cual es de gran utilidad en el campo forense
ya que permite extender estos estudios a muestras como
saliva, pelo, restos óseos, etc. Con ellos se obtienen alelos discretos, fáciles de analizar por PCR y caracterizar
mediante electroforesis en poliacrilamida, coloración con
bromuro de etidio o nitrato de plata y el contraste con escaleras alélicas. Sin embargo, su variabilidad es mucho
menor que la observada para loci minisatélites mayores,
encontrándose sus valores de heterocigosis alrededor del
80-85%25 .
La evaluación estadística cuando se utilizan minisatélites, ya sea por sondas unilocus o PCR, requiere del conocimiento de las frecuencias alélicas y de la estructura de
la población de la cual son estimadas9;20 . Es necesario
valorar si se están utilizando bases de datos de referencia
apropiados y si la suposición de equilibrio de Hardy Weinberg es válida. En los casos de loci con distribución cuasicontínua, como lo son la mayoría analizados con sondas
unilocus, para el cálculo de frecuencias alélicas se establecen categorías de tamaño o "binning"5 . Es importante
que el agrupamiento de alelos sea conservador, relativo
al criterio empleado para declarar un apareamiento foren-
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Pineda-Del Villar
descritos, múltiples loci microsatélites con heterocigosidades mayores del 80%, en particular, el locus HUMACTB2
(SE33) que es complejo, y tiene una heterocigosis promedio de 94% y más de 35 alelos17;19 .
La simplicidad de la técnica de la PCR y su aplicación
para el análisis de los STRs le confiere a estos sistemas
una gran fortaleza, en relación a aquellas donde se utiliza
hibridación. Además, mientras que con VNTR los resultados se obtienen entre 15 días a un mes, una batería de 12
STR, mediante amplificación múltiple, puede arrojar resultados entre 3 y 4 días1;4;12 . Todas estas características,
aunadas a la tradicional valoración estadística de loci codominantes con herencia mendeliana clásica, han determinado que su aplicación en la mayoría de los laboratorios
dedicados a los estudios de paternidad e identificación forense, se incremente dia a dia2;7;26 .
CONSIDERACIONES Y RECOMENDACIONES PARA EL
USO DE REPETITIVO EN TANDEM EN ANALISIS DE PATERNIDAD BIOLOGICA E IDENTIFICACION FORENSE
Figura 2. Procedimiento Southern y sondas uni o multilocus (A:
Padre, B: Hijo, C: Madre/ A: Evidencia, S1 y S2 : sospechosos).
se, es decir, que el peso estadístico de la evidencia esté
sesgado en favor del acusado16 .
ADN MICROSATELITE Y SU ANALISIS CON PCR
El ADN microsatélite, llamado también repeticiones cortas
en tandem (STR) están constituídos por unidades que van
desde 2 a 6 pares de bases, son abundantes en el genoma y cerca de la mitad de los estudiados hasta ahora, son
altamente polimórficos25 (Figura 1). Estos loci tienen la
gran ventaja, en relación a la mayoría de los minisatélites,
de que poseen alelos discretos que pueden caracterizarse
por PCR y utilizarse técnicas de marcaje no radiactivo en
combinación con secuenciadores automáticos20 . La PCR
se realiza utilizando iniciadores que hibridan con secuencias únicas que delimitan el locus STR. Permite el análisis de cantidades de muestras muy pequeñas, con preparaciones crudas de ADN, inclusive ADN degradado y los
resultados son fáciles de interpretar. En general, los loci STR tri y tetranucleotídicos ofrecen una ventaja sobre
los dinucleotídicos ya que los productos de amplificación,
tienden a tener menos artefactos, es decir, bandas extras
que dificultan la interpretación de los resultados y que pueden ser más grandes o más pequeñas que el alelo real25 .
En general, la variabilidad genética de los STR es menor,
entre el 60 y 80%. Sin embargo, recientemente han sido
Uno de los criterios de valoración de cualquier marcador,
para propósitos de identificación, es su poder de exclusión, es decir, el poder de excluír a un individuo falsamente
acusado23 o simplemente declarar una no inclusión lejos
de cualquier duda razonable. Esta cualidad de un marcador está directamente relacionada con su nivel de polimorfismo o heterocigosis, y que a su vez determinará cuan
probable es que en la población dos individuos no relacionados coincidan en su genotipo.
La identificación de individuos, mediante el análisis de
ADN, se basa en el alto nivel de polimorfismo existente en
los loci analizados, que generan un número muy alto de
genotipos posibles, a diferencia de los sistemas biológicos
de identificación clásicos proteicos, tales como enzimas,
grupos sanguíneos, etc, permitiendo distinguir un individuo de otro, prácticamente en cada caso18 . Otra ventaja
del análisis del ADN con respecto a los marcadores proteícos, es su ubicuidad, ya que puede aplicarse en cualquier
célula nucleada y es muy resistente a la degradación3 .
Con las sondas multilocus o con una batería de 5 a 6
sondas unilocus, con heterocigosis de alrededor del 90%,
el poder de exclusión puede llegar a 99,99%. Por el contrario, cuando se utilizan minisatélites o microsatélites, con
niveles de heterocigosis menores, el número de loci a analizar debe ser mayor. Chakraborty y Jin10 , derivaron una
teoría para establecer cuantos loci, de esta categoría, deberían ser analizados por PCR para alcanzar los mismos
niveles de discriminación que con las sondas. Por ejemplo, para loci mini o microsatélites con heterocigosidades
de alrededor del 80%, se requeriría analizar unos 11 y 18,
cuando la heterocigosidad es de un 70%. Sin embargo,
con los nuevos microsatélites descritos, el número de loci
es menor.
La delicadeza de estas pruebas y las implicaciones de
sus resultados determina que cualquiera sea la batería de
los marcadores seleccionados, éstos, combinadamente,
El análisis de ADN en genética forense
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deben tener un poder de exclusión o conducir a una Probabilidad de Paternidad (W), en los casos de inclusión, no
menor al 99,99%. A pesar de que la normativa actual recomienda alcanzar este valor, en la mayoría de los paises
europeos un valor del 99,73% es considerado como "paternidad practicamente probada"8 . Esto es un muy asunto
muy serio porque muchos laboratorios, inclusive en USA,
establecen diagnósticos de no paternidad con solo un sis-
tema o marcador20;21 . En los casos delictivos, los loci analizados deben conjuntamente conducir a un Poder de Discriminación no menor al 99.99%. En algunos casos, esto
es muy difícil de obtener por la naturaleza de las muestras
de las que se dispone8 , sin embargo, cualquiera sea el caso, deben realizarse todos los esfuerzos para analizar los
loci que sean necesarios para asegurar un resultado, lejos
de toda sombra de duda.
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