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Condiciones que favorecen la desnaturalización
•Alta temperatura
•Baja fuerza iónica (repulsión de fosfatos)
•Alto pH (desprotonación de bases)
Monitoreo de la desnaturalización
•Los enlaces conjugados de las bases generan absorción en el UV a 260nm
Nucleótidos libres> ssADN> dsADN
•La temperatura a la cual la A260 alcanza la mitad de su valor máximo es denominada Tm
•La Tm depende de la concentración salina, pH, composición, longitud
•La condición standard es 0.12 M buffer fosfato de sodio (0.18 M en ion sodio
DESNATURALIZACION POR CALOR
•Oligonucleótidos cortos
Tm = (A+T)x2oC +
(C+G)x4oC
•Oligonucleótidos largos
Tm = 81.5 +16.6Log [Na+]+
+0.41 (%CG) – 625/N
N –length of oligo
Hidrólisis de ácidos nucleicos



Ruptura de enlaces en el esqueleto polinucleotídico
Hidrólisis ácida (1 mM HCl): ruptura del enlace glicosídico entre purinas y
desoxiribosa (producto: ac. apurínico
Hidrólisis alcalina (RNA)– clivaje del enlace fosfodiester
Renaturalización


La desnaturalización es un proceso reversible
Reanealing – reasociación de las cadenas de ADN
Cinética de renaturalización
La reasociación de ADN no repetido se produce en un
rango de 2-log
Definición de Cot1/2: función inversa de la
constante de velocidad (k)
c
1

c0 1  kC0t
1
1

2 1  kC0t
C0t ½ : valor de Cot cuando se
reasoció un 50%
1
(1  kC0t )  1
2
kC0t  2  1  1
C0t1/ 2
1

k
(1  kC0t )  2
¿Complejidad del Genoma ?
¿Qué es?
AAAAAAAAAAAAAAAA
C= 1; L=16
ATATATATATATATATA
C= 2; L=16
ATCATCATCATCATCA
C= 3; L=16
ATCGCTAGAACGTCTG
C= 16; L=16
Curvas de reasociación de ADN no
repetitivo (fragmentos de 500 nt)
(N)
C=N
200
genes
≈ 10,000
genes
≈ 4,000
genes
C0t1/2
3 genes
106
repeats
If no repeated sequences: C = to genome size (nt-bp)
N (genome size) is determined directly from C0t1/2
Reasociación para Eucariotes
≈ 20-25% altamente repetitivo: 2x106 copias
≈ 25-30% Moderadamente
Repetitivo
350 copias
≈ 45-55%
Copia única
> 2 logs: diferentes poblaciones

¿Qué representan las secuencias
únicas, moderadamente repetidas y
altamente repetidas???
Leer del Lodish!!!!
Parametro
Efecto sobre Tm
Efecto sobre la
velocidad de
renaturalización
Composición de
bases
Incremento de Tm con
el aumento del %G-C
no ejerce efecto
longitud
<150 bp; incremento
Incrementa la velocidad
de Tm con el
con la longitud
incremento de longitud;
>500 bp no hay efecto
ionic strength
Incremento de Tm con
el aumento de [Na+]
optimo a 1.5M Na+
%bp mismatch
Disminuye Tm con el
aumento de
%mismatch
Disminuye la velocidad
con el aumento de
%mismatch
concentración
no ejerce efecto
Aumenta la velocidad
con el aumento de [DNA]
Agente
denaturalizante
disminuye Tm wcon el
aumento de
[formamide], [urea]
optimo a 50% formamide
temperatura
-
optima at 20°C por
debajo de Tm
Empaquetamiento del ADN Eucariota
En el genoma humano tenemos 3 x 109 bp distribuidos en 23 cromosomas
La forma B-DNA ocupa 3.4 A/bp
La longitud total del ADN celular humano es de
2 metros!!!
Debemos empaquetarlo en un núcleo con un diámetro de 5 mm
(10.000 veces)
El DNA durante la interfase se encuentra condensdo formando un complejo
nucleoproteico denominado cromatina
Chromatin Proteins
Chromatin proteins
1. Histone Proteins (small, positively charged—rich in lysine and arginine
residues)
Core histones: H2A, H2B, H3, H4
Linker histone: H1
2. Nonhistone chromosomal proteins
El ADN se enrolla alrededor del núcleo histònico: Nucleosomas
2 H2A
2 H2B
2 H3
2 H4
“Beads on a String”
Nucleosomes
-Contain a histone core octomer + 146 bp core DNA
-Spaced ~200 bp apart
(146 bp core DNA + 20-60 bp linker DNA)
-Core DNA is protected DNases
La Histona H1 une 2 hélices de ADN
30-nm Fiber
2 Modelos para la fibra de cromatina de 30-nm
Un modelo de la estructura del cromosoma
DNA exists
in
chromatin
form
during
interphase
DNA in most
compact form
(chromosomes)
during metaphase
of mitosis
¿Qué es el superenrollamiento?
Qué es el superenrollamiento?
El superenrollamiento se produce en casi
todos los cromosomas (circular o lineal)
Relajado vs Superenrollado
El ADN relajado no está superenrollado
En el superenrrolamiento negativo el ADN está subenrollado (favorece el
desapareamiento de la doble hélice (el ADN circular aislado de células siempre se
encuentra superenrollado negativamente
L=T+W
Linking Number (L or Lk) = número de veces que dos cadenas están entrelazadas
Twists (T or Tw) = número de vueltas de hélice
Writhes (W or Wr) = número de veces que el dúplex se entrecruza consigo mismo
relaxed
T = +3
W = +0
T = +2
W = +1
T = +1T = +0
W = +2 W = +3
T = –3
W = +0
T = –2
W = –1
T = –1T = –0
W = –2 W = –3
L=T+W
relaxed
Qué hacen las topoisomerasas?
1. Cambian el linking number de la molécula de ADN mediante:
A) Cortando una o ambas cadenas y luego,
B) Enrollarlas mas o menos y uniendo nuevamente los extremos.
2. Usualmente relajan el ADN superenrollado
Type I Topoisomerases
They relax DNA by nicking then closing one strand of duplex DNA. They cut one strand of the
double helix, pass the other strand through, then rejoin the cut ends. They change the linking
number by increments of +1 or –1.
Topo I from E. coli
1) acts to relax only negative supercoils
2) increases linking number by +1
increments
Topo I from eukaryotes
1) acts to relax positive or negative supercoils
2) changes linking number by –1 or +1
increments
Relaxation of SV40 DNA by Topo I
Maximum
supercoiled
3 min.
Topo I
25 min.
Topo I
Type II Topoisomerases
They relax or underwind DNA by cutting then closing both strands. They change the linking
number by increments of +2 or –2.
All Type II Topoisomerases Can Catenate and Decatenate cccDNA molecules
Circular DNA molecules that use type II topoisomerases:
E. coli
-plasmids
-E. coli chromosome
Eukaryotes
-mitochondrial DNA
-circular dsDNA viruses (SV40)
An E. coli Type II Topoisomerase: DNA Gyrase
Topo II (DNA Gyrase) from E. coli
1) Acts on both neg. and pos. supercoiled DNA
2) Increases the # of neg. supercoils by increments of 2
3) Requires ATP
Sample Linking Number Questions
(Note: assume that B-DNA has 10 bp/turn.)
1) You have a relaxed 5,500 bp plasmid DNA molecule,
which you treat with DNA gyrase to add 50 negative supercoils
A. How many helical turns are there in the relaxed molecule?
B. What is the linking number of the molecule after treatment with DNA gyrase?
A. 5500 bp X 10 bp/turn = 550 turns
B. L = T + W = 550 – 50 = 500
LOS CROMOSOMAS DE VIRUS: CLASIFICACIÓN
Considerando el tipo de organismo que parasitan
Los virus pueden clasificarse en:
•Bacteriofagos o fagos: virus que parasitan a bacterias
•Virus Animales.
•Virus vegetales
Desde el punto de vista genético
•Virus cuyo material hereditario es ADN.
•Virus cuyo material hereditario es ARN.
•Virus cuyo material hereditario es ARN-ADN.
•Virus cuyo material hereditario es ADN-ARN.
VIRUS CUYO MATERIAL HEREDITARIO ES ADN
VIRUS ADN
Tipo de Molécula
Tipo de Hélice
Tipo de virus según
huésped.
Familia de virus
Fago
ØX174
M13
Animal
Parvovirus
Animal
Papovavirus (SV40,
polioma)
Adenovirus
Herpetovirus
(Herpes)
Poxvirus (viruela)
Iridovirus (peste
porcina)
Sencilla
Circular
Doble
Lineal
Doble
Fago
Extremos
cohesivos: Fago
lØ80, 434, P2, 186)
Redundancia terminal: serie Tpar, T3 y T7
ØX174
Ha sido empleado ampliamente en estudios sobre la replicación del ADN
•tienen una cápside poliédrica
•forma replicativa duplex
de la hebra - se sintetiza el ARN
mensajero que se traducirá para
producir las proteínas de la cápside
•molécula de ADN circular de hélice
sencilla (hebra +) con 5.400 nt
Fago filamentoso M13
El bacteriofago M13 tiene una cápside de tipo filamentoso dentro de la
cual se encuentra una molécula circular de ADN de hélice sencilla de
6.400 nucleotidos. Al igual que ØX174, también pasa por una forma
replicativa dúplex.
SV40 (Papovavirus)
tiene una cápside icosaédrica
ADN circular doble hélice de
5.243 pares de nucleotidos.
Su ADN se asocia con las
histonas de la célula huésped
fago l
El fago l posee una cápside icosaédrica con una cola.
Dentro de la cápside existe una molécula de ADN doble hélice lineal
con 48.000 pares de bases.
fagos de la serie T
cápside icosaédrica con cola que encierra en su interior ADN
doble hélice lineal (aproximadamente 166.000 pb).
Presentan redundancia terminal: repetición de una secuencia de 2.000 a
6.000 bp en los dos extremos
LOS CROMOSOMA DE LAS BACTERIAS: ORGANIZACIÓN EN DOMINIOS
La circularidad del cromosoma de E. coli
se demostró mediante estudios genéticos de construcción de mapas
de tiempo mediante la técnica de la conjugación interrumpida (Jacob y
Wollman, 1958).
F. Jacob
E. L. Wollman
la primera evidencia citológica se obtuvo más tarde (Cairns, 1963) marcando
radiactivamente el ADN, realizando una autorradiografía y analizando los
resultados al microscopio óptico.
PROTEÍNAS BACTERIANAS SEMEJANTES A LAS HISTONAS
En bacterias se han encontrado proteínas con características muy semejantes a
las histonas de los organismos eucariontes.
•la HU que es un dímero de subunidades diferentes y semejante a la histona H2B
•la proteína H dímero de subunidades idénticas y semejante a la histona H2A
•la proteína P semejante a las protaminas,
•la subunidad H1,
•el dímero HLP1 y
•el monómero HLP1.
PROTEÍNAS BÁSICAS DETECTADAS EN BACTERIAS
Contenido por
células
Semejanza con
eucariontes
HU
Dímero
subunidade
s y de
9.000 d.
40.000 dímeros
Histona H2A
H
Dímero
subunidade
s idénticas
de 28.000 d.
30.000 dímero
Histona H2B
IHF
Subunidad de
10.500 d.
Subunidad
de 9.500
d.
Desconocido
Desconocida
H1
Subunidad de
15.000 d.
10.000 copias
Desconocida
HLP1
Monómero de
15.000 d.
20.000 copias
Desconocida
P
Sububnidad de
3.000 d.
Desconocido
Protaminas
Proteína
Composición
LOS PLASMIDIOS
elementos genéticos extracromosómicos
Moléculas de ADN doble hélice circular que se replican de forma
autónoma e independiente a la del cromosoma principal y que
pueden, en algunas situaciones, integrarse en el cromosoma principal
bacteriano y a partir de ese momento replicarse al mismo tiempo.
El tamaño y número de los plasmidios es muy variable (2.000 a 100.000
pares de bases/1-100 copias por célula)
.
Los plasmidios se pueden se clasifican según las funciones o el tipo
de información que llevan en:
•Factores de Fertilidad o factores F.
•Factores de resistencia de transferencia a drogas, factores RTF o
factores R.
•Factores colicinógenos, factores Col o factores Cf. Las colicilinas son
sustancias que matan a las bacterias. Naturalmente las bacterias
productoras de colicilinas son inmunes a ellas.

Algunas preguntas-ejercicios….
Genética Molecular
Curso 2006
Clase II
Temario
Superenrrollamiento. Estructura y tipos de elementos en genomas procariótic os (“¿un
cromosoma?”, megaplásmidos, plásmidos, episomas). Estructura de los cromosomas
eucarióticos. Histonas, nucleosomas. Grados de compactación: heterocromatina y
eucromatina. Bandas en los cromosomas. Centrómeros. Empaquetamiento del DNA y
accesibilidad.
Preguntas y Problemas
1) a) El plásmido pDJ02 está constituído por una molécula circular cerrada de DNA de doble
cadena de 16,500 bp. Cuál es el valor de L de ésta molécula cuando está relajada en la forma
de B-DNA?. Cuántas vueltas de hélice hay en la molécula relajada?
b) La molécula de la parte a) es transferida de una solución acuosa a 70% ethanol. Bajo esas
condiciones la estructura cambia de la forma B a la A-DNA. Cuál es el valor de L? ¿Cuántas
vueltas de hélice posee?
c) Cuál de las moléculas (parte a o b) posee una estructura más compacta? Explique.
2) Ciertas secuencias de DNA pueden adoptar la configuración Z-DNA en determinadas
condiciones. Un ejemplo es una secuencia de doble cadena que posee repeticiones de d( 5'
GC 3' ) . El Z-DNA tiene 12 pares de bases (6 d(GC) dobletes) por vuelta
a) Suponga que una molécula circular cerrada de dsDNA (1036 pares de bases en total)
posee 1000 bp en la forma de B-DNA relajada y 36 bp (18 consecutivos d(GC)dobletes) en la
forma Z-DNA. Cuál es el valor de Lde ésta molécula?
b) la forma Z-DNA no se forma generalmente en el DNA relajado. Sin embargo si el DNA de la
parte (a) es convertido a la forma superenrrollada negativa por tratamiento con girasa, la
secuencia de (GC) puede convertirse a la configuración dextrógira. Explique porqué sucede
esto.
3) ¿Qué es un cromosoma?
4) ¿Qué características debe poseer un ácido nucleico para ser considerado genómico?
5) ¿Qué diferencia un plásmido de un cromosoma?