Download 2. Estructura y Propiedades de Proteínas

2. ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE PROTEÍNAS
Purificación de LDH de músculo de Gallus gallus
CICLO DE CORI
Sangre
↑Demanda de ATP
↓O2
Hígado
Glucosa
ADP + GDP + Pi
Piruvato
NADH
Gluconeogénesis
Glucógeno
Glucogenolisis y
Glucólisis
ATP + GTP
ATP
L-Lactato
NAD+
Glucosa
ADP + Pi
Lactato deshidrogenasa
(LDH)
L-Lactato
Músculo
L-Lactato
2. PURIFICACIÓN DE LA ENZIMA
LACTATO DESHIDROGENASA DE
MÚSCULO ESQUELÉTICO DE BOVINO
PARTE I. EXTRACCIÓN Y PRECIPITACIÓN POR SALADO.
¿PARA QUÉ PURIFICAR UNA PROTEÍNA?




•Suero fetal bovino
•Colorante de carne
•Proteína liofilizada



Lipasa
Hexosa oxidasa
Vacuna Hepatitis B
Insulina
Gelatina
Proteínas recombinantes
varias
Pectinoesterasas
¿POR QUÉ QUEREMOS PURIFICAR UNA
PROTEÍNA?

Precisar secuencias de aminoácidos.

Establecer relaciones evolutivas.

Investigar la función bioquímica.

Establecer relaciones estructura-función.

Aplicaciones terapéuticas o biotecnológicas
GUIA PARA PURIFICAR UNA PROTEÍNA
• Definir los objetivos.
Pureza, actividad y cantidad.
•Definir las propiedades de la proteína de interés e impurezas.
PM, pI, solubilidad, estabilidad. Componentes que puedan dañar
a las proteínas (ejm proteasas).
• Seleccionar la fuente de proteína.
Organismo, tejido, localización celular.
• Desarrollar una técnica de análisis.
Para una detección rápida de la actividad de la proteína.
GUIA PARA PURIFICAR UNA PROTEÍNA
•Minimizar el manejo de la muestra.
Evitar procedimientos largos.
• Minimizar el uso de aditivos.
Usar lo mínimo necesario.
• Eliminar los contaminantes dañinos rápidamente.
Por ejemplo, las proteasas.
• Usar una técnica diferente en cada paso.
Con el fin de aprovechar al máximo las características de la muestra
en el proceso de separación.
GUIA PARA PURIFICAR UNA PROTEÍNA
•Reducir el número de pasos.
Los pasos extra reducen el rendimiento e incrementan el tiempo de
purificación.
FASES DE LA PURIFICACIÓN
1.
Fase I ó fase de captura, el objetivo es aislar, concentrar y
estabilizar la proteína de interés. Se deben de eliminar los
contaminantes críticos que comprometan la estabilidad de la
proteína.
2.
Fase II ó fase intermedia, el objetivo es eliminar la mayoría de
las impurezas como otras proteínas, ácidos nucléicos,
endotoxinas y virus.
3.
Fase III ó fase de perfeccionamiento, la mayoría de las
impurezas ya han sido removidas excepto aquellas que están
muy relacionadas con la proteína de interés y que se encuentran
en cantidades muy pequeñas. El objetivo es logar la mayor
pureza posible.
DEFINIR LAS PROPIEDADES DE LA PROTEÍNA DE
INTERÉS
Peso Molecular
pI
Solubilidad
Polaridad
Unión Específica
Estabilidad
•La información es útil para detectar la proteína a través
de SDS-PAGE, también es importante cuando
seleccionamos un método de filtración en gel.
•El conocer el valor del pI puede ser utilizado con
diferentes propósitos: pp isoeléctrica, selección de
columna de intercambio iónico, pH de trabajo.
• Afectada por temperatura, pH, fuerza iónica. Esto debe ser
considerado para evitar la agregación y precipitación de la
proteína. También útil para separación.
•Hidrofobicidad e hidrofilicidad de la muestra, para
elegir una columna de interacción hidrofóbica.
•Ligandos útiles para separar la proteína.
•En términos de actividad, agregación y composición de
subunidades. Las características físicas y químicas de la
proteína son importantes a lo largo del proceso.
SELECCIONAR LA FUENTE DE PROTEÍNA

a)
b)
c)
La elección de la procedencia de la proteína debe basarse en
criterios tales como:
la facilidad de obtener cantidades suficientes del tejido del
que se aísla la proteína,
la cantidad de la proteína de interés en el tejido y
cualquier propiedad peculiar de la proteína escogida, que
ayudará en su estabilización y su aislamiento.
RUPTURA DE LA CÉLULA
¿QUÉ PROPIEDAD DE LA PROTEÍNA ES IMPORTANTE?
ESTABILIDAD

Las proteínas se desnaturalizan fácilmente por temperaturas elevadas,
aunque algunas se pueden desnaturalizar a 25°C. La purificación de las
proteínas debe llevarse a cabo a 0°C ó temperaturas cercanas.
MÉTODOS
•Suaves:
Lisis celular (choque osmótico)
Digestión enzimática (lisozima)
Lisis química (detergentes)
Homogenización manual
Molienda
Menos agresivos, previenen desnaturalización de la proteína,
pero no aseguran su liberación celular.
RUPTURA DE LA CÉLULA
¿QUÉ PROPIEDAD DE LA PROTEÍNA ES IMPORTANTE?
ESTABILIDAD
MÉTODOS
•Moderados:
Homogenización con cuchillas
Molienda abrasiva
Congelamiento
•Vigorosos:
Ultrasonicación
Homogenizador Manton-Gaulin
Prensa francesa
Reducen viscosidad del extracto, pero pueden inactivar proteínas.
SELECCIONAR LA FUENTE DE PROTEÍNA
Buffer de Lisis
Debe mantener las condiciones apropiadas para mantener e
incluso mejorar la estabilidad de la proteína.
pH
Fuerza Iónica
Aditivos
Debe ser al menos una
unidad arriba o abajo del
pI de la proteína. Ésta
diferencia previene la pp
isoeléctrica,
por
el
mantenimiento de cargas
positivas o negativas en
la proteína.
Incrementar la fuerza
iónica del medio puede
reducir las interacciones
iónicas entre las proteínas
y las pérdidas por pp.
Son componentes que
previenen la degradación
y mejoran la estabilidad.
Se deben agregar solo si
es necesario.
SELECCIONAR LA FUENTE DE PROTEÍNA
Aditivos
FRACCIONAMIENTO CELULAR:
CENTRIFUGACIÓN DIFERENCIAL

Eliminar contaminantes o clarificar la
muestra

Separación de los componentes con
base en las diferencias en densidad,
tamaño y forma. Como resultado, el
efecto de la gravedad para cada
proteína es diferente.

Partículas más grandes y pesadas
migran más rápido.
FRACCIONAMIENTO
CELULAR:
CENTRIFUGACIÓN
DIFERENCIAL
Homogenización
del tejido
Baja
decentrifugación
centrifugación
Baja velocidad
velocidad de
000g,g,10’)
10’)
(1 000
Sobrenadante sujeto a velocidad de
centrifugación media
(20 000 g, 20’)
Sobrenadante sujeto a velocidad de
centrifugación alta
(80 000 g, 1 h)
Tejido
homogenado
Pellet,
contiene
células
completas,
núcleos,
membranas
plasmáticas
Sobrenadante sujeto
a velocidad de
centrifugación
muy alta
(150 000 g, 3 h)
Pellet,
contiene
mitocondrias,
lisosomas,
peroxisomas
Pellet, contiene
microsomas
(fragmentos de
RE), vesículas
pequeñas
Sobrenadante
contiene
proteínas
solubles
Pellet, contiene ribosomas,
macromoléculas grandes
Diagrama
para la
obtención de
diferentes
fracciones
celulares
FRACCIONAMIENTO
CELULAR:
GRADIENTE DE
DENSIDAD
Centrifugación
Otros
compuestos
utilizados para
formar el
gradiente:
detergentes no
iónicos, Ficoll,
Percoll,
Nycodenz y
Optiprep.
Muestra
Gradiente
de Sacarosa
Componentes
menos densos
Componentes
más densos
Fraccionamiento
REMOVER CONTAMINANTES Y/O CONCENTRAR
LA MUESTRA

Después de romper las células y estabilizar las proteínas, el
siguiente paso es concentrar. Se pueden utilizar diferentes
métodos:
Ultrafiltración
Liofilización
Precipitación
Precipitación
¿Qué propiedad de la proteína es importante?
SOLUBILIDAD



La solubilidad de una proteína es sensible a la
temperatura, el pH, la fuerza iónica.
Si afectamos alguna de éstos factores podemos disminuir
o incrementar la solubilidad de la proteína.
El método más comúnmente empleado es la
precipitación por salado con (NH4)2SO4.
¡Y es el que vamos a hacer en la práctica!
Sin embargo, también hay otros métodos…
Pp con solventes orgánicos.
Pp isoeléctrica.
Pp térmica.
Log (S/S’)
Precipitación
¿Qué propiedad de la proteína es importante?
SOLUBILIDAD
Fuerza Iónica
Precipitación
¿Qué propiedad de la proteína es importante?
SOLUBILIDAD
Solubilidad
Capa de
Hidratación
Salting in
Salting out
Concentración de sal
Precipitación
¿Qué propiedad de la proteína es importante?
SOLUBILIDAD
EXISTEN TABLAS QUE NOS INDICAN CUANTO
AÑADIR DE SULFATO DE AMONIO
Y TAMBIÉN EN INTERNET
http://www.proteinchemist.com/cgi-bin/s2.pl
 Conocer:
1.
Sulfato de amonio sólido
2.
Conocer el volumen de la solución
3.
Y la concentración final de la sal
¿CÓMO VAMOS A
PURIFICAR A LA LDH
DE Gallus gallus?
PROPIEDADES DE LDH DE Gallus gallus
LDH A
LDH B
332
333
36514.4
36318.0
7.75
7.07
-0.004
0.087
Citoplasma
Citoplasma
Forma activa
Homotetrámero
Homotetrámero
Superfamilia
LDH/MDH
LDH/MDH
Oxidoreductasa
Oxidoreductasa
NAD+
NAD+
Numero de aminoácidos
Peso molecular (Da)
Punto isoeléctrico
Promedio general de hidropaticidad (GRAVY)
Localización celular
Tipo de enzima
Cofactor