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Utilización de transcriptómica para el estudio de los cambios de
ploidía y modo reproductivo en pasto llorón (Eragrostis curvula)
Viviana Echenique
CERZOS (CONICET)
y
Dpto. de Agronomía
Universidad Nacional del Sur
Argentina
[email protected]

El género Eragrostis está compuesto por más de 250 especies distribuídas
en diferentes regiones del mundo.

E. curvula es miembro de la familia Poacea, subfamilia Chloridoidea.

Es una gramínea C4, nativa Sudáfrica.





Varias de sus formas, conocidas como pasto llorón (lovegrasses) son
utilizadas en Argentina, US y Australia como forrajeras o consolidadoras de
suelos.
El área cultivada en Argentina es de 786.749 has. (2002)
Es un pasto perenne resistente
a la sequía
Excelente complemento
del pastizal natural
Principal limitación:
calidad del forraje

Algunos cultivares son poliploides (4x - 8x) y apomícticos

Apomixis gametofítica: DIPLOSPORIA

Los diploides (2n = 2x = 20) son siempre sexuales.


También son muy poco frecuentes en la naturaleza (4
colectados en Sudáfrica).
Los cvs. más valiosos como forrajes son tetraploides (2n = 4x
= 40) y apomícticos: producen progenies uniformes.
Desarrollo del saco embrionario



Luego de una serie de
mitosis, una megáspora
no reducida forma un
saco embrionario no
reducido y un embrión
por partenogénesis
Es pseudógamo
Relación ploidía embrión
endosperma: 2/3
Serie artificial
Cultivo in vitro de inflorescencias
T
C
D
Colchicina
y DMSO
cv. Tanganyika
4x Apo.
UNST1122
2x Sex.
Cardone et al. (2008) Euphytica 151 (2): 263-272
UNST1131
and
UNST1112
4x Sex.
Esta serie es de utilidad para:




(a) El establecimiento de poblaciones de mapeo (4x) que
segreguen por modo reproductivo o calidad de forraje,
(b) estudiar los cambios genéticos, epigenéticos y
transcripcionales que ocurren inmediatamente luego de
cambios de ploidía
(c) la identificación de genes relacionados con el modo
reproductivo por perfilado transcriptómico,
(d) el desarrollo de estrategias de mejoramiento
4xApo
2xSex
4xSex
Desarrollo del saco embrionario
2x sexual
Tests de Progenie
31 31
A
A
B
B
C
C
D
D
E
E
F
F
G
G

(b) la identificación de cambios genómicos
tempranos que ocurren por cambios en la ploidía
Cambios genéticos

31.45% de 1008 RAPD y AFLP fueron del tipo 1/0/1 y 0/1/0).


La estructura genética es
recuperada con el nivel de ploidía
Las alteraciones genómicas son
específicas y la estructura genética
es característica de un nivel de
ploidía
Mecchia et al. 2007. J. Plant Physiol. 164: 1051 - 1061


27 de las bandas polimórficas fueron re-amplificadas con el mismo
par de primers de AFLP, clonadas y secuenciadas confirmando la
identidad de las bandas de igual migración.
Las secuencias se organizaron en 14 contiguos, 10 no dieron homología
con genes conocidos, las otras 4 correspondieron a secuencias
codificantes:
- una proteína de un retro,
- una sacarosa sintasa,
- una metilasa,
- una ATPasa (también encontrada diferencial en genotecas de cDNA
de inflorescencias 4x 2x).

También se encontraron secuencias no codificantes
Conclusiones:
90 % de las bandas polimórficas revierten
 Los cambios genéticos involucran regiones codificantes y no codificantes

Cambios epigenéticos
43
30
44
47
• Los cambios epigenéticos involvucraron sólo regiones codificantes:
•pleckstrin homology domain containing family A (e)
•S-domain receptor-like protein kinase (e)
•Retrotransposon protein, ribonuclease H activity (e)
•Retrotransposon protein (e)
•Repetitive element (e)
•CDK-activating kinase assembly factor MAT1 family protein (i)
•Chalcone synthase (e)
•Zinc finger protein(e)
•Expressed protein (e)
•Hypothetical protein (e)
•
El patrón de metilación de citosinas
fue más similar entre las plantas 4x
Ochogavía et al. (2009) Plant. Mol. Biol.
Conclusiones:




También se produce
metilación de citosinas
reversión
en
el
patrón
de
La reversión epigenética es menos reproducible que la
genética
Los cambios ocurrieron en regiones codificantes
Este es uno de los primeros informes de respuestas
del genoma y epigenoma a cambios de ploidía en
autopoliploides.


Están estos cambios relacionados a cambios en
expresión?
Pueden ayudarnos a comprender fenómenos
relacionados con la ploidía, como la apomixis?
Estudios en expresión de genes



Objetivo: comparar patrones de expresión en la misma serie de
plantas
2 estrategias:
Differential display
Secuenciado de ESTs
RNA de inflorescencias y hojas de las plantas T (4x, apo),
D (2x, sex) y C (4x, sex).
Display diferencial
4242 genes de inflorescencias
Inflorescencias
y
7622 de hojas
Hojas
Perfiles genómicos
Mecchia et al., 2007
Perfiles de expresión
Selva et al., en preparación
Secuencias
Differential Display
8
Number of genes
7
6
5
4
3
2
1
0
C1
C2
C3
C4
C5
C6
C7
C8
C9
C10
C11
C12
Rice chromosome
Differential Display
7
Number of Genes
6
5
4
3
2
1
0
C1
C2
C3
C4
C5
C6
Maize chromosome
C7
C8
C9
C10
Secuenciado de EST

3 genotecas de cDNA de inflorescencias (4x apo, 4x sex and 2x
sex), 1 de hojas

12.295 ESTs de buena calidad fueron agrupadas y ensambladas
dando 8.884 unigenes (1.490 contiguos y 7.394 singletons)

Las genotecas fueron comparadas de a pares

207 genes diferencialmente expresados relacionados con ploidía y/o
modo reproductivo

188 genes funcionalmente anotados.
2xSex 4xApo leaves 4xSex
Clasificación funcional de los unigenes de acuerdo a
Gene Ontology
Cervigni et al., a) PMB (2008) 67: 1-10
2xSex vs. 4xApo
2xSex vs. 4xSex
4xApo vs. 4xSex
Genes afectados por modo reproductivo
26 = 18
8
en plantas sexuales
Genes afectados por nivel de ploidía
36 = 31
Cervigni et al.
(2008). Plant. Mol.
Biol. 67: 11-23.
5
en plantas tetraploides
Genes de patrón inesperado
50 = 44
6
en 2x sex y 4x apo
Validation by QR-PCR of gene expression The Y axis represent how many times a gene is
expressed in the corresponding genotype with respect to the 4x apo genotype T. Black
bars represent the 4x apomictic genotype and consequently show the value 1 in all
cases. Stripped and squared bars represent 4x and 2x sexual genotypes respectively.
Differences between mean values were evaluated using a t Student test by paired
samples. P < 0.05 was considered significant.
Expresión de los genes “inesperados”
4x sex

Un grupo de genes tiene expresión
aumentada luego de la poliploidización

No son activos en plantas 2x sex y 4x
apo

Son el nexo entre la apomixis y la
poliploidía?
2x sex
Expresión
4x apo

Nuestra hipótesis: se requiere de un
proceso
de
reestructuración
del
transcriptoma
para
mantener
la
sexualidad en los poliploides. Es la
apomixis el resultado de una falla en
este proceso?
Mapeo in silico en arroz y maíz
Total
Grupo2
Grupo4
16
Number of geness
14
Grupo1
Grupo3
Grupo5
12
10
8
6
4
2
0
C1
C2
C3
C4
C5
C6
Maize cromosome
C7
C8
C9
C10
Genes que mapean en regiones asociadas a diplosporía en arroz y maíz
Genes obtenidos por DD
Descripción
4X Apo
2X Sex
4X Sex
Rice
Maize
Put. protein kinase (Rice) BAD44833.1
O
O
I
1
3
prot kinase (Weat) ABG68041.1
O
I
O
5
8
put gag-pol polyprot (Maize) AF466646_9
O
I
O
1
6
put prot kinase ADK1 (Rice) BAD45137.1
O
I
O
1
8
put serine carboxypept II (Rice) AAV43957.1
I
O
I
5
3
Fructose-bisphosphate aldolase
0
1
4
5
8
Disease resistance protein-like
0
1
4
1
3
N/A
0
0
4
1
8
COP9 signalosome complex subunit
0
0
5
1
8
Putative serine/threonine-specific kinase
0
0
5
1
8
Putative microtubule bundling
0
0
4
1
3
importin alpha-like protein
0
0
4
1
8
Hypothetical protein
0
5
0
1
6
Cellulose synthase 1
0
4
0
1
3
S-adenosylmethionine synthetase 1
0
4
0
1
3
N/A
2
0
5
5
8
ESTs
Pruebas de progenie
31 31
2003
2007
A
A
B
B
C
C
D
D
E
E
F
F
G
G
~100% sex
~20% sex
Estudios citoembriológicos
Cultivars
# of
spikelets
Apo
Sex
# of
embryosacs (+)
Tanganyika
(4x)
43
32
0
32
Don Juan
(8x)
31
14
0
14
Don Eduardo
(6x)
38
17
0
17
Don Pablo
(7x)
23
13
0
13
Victoria (2x)
53
0
51
51
441 (2x)
50
0
48
48
UNST1131
(4x)
69
46
4
50
UNST1112
4x
44
11
1
12
Zappacosta, 2009 Tesis Doctorado
Zappacosta et al., en preparación
~20% sex
MSAP
Without changes (2003-2007)
(D/D)
(E/E)
(I/I)
(M/M)
Total
Methylations (2003-2007)
(E/M)
(I/M)
(D/M)
(D/E)
(D/I)
Total
Demethylations (2003-2007)
(E/D)
(I/D)
(M/D)
(M/E)
(M/I)
Total
2003-2007
172
15
34
1
222
81,02%
6
16
7
3
1
33
12,04%
0
11
5
2
1
19
6,94%
Otras consideraciones

Situaciones de “estres genómico” (cultivo de tejidos, salinidad, sequía) conducen
a la obtención de progenie variable en especies apomícticas (literatura)

Muchas secuencias encontradas son “genes de estrés”

En pasto llorón se observó progenie variable luego de situaciones de sequía en
período reproductivo y cultivo in vitro

En generación R2 la progenie fue nuevamente uniforme



En situaciones de estrés hídrico y cultivo in vitro hay
movimiento de transposones y retros (literatura), en
algunos casos no azarosos
Encontramos expresión diferencial de retros entre
plantas apo y sex (mayor expresión)
En condiciones de estrés nutricional en lino hay cambios
genómicos altamente dirigidos y constantes en diferentes
líneas de plantas (rev. En Cullis, 2005). Involucra elementos transponibles
Qué sucede?




Los diploides son 100% sex SIEMPRE
Los tetraploides pueden ser altamente sexuales
La expresión de la apo incrementó en los colchiploides en cuatro años
Encontramos una planta de semilla 100% sexual (USDA)
Nuestra hipótesis
La reproducción sexual en tetraploides apomícticos puede ser “desreprimida” por situaciones de estrés genómico y es gradualmente silenciada.

La
existencia de una planta 100% sexual indicaría la existencia de una
región (o dos) determinante/s de la apomixis, sujetas a… control
epigenético?
La
región/es puede/n estar presentes en los diploides, pero no se expresa
4x sex
Nuestra hipotesis: Se necesita un
proceso de reestructuración del
transcriptoma para mantener la
sexualidad en poliploides.
2x sex
Nuestros resultados indicarían que el
proceso no se mantiene indefinidamente
Expresión
4x apo
Cuando el patrón epigenético es
restaurado la sexualidad es silenciada …..
“solamente”
En aquellas plantas que poseen la región
determinante de la apomixis
Genotecas de cDNA para búsqueda de genes
relacionados con biosíntesis de lignina
Búsqueda de genes relacionados con biosíntesis de lignina
Díaz, 2006, Tesis Doct.
Díaz et al., enviado
Transformación genética
Genes tales como pal, c4h, c3h, 4cl NO SON BLANCOS
ADECUADOS para la manipulación de la biosíntesis de
Estrategia sentido/antisentido monolignoles.
Genes como omt, ccoaomt, ccr y cad SON BUENOS
BLANCOS para alterar el contenido y/o la calidad de
lignina.
CLUSTAL
2.0.5
multiple
sequence
alignment
AAS10085.1
NP_195225.1
CAJ2202.1
CAJ42204.1
P81393.1
P81395.1
EC01_d_1802.abd_1
EC02_d_2953.ab1_1
-----------------------------MGRSP-CCEKAHTNKGAWTKEEDERLVAYIK
-----------------------------MGRSP-CCEKDHTNKGAWTKEEDDKLISYIK
-----------------------------MGRSP-CCEKAHTNKGAWTKEEDERLVAHIR
-----------------------------MGRSP-CCEKAHTNRGAWTKEEDERLVAYVR
-----------------------------MGRSP-CCEKAHTNKGAWTKEEDDRLVAYIR
-----------------------------MGRSP-CCEKAHTNKGAWTKEEDQRLINYIR
--WTRIGVVLS--VAVQIAELTSASAFLSMGRHS-CCYKQKLRKGLWSPEEDEKLMNHIT
QGRKRPARQQPPYPSNDDCKQQLPVDEESMGREAAAATRPKLRRGLWSPEEDEKLYNHII
*** . .. : : .:* *: ***::*
::
30
30
30
30
30
30
55
60
AAS10085.1
NP_195225.1
CAJ2202.1
CAJ42204.1
P81393.1
P81395.1
EC01_d_1802.abd_1
EC02_d_2953.ab1_1
AHGEGCWRSLPKAAGLLRCGKSCRLRWINYLRPDLKRGNFTEEEDELIIKLHSLLGNKWS
AHGEGCWRSLPRSAGLQRCGKSCRLRWINYLRPDLKRGNFTLEEDDLIIKLHSLLGNKWS
AHGEGCWRSLPKAAGLLRCGKSCRLRWINYLRPDLKRGNFTEEEDELIVKLHSVLGNKWS
AHGEGCWRSLPRAAGLLRCGKSCRLRWINYLRPDLKRGNFTADEDDLIVKLHSLLGNKWS
AHGEGCWRSLPKAAGLLRCGKSCRLRWINYLRPDLKRGNFTEEEDELIIKLHSLLGNKWS
AHGEGCWRSLPKAAGLLRCGKSCRLRWINYLRPDLKRGNFTEEEDEIIIKLHSLLGNKWS
KHGHGCWSTVPKLAGLQRCGKSCRLRWINYLRPDLKRGAFSQEEEDLIIELHAVLGNRWS
RYGVGCWSSVPKLAGLERCGKSCRLRWINYLRPDLKRGSFSQQEEDLIISLHKILGNRWS
:* *** ::*: *** ********************* *: :*:::*:.** :***:**
90
90
90
90
90
90
115
120
AAS10085.1
NP_195225.1
CAJ2202.1
CAJ42204.1
P81393.1
P81395.1
EC01_d_1802.abd_1
EC02_d_2953.ab1_1
LIAGRLPGRTDNEIKNYWNTHIRRKLINRGIDPTSHRPIQESSASQ-------------LIATRLPGRTDNEIKNYWNTHVKRKLLRKGIDPATHRPINETKTSQ-------------LIAGRLPGRTDNEIKNYWNTHIRRKLLSRGIDPVTHRPVTEHHASN-------------LIAARLPGRTDNEIKNYWNTHIRRKLLGSGIDPVTHRRVAGGAATT-------------LIAGRLPGRTDNEIKNYWNTHIRRKLLSRGIDPTTHRSINDGTASQ-------------LIAGALPGRTDNEIKNYWNTHIKRKLVSRGIDPQTHRSLNSATTTA-------------QIATRLPGRTDNEIKNLWNSSIKKKLRQKGIDPNTHKPLA---------------EVD-QIASQLPGRTDNEIKNFWNSCIKKKLRQRGIDPSTHKPLSGGGGEPMPHMDIFGRDVEPF
**
*********** **: :::**
**** :*: :
136
136
136
136
136
136
158
180
AAS10085.1
NP_195225.1
CAJ2202.1
CAJ42204.1
P81393.1
P81395.1
EC01_d_1802.abd_1
EC02_d_2953.ab1_1
----------DSKPTQLEPVTSNTINISFTSAPKVETFHES-------ISFPGKSEKISM
----------DSSDS---SKTEDPLVKILSFGPQLEKIAN----------FGDER--------------ITISFETEVAAAARDDKKGAVFRLEDEEEEERNKATMVVGRDRQSQSHSH
----------ISFQPSPNSAAAAAAAETAAQAPIKAEET------------------------------DQVTTISFSNANSKEEDTKHKVAVDIMIKE-----------------------------TATPTVNNSCLDFRTSPSNSKNICMPTTDNN-------------------------------------RSKAAPTISTERTSESSDVEPS------------------AFDPAKFIPWNNHQQQHHHHHDASAAVSFPIRSMSRDLPESC------------------
179
168
186
165
166
167
180
222
AAS10085.1
NP_195225.1
CAJ2202.1
CAJ42204.1
P81393.1
P81395.1
EC01_d_1802.abd_1
EC02_d_2953.ab1_1
LTFKEEKDECPVQEKFPDLNLELRISLPDDVDRLQGHG----KSTTPRCFKCSLGMINGM
--IQKRVEYSVVEERCLDLNLELRISPP-WQDKLHDERNLRFGRVKYRCSACRFGFGNGK
SHPAGEWGQGKRPLKCPDLNLDLCISPPCQEEE--EMEE---AAMRVRPA-VKREA-----------AAVKAPRCPDLNLDLCISPPCQHEDDGEEED---EELDLKPAFVKREALQAG
-------ENSPVQERCPDLNLDLKISPPCQQQINYHQEN-------LKTGGRNGSS---NNSSSSTDDTKCNSSTTEESQSLITPPPKEEEKSVPLVDLELSLGLPSQSQCNKSVS--------SGGALG---SLNHLLSETRTITRAAAGTWASQR---RYLGTSKGASQRVI------FDLARGALEDEFSVDFLLRKPRDPSVTTSTHTHTQRPTPPFQLPQKIPQQKTLHKLP
:
.
235
225
236
214
208
224
224
279
AAS10085.1
NP_195225.1
CAJ2202.1
CAJ42204.1
P81393.1
P81395.1
EC01_d_1802.abd_1
EC02_d_2953.ab1_1
ECRCGRMRCDVVGGSSK---GSDMSN--GFDFLGLAKKE---------------TTSLLG
ECSCNNVKCQTEDSSSSSYSSTDISSSIGYDFLGLNN------------------TRVLD
-----GLCFGCSLGLPR---TADCKCSS-SSFLGLRT-------------------AMLD
HGHGHGLCLGCGLGGQKG--AAGCSCSNGHHFLGLRT-------------------SVLD
-----TLCFVCRLGIQN---SKDCSCSDGVGN-------------------------------LNSSSSGFYDLFRPPAKVAQRMCVCKWTLGLQKGEQ--------------FCNCQS
---------------PTRVIG-MITKRRLKGPIQNYHTNR----------------CRAK
VWHVSFFFFFTFSPGPTHVESTFLTPWDTGVHIRVYLIKKKIYLQLFLGPSISDLVWEIK
275
267
268
253
232
266
252
339
AAS10085.1
NP_195225.1
CAJ2202.1
CAJ42204.1
P81393.1
P81395.1
EC01_d_1802.abd_1
EC02_d_2953.ab1_1
FRSLEMK-------------FSTLEMK-------------FRSLEMK-------------FRGLEMK---------------------------------FNGFYRYC------------QNGHNMEEANEX--------LPGKLFQSWIKSHGRLFFTFX
282
274
275
260
274
264
360
Represores de lignina informados
R2R3MYB
AtMYB4 [Arabidopsis thaliana]
AtMYB32 [Arabidopsis thaliana]
AmMYB308 [Anthirrinum majus]
AmMYB330 [Anthirrinum majus]
ZmMYB31 [Zea mays]
Zm YB42 [Zea mays]
Protocolo de transformación
Marcadores moleculares: para evaluar pureza varietal, establecer
relaciones genéticas y caracterizar los nuevos materiales
- 15 plantas de cada material
- RAPDS, AFLPs y SSRs
Zappacosta D, Carrera A, Pacheco G, Cardone S, Echenique V. 2008. Diferenciación de
genotipos de pasto llorón por marcadores moleculares. Análisis de semillas 2 (8): 90-93
INASE (Instituto Nacional de Semillas).
Conclusiones

La transformación de una especie apomíctica es una estrategia atractiva
ya que el transgen es fijado inmediatamente en un background genético
adaptado y capaz de propagación clonal a gran escala
Nuestros recursos:
-

Genes candidatos
Vectores
Protocolo de cultivo in vitro
Protocolo de transformación
Implementación de tecnologías moleculares también serán posibles
usando marcadores moleculares:
Nuestros recursos:
- 254 SSRs y 190 SNPs fueron identificados de las genotecas de cDNA
- Se está trabajando en poblaciones de mapeo a nivel diploide
tetraploide y de híbridos con E. tef
Eragrostis team
Argentina
CERZOS (CCT Bahía Blanca, CONICET)
Gerardo Cervigni, Marina Díaz,
Gabriela Luciani, J Pablo Selva,
Diego Zappacosta y Mauro Meier
Facultad de Ciencias Agrarias (UNR)
Silvina Pessino
Martín Mecchia
Ana Ochogavia
Silvina Felitti
INTA Castelar
Norma Paniego
Gabriela Pacheco
Asociación de Cooperativas Argentinas
Ing. Rubén Miranda
FAUBA
Susana Cardone
Victorian AgriBiosciences Centre, Australia
Germán Spangenberg
USDA-ARS, US
Paul Voigt
Proyecto financiado por:
ANPCyT (PICT 14624 y PAV 137)
SECyT (UNS)
PIP CONICET 2008
We Welcome You To
Buenos Aires
ARGENTINA
For the 6th International Symposium on
Molecular Breeding of Forage and Turf
(MBFT)
March 2010
http://www.criba.edu.ar/mbft2010