Download Cómo hacer mutagénesis? - Mi Portal

Drosophila como sistema
• Ventajas generales:
– Fácil y barato de mantener
– Tiempo de generación corto (10 dias)
– Produce mucha progenie
Drosophila como sistema
• Ventajas genéticas:
– Sin recombinación meiótica en machos
– Sólo cuatro cromosomas
– Cromosomas politénicos visibles al óptico
– Muchos caracteres externos variables (ojos,
nervios en las alas, quetas…)
– Un gran repertorio de técnicas y trucos
– Genoma completamente secuenciado
Drosophila como sistema
• Ventajas como modelo:
– Muchos procesos de desarrollo conservados
entre moscas y vertebrados
– Muchos genes claramente relacionados con
genes humanos (más que Caenorhabditis
elegans)
Drosophila como sistema
• Desventaja fundamental:
– Tiene que mantenerse viva en el laboratorio
(no hay posibilidad de conservar congelada)
CICLO VITAL DE DROSOPHILA
LA CUTÍCULA EMBRIONARIA
¿Cómo hacer mutagénesis?
Se hace mutagénesis de un buen número de machos de modo que un cierto
porcentaje de sus espermatozoides tengan mutaciones
¿Cómo hacer mutagénesis?
Los machos mutagenizados se cruzan “en masa” con hembras normales
x
F1
Todos los descendientes son heterozigotos. Por lo general, cada uno
para una mutación distinta.
¿Cómo hacer mutagénesis?
Para los mutantes recesivos es preciso obtener individuos homozigotos.
Pero, ¿cómo conseguirlos?
x
1/4
La autofecundación “en masa” de la F1 NO generará casi nunca
homozigotos para cada mutación sino dobles mutantes en heterozigosis
¿Cómo hacer mutagénesis?
Cruzando POR SEPARADO cada macho F1 con hembras wt se obtiene en
cada cruce (botella) 1/2 de heterozigotos para cada mutación.
x
F2
1/2
1/2
¿Cómo hacer mutagénesis?
Si se deja que las moscas de cada botella se crucen entre ellas
aparecerán algunos homozigotos para la mutación que contenga
1/2
x
1/4 de los cruces
Todos wt
1/2
¿Cómo hacer mutagénesis?
Si se deja que las moscas de cada botella se crucen entre ellas
aparecerán algunos homozigotos para la mutación que contenga
1/2
1/2
x
1/2 de los cruces
1/2
1/2
¿Cómo hacer mutagénesis?
Si se deja que las moscas de cada botella se crucen entre ellas
aparecerán algunos homozigotos para la mutación que contenga
1/2
1/2
x
1/4 de los cruces
1/4
Fenotipo visible
1/2
1/4
¿Cómo hacer mutagénesis?
Resumen de los resultados de la autofecundación en botellas
donde había un mutante
1/2
1/2
x
1/16
6/16
9/16
Entre los hermanos de los mutantes habrá portadores de la mutación,
pero también muchos wt
¿Cómo hacer mutagénesis?
El experimento se simplificaría si hubiera algún modo de eliminar
automáticamente los individuos “a” y “b”
F1
F2
x
1/2
x
1/2
a
F3
b
1/16
6/16
9/16
¿Cómo hacer mutagénesis?
Una posibilidad es usar letales recesivos (r) y letales dominantes
inducibles (D)
r
F1
x
r
D
r
r
D
F2
r
r
D
¿Cómo hacer mutagénesis?
Pero si hay recombinación en la hembra el sistema puede destruirse
r
D
Meiosis
r
D
x
r
…
r
…
¿Cómo hacer mutagénesis?
• Los recombinantes que se producen entre
cromosomas que difieren en una inversión dan
descendientes inviables. En Drosophila hay
sistemas de cromosomas con inversiones,
CROMOSOMAS BALANCEADORES, que pueden
emplearse para evitar este problema.
• El “screening” se hace por separado para cada
cromosoma
El “screening” de Heidelberg
EMS
w
w
x
B
r
D
w
F1
B
w
r
D
Se mutagenizan con EMS varios miles de machos que después se
cruzan con hembras vírgenes “en masa”
El “screening” de Heidelberg
w
B
r
r
B
x
w
D
D
29º 4 dias
18º o 25º
w
w
D
B
B
B
D
r
D
r
r
F2
B
r
D
El “screening” de Heidelberg
w
B
x
r
w
w
1/4
w
B
w
B
r
1/2
F3
r
B
B
r
r
1/4
Mueren como larvas
CRITERIOS DE SELECCIÓN:
-1)no hay moscas de ojos blancos;
-2)de 1/4 de los huevos no salen larvas;
-3)observación embriones
RESULTADOS DEL “SCREENING”
EN EL CROMOSOMA 2
• 1500 machos
mutagenizados
se cruzaron
r
w
w
B
r
con unas
2500Bhembras
vírgenes
r
w
B
• 10.000
cruces individuales
de F1, 5764
EMS
1/4
1/2
1/4
dieron suficiente descendenciaMueren como larvas
r
w
B
• 4217 de lasww F2 no dieron
moscas de ojos
x
r
r
B
B
blancos (73% → 1.3 xmut/crom) D
w
• 2843 daban
25% huevos de los queDno
salían larvas D
RESULTADOS DEL “SCREENING”
EN EL CROMOSOMA 2
• Examen a la lupa de los embriones de las
2843 líneas
• 1620 líneas son letales embrionarios
auténticos
• 321 muestran defectos claros cutícula
• Análisis de complementación: 61 genes,
48 con más de 1 alelo, 13 con 1 alelo
ASPECTO DE ALGUNOS MUTANTES
EL SISTEMA GAL4-UAS
DROSOPHILAS TRANSGÉNICAS
Gen marcador
Se perderá rápidamente
La transposasa sólo se produce
en la línea germinal y sólo allí se
integra el transposón P
Transposón sólo en la línea germinal
de algunas de las moscas
Moscas ya con el transposón
en la línea somática
EL PEZ CEBRA COMO SISTEMA
MODELO DE VERTEBRADOS
•
•
•
•
•
Pequeño tamaño (3-4 cm)
Tiempo de generación corto (3-4 meses)
Alta fecundidad (100-200 huevos/hembra)
Fácil de mutagenizar
Embrión transparente y de desarrollo
externo
• Se puede fecundar “in vitro”. Esperma
congelable
“SCREENINGS” EN EL PEZ
CEBRA
Se dejan transcurrir varias semanas
entre mutagénesis y cruzamiento
para reducir la aparición de mosaicos
Cruzamiento:
Macho
x Hembra entre
alb/alb
1/4 de wt/ENU
los cruzamientos
los
Individuo
F1
mosaico
para
F2 darán individuos homozigotos
mutación
en fenotipo
el locus alb
para m: con
visible
DESARROLLO DEL PEZ CEBRA
MUTANTES OBTENIDOS
“SCREENINGS” DEL PEZ CEBRA
“SCREENING” DE TÜBINGEN
•
•
•
49 MACHOS MUTAGENIZADOS
3075 FAMILIAS F2 INICIADAS
2746 FAMILIAS F2 ANALIZADAS
–
•
•
•
•
•
•
150 GENES CON MÁS DE 1 ALELO
222 GENES CON 1 ALELO
Nº alelos/gen: de 1 a 34. Nº medio:
2.4
Development 123:1-36 (1996)
266 MACHOS MUTAGENIZADOS
2799 FAMILIAS F2 INICIADAS
1808 FAMILIAS F2 ANALIZADAS
–
(14.357 cruces para dar F3)
4624 MUTANTES OBTENIDOS
1163 MUTANTES CONFIRMADOS
372 GENES IDENTIFICADOS
–
–
–
“SCREENING” DE BOSTON
•
•
•
(más de 30.000 cruces para dar F3)
2383 MUTANTES OBTENIDOS
695 MUTANTES CONFIRMADOS
220 GENES IDENTIFICADOS
–
–
–
56 GENES CON MÁS DE 1 ALELO
164 GENES CON 1 ALELO
Nº alelos/gen: de 1 a 11. Nº medio:
1.5
Development 123:37-46 (1996)
“SCREENING” DE HAPLOIDES
Ventaja:
Enseguida se detectan
mutaciones interesantes
Problemas:
-1)Los embriones haploides
acaban muriendo
-2)Los embriones haploides tienen
algunos problemas de desarrollo
MÉTODOS ALTERNATIVOS
Presión poco después
de la fertilización:
NO se completa la meiosis II y
embriones diploides
Problema: no son
completamente homocigotos
Choque térmico tras fertilización:
NO se completa 1ª mitosis tras
meiosis y embriones diploides y
completamente homocigotos
Problema: pobre viabilidad (10-20%)
“Screeining” de
haploides ya visto
“SCREENINGS” EN RATÓN
•
•
•
•
Es un mamífero (cercano al hombre)
Genoma secuenciado
Transformable y sistemas “knock out”
Corto tiempo de generación (2 meses)
• Desarrollo embrionario intrauterino
• Requerimientos de espacio en jaulas
• Pocos programas de mutagénesis a gran
escala: unos 300 mutantes dominantes,
pocos de desarrollo
DISEÑO DE UN CROMOSOMA
BALANCEADOR EN RATÓN
Sin Wnt3 el ratón muere
Ag da color amarillento al pelo
Puro y Neo dan resistencia
a antibióticos
Se obtiene un gen Hprt funcional,
Hprt permite crecer en medio HAT
ca. 1/3 del cromosoma con la inversión
UN BALANCEADOR PARA EL
CROMOSOMA 11
Color amarillento de partes del
cuerpo de los ratones portadores
de la inversión
ESQUEMA DEL “SCREENING”
Ratones macho
Marcador dominante
REX: pelo rizado
Mutación
Camadas de más de 24 ratones sin animales negros indican un mutante recesivo letal
ALGUNOS MUTANTES DEL
DESARROLLO OBTENIDOS
MUTAGÉNESIS EN ARABIDOPSIS
Meristemo apical del embrión
Nº células del meristemo que
contribuirán a las semillas
de la planta = 2 en Arabidopsis
CAENORHABDITIS ELEGANS
XX
X0
“SCREENING” DE GENES DE
EFECTO MATERNO
“SCREENING” DE
INTENSIFICADORES
sevd2: alelo nulo
sevB4: alelo hipomorfo
“SCREENING” DE SUPRESORES
wt
RTK activado
constitutivamente
Mutante supresor
POLARIDAD DE LOS CARPELOS
CRC (Crabs claw): TF similares están
relacionados con diferenciación polar
Pérdida parcial de polaridad carpelos
(óvulos externos en línea medial)
Pérdida completa polaridad carpelos
y de simetría bilateral
RECOMBINACIÓN MITÓTICA
EL SISTEMA Flp/FRT
Procede del plásmido 2m
de levaduras
EJEMPLOS Flp/FRT
Mala adhesión compartimentos
dorsal y ventral del ala
Mutantes afectando el control del tamaño.
Efecto en cabeza, resto del cuerpo normal
EL SISTEMA DFS
La mutación se recupera desde
Sus hermanos machos
Inducción por calor en larvas.
También mueren larvas con
cromosoma balanceador
“SCREENING” EN F1 DE GENES
DE EFECTO MATERNO
Puede haber recombinación
meióica
Distintos niveles de GFP
Ya no puede haber
recombinación meióica
NÚMEROS DEL “SCREENING”
•
•
•
•
•
•
Cruzamientos estudiados: 59.200
Hembras F1 miradas: 21.970
Mutantes potenciales: 726
Mutantes confirmados: 353
Genes mutados: 86 (41 nuevos)
Nº medio alelos/gen: 2.02
Genetics 167:325-342 (2004)
LA TÉCNICA Minute
-1 copia mini-white en mutante white
da ojos color rojo amarillo/naranja
-2 copias dan rojo oscuro
Genes Minute: intervienen en traducción
-M/M: mueren las células
-M/+: crecen lento
-+/+: crecen normal