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IMPLEMENTACIÓN DE UN ENSAYO PCR MULTIPLEX PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LAS ENTEROVARIEDADES DE Escherichia coli PATÓGENAS Autora: Andrea Zambrano Cobos Directora: BSc. Karina Ponce Codirector: Dr. Marcelo Grijalva Sangolquí - Ecuador 2012 TABLA DE CONTENIDOS INTRODUCCIÓN MATERIALES Y MÉTODOS RESULTADOS Y DISCUSIÓN CONCLUSIONES RECOMENDACIONES BIBLIOGRAFÍA Escherichia coli (Enterobacteriaceae) CARACTERÍSTICAS: • • • • • • Anaerobio facultativo, Gram Pared celular rígida y porosa Flagelos y pilis Membrana celular (lípidos y proteínas) Una sola cadena circular de ADN Aproximadamente 5000 genes Aislamiento e identificación Bioquímica Serotipificación CATEGORIAS DIARREOGÉNICAS 1. 2. 3. 4. 5. 6. EPEC ETEC EIEC EHEC EAEC DAEC •Poseer distintos factores de virulencia •Causar un síndrome diarreico diferente •Presentar distinta epidemiología •Pertenecer a distintos serotipos O:H Métodos específicos de detección MECANISMO DE PATOGENICIDAD depende Variable E. coli diarreicas • Invasividad. • Adherencia a la superficie de la mucosa. • Producción de enterotoxinas. • Producción de citotoxinas ETAs EHEC: La distribución es universal. Los alimentos asociados a brotes son el arroz, carne contaminada, salsa de vainilla. ETEC: Diarrea del viajero. Países en desarrollo. La transmisión ocurre por la ingesta de alimentos o agua contaminados. EIEC: Genéticamente igual a Shigella spp. Presentan colitis inflamatoria y disentería. EPEC: En niños menores de 2 años. Elevadas tasas de morbilidad y mortalidad. Trasmisión por contaminación fecal EAEC: La causa más frecuente de diarrea persistente en lactantes DAEC: Predomina en pre-escolares, niños pequeños y lactantes VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA • Países desarrollados y subdesarrollados • Datos epidemiológicos • No existen reporte de E. coli patógenas DETECCIÓN 1. Propiedades bioquímicas 2. Serotipo (Ciertas variedades) 3. Reacciones inmunoenzimáticas 4. Cultivos celulares 5. PCR 6. Hibridación de sondas Para estudios epidemiológicos PFGE, MLST PCR MÚLTIPLEX Amplifica Simple identificación 2 ó más loci en la Rxn • Diagnóstico rápido • Alta confiabilidad • Sensible y específico Esta correlacionado con la presencia de genes involucrados con la patogenicidad OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIÓN Objetivo General Implementar un ensayo PCR múltiplex para la identificación de las enterovariedades de Escherichia coli patógenas Objetivos específicos • Optimizar el sistema según los parámetros: Temperatura de hibridación, concentración de primers, tiempo y ciclos de amplificación • Identificar los genes eltB y estA de E.coli enterotoxigénica, los genes vt1, vt2 y eaeA de E.coli enterohemorrágica, el gen ipaH de E.coli enteroinvasiva, el gen eaeA de E.coli enteropátogena, el gen aggR de E.coli enteroagregativa, el gen DA de E.coli difusa adherente • Determinar la sensibilidad analítica del sistema. • Elaborar un protocolo de implementación del ensayo PCR multiplex para la identificación de las enterovariedades Escherichia coli patógenas. MATERIALES Y MÉTODOS DISEÑO DE TIPO EXPLORATORIO - CONFIRMATORIO Optimización: [primers], Tº Hibridación, Ciclos y tiempo de amplificación. Sensibilidad Diseño PCR Multiplex Especificidad Controles positivos y primers Instituto de Ciencias Biomédicas de la Universidad de Chile y Dr. James Nataro de la Universidad de Virginia Cebadores DAEC EPEC Da eae vt1 376 pb 130 pb 750 pb EHEC vt2 298 pb EIEC EAEC ETEC ipaH aggR estA eltB 600 pb 254 pb 147 322 pb pb Extracción ADN genómico Kit comercial de Promega Wizard Genomic DNA Purification OPTIMIZACIÓN Temperatura de hibridación Rango: 56ºC-68ºC Concentración de Primers 0,2 uM - 0,4 uM - 0,5 uM - 0,75 uM - 1uM Tiempos de amplificación 1 min-45 seg- 30 seg DISEÑO DE PCR MULTIPLEX 1. Ensayo PCR: 8 pares primers en una Rxn 2. Ensayo PCR: Combinación de 2 pares de primers con cada DEC 3. Ensayo PCR: 2 PCR multiplex A y B LÍMITE DE DETECCIÓN Cepas de referencia : EHEC y ETEC ESPECIFICIDAD Escherichia coli Escherichia coli ATCC 51313 Escherichia coli ATCC 25922 Klebsiella pneumoniae Salmonella serotipo Enteritidis Vibrio cholerae RESULTADOS Y DISCUSIÓN Microbiología ADN Genómico ETEC: 33,6ng/uL EPEC: 20,2 ng/uL EIEC: 17,8 ng/uL EHEC: 17,3 ng/uL EAEC: 47,5 ng/uL DAEC: 10,8 ng/uL Temperatura de hibridación ipaH ipaH M eltB eltB ipaH ipaH eae eae eae eae ETEC-EAEC EIEC-EPEC M eltB eltB aggR aggR aggR aggR ipaH ipaH ipaH ipaH Da vt2 vt2 Da Da Da EIEC-ECDA M EHEC M vt2 vt2 vt2 vt2 vt2 c- Concentración de cebadores 0,4 uM vt1 eae eltB aggR 0,2 uM Da vt1 eae eltB estA Da Da Da Diseño PCR multiplex Pool DNA Primer Ensayo Concentración de primers Segundo Ensayo PCR Dúplex Tercer Ensayo Tercer Ensayo MULTIPLEX A Y B B A: EHEC-EPEC-DAEC B: ETEC-EIEC-EAEC A MULTIPLEX A Y B Limite de detección Multiplex A : EHEC 0,0029 ng/uL Multiplex B : ETEC 0,011 ng/uL ESPECIFICIDAD M ETEC Salm Vibrio K.pneu Amplifica E. coli patógenas!!! C- Prueba de Campo Múltiplex A M m1 m2 EPEC C1+ Múltiplex B C1- m1 m2 ETEC C2+ C2- Conclusiones Se logro detectar los 8 genes virulentos de la E. coli diarreicas en dos PCR multiplex Los parámetros que fueron optimizados en la PCR monoplex variaron al momento de diseñar la PCR multiplex. Las [primers] oscilan entre 0,1 uM a 1,25 uM, la Tº de hibridación optimizada fue de 57ºC, el tiempo de los pasos de la PCR fueron de 45”. Se dividió en 2 PCR multiplex: A identifica ECEH, ECEP, y ECDA. B identifica a ECET, ECEI, ECEA. La sensibilidad PCR multiplex A fue de 0,0029 ng/uL y B fue de 0,011 ng/uL. La especificidad del sistema se evaluó en otros microorganismos, resultando negativo la amplificación Recomendaciones Realizar la técnica directamente desde las muestras de heces o desde la bacteria, aislando el ADN mediante kits comerciales. Antes de diseñar la PCR multiplex optimizar la temperatura de hibridación de cada cebador y la concentraciones de los mismos. Usar la PCR múltiplex para investigar un número elevado de microorganismos. Hacer uso de esta técnica para estudios a mayor escala como es la prevalencia de las diferentes enterovariedades de E. coli, caracterización genotípica, etc. AGRADECIMIENTOS
