Download “IDENTIFICACIÓN DE Escherichia coli DIARREOGÉNICAS EN

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA
SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN
“IDENTIFICACIÓN DE Escherichia coli
DIARREOGÉNICAS EN MUESTRAS CLÍNICAS
(HECES) Y DE ALIMENTOS EN EL ESTADO
DE SINALOA”
TESIS PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRO EN CIENCIAS DE LA SALUD
PRESENTA:
Q.F.B. EDGAR RAFAEL GONZÁLEZ NÚÑEZ
DIRECTORES DE TESIS:
DR. ALDO ARTURO RESÉNDIZ ALBOR
DR. VICENTE ADRIÁN CANIZALEZ ROMÁN
MÉXICO, D. F.
JULIO 2011
AGRADECIMIENTOS
Esta tesis fue realizada en la Facultad de Ciencias Químico-Biológicas de la
Universidad Autónoma de Sinaloa, bajo la dirección del Dr. Vicente Adrián
Canizalez Román (Profesor- Investigador de la
Facultad de Medicina). En
colaboración con el laboratorio de Inmunología de las Mucosas del Departamento
de Bioquímica de la Sección de Estudios de Posgrado e Investigación, en la
Escuela Superior de Medicina del Instituto Politécnico Nacional, bajo la Dirección
del Dr. Aldo Arturo Reséndiz Albor (Profesor- Investigador del IPN). Como parte
del proyecto titulado: “Identificación de Escherichia coli diarreogénicas en
muestras clínicas (heces) y de alimentos en el Estado de Sinaloa”.
Durante la realización de esta tesis, el autor recibió una beca institucional
por un año (No. de Boleta. B091273), beca PIFI por un semestre, beca CONACYT
(Núm. de becario 241411) por un año. Además de contar con apoyo económico de
la beca programa de Fomentó y Apoyo a Proyectos de Investigación (PROFAPIUAS) No. Del proyecto 2008/027 para obtener el grado de Maestría en Ciencias
de la Salud, Área Inmunología durante Agosto del 2009 a Julio del 2011.
I. ÍNDICE GENERAL
I.
ÍNDICE GENERAL.........................................................................................i
ABREVIATURAS…………………………………………………………………………iii
ÍNDICE DE CUADROS………………………………………………………………….v
ÍNDICE DE FIGURAS…………………………………………………………………...vii
RESUMEN………………………………………………………………………………...ix
ABSTRACT……………………………………………………………………………….xii
II.
INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………1
A. ANTECEDENTES GENERALES………………………………………………...6
1. ENFERMEDADES TRANSMITIDAS POR ALIMENTOS……………………...6
1.1 ENFERMEDADES CAUSADAS POR ALIMENTOS
CONTAMINADOS A NIVEL MUNDIAL……………………………………..6
2. COLIFORME………………………………………………………………………9
a. ESCHERICHIA COLI…………………………………………………………10
1). MORFOLOGÍA DE E. COLI………………………………………………..11
2). METABOLISMO E. COLI…………………………………………………..12
3). OTRAS PRUEBAS QUE RESULTAN POSITIVAS……………………..12
4). ESTRUCTURA ANTIGÉNICA DE E. COLI………………………………13
B. ANTECEDENTES DIRECTOS…………………………………………………14
1. CATEGORÍAS DE E. COLI……………………………………………………14
a. E. COLI ENTEROTOXIGÉNICA (ETEC)…………………………………..14
b. E. COLI ENTEROHEMORRÁGICA (EHEC)……………………………...15
c. E. COLI ENTEROINVASIVA (EIEC)………………………………………18
d. E. COLI ENTEROPATÓGENA (EPEC)…………………………………...20
e. E. COLI ENTEROAGREGATIVA (EAEC)………………………………...21
f. E. COLI DE ADHERENCIA DIFUSA (DAEC)…………………………….23
2. TRATAMIENTO…………………………………………………………………..27
III.
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA……………………………………….28
IV.
JUSTIFICACIÓN………………………………………………………………...30
VI.
HIPOTESIS…………………………………………………………………….. 32
VI.
OBJETIVOS……………………………………………………………………..33
A. OBJETIVO GENERAL………………………………………………………….33
B. OBJETIVOS PARTICULARES………………………………………………...33
VII.
ESTRATEGIA EXPERIMENTAL…………………………………………….34
VIII.
MATERIALES Y MÉTODOS…………………………………………………..35
A. DESCRIPCIÓN DE LAS MUESTRAS DE ALIMENTOS Y CLÍNICAS….....35
1. POBLACIÓN DE ESTUDIO………………………………………………….....35
2. AISLAMIENTO DE E. COLI………………………………………………….....37
3. IDENTIFICACIÓN DE LAS E. COLI DIARREOGÉNICAS……………….....39
4. EXTRACCIÓN DE DNA………………………………………………………...39
5. AMPLIFICACIÓN POR PCR……………………………………………….....39
6. AMPLIFICACIÓN POR PCR MÚLTIPLE……………………………………...42
7. AMPLIFICACIÓN CON PCR MÚLTIPLE E INDIVIDUAL…..........................42
8. DETECCIÓN DEL DNA AMPLIFICADO……………………………………....46
9. PURIFICACIÓN DNA…………………………………………………………....46
IX.
RESULTADOS……………………………………………………………….......47
X.
DISCUSIÓN…………………………………………………………………….....77
XI.
CONCLUSIONES…………………………………………………………….......85
XII.
PERSPECTIVAS………………………………………………………………....87
XIII. REFERENCIAS………………………………………………………………….....88
ANEXOS………………………………………………………………………………...101
ABREVIATURAS
(A/E): Adherencia y Esfacelación.
AH: Aguas y Hielo.
BGN: Bacilo Gram Negativo.
CH: Colitis Hemorrágica.
CAR: Cárnicos.
CENAVESE: Centro Nacional de Vigilancia Epidemiológica y Control de
Enfermedades.
CDC: Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades.
E .coli: Escherichia coli.
STEC: E. coli productora de la toxina shiga.
(ETEC): Escherichia coli ENTEROTOXIGÉNICA.
(EHEC): Escherichia coli ENTEROHEMORRÁGICA.
(EIEC): Escherichia coli ENTEROINVASIVA.
(EPEC): Escherichia coli ENTEROPATÓGENA.
(EAEC): Escherichia coli ENTEROAGREGATIVA.
(DAEC): Escherichia coli DE ADHERENCIA DIFUSA.
ETA: Enfermedades Transmitidas por los Alimentos.
FAO: Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación.
FDA: Administración de Drogas y Alimentos.
INSP: Instituto Nacional de Salud pública de México
ITU: Infección del Tracto Urinario.
LD: Lácteos y Derivados.
LIA: Agar Hierro Lisina.
LT: Toxina Termolábil.
LEPS: Laboratorio Estatal de Salud Pública de Sinaloa.
LPS: Lipopolisacáridos.
MDa: Megadaltones.
MIO: Movilidad Indol Ornitina.
NMP: Numero más Probable.
PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa.
PM: Pescados y Mariscos.
PRE: Alimentos Preparados.
SHU: Síndrome Urémico Hemolítico.
ST: Toxina Termoestable.
STX1: Toxina Shiga.
STX2: Toxina Shiga.
TSI: Triple Azúcar Hierro.
VT: Verotoxina.
WHO: Organización Mundial de la Salud
RESPYN: Revista Salud Pública y Nutrición
ÍNDICE DE CUADROS
Página
Cuadro 1
Características de las categorías de E. coli causantes de
25
diarrea.
Cuadro 2
Clasificación por grupo de alimentos.
Cuadro 3
Primers utilizados en la PCR para la amplificación del gen
40
16s RNAr para la identificación de E. coli.
Cuadro 4
Primers utilizados en la PCR múltiple para la amplificación
de los genes de las diferentes categorías de E. coli 43
diarreogénicas.
Cuadro 5
Detección y frecuencia de E. coli en los grupos de
51
alimentos analizados.
Cuadro 6
Distribución de las categorías de E. coli diarreogénicas por
55
grupo de Alimentos en los años 2007 al 2008.
Cuadro 7
Detección y frecuencia de las categorías de E. coli
diarreogénicas en los alimentos analizados por PCR 56
múltiple.
Cuadro 8
Distribución de las categorías de E. coli diarreogénicas por
58
alimentos.
Cuadro 9
Distribución de las categorías de E. coli diarreogénicas por
70
grupo de edad.
36
Página
Detección y frecuencia de las categorías de E. coli
Cuadro 10 diarreogénicas en las muestras clínicas (heces) por grupos 72
de edad.
ÍNDICE DE FÍGURAS
Página
Figura 1
Esquema de patogenicidad de E. coli causante de diarrea.
26
Figura 2
Esquema de identificación de E. coli mediante PCR.
34
Figura 3
Crecimiento de cepas control de E. coli sobre Agar
38
MacConkey.
Figura 4
Amplificación DNA de la región del gen 16s RNA (16E1,
41
16E2, 16E3) por PCR.
Figura 5
Amplificación de DNA por PCR múltiple de los genes de las
44
categorías de E. coli causantes de diarrea.
Figura 6
Amplificación de DNA por PCR de los genes del serotipo
45
STEC O157:H7.
Figura 7
Distribución geográfica de los puntos donde se realizó el
48
muestreo de Alimentos en el Estado de Sinaloa.
Figura 8
Grupos de Alimentos analizados.
50
Figura 9
Proporción de las categorías de E. coli diarreogénicas.
54
Figura 10
Distribución geográfica de las categorías de E. coli diarreogénicas identificadas por municipio en el Estado de Sinaloa.
61
Figura 11
Distribución por meses de E. coli y cepas diarreogénicas en
los años 2007 al 2008.
63
Figura 12
Distribución geográfica de los puntos donde se tomaron mue- 65
stras de personas que presentaban un cuadro clínico diarreico
en el Estado de Sinaloa.
Página
Figura 13
Grupos de edad de las muestras clínicas analizadas en este
67
estudio.
Figura 14
Proporción de las categorías de E. coli diarreogénicas.
Figura 15
Distribución geográfica de las categorías de E. coli
diarreogénicas identificadas por municipio en el Estado de 74
Sinaloa en el año 2008 al 2009. En muestras clínicas.
Figura 16
Distribución por meses de las cepas
diarreogénicas en los años 2008 al 2009.
de
E.
69
coli
76
RESUMEN
Hoy en día ha habido un considerable incremento de brotes ocasionados por E.
coli diarreogénicas estas categorías son clasificadas en base a sus factores de
virulencia (toxinas, plásmidos, fimbrias y factores de señalización) y pueden ser
únicamente identificados por estas características. Estas cepas están afectando a
miles de personas (morbilidad y mortalidad) en diferentes países, así como
también en México. Además, de que el origen principal de este incremento de
brotes es la contaminación de los alimentos por estos patógenos, convirtiéndolos
en los vehículos ideales de transmisión de infecciones a los humanos (mundo
globalizado, tránsito de personas y alimentos). Por lo que el objetivo de este
trabajo es determinar la presencia y distribución de los factores genéticos de las
categorías de E. coli causantes de diarrea y su prevalecía en diferentes alimentos
y muestras clínicas de heces de personas que presentaban un cuadro clínico
diarreico en el Estado de Sinaloa. El aislamiento de las posibles cepas de E. coli
tanto en muestras clínicas (heces) como en alimentos se llevó a cabo mediante el
método convencional Agar MacConkey medio selectivo. La identificación de E.
coli se realizó mediante PCR individual la región del gen 16s RNAr con los
primers u oligonucleotidos (16E1, 16E2, 16E3) y la Identificación de las E. coli
diarreogénicas se realizó mediante PCR múltiple: Los genes a amplificar de las
categorías de E. coli diarreogénicas fueron para EHEC (stx1, stx2, eae, primers
diseñados con el software oligo versión 7 para el presente estudio), EPEC (eae,
bfp, primers diseñados con el software oligo versión 7 para el presente estudio), y
se usaron primers diseñados por otros investigadores para las categorías de
ETEC (STII, Lt), EIEC (ipah, virF), ADEC (daaE), EAEC (aggr, aafII), el serotipo de
EHEC O157:H7 (rfbE O157, fliC H7) y la enterohemolisina ( hlya). Al analizar las
muestras de alimentos se observó que la frecuencia de identificación de E. coli
fue de un 8.0 % (n=412/5162). De estas 412 muestras contaminadas por E. coli,
el 13.2% (54/412) correspondieron a E. coli diarreogénicas o potenciales
productoras de diarreas y 87% (358/412) no presentaron genes de las categorías
buscadas. La categoría de E. coli diarreogénicas identificada más frecuentemente
fue EPEC en un 83% (45/54; 9 típicas and 36 atípicas) seguida por STEC (9%;
5/54), ETEC (4%; 2/54) y EAEC (4%; 2/54) .Ninguno de los aislados de E. coli
presentaron los genes de virulencia que corresponden a DAEC o EIEC. El
alimento que presento una mayor proporción de E. coli diarreogénicas fueron los
productos lácteos, cárnicos y la comida preparada, aunque no se observó una
tendencia de alguna categoría por algún grupo de alimento. Nosotros concluimos
que las cepas patógenas de E. coli diarreogénicas (EPEC, STEC, EAEC y ETEC)
están presentes en un (1.5%; 54/5162) in los alimentos que se consumen y
distribuyen en el norte de México.
Al analizar las muestras clínicas (heces), se encontró que la frecuencia de
identificación de E. coli diarreogénicas en personas que presentaban un cuadro
clínico diarreico fue del 26% (31/117), encontrándose que el 74% (86/117)
correspondieron a cepas de E. coli sin genes de virulencia que caracterizan a las
cepas no diarreogénicas (no hubo presencia de las categorías de E. coli). De las
31 cepas patógenas, el patógeno más frecuentemente aislado fue EPEC con un
42% (13/31), de las cuales 8 fueron típicas (con el gen eae y bfp) y 5 atípicas (solo
con el gen eae). En menor frecuencia se identificó EAEC en un 29% (9/31), ETEC
en un 26% (8/31) y DAEC en un 3% (1/31). Ninguno de los aislados de E. coli
presentaron los genes de virulencia que corresponden a EHEC, STEC ó EIEC. Por
grupo de edad, se determinó que EPEC (típica y atípica) (19.2%, 11/57) y EAEC
(12%, 7/57) fueron más prevalentes entre los grupos de edad de 0-2 años. ETEC
fue más prevalente en el grupo de edad de 11-20 (33%, 2/6) años, seguido 6-10
(30%, 3/10)
y 51-99 años (18%, 2/11).
La categoría de DAEC se identificó
únicamente en el grupo de edad de 3-5 años (5%, 1/18). Ninguna de las E. coli
diarreogénicas fueron identificadas en los grupos de edad de 21-30 y 31-50 años.
Los resultados muestran que hay una alta proporción de E. coli productoras de
diarrea o diarreogénicas en pacientes con diarrea aguda ó persistente, en donde
predomina E. coli enteropatógena EPEC (típica).
Estos resultados confirman la presencia de estas cepas patógenos de E. coli
diarreogénicas (EPEC, ETEC, EAEC y STEC) en alimentos que se consumen,
venden y distribuyen en Sinaloa con una frecuencia de 1.1% (54/5162), lo cual
correlaciona con la presencia de estos patógenos en humanos (EPEC, ETEC,
EAEC y DAEC), pero con una frecuencia mayor 26.4% que en alimentos. La
presencia de cepas diarreogénicas de E. coli en los grupos de alimentos, podrían
jugar un papel importante como agentes etiológicos causantes de diarrea
en
Sinaloa y son un indicador directo de la calidad higiénico-sanitaria de los alimentos
que circulan en el Estado de Sinaloa.
ABSTRACT
Contaminated food is the principal vehicle for transmission of pathogenic strains of
diarrheagenic Escherichia coli (DEC) to humans. This study reports the
epidemiological surveillance of Escherichia coli strains in 5162 food service
establishment and retail food samples, consisting of Ice and Water (n=1596),
restaurant-made food or street food (n=1594), dairy products (n=669), fish and
seafood (n=656), meat and meat products (n=647). Samples were collected in 10
municipalities of Sinaloa State located at the NorthWest of Mexico during JanuaryDecember in 2007 and 2008. Materials and Methods. E. coli strains were isolates
by conventional methods of food microbiology. To detect DEC strains, multiplex
PCR and single PCR reactions were performed that amplified genes of recognized
virulence
factors
of
enteroaggregative
(EAEC;
aggr
and
aafII
genes),
enteroinvasive (EIEC; Ipah and VirF), enteropathogenic (EPEC Typical; eae and
bfp or EPEC Atypical; eae), enterotoxigenic (ETEC; st y lt), diffusely adherent
(DAEC; daaE) or shiga toxin-producing (STEC; stx1/stx2 or EHEC; eae, stx1/stx2,
or hlya) E. coli strains. For this study were designed primers for the category of
EPEC (eae and bfp) and EHEC (stx1/stx2) with oligo software version 7. Results.
Bacteriological analysis detected that 8.0% (412/5162) of the food samples were
contaminated with E. coli strains, with non-permissive levels for human
consumption. Of those, 13.2% corresponded to DEC strains (54/412), as detected
by multiplex PCR. The diarrheagenic category most frequently isolated was EPEC
with 83% (45/54; 9 typical and 36 atypical) followed by STEC (9%; 5/54), ETEC
(4%; 2/54) and EAEC (4%; 2/54) also. None of our E. coli isolates harbored
virulence genes corresponding to DAEC and EIEC. The food items most
contaminated with DEC strains were dairy products, meat samples and prepared
foods, although we did not find a tendency for a specific diarrheagenic category.
Conclusion.
We conclude that potentially pathogens DEC strains (EPEC, STEC, EAEC and
ETEC pathotypes) are present (1.1%; 54/5162) in food products that are
consumed, sold or/and distributed at Northwest of Mexico.
Diarrheagenic Escherichia coli strains are being recognized as important
clinical enteropathogens worldwide. However, it is unclear whether there are
differences in age-related susceptibility to specific strains. This study aimed at
investigating DEC among patients (from 3 months to 99 year old) with
acute/persistent diarrhea at Northwest of Mexico during January- December in
2008 and 2009. Materials and Methods. DEC were isolated from stool samples
collected from 117 patients with acute/persistent diarrhea. Fecal samples were
cultured and identified according to the standard biochemical methods and three
oligonucleotide primers 16E1, 16E2 and 16E3 were used to identify specifically all
E. coli isolates by PCR. To detect DEC strains, multiplex PCR and single PCR
reactions were performed that amplified genes of recognized virulence factors of
enteroaggregative (EAEC; aggr and aafII genes), enteroinvasive (EIEC; Ipah and
VirF), enteropathogenic (EPEC Typical; eae and bfp or EPEC Atypical; eae),
enterotoxigenic (ETEC; st y lt), diffusely adherent (DAEC; daaE) or shiga toxinproducing (STEC; stx1/stx2 or EHEC; eae, stx1/stx2, or hlya) E. coli strains. For
this study were designed primers for the category of EPEC (eae and bfp) and
EHEC (stx1/stx2) with oligo software version 7. Results. Thirty-one patients
(26.4%) harbored DEC (from 117). The most frequently isolated pathogen was
Enteropathogen (EPEC) Escherichia coli with 42% (13/31; 8 typical and 5 atypical)
followed by EAEC with 29% (9/31), ETEC with 26% (8/31) and DAEC with 3%
(1/31). None of our E. coli isolates harbored virulence genes corresponding to
STEC and EIEC. By the age group; EPEC typical or atypical (19.2%, 11/57) and
EAEC (12%, 7/57) were more prevalent among the age group 0-2 years old. ETEC
was more prevalent among the age group 11-20 (33%, 2/6) years old, followed by
6-10 (30%, 3/10) and 51-99 (18%, 2/11) years old. DAEC only was identified
among the age group 3-5 years old (5%, 1/18). None of DEC isolates were
identified among the age group 21-30 and 31-50 years old. The results show a
high proportion of DEC among patients with acute/persistent diarrhea at Northwest
of Mexico, with typical EPEC predominating.
II. INTRODUCCIÓN
La diarrea es una alteración de las heces en cuanto a volumen, fluídez o
frecuencia en relación anormal a la fisiológica, lo cual conlleva una baja absorción
de líquidos y nutrientes, pudiendo estar acompañada de dolor, fiebre, náuseas,
vómito, debilidad o pérdida del apetito. De acuerdo con cifras de la Organización
Mundial de la Salud, la diarrea es una de las principales causas de muerte en todo
el mundo, íntimamente asociada a la deshidratación. Además de la gran pérdida
de agua que supone las evacuaciones diarréicas, los pacientes, por lo general
niños, pierden cantidades peligrosas de sales importantes, electrolitos y otros
nutrientes. La diarrea afecta a todas las razas, sexos, edades y regiones
geográficas del mundo (Mandell, et al., 1999, WHO, 2009). Las enfermedades
diarreicas han constituido un problema importante de salud pública en el mundo;
Cada año, se producen unos dos mil millones de casos de diarrea en todo el
mundo. Las enfermedades diarreicas son una causa principal de mortalidad y
morbilidad en la niñez en el mundo, y por lo general son consecuencia de la
exposición a alimentos o agua contaminados. En todo el mundo, alrededor de mil
millones de personas carecen de acceso a fuentes de agua mejoradas y unos
2500 millones no tienen acceso a instalaciones básicas de saneamiento. La
diarrea causada por infecciones es frecuente en países en desarrollo (WHO,
2009).
En México se ha reportado un incremento en la incidencia de diarreas (Informe de
Gobierno, 2002). En realidad, ese incremento en casos reportados solo refleja
parcialmente la magnitud del problema, ya que debemos considerar que la
mayoría de casos no se informan a las autoridades de salud. La alta incidencia de
infecciones gastrointestinales se relaciona con la superficie media del intestino que
en el humano alcanza los 340 m2 (Mandell, et al., 1999), lo que lo hace un blanco
importante para los patógenos. En México, en 2005, se produjeron 5.9 millones de
casos de enfermedades intestinales, el 13.8% del total de padecimientos
registrado al nivel nacional, ocupando el segundo lugar luego de las enfermedades
1
respiratorias (DGEPI, 2006). Mientras que en el Estado de Sinaloa, las
enfermedades diarreicas son responsables de más del 40% de la morbilidad por
causas infecciosas. En el 2006 se presentaron 280,204 de enfermedades
infecciosas intestinales (SSA), de las cuales un alto porcentaje (58% infecciones
intestinales) aunado a que se desconoce el agente causal (posiblemente un gran
numero son E. coli diarreogénicas). Debido a la escasa disponibilidad de pruebas
diagnósticas implementadas en el sector de salud. En Sinaloa, el panorama
epidemiológico de casos infecciosos está propiciado principalmente por el clima y
temperatura habituales en el Estado, donde los microorganismos pueden
desarrollarse fácilmente, además de la aparición de patógenos emergentes y reemergentes (SSA.SIN, 2008).
Dentro de estos patógenos causantes de enfermedades gástricas importantes,
también se encuentra E. coli, la cual puede ser responsable de diarreas y de
enfermedades que llegan a ser muy graves, como la colitishemorrágica y
síndrome urémico (Banatvala, et al., 2001, Rodríguez-Ángeles, 2002). Sin
embargo, existen varias maneras de interaccionar con el epitelio intestinal y de
causar de diarrea por E. coli. En diversos estudios han encontrado que las E. coli
que causan diarrea (cepas diarreogénicas) son las bacterias más frecuentemente
aislada de niños con diarrea (Levine, et al., 1993). Y que son tan prevalentes como
otros patógenos, como Salmonella (Nishikawa, et al., 2002). Además, se ha
sugerido recientemente (2005) que el 10% de todas las gastroenteritis agudas
producidas en niños en los Estados Unidos, son producidas por las E. coli
diarreogénicas (Cohen, et al., 2005). Posiblemente este porcentaje es mucho
mayor en países en vías de desarrollo como el nuestro.
E. coli fue descrita por primera vez en 1885 por Theodor Von Escherich,
bacteriólogo alemán, quién la denominó Bacterium coli. Posteriormente la
taxonomía le adjudicó el nombre de E. coli, en honor a su descubridor (Koneman,
et al., 1999, Prescott, 1999, Curret opinión in microbiology 1998). Es un bacilo
Gram negativo, anaerobio facultativo de la familia Enterobacteriaceae, tribu
2
Escherichia, cuyas principales características bioquímicas son producción de
indol, rojo de metilo, fermentación de lactosa, movilidad, nitrato a nitrito, ácido de
glucosa, gas de glucosa (Sánchez-Veja, 2003, Farmer, 1995), E. coli es una
bacteria mesófila, es decir se desarrollan a temperatura de 20 a 45 grados
Celsius. Con una temperatura optima del 37c° y se desarrollan a un pH de 6 -8
(Koneman 1999, Sánchez-Veja, 2003). Esta bacteria coloniza
el intestino del
hombre pocas horas después del nacimiento y se le considera un microorganismo
de la flora normal, permanece en el lumen intestinal sin causar daño, sin embargo
en hospederos debilitados o inmunosuprimidos, o cuando las barreras
gastrointestinales son violadas hay cepas que pueden ser patógenas y causar
daño produciendo diferentes cuadros clínicos, entre ellos diarrea (Boop et
al.,1999, Farmer, 1995).
Hay diversas clonas de E. coli que han adquirido atributos específicos de
virulencia, los cuales le confieren la habilidad de adaptarse a nuevos nichos,
permitiéndole causar un amplio espectro de enfermedades. Esta exitosa
persistencia de las combinaciones de factores génicos relacionados con
virulencia, han llevado a la clasificación de las E. coli en patotipos específicos o
categorías
que
son
capaces
de
causar
enfermedades
intestinales
y
extraintestinales (Kaper et al., 2004). Entre los tipos de bacterias más nocivas se
encuentra E. coli productora de la toxina Shiga, puede producir síndrome urémico
hemolítico, condición que puede llevar a una insuficiencia renal (Who, 2005). Se
sabe que los rumiantes (vacas, ovejas, venados) son los principales portadores de
E. coli O157-H7 y esparcida por medio de sus defecaciones. Tal es el caso
reportado el 12 de octubre del 2006 por la Administración de Drogas y Alimentos
(FDA) y el estado de California reportaron un brote de E. coli O157:H7 el cual se
detectó en una finca de espinacas, dicho brote era proveniente de la materia fecal
de ganado de dicha finca. Según los casos reportados por el Centro de Control de
Enfermedades (CDC), la espinaca contaminada por esta cepa ocasionó que 204
personas enfermaran, entre los cuales se incluyen 31 casos de un tipo de
insuficiencia
renal
denominado
Síndrome
Urémico
Hemolítico
(HUS),104
3
hospitalizaciones y 3 defunciones (FDA, 2006). Uno de los brotes más recientes
causado por E. coli O157:H7 fue reportado el 4 de enero del 2010 en 16 estados
de los Estados Unidos. Según los casos reportados por el Centro de Control de
Enfermedades (CDC), la carne de vacunos y aves contaminadas por esta cepa
ocasionó que 21 personas enfermaran, entre los cuales incluyen 1 caso de un tipo
de insuficiencia renal denominado Síndrome Urémico Hemolítico (HUS) y 9
hospitalizaciones (CDC, 2010). Y el brote más reciente reportado en el presente
año 2011 en el mes de mayo en Alemania y Suecia. Según los casos reportados
por el Centro de Control de Enfermedades (CDC), el posible origen del contagio
ha sido atribuido al germinado de soya, donde los últimos datos sobre la epidemia
revelan que 3235 personas han contraído la enfermedad, el 69% de ellas mujeres.
Más de 700 alemanes siguen internados en hospitales al haber desarrollado el
síndrome urémico hemolítico y hasta el momento se han reportado 37 muertes,
debido a un nuevo serotipo de EHEC O104:H4 (CDC, 2011).
Debido a este incremento en los brotes producidos por las categorías de E. coli.
En este proyecto nos enfocaremos a cepas de E. coli diarreogénica o
comúnmente como E. coli patogénicas, estas categorías son clasificados en base
a sus factores de virulencia (toxinas, plásmidos, fimbrias y factores de
señalización) y pueden ser únicamente identificados por estas características.
Dentro de las infecciones intestinales, las E. coli se han clasificado en seis
grupos: E. coli enterotoxigénica (ETEC), E. coli enteropatógena (EPEC), E. coli
enteroinvasiva (EIEC), E. coli enterohemorrágica también conocidas como
productoras de toxina vero o toxina semejante a shiga (EHEC o VTEC o STEC), E.
coli enteroagregativa (EAEC) y E. coli de adherencia difusa (DAEC) (Eslava et
al.1994, Nataro et al., 1998). Una vez que la colonización se establece, las
estrategias patogénicas de E. coli diarreogénica muestran una variedad
remarcable. Tres paradigmas generales han sido descritos por el cual E. coli
puede causar diarrea: i) producción de enterotoxinas (ETEC y EAEC), ii) invasión
(EIEC), y/o iii) adherencia con señalizadores de membrana (EPEC, EHEC y
4
DAEC). Sin embargo, la interacción del microorganismo con la mucosa intestinal
es específica para cada categoría (Eslava et al.,1994, Nataro et al., 1998).
5
A. ANTECEDENTES GENERALES
1.
ENFERMEDADES TRANSMITIDAS POR ALIMENTOS (ETA)
Las ETA son aquellas ocasionadas por el consumo de alimentos contaminados
con las cantidades suficientes de microorganismos patógenos o de productos de
su metabolismo que sean tóxicos para el ser humano; produciendo una serie
síntomas que afectan la salud del consumidor En forma individual o colectiva.
Hasta el 2005 se habían descrito más de 250 enfermedades transmitidas por
alimentos (Rosas GA, 2001, González-Flores, 2005). La mayoría ocasionada por
bacterias, presentes en los alimentos, en cantidades elevadas. Los alimentos que
se utilizaron en este trabajo se encuentran los alimentos preparados (bajo el
procesos de picado, molienda, cocción, etc.), productos lácteos, aguas, hielos,
pescados y mariscos (crudos), cárnicos (carnes crudas).
1.1.
Enfermedades causadas por alimentos contaminados a nivel mundial
Las enfermedades transmitidas por alimentos se han ido expandiendo poco a
poco por los países del mundo, tanto desarrollados como en vías de desarrollo.
Sin respetar fronteras, han causado cuantiosas pérdidas de vidas humanas, como
grandes pérdidas económicas (González-Flores, 2005, Díaz, C. 2003).
La falta de higiene y la carencia o el mal funcionamiento de los servicios
sanitarios, son algunas de las razones por las que la diarrea continúa
representando un importante problema de salud en países en desarrollo (FDA,
2002). En los países industrializados las enfermedades transmitidas por alimentos
contaminados microbiológicamente afectan a un 30 % de la población; En países
industrializados, como Estados Unidos, el porcentaje de casos de personas que
padecen alguna enfermedad asociada a los alimentos ha sido reportado en un
30% (OMS) por ejemplo: de 76 millones de casos 325 mil son hospitalizados y 5
mil defunciones (WHO, 2005). La incidencia global de las enfermedades
transmitidas por alimentos es difícil de estimarse. Pero se ha divulgado que solo
en el año 2000, 2.1 millones de fallecimientos por enfermedades diarreicas
(Vásquez-Arroy and Cabral-Martell, 2001).
6
Las enfermedades diarreicas son la segunda mayor causa de muerte de niños
menores de cinco años, y ocasionan la muerte de 1,5 millones de niños cada año.
La diarrea puede durar varios días y puede privar al organismo del agua y las
sales necesarias para la supervivencia. La mayoría de las personas que fallecen
por enfermedades diarreicas en realidad mueren por una grave deshidratación y
pérdida de líquidos. Los niños malnutridos o inmunodeprimidos son los que
presentan mayor riesgo de enfermedades diarreicas potencialmente mortales
(WHO, 2009). Cada año, se producen unos dos mil millones de casos de diarrea
en todo el mundo. Las enfermedades diarreicas son una causa principal de
mortalidad y morbilidad en la niñez en el mundo, y por lo general son
consecuencia de la exposición a alimentos o agua contaminados. En todo el
mundo, alrededor de mil millones de personas carecen de acceso a fuentes de
agua mejoradas y unos 2500 millones no tienen acceso a instalaciones básicas de
saneamiento. La diarrea causada por infecciones es frecuente en países en
desarrollo (WHO, 2009). En 2004, las enfermedades diarreicas fueron la tercera
mayor causa de muerte en países de ingresos bajos, donde ocasionaron el 6,9%
de los fallecimientos. Son la segunda mayor causa de muerte de niños menores
de cinco años, tras la neumonía. De los 1,5 millones de niños que fallecieron por
enfermedades diarreicas en 2004, el 80% tenían menos de dos años (WHO,
2009).
En países en desarrollo, los niños menores de tres años sufren, de promedio, tres
episodios de diarrea al año. Cada episodio priva al niño de nutrientes necesarios
para su crecimiento. En consecuencia, la diarrea es una importante causa de
malnutrición, y los niños malnutridos son más propensos a enfermar por
enfermedades diarreicas (WHO, 2009). Según Kumate e Isibasi, 1986; Kumate,
1998.En los países desarrollados las enfermedades diarreicas representan uno de
los problemas de salud pública más importantes, causando repercusiones en el
ámbito laboral, social y económico.
7
México es una de las naciones que registraban a nivel mundial las tasas de
mortalidad más elevadas por estos padecimientos, siendo muy elevados los
costos de vidas humanas tanto de recursos médicos destinados a su atención.
Olarte 1986, menciona que esto se relaciona a grandes pérdidas de tiempo
laborable, siendo una de las primeras causas de ausentismo laboral. En México, la
mayoría de los cuadros diarreicos son de naturaleza infecciosa, y como factores
de gran importancia son los de carácter sanitario, socioeconómico y laboral
(Vásquez-Arroyo and Cabral-Martell, 2001). En México, durante el periodo de
1980 a 1989, el Laboratorio Nacional de Salud Pública, confirmó 58 brotes de
toxiinfecciones alimentarias de origen microbiano y parasitario a nivel nacional
(Parrilla-Cerrillo, et al., 1993). En el año 2002, el Sistema Nacional de Información
en Salud reportó, 3612 casos de intoxicaciones alimentarias de origen bacteriano,
de los cuales 173 se presentaron en el estado de Sinaloa (Díaz, 2003). En el año
2005 en México, se produjeron 5.9 millones de casos de enfermedades
intestinales, el 13.8% del total de padecimientos registrado al nivel nacional,
ocupando el segundo lugar luego de las respiratorias (DGEPI, 2006).
Estas estadísticas deben ser tomadas con reservas, debido a que los datos
publicados por los sistemas de salud, sólo representan una parte del número
verdadero de casos, sin embargo, aunque los sistemas nacionales de información
en salud han mejorado substancialmente, aun no se puede precisar cuántas
personas contraen toxiinfecciones alimentarias en una región específica. Las
infecciones gastrointestinales ocasionadas por bacterias causan enfermedades
que atacan a la población en general afectando a las personas de todas las
edades y países, en México las infecciones gastrointestinales son unas de las
causas de morbilidad y mortalidad muy altas cada año. Las enfermedades
transmitidas por alimentos (ETA) son uno de los problemas de salud pública que
difícilmente se erradican en países en vías de desarrollo a diferencia de países
desarrollados que una enfermedad como esta es controlada de manera eficiente,
en todo caso se le considera emergente o bien reemergente.
8
2. COLIFORMES
Durante más de medio siglo se ha empleado el grupo coliformes como un
indicador del grado de contaminación y por lo tanto, de la calidad sanitaria.
Pertenecen al grupo coliformes los bacilos aerobios o anaerobios facultativos,
Gram-Negativo, no esporulados, que fermentan la lactosa con producción de gas
dentro de las 48 horas de incubación a 35 °C. Incluye los géneros Escherichia,
Enterobacter, Klebsiella, y especies lactosa positiva de otros géneros. La
determinación de coliformes fecales representa la fracción de coliformes presentes
en intestinos y materias fecales del hombre o animales de sangre caliente
(coliformes termotolerantes) (FDA, 2002). La presencia de E. coli en un alimento
indica que ha tenido lugar una contaminación de origen fecal. Por lo general, la
determinación de coliformes se refiere a los microorganismos que crecen y
producen gas a partir de lactosa en un medio que contiene sales biliares u otros
agentes selectivos, equivalentes y que se incuban a 44-45.5 °C (Urbaneja, 2004).
Básicamente se cuenta con dos tipos de microorganismos indicadores: los
coliformes fecales y los mesofílicos aerobios (Vázquez-Arroyo et al., 2001). La
presencia de éstos dependerá del tipo de alimento y los criterios cambiarán para el
caso de alimentos procesados o fermentados que implican la participación de
ellos.
Estos indicadores cuentan con características que los hacen especiales y son:





Presencia constante en la materia fecal.
Exclusividad y abundancia en la materia fecal.
Incapacidad para multiplicarse en el agua.
Sobrevivencia semejante a las de las bacterias patógenas.
Facilidad para demostrar en el laboratorio.
Los microorganismos patógenos que proliferan en ambientes acuáticos pueden
provocar cólera, fiebre tifoidea, disenterías, poliomielitis, hepatitis, salmonelosis,
etc. (FDA, 2002). La Organización Mundial de la Salud (OMS), estimó que la
morbilidad y mortalidad derivadas de las enfermedades más graves asociadas
9
con el agua se reduciría entre un 20 y 80%, si se garantizara su potabilidad y
adecuada canalización (FDA, 2002). El agua y los alimentos contaminados se
consideran como los principales
vehículos involucrados en la transmisión de
bacterias, virus o parásitos. Estos organismos habitualmente crecen en el tracto
intestinal y abandonan el cuerpo por las heces. Un organismo puede ocupar un
nuevo hospedador cuando se ingiere agua que fue contaminada y no tratada
adecuadamente. El agua es utilizada como medio de eliminación de excretas y
otros desechos; puede también contener microorganismos patógenos de asiento
no intestinales (por ejemplo: flora de la piel). Tales gérmenes son destruidos por
los mismos mecanismos y medios que suelen utilizarse cuando se tratan las
aguas por el proceso ordinario de potabilización.
La bacteria más frecuente asociada con los cuadros diarreicos es E. coli, y afecta
a todas las edades y estrato social siendo los más susceptibles niños pequeños,
alimentados en forma deficiente o niños desnutridos, los que viven bajo
inadecuadas condiciones de higiene y con falta de control de excretas, presencia
de aguas contaminadas, niños con problemas inmunológicos o la llamada diarrea
del viajero (WHO, 2005).
a. Escherichia coli
Hasta hace poco la tribu Escherichiaea contenía solo una especie: Escherichia
coli. En los últimos años se efectuaron dos modificaciones en dicha tribu. Primero
se descubrieron nuevas especies de Escherichia. (Pero como estas casi nunca
son patógenas para los seres humanos, no se describirán).
E. coli fue descrita por primera vez en 1885 por Theodor von Escherich,
bacteriólogo alemán, quién la denominó Bacterium coli. Posteriormente la
taxonomía le adjudicó el nombre de E. coli, en honor a su descubridor (Koneman
et al., 1999, Prescott, 1999, Curret opinión in microbiology, 1998). E. coli es una
especie que pertenece a la familia de las Enterobactereaceae y cuyo hábitat
natural es el suelo, el agua, la materia en descomposición y en el tubo intestinal
10
del hombre (principalmente intestino grueso) y los animales; por lo que han
recibido el nombre de “bacilos género”, a esta familia pertenecen algunos de los
microorganismos responsables y causantes de enfermedad gastrointestinal
(Sánchez-Veja, 2003). Se estima que cada gramo de heces humanas contiene
hasta 108 microorganismos de E. coli. Esta bacteria crece muy bien en medios de
gran simplicidad; tiene movilidad y flagelos perítricos; fermenta la lactosa y forma
un brillo verdoso sobre el agar de eosina y azul de metileno y color rosa-rojo en
agar MacConkey. Tiene actividad de descarboxilasa de lisina; utiliza el acetato
como única fuente de carbono e hidroliza el triptófano para formar indol (Stuart
2000, Rodríguez-Ángeles, 2002).
Esta bacteria forma parte de la flora normal intestinal, es decir, es un agente
oportunista que por lo regular no causa enfermedad en el hombre (saprobio), a
menos de que el huésped se encuentre en condiciones apropiadas para el
establecimiento de la infección (individuos inmunosuprimidos, en particular en la
infancia o en la vejez); además produce ciertas sustancias que resultan benéficas
o útiles para el individuo, como son las bacteriocinas o colicinas que son unas
sustancias bactericidas de tipo viral las cuales mantienen un efecto inhibitorio
sobre el desarrollo de otra especies potencialmente patógenas, relacionadas con
la presencia de un plásmido. Sin embargo, E. coli y otros bacilos entéricos son
los responsables de la mayor parte de la infecciones nosocomiales; produciendo
infecciones localizadas principalmente en vías urinarias aunque también pueden ir
al torrente sanguíneo y causar septicemia (Sánchez-Veja, 2003).
1). Morfología de E. coli
 Son bacilos Gram negativos, pequeños que no pasan de 2 a 3 micras.
 Pueden tener o no movilidad, cuando son móviles, su locomoción la
realizan por medio de flagelos perítricos.
 Pueden poseer una cápsula bien definida o una cubierta laxa.
11
 Tienen fimbrias o pilis, que son responsables de la fijación a otras bacterias.
 La pared celular se compone de mureína, lipoproteína, fosfolípido,
proteínas y lipopolisacáridos (LPS); la porción de la lipoproteína- mureína,
es
la
responsable
de
la
rigidez
celular
y
constituye
el
20%
aproximadamente de la pared celular, el 80% restante se une a los lípidos
de la lipoproteína, para formar la bicapa lipídica.
 Las cadenas laterales polisacáridas específicas del LPS es la porción
responsables de los determinantes antigénicos, que es lo que origina la
diversidad de especies (Koneman, 1999).
2). Metabolismo E. coli
 Son aerobias o anaerobias facultativas, cuando se encuentran en
anaerobiosis fermentan a los carbohidratos.
 Son fermentadoras de glucosa y lactosa.
 Reducen los nitratos a nitritos (Koneman, 1999, Sánchez-Veja, 2003).
3). Otras pruebas que resultan positivas son:
a) La hidrólisis del triptófano a indol (identificada por el reactivo de Kovac, con
la aparición de un anillo rojo en la superficie del medio).
b)
Descarboxilación de la lisina, con la fermentación inicial de glucosa, por lo
que el
medio se torna amarillo y por la descarboxilación se torna de color
púrpura.
c) Cuando se aísla de la orina, se identifica con eficacia en agar sangre por la
producción de hemólis beta.
 Son mesófilas, es decir se desarrollan a temperatura de 20 a 45 grados
Celsius. Con una temperatura optima del 37c°.
 Se desarrollan a pH de 6 -8 (Koneman, 1999, Sánchez-Veja, 2003).
12
4). Estructura antigénica de E. coli
Para determinar el grupo patógeno al que pertenecen en 1944 kauffman desarrolló
un esquema de serotipificación que continuamente varía y que actualmente tiene
176 antígenos somáticos (O), 112 flagelares (H) y 60 capsulares (K). El antígeno
“O” es el responsable del serogrupo; la determinación del antígeno somático y
flagelar (O:H) indica el serotipo, el cual en ocasiones se asocia con cuadros
clínicos en particular (Eslava et al., 1994, Karmali y Beutin, 1998).
E. coli productoras de diarrea se han reportado en los últimos 15 años y la
incidencia de la enfermedad que producen ha aumentado en muchos continentes
(Nataro and Kaper, 1998). Las investigaciones de los brotes de E. coli
diarreogénicas indican que su aparición está relacionada en gran parte con el
consumo de alimentos contaminados o mal preparados (Albert et al.1999,
Watanabe et al. 1996, Welinder-Olsson, 2004 and Reid et al., 2000). Por otro lado,
en diversos estudios han encontrado que las E. coli que causan diarrea (cepas
diarreogénicas) son las bacterias más frecuentemente aislada de personas con
diarrea (Kaper and Nataro, 2004) y que son tan prevalentes como otros
patógenos, como Salmonella (Itoh et al., 1998). Además, se ha sugerido
recientemente (2005) que el 10% de todas las gastroenteritis agudas producidas
en niños en los Estados Unidos, son producidas por las E. coli diarreogénicas
(Itoh et al., 1998). Posiblemente este porcentaje es mucho mayor en países en
vías de desarrollo como el nuestro, y posiblemente afecta a una gran proporción
de personas adultas.
13
B. ANTECEDENTES DIRECTOS
1. CATEGORÍAS DE E. COLI.
a. E. coli enterotoxigénica (ETEC)
ETEC coloniza la mucosa del intestino delgado por medio de pilis o fimbrias que
tienen
diversas
formas
denominadas
CFA
(colonization
factor
antigens)
,siendo su principal mecanismo de patogenicidad la síntesis de alguna o ambas
enterotoxinas llamadas toxina termolábil (LT) la cual es codificada por el gen eltB y
toxina termoestable (ST) la cual es codificada por el gen estA. Sus genes están en
un plásmido que también puede tener información genética para los CFA’s,
aunque algunos genes de ST se han encontrado en transposones (Nataro y
Karper 1998, Fasano et al., 2000). Las toxinas LT y ST aumentan el nivel
intracelular de cAMP y cGMP respectivamente, que se encuentran en la
membrana de las células intestinales, provocando la salida de iones y agua
(Sears, 1996).
ETEC es importante en lactantes, principalmente en niños menores de dos años, y
en particular durante los primeros seis meses de vida. La frecuencia de
aislamiento de este grupo patógeno de E. coli en niños con diarrea es de 10 a
30%. En los niños en edad escolar y en adultos puede ser asintomática y poco
frecuente o producir la diarrea del viajero. La enfermedad tiene un periodo de
incubación de 14 a 50 h. El cuadro clínico se caracteriza por diarrea aguda,
generalmente sin sangre, sin moco, sin pus y en pocos casos se presentan fiebre
y vómito. La diarrea producida por ETEC puede ser leve, breve y autolimitada pero
también
puede ser grave (Nataro and Karper 1998, Fasano et al., 2000). La
contaminación fecal de agua y alimentos es la principal fuente de infección, siendo
la dosis infectiva de 108 UFC (unidades formadoras de colonias). La
contaminación fecal del agua y de la comida es la principal razón de la alta
incidencia de infección por ETEC en países en desarrollo. ETEC coloniza la
superficie mucosa del intestino delgado y elabora enterotoxinas, las cuales
14
producen la secreción intestinal. La colonización es mediada por una o más
factores de colonización fimbriales o fimbrias proteicas, las cuales son designadas
como CFA (factor antigénico de colonización) (Wood et al., 1983).
b. E. coli enterohemorrágica (EHEC)
La E. coli enterohemorrágica (EHEC) aparece en la década de los 80´s en casos
esporádicos y en brotes epidémicos fundamentalmente en países desarrollados.
El serotipo más observado en EE.UU, Europa y Japón ha sido O157:H7.
Riley describió
y relacionó a EHEC con brotes caracterizados por dolor
abdominal, diarrea acuosa con sangre y poco o nada de fiebre, cuadro al que se le
llamó colitis hemorrágica (CH) y que era debido a la ingestión de carne cruda o
mal cocida (Riley et al., 1983). La bacteria aislada de todos los casos fue E. coli
del serotipo O157:H7. Karmali en 1983 (Karmali et al., 1983), en donde afecto a 47
personas las cuales consumieron hamburguesas poco cocidas en Estados Unidos.
La asoció con casos aislados de síndrome urémico hemolítico (SUH)
caracterizado por daño renal
agudo, trombocitopenia y anemia hemolítica
microangiopática, precedida por diarrea con sangre, con la presencia de heces
con E. coli productora de una citotoxina con actividad sobre células Vero, por lo
que se le llama verotoxina (VT), y a las cepas capaces de producirla se les
denominó E. coli verotoxigénicas (VTEC) (Konowalchuk et al., 1977). Además, se
observó que la citotoxina se neutralizó con antitoxina obtenida a partir de Shigella
dysenteriae tipo 1, por lo que también se le llamó “shiga-like toxin” a las E. coli
capaces de producirla se les da el nombre de STEC (Nataro and Kaper, 1998).
La determinación de la capacidad toxigénica de las cepas es necesaria para que
el paciente desarrolle colitis hemorrágica y diarrea con sangre, ya que la citotoxina
STX es el principal mecanismo de patogenicidad de EHEC y su síntesis está
relacionada con la presencia de material genético de un bacteriófago STX, que
está insertado en el genoma. La STX actúa a nivel de síntesis de proteínas ya que
se une a la subunidad 60S de los ribosomas de las células intestinales o renales
del hospedero. En las cepas EHEC aisladas, se han encontrado las variantes
15
STX1 y STX2 que son inmunológicamente diferentes, de tal manera que se
pueden aislar bacterias que sinteticen alguna de las toxinas o ambas.(Karmali
1998, Nataro y Kaper, 1998).
Además de la toxina, las EHEC tienen otros
mecanismos de patogenicidad como el fenómeno de adherencia y esfacelación
(A/E), y presentan el gene cromosomal eae que codifica para la proteína de
membrana externa (OMP) de 94 kilodaltones (kDa), llamada intimina, cuya
expresión es regulada por genes plasmídicos; el gene eae también se encuentra
en cepas EPEC. Otro factor de patogenicidad es el plásmido pO157, de 60
megadaltones (MDa), que codifica para la enterohemolisina (Donnenberg et
al.,1993).
Actualmente, hay al menos dos clasificaciones del grupo EHEC. Una es en función
de la presencia de sus factores de patogenicidad: a) cepas típicas cuando tienen
el fago, el plásmido de 60 MDa y presentan el fenómeno de A/E, y b) cepas
atípicas, cuando no producen lesiones de A/E (adherencia y esfacelamiento) y
pueden presentar o no el plásmido de 60 MDa.
La otra clasificación es en función del serotipo: a) cepas E. coli O157:H7. Este
serotipo no fermenta el D-sorbitol ni la ramnosa y no produce B-glocuronidasa;
esta bacteria puede producir principalmente SUH y CH. E. coli O157:H7 se puede
encontrar en bovinos, cabras, borregos y con menos frecuencia en cerdos y
pollos; su principal reservorio es el intestino de ganado bovino (Karmali, 1998).
También se ha logrado recuperar de frutas y vegetales como lechuga, rábanos
(Bernard et al., 1996). Además de productos industrializados como mayonesa y
jugos de naranja y manzana no pasteurizados, aun cuando estos alimentos tengan
pH de 3.4, condición en la que puede sobrevivir varios días. La transmisión de E.
coli O157:H7 puede darse por la ingesta de carne cruda o mal cocida, leche
bronca, agua contaminada; también puede ser de persona a persona o debida a
los manipuladores de alimentos (Rodríguez-Ángeles, 2002). Hay estudios que
sugieren la importancia de la mosca doméstica como vector en la transmisión de
E. coli O157:H7 (Rodríguez-Ángeles, 2002). Y b) cepas no-O157:H7 cuya
16
frecuencia de aislamientos es cuatro veces mayor que las O157:H7. Estas cepas
pueden ser sorbitol positivo y sus serotipos son diferentes del O157:H7.
Actualmente hay más de 200 serotipos. El cuadro clínico causado por las cepas
que son no-O157 se caracteriza por diarrea acuosa con dolor abdominal y colitis
hemorrágica. Las cepas no-O157 son capaces de causar brotes o casos aislados
de diarrea y en ocasiones no se logra establecer la fuente de contaminación,
aunque se sabe que se pueden aislar de los mismos alimentos que las cepas de
serotipo O157:H7 y también de carne de guajolote, ternera, pescado y mariscos
(Rodríguez-Ángeles, 2002).
El principal mecanismo de patogenicidad de las cepas EHEC no-O157:H7 es la
toxina STX; también produce el fenómeno de A/E y la presencia de pO157. El
periodo de incubación de EHEC es de 1 a 8 días; inicialmente produce diarrea sin
sangre, con o sin vómito, dolor abdominal, fiebre y después de 1 a 2 días la
diarrea se torna sanguinolenta y se intensifica el dolor abdominal, de una duración
de 4 a 10 días, con heces abundantemente sanguinolentas. Se cura o bien llega
hasta SUH (Fasano et al., 2000).
En 1996, hubo un brote de E. coli O157:H7 en Japón, que afecto a más de 6,300
niños y produjo 2 muertes. Éste es el brote más grande registrado para este
patógeno (WHO, 1996). Los casos más resientes son uno reportado el 12 de
octubre del 2006 por la Administración de Drogas y Alimentos (FDA) y el Estado
de California reportaron un brote de E. coli O157:H7 el cual se detectó en una
finca de espinacas, dicho brote era proveniente de la materia fecal de ganado de
dicha finca. Según los casos reportados por el Centro de Control de
Enfermedades (CDC), la espinaca contaminada por esta cepa ocasionó que 204
personas enfermaran, entre los cuales se incluyen 31 casos de un tipo de
insuficiencia renal denominado Síndrome Urémico Hemolítico (HUS), 104
hospitalizaciones y 3 defunciones (FDA, 2006). Las cepas de EHEC del serotipo
O157:H7, es el más importante patógeno de EHEC en Estados Unidos, el Reino
Unido y Japón. En Estado Unidos se presentan al año, 73,000 casos diarreicos y
17
40 muertes causados por EHEC O157:H7. Uno de los brotes más recientes
causado por E. coli O157:H7 fue reportado el 4 de enero del 2010 en 16 estados
de los Estados Unidos. Según los casos reportados por el Centro de Control de
Enfermedades (CDC), la carne de vacunos y aves contaminadas por esta cepa
ocasionó que 21 personas enfermaran, entre los cuales incluyen 1 caso de un tipo
de insuficiencia renal denominado Síndrome Urémico Hemolítico (HUS) y 9
hospitalizaciones (CDC, 2010). Y el brote más reciente reportado en el presente
año 2011 en el mes de mayo en Alemania y Suecia. Según los casos reportados
por el Centro de Control de Enfermedades (CDC), el posible origen del contagio
ha sido atribuido al germinado de soya, donde los últimos datos sobre la epidemia
revelan que 3235 personas han contraído la enfermedad, el 69% de ellas mujeres.
Más de 700 alemanes siguen internados en hospitales al haber desarrollado el
síndrome urémico hemolítico y hasta el momento se han reportado 37 muertes,
debido a un nuevo serotipo de EHEC O104:H4 (CDC, 2011).
En la identificación de EHEC es importante el trabajo en conjunto del laboratorio y
los epidemiólogos para la vigilancia y detección oportuna de E. coli O157:H7 para
prevenir posibles brotes en México, principalmente en zonas turísticas y
fronterizas (Rodríguez-Ángeles 2002, Fasano et al., 2000). Aunado a esto hay
otros serotipos, particularmente los serogrupos O26 y O111, pueden además
causar enfermedad y son más preponderantes que la O157:H7 en varios países.
Por otro lado, la infección por EHEC es facilitada por la dosis de infección, que es
extremadamente baja para producir la enfermedad (se estima que son menos de
100 células de EHEC) (Karmali and Beutin, 1998).
c. E. coli enteroinvasiva (EIEC)
El grupo EIEC y Shigella spp están relacionados genética y bioquímicamente,
son descarboxilasa negativas, no móviles y lactosa negativas. El mecanismo de
patogenicidad de ETEC es la invasión del epitelio del colon; para ello el primer
paso es la adherencia de la bacteria a las vellosidades de la mucosa requiriendo
18
de mucinasa y adhesinas, para después entrar por endocitosis a la célula, y
posterior multiplicación de la EIEC dentro de la célula y diseminación a células
sanas adyacentes (Nataro and Kaper 1998, Rodríguez-Ángeles, 2002). La
información genética para este mecanismo está en el loci del cromosoma y del
plásmido, además de tener la capacidad de elaborar una o más enterotoxinas que
pudieran ser importantes en la producción de diarrea. Los genes necesarios para
la invasión se encuentran en el plásmido de invasividad de 140 MDa llamado pInv,
que codifica para las proteínas, como por ejemplo las Ipah y Vir-F. Entre otras que
están involucradas en el proceso de patogénesis (Eslava et al., 1994).
Los síntomas característicos en personas infectadas por EIEC son diarrea acuosa,
con sangre y moco, pero algunos casos sólo presentan diarrea. Las cepas EIEC
se asocian más con brotes que con casos aislados, en los cuales la transmisión
puede ser de persona a persona, por ingestión de alimentos y agua contaminada,
convirtiéndose en un patógeno importante principalmente en niños mayores de
seis meses (Eslava et al., 1994). El diagnóstico de EIEC se hace por prueba in
vivo como la de Sereny, que es la inoculación de un cultivo puro de la bacteria en
un ojo de un cobayo en el cual después de 24 a 96 h se produce una ulceración
en el ojo, pero también hay métodos inmunológicos y moleculares como se indica
en el diagnóstico (Rodríguez-Ángeles, 2002).
En dos brotes producidos por EIEC, se observó que del 0 al 7% de las personas
infectadas
presentaban
sangrado
(Snyder
et
al.,
1984).
En
estudios
epidemiológicos se identificó a EIEC como uno de los agentes etiológicos
productores de diarrea en niños en países en vías de desarrollo como en Brasil
(Regua-Mangia et al., 2004), Tailandia (Ratchtrachenchai et al., 2004), Jordania
(Youssef et al., 2000), Nigeria (Agbonlahor et al., 1982) y en México (Larrosa-Haro
et al., 2002). En diversos casos esporádicos, gran parte de las infecciones debido
a cepas de EIEC son probablemente mal identificadas como Shigella spp. o E.
coli no patogénicas.
19
d. E. coli enteropatógena (EPEC)
EPEC fue la primera categoría que se identificó serológicamente y se asoció con
casos de diarrea en infantes, siendo la adherencia su principal factor de
patogenecidad. El proceso de adherencia íntima entre la bacteria y la membrana
de las células del epitelio intestinal, seguida de la destrucción de la
microvellosidad, con polimerización de actina, que lleva
a la alteración del
citoesqueleto en el sitio de la unión de la bacteria, debido al aumento de los
niveles de calcio intracelular y de proteína cinasa C, lo cual ha sido denominado
adherencia y esfacelamiento (A/E) (Eslava et al., 1994). La adherencia está
medida por pilis o fimbrias rizadas que se llaman Bfp (bundle-forming pilus), cuya
información genética está codificada en un plásmido de 50-70 MDa denominado
EAF (EPEC adherence factor) y de algunos genes cromosomales (RodríguezÁngeles, 2002).
En ensayos in vitro las cepas EPEC se caracterizan por formar microcolonias en el
citoplasma de las células HEp-2 y su estudio incluye factores de patogenecidad
como el efecto A/E, presencia de plásmidos y fimbrias. Las cepas EPEC se
consideran típicas cuando tienen los genes eae para la intimina, que participa en
A/E, y el plásmido EAF que codifica para el Bfp; se dice que son atípicas cuando
sólo presentan los genes eae pero no el plásmido EAF (Nataro and Kaper, 1998,
Rodríguez-Ángeles, 2002).
EPEC puede ocasionar brotes o casos aislados de diarrea. Este grupo afecta
principalmente a niños menores de seis meses y a los de dos años. También
puede aislarse en adultos enfermos y sanos, principalmente cuando hay un factor
predisponente como diabetes. La forma de transmisión de la enfermedad es fecaloral por manos contaminadas de manipuladores de alimentos. Los reservorios de
EPEC pueden ser niños y adultos con o sin síntomas (Rodríguez-Ángeles, 2002).
El cuadro clínico que produce EPEC se manifiesta con diarrea aguda, la cual
puede ser leve o grave, con vómito, fiebre baja y mala absorción. El diagnóstico de
20
EPEC incluye ensayos in Vitro en cultivos celulares y métodos moleculares como
se observa en el cuadro1, de diagnóstico (Rodríguez-Ángeles, 2002).
En un estudio realizado en Bangladesh, de 814 pacientes (menores de 5 años)
que presentaron enfermedad gastrointestinal, se encontró a EPEC como uno de
los agentes etiológicos más importantes, aún por encima de patógenos clásicos
como Shigella spp. Aeromonas spp. y Vibrio cholerae (Albert et al., 1999).
También, se ha determinado que EPEC es el patógeno más frecuente identificado
en casos de pacientes con gastroenteritis en Australia (Robins-Browne et al.,
2004) y en Japón (Nishikawa et al., 2002). En Latinoamérica (incluyendo a México)
(Vidal et al., 2007), se logró reconocer a EPEC como el principal patógeno
involucrado con diarrea infantil, los resultados además revelaron que la bacteria
tiene mayor prevalencia que Campylobacter spp y Rotavirus (Vidal et al., 2007),
por lo que EPEC permanece como una causa importante de diarrea infantil
potencialmente fatal en países en desarrollo (Rodríguez-Ángeles, 2002). Puesto
que los rangos de mortalidad van desde el 20 al 50%, hace a la infección por
EPEC una entidad clínica de inmediata respuesta (Kuhnert et al., 2000).
e. E. coli enteroagregativa (EAEC)
Scaletsky y Nataro encontraron cepas aisladas de
pacientes con diarrea, las
cuales por serología no correspondían el grupo EPEC pero si presentaban un
patrón característico de adherencia diferente a EPEC y que además eran
negativas a la prueba de EAF. En estudios posteriores se encontró el fenotipo de
adherencia agregativa, caracterizada por autoaglutinación de las bacterias entre sí
y por ser inespecífica, porque las bacterias se adhieren a la superficie de las
células HEp-2 y a la superficie del cubreobjetos libre de células HEp-2 (Eslava et
al., 1994, Rodríguez-Ángeles, 2002).
La adherencia a células HEp-2 y la hemaglutinación de eritrocitos humanos se
debe a la presencia de la fimbria de adherencia agregativa (AAF/I), codificada por
el gene aggA que se encuentra en un plásmido de 60 MDa. También se ha
21
descrito la fimbria AAF/II inmunológicamente diferente a AAF/I y que está
codificada por el gene aafA; sin embargo, no todas las EAEC presentan estas
fimbrias (Rodríguez-Ángeles, 2002).
En el mecanismo de patogenicidad de EAEC están implicados la bacteria y los
productos que ella produce; también se sabe que las cepas EAEC tienen la
capacidad de incrementar en la mucosa la producción y secreción de moco que
atrapa a las bacterias que se autoaglutinan en una fina película en el epitelio
intestinal. La producción de moco puede estar relacionada con la capacidad de
EAEC para colonizar persistentemente el intestino y causar diarrea. En el
plásmido de 60 MDa de EAEC también se encuentran los genes que codifican
para la toxina EAST1 (Rodríguez-Ángeles, 2002).
Eslava y colaboradores identificaron dos proteínas de alto peso molecular de
cepas EAEC, aisladas de niños que murieron de diarrea persistente. Estas
proteínas fueron probadas en ratas observándose en ellas vellosidades cortas,
hemorragia y necrosis. El gene para una de estas proteínas se encontró en un
plásmido de 65 MDa y a la proteína se le dio el nombre de Pet (plasmid-encoged
toxin) la cual tiene la capacidad de producir efecto citopático en células HEp-2,
caracterizado por arredondamiento y desprendimiento de las células así como
contracción del citoesqueleto y pérdida de fibras de actina. En EAEC se ha
descrito también la proteína Pic que está codificada en el genoma y que tiene
actividad de proteasa (Rodríguez-Ángeles, 2002).
El sitio blanco de daño de EAEC puede ser la mucosa del intestino grueso y
delgado, con un periodo de incubación de menos de ocho horas y puede durar
hasta 18 a 20 días. Esta bacteria puede causar brotes o casos aislados de diarrea
persistente. En niños puede manifestarse con diarrea líquida, de color verde, con
moco, sin sangre, y que en ocasiones puede llegar a ser severa y requerir
rehidratación intravenosa. Algunas veces, el cuadro clínico se presenta como
diarrea con moco, con o sin sangre, vómito y sin o con poca fiebre (Sainz et al.,
22
2001, Itoh et al., 1998). La prueba de referencia para el diagnóstico de EAEC es la
observación de la adherencia agregativa en células HEp-2 de cultivos bacterianos,
previamente inoculados en medio Luria e incubados en condiciones estacionarias
y a 37°C.
EAEC Produce diarrea principalmente en niños de países en vías de desarrollo
como México (Cravioto., 1988), Brasil, India, Mongolia, Gabón y en países
desarrollados como Japón, Inglaterra y Alemania (Nishikawa et al., 2002). El brote
más grande registrado se presentó en Japón en donde implicó a 16 diferentes
escuelas, con un total de 2,697 niños que se enfermaron con diarrea después de
consumir en la escuela alimentos contaminados con EAEC (Eslava et al., 1994).
En particular en México, estas bacterias han causado dos brotes infecciosos, que
incluyeron la muerte de niños en el Hospital Infantil de México (Eslava et al.,
1994). Posiblemente aquí en México esta bacteria infecta y produce diarrea en
niños. Por lo que esta categoría en particular es de gran importancia en nuestro
proyecto, ya que se ha determinado que se presenta con una alta incidencia en
varios países. Pero sin pruebas firmes de esta hipótesis no podemos asegurarnos
de esta prevalencia.
f. E. coli de adherencia difusa (DAEC)
Las cepas de E. coli de adherencia difusa, no forman microcolonias cuando se
adhieren a células HEp-2. Se sabe poco de su mecanismo de patogenicidad pero
se ha caracterizado una fimbria de superficie, conocida como FI845, involucrada
en el fenómeno de adherencia difusa (Rodríguez-Ángeles 2002, Itoh et al., 1998).
Los genes que codifican para esta fimbria se pueden encontrar en el cromosoma o
en un plásmido. El fenómeno de adherencia difusa también se ha asociado con
una proteína de membrana externa de 100 kDa, en una cepa del serotipo
0126:H27, cuyos genes se han secuenciado pero sólo se han encontrado en una
minoría de las cepas aisladas (Rodríguez-Ángeles 2002, Itoh et al., 1998). Al
realizar ensayos in vitro en células CaCo y HEp-2, las cepas DAEC tienen la
capacidad de inducir la formación de estructuras protuberantes, semejantes a
23
dedos, las cuales confieren protección a las bacterias, pero la presencia de dichas
estructuras no se ha demostrado in vivo. El grupo DAEC se puede aislar tanto de
personas sanas como en personas con diarrea, siendo más importante en niños
de 4 a 5 años. Los principales síntomas que se presentan son diarrea acuosa sin
sangre y sin leucocitos. En el cuadro de E. coli se indican los métodos de
diagnóstico. La hibridación con sondas derivadas de un fragmento del gen daaC,
que codifica para la fimbria F-1845, también se ha empleado para el diagnóstico
pero puede presentar falsos positivos, y el diagnóstico empleado PCR aún se ha
desarrollado para la identificación de la fimbria F-1845 (Rodríguez-Ángeles 2002,
Itoh et al., 1998).
Existen muy pocos estudios clínicos que permitan adecuar una descripción del
síndrome clínico asociado con la infección por DAEC. En un estudio en Francia,
observaron que la mayoría de los pacientes infectados con DAEC tuvieron diarrea
acuosa sin sangre o leucocitos fecales (Poitrineau et al., 1995). En diversos
estudios se ha implicado a cepas de DAEC como agentes causantes de diarrea,
Esto sugiere que E. coli adherente difusa, quizás sea un patógeno importante
causante de diarrea en niños, sin embargo, la prevalencia de DAEC no se conoce.
Como resumen el (Cuadro1), muestra las características más comunes de las
categorías de E. coli como síntomas, epidemiología y factores de virulencia
participantes de cada categoría. Mientras que en la (Figura 1) se muestra un
esquema de patogenicidad de las seis categorías de E. coli causantes de diarrea
(Rodríguez-Ángeles, 2002).
24
Cuadro 1. Características de las categorías de E. coli causantes de diarrea.
Categorías
Síntomas Clínicos
Edad de Incidencia
Factores de Virulencia
ETEC
Diarrea aguda acuosa
Niños menores de 2 años y
diarrea del viajero adultos
ST y LT (Toxina Termoestable y
Termolábil).
EHEC
SUH, CH, diarrea con
sangre ó sin sangre
Niños y Adultos
EIEC
Diarrea con moco o
Diarrea acuosa
Niños mayores de 1 año
Enterotoxina ipaH y VirF (Necesarias
para el fenotipo de invasividad y
movimiento a través del citoplasma).
EPEC
Diarrea aguda
Niños menores de 6 meses
hasta 2 años
Gen cromosomal eae y bfp (Fimbrias
formadoras de penachos).
EAEC
Diarrea líquida, diarrea
persistente hasta 20
días
Recién nacidos y niños
menores de 2 años
aafII (Adherencia agregativa fimbria),
Gen regulador AggR.
DAEC
Diarrea acuosa sin
sangre
Niños de 5 años,
preescolares
Gen cromosomal daaE (fimbria de
F-1845).
Citotoxina stx1y stx2 (Toxina semejante
a shiga), gen cromosomal eae (intimina),
Enterohemolisina Hlya, serotipo
O157:H7.
25
Figura 1. Esquema de patogenicidad de E. coli causantes de diarrea (RodríguezÁngeles, 2002).
26
2. Tratamiento
El uso de diferentes métodos diagnósticos para una identificación precisa nos
permitirá establecer un determinado tratamiento, en el caso de E. coli. Se
recomienda rehidratación, reposo, lavarse las manos, ya como medida preventiva.
Así mismo, el uso de antimicrobianos puede resultar contraindicativo, aunque el
tratamiento profiláctico para la diarrea del viajero es trimetropinsulfametoxasol, en
caso de infección extraintestinal se recomienda el uso de aminoglucósidos,
cloranfenicol, cefalosporina de tercera generación y tetraciclina (Stuart, 2000). No
se recomienda el uso de los agentes contra la motilidad intestinal por que
incrementan la duración y la gravedad de la diarrea por E. coli (Stuart, 2000).
Ciertas cepas han desarrollado resistencia a múltiples fármacos y se encuentran
bajo el control de plásmidos transmisibles; por lo que en situaciones que
predisponen la infección por estos microorganismos se recomienda la corrección
quirúrgica, como por ejemplo la obstrucción de vías urinarias (Sánchez et al.,
1998, Stuart, 2000).
27
III. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Escherichia coli (E. coli) es una de las especies predominantes en el intestino
humano y usualmente coexiste sin causar daño al hospedero; sin embargo han
emergido categorías de E. coli patogénicas que producen diarrea en humanos.
Referidas como E. coli diarreogénicas o comúnmente como E. coli patogénicas,
estas categorías son clasificados en base a sus factores de virulencia (toxinas,
plásmidos, fimbrias y factores de señalización) y pueden ser únicamente
identificados por estas características. Hoy en día existe un considerable
incremento de brotes ocasionados por E. coli diarreogénicas, afectando a miles
de personas (morbilidad y mortalidad) en diferentes países (Vugia et al., 2006,
Jonathan et al., 2006), así como también en México (Cortes-Ortiz et al., 2002). El
origen principal de este incremento de brotes es la contaminación de los alimentos
por estos patógenos, convirtiéndolos en los vehículos ideales de transmisión de
infecciones a los humanos (Vugia et al., 2006, Sainz et al., 2001).
El mundo comienza a familiarizarse con los microorganismos y con las
enfermedades transportadas por alimentos (Koneman et al.,1999, Prescott et al.,
1999). Particularmente en la última década, y especialmente desde el ya
desgraciadamente famoso brote epidémico de 1993, en Estados Unidos, en los
estados de Washington, Idaho, California y Nevada, la mayor de las epidemias por
envenenamiento alimentario causada por E. coli O157:H7. En este brote se
comunicaron en total 582 casos confirmados por cultivo que causaron 171
hospitalizaciones, 41 casos de HUS y 4 muertes. Las hamburguesas de una única
cadena de restaurantes de comida rápida estuvieron involucradas (Koneman et
al.,1999, Prescott et al., 1999). Uno de los brotes más reciente causado por una de
las seis categorías de E. coli (EHEC O157:H7) se presentó en Septiembre de
2006 en Estados Unidos afectando a 199 personas y causando la muerte de 3
personas, por el consumo de espinacas contaminadas por este patógeno
(Shannon et al. 2006). Unos de los brote más recientes en el 2010 en Estados
Unidos afectando a 21 personas enfermaron, 9 hospitalizados, 1 caso de SUH, y
28
ninguna muerte, por el consumo de espinacas, carne de vacuno y aves. Y el brote
más reciente reportado en el presente año 2011 en el mes de mayo en Alemania
y Suecia. Según los casos reportados por el Centro de Control de Enfermedades
(CDC), el posible origen del contagio ha sido atribuido al germinado de soya,
donde los últimos datos sobre la epidemia revelan que 3235 personas han
contraído la enfermedad, el 69% de ellas mujeres. Más de 700 alemanes siguen
internados en hospitales al haber desarrollado el síndrome urémico hemolítico y
hasta el momento se han reportado 37 muertes, debido a un nuevo serotipo de
EHEC O104:H4 (CDC, 2011).
Además EPEC se ha determinado en agua (Curret opinión in microbiology 1998),
EAEC en agua y otros alimentos (Harada et al., 2007, Pai et al. 1997, Nakajima et
al., 2005). ETEC en agua y comida contaminada (Black 1990, Wood et al., 1983).
EIEC en alimentos o agua contaminada (Lanyi et al., 1959, Tulloch et al., 1996) y
en DAEC las fuentes de infección no se conocen.
29
IV. JUSTIFICACIÓN
En el Estado de Sinaloa, las enfermedades diarreicas son responsables de más
del 40% de la morbilidad
por causas infecciosas. En el 2006 se presentaron
280,204 de enfermedades infecciosas intestinales (SSA), de las cuales un alto
porcentaje (58% infecciones intestinales) aunado a que se desconoce el agente
causal (posiblemente un gran numero son E. coli diarreogénicas). Debido a la
escasa disponibilidad de pruebas diagnósticas implementadas en el sector de
salud (SSA.SIN, 2008) y puesto que en Sinaloa se presentan diversos brotes
diarreicos, en los cuales (la mayoría) se desconoce el agente causal, aunado a
que las E. coli diarreogénicas son agentes emergentes que no son identificadas
por técnicas comunes en los laboratorios clínicos, ni de referencia en Sinaloa y en
gran parte de México, nos proponemos a valorar la presencia, así como sus
factores de virulencia de las seis categorías de las E. coli diarreogénicas en
alimentos, con lo cual, generaremos información de la problemática actual de E.
coli diarreogénicas, que permita desarrollar estrategias para evitar la diseminación
y contagio por estos patógenos, al identificar la fuente de contaminación y
establecer las acciones de control.
La información aportada en esta tesis es de suma importancia, ya que a pesar de
tener información sobre las enfermedades causadas por alimentos contaminados,
en Sinaloa se conoce muy poco acerca de E. coli, esto debido a la faltan de
estudios sobre el tema que nos permita saber la problemática actual de E. coli
diarreogénicas (Presencia de estas cepas patógenas, que grupo de alimentos y
alimento están siendo utilizados como vehículos de transporte por las diferentes
categorías de E. coli diarreogénicas). Actualmente La Organización Mundial de
la Salud (OMS) informa que la vigilancia de enfermedades transmitidas por
alimentos se está volviendo, cada vez más, una alta prioridad en la agenda de
salud pública en muchos países.
30
Por esta razón surgió la necesidad de realizar este estudio, ya que el conocimiento
de estos dos aspectos presencia y frecuencia de los factores de virulencia de las
E. coli diarreogénicas, permitirán avanzar en el mejor entendimiento de la
importancia de estos organismos como agentes etiológicos de diarreas en infantes
y adultos, particularmente en Sinaloa y esto repercutirá positivamente en el
monitoreo, vigilancia, y detección oportuna de estas categorías para prevenir
posibles brotes.
31
V. HIPOTESIS
Las categorías de E. coli y los genes relacionados con su patogenicidad están
presentes en los diferentes alimentos que se consumen en el Estado de Sinaloa y
en personas con un cuadro diarreico. Por lo tanto, los alimentos son vehículos
ideales de transmisión de infecciones a los humanos.
32
VI. OBJETIVOS
A. OBJETIVO GENERAL
Determinar la presencia y distribución de las categorías de E. coli causantes de
diarrea en muestras clínicas (heces) y de alimentos en el Estado de Sinaloa.
B. OBJETIVOS PARTICULARES
1. Analizar la distribución de los puntos donde se obtuvieron muestras de
alimentos y muestras clínicas (heces) en el Estado de Sinaloa. Y organizar
las muestras por grupos de alimentos y grupos de edad.
2. Aislar las posibles cepas de E. coli de las muestras de alimentos y
muestras clínicas (heces) provenientes de Sinaloa a través de medios
selectivos (Agar MacConkey), e Identificar las cepas de E. coli con la ayuda
de PCR individual.
3. Identificar las diferentes categorías de E. coli causantes de diarrea EHEC,
EPEC, ETEC, ADEC, EIEC, EAEC y el serotipo de EHEC O157:H7, con la
ayuda de PCR múltiple e individual. En aislados de personas con un cuadro
diarreico y en diversos alimentos.
4. Determinar la Frecuencia de las E. coli diarreogénicas en aislados de
personas con un cuadro diarreico y en los diversos alimentos. Y
correlacionar las categorías de E. coli encontradas en personas con un
cuadro diarreico y en alimentos.
5. Analizar la distribución de las categorías de E. coli diarreogénicas por
grupo de alimentos, por alimento, por grupos de edad, por meses y por
municipios del Estado de Sinaloa.
33
VII. ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
Figura 2. Esquema de identificación de E. coli por PCR. Utilizando los primers
(16E1, 16E2, 16E3) y PCR múltiple utilizada para la identificación de las
categorías de E. coli diarreogénicas.
34
VIII. MATERIALES Y MÉTODOS
A. DESCRIPCIÓN DE LAS MUESTRAS DE ALIMENTOS Y CLÍNICAS (HECES)
1. Población de Estudio: El estudio se llevó a cabo en la Unidad de Investigación
de la Facultad de Medicina en colaboración con el Sector Salud, por lo que se
analizaron muestras clínicas y de Alimentos. Se contaron con 117 muestras
clínicas durante los años 2008 al 2009 de 8 municipios (Culiacán, Elota, El
Rosario, Guasave, El Fuerte, Escuinapa, Ahome y Navolato). En donde la
población de los 8 municipios involucrados en el análisis de muestras clínicas
representan el 70% (1, 940,476/2, 767,552) de la población total del Estado de
Sinaloa (INEGI, 2010). Las muestras clínicas correspondieron a heces
recolectadas de personas con un cuadro diarreico, las cuales tienen las
características de ser mayores de 5 años con 5 evacuaciones en menos de 5 días.
Las muestras se analizaron por grupos de edad (0-2 años, 3-5 años, 6-10 años,
11-20 años, 21-30 años, 31-50 años y 51-99 años).
Con respecto al estudio en alimentos, se obtuvieron 5162 muestras de alimentos
(todo tipo de alimentos) recolectadas durante los años 2007 y 2008 en 10
Municipios (Culiacán, Elota, El Rosario, Guasave, El Fuerte, Ahome, Navolato,
Mazatlán, Salvador Alvarado. En donde la población de los 10 municipios
involucrados en el análisis de alimentos representan el 87.8%
(2, 431,453/2,
767,552) de la población total del Estado de Sinaloa (INEGI, 2010). A todas las
muestras de alimentos, provenientes de los diferentes municipios del estado de
Sinaloa, se les realizaron determinaciones tales como: coliformes fecales y
coliformes totales, que son pruebas de indicadores de contaminación fecal. Estas
determinaciones se realizaron con el objetivo de buscar E. coli. Los alimentos se
clasificaron en grupos como: alimentos preparados (PRE), aguas y hielo (AH),
lácteos y derivados (LD), pescados y mariscos (PM) y cárnicos (CAR) (Cuadro 2).
35
Cuadro 2. Clasificación por grupo de alimentos analizados en este estudio.
36
2. Aislamiento de E. coli: Para el aislamiento de las posibles cepas de E. coli
tanto en muestras clínicas (heces) como en alimentos, se utilizó el medio selectivo
de Agar MacConkey, en donde se estriaron directamente las muestras clínicas
(heces) y las muestras de alimentos positivas a coliformes Fecales o totales en
tubos de lauryl sulfato o EC-MUC se estriaron en este medio, con un periodo de
incubación de 18-24 horas a 35- 37C° (Figura 3). Para identificar a E. coli, del
medio MacConkey, se recolectaron cepas color rosa o incoloras, se extrajo el DNA
bacteriano y se utilizó la metodología de PCR (Reacción En cadena de la
Polimerasa) identificando la región del gen 16s RNAr con los primers u
oligonucleotidos (16E1, 16E2, 16E3) de acuerdo a H.Y. Tsen, 1998.
37
Escherichia coli
1
6
2
Agar MacConkey
E.coli
1-EAEC
5
3
2-ETEC
3-EHEC
4
Figura 3. Crecimiento de cepas control de bacterias de E. coli sobre Agar
MacConkey. En placa con agar MacConkey las colonias de las categorías de E.
coli diarreogénicas muestran una morfología similar EAEC (1), ETEC (2), EHEC
(3), DAEC (4) Y EPEC (5), y poseen diferentes tonos de rojos debido al proceso de
fermentación. Con excepción de la categoría de EIEC (6) que es lactosa negativa. 38
3. Identificación de las E. coli diarreogénicas: Los genes a amplificar de las
categorías de E. coli diarreogénicas fueron para EHEC (stx1, stx2, eae, primers
diseñados con el software oligo versión 7 para el presente estudio), EPEC (eae,
bfp, primers diseñados con el software oligo versión 7 para el presente estudio), y
se usaron primers diseñados por otros investigadores para las categorías de
ETEC (STII, Lt), EIEC (ipah, virF), ADEC (daaE), EAEC (aggr, aafII), el serotipo de
EHEC O157:H7 (rfbE O157, fliC H7) y la enterohemolisina ( hlya) (Maricel Vidal,
2005, Gehua Wang, 2002, Claudia Toma, 2003).
4. Extracción de DNA
Previamente a la extracción de DNA las cepas se sembraron en agar MAcConkey
y se incubaron de 18-24 horas a 35- 37C°. Posteriormente se resuspendieron 5
colonias en 150 µl de buffer para lisis (KCl 50mM, Tris-HCl 10mM pH 8.5, MgCl2
1.5mM, Tween-20 0.45%). La lisis del DNA para PCR se llevó a cabo hirviendo la
suspensión durante 5 min a 95 C°. El DNA extraído se tomó directamente de la
parte del sobrenadante y se empleó como templado en la reacción de PCR.
5. Amplificación por PCR
Una vez obtenido el DNA de las cepas bacterianas se procedió a realizar la
amplificación del gen 16s RNAr para la identificación de E. coli y para ello se
utilizó la PCR individual empleando los oligonucleotidos (iniciadores) descritos en
el cuadro 3.
Se realizó la PCR para la amplificación DNA de la región del gen 16s RNAr, para
identificar E. coli. Se utilizó un marcador de 50 pb en escalera DNA con las
condiciones: desnaturalización inicial de 94C° por 20 seg, 35 ciclos de 94 °C por
20 seg, 60 °C por 20 seg, 72 °C por 30 seg, extensión final a 72 °C por 2 min, y se
mantuvo a 4 °C, de acuerdo a H.Y. Tsen, (1998). La reacción de PCR consistió en
12.5
µl
del reactivo Go Taq Green Master Mix 2X (promega), 1 µl de cada
iniciador (F-sentido y R-antisentido) con una concentración de 0.5 µM (invitrogen)
39
y 1 µl de DNA templado y se ajustó el volumen de agua (grado biología molecular)
para un volumen final de 25 µl, para cada reacción (1 muestra) figura 4.
Cuadro 3. Primers utilizados en la PCR para la amplificación del gen 16s RNAr
para la identificación de E. coli.
40
Figura 4. Amplificación DNA de la región del gen 16s RNAr (16E1, 16E2,
16E3) por PCR. Productos de amplificación con los primers 16E1/16E2/ 16E3. La
línea 1 representa un marcador de 50 pb, la línea 2 al 7 muestra los productos de
amplificación de DNA de las categorías de Escherichia coli como controles
positivos (ETEC, EIEC, EPEC, EHEC, EAEC, DAEC). La línea 8 el producto de
amplificación corresponde a una muestra problema de alimentos cárnicos, la línea
9 y 10 son controles negativos. La línea 9 klebsiella pneumoniae, la línea 10
Vibrio parahaemolyticus. La línea 11 muestra un producto de amplificación de
una muestra problema de clínicos (heces) y la línea 12 representa un marcador
de 1kbp en escalera de DNA.
41
6. Amplificación por PCR múltiple
Se realizó PCR múltiple para amplificar los genes de las categorías de E. coli
diarreogénicas; las cuales fueron para EHEC (stx1, stx2, eae), EPEC (eae, bfp),
ETEC (STII, Lt), EIEC (ipah, vir), ADEC (daaE), EAEC (aggr, aafII) (Cuadro 4). Se
utilizó un marcador de 50 pb en escalera DNA y 1kbp en escalera de DNA con las
condiciones: desnaturalización inicial de 94C° por 3 min, 35 ciclos de 94 °C por 1.5
min, 55°C por 1.5 min, 72 °C por 1.5 min, extensión final a 72 °C por 5 min, y se
mantuvo a 4 °C. De acuerdo a Maricel Vidal, (2005) (Figura 5). La reacción de
PCR consistió en 12.5 µl del reactivo Go Taq Green Master Mix 2X (promega), 1
µl de cada iniciador (F-sentido y R-antisentido) con una concentración de 0.5 µM
(invitrogen) y 1 µl de DNA templado y se ajustó el volumen de agua (grado
biología molecular) para un volumen final de 25 µl, para cada reacción (1
muestra).
7. Amplificación con PCR múltiple e individual
Se realizó PCR múltiple e individual para el serotipo de EHEC O157:H7 (Cuadro
4). Se utilizó un marcador de 50 pb en escalera DNA y 1kbp en escalera de DNA
con las condiciones: desnaturalización inicial de 98 °C por 8 min, 35 ciclos de 95
°C por 30 seg, 58°C por 30 seg, 72 °C por 30 seg, extensión final a 72 °C por 7
min, y se mantuvo a 4 °C. De acuerdo a Gehua Wang, (2002). La reacción de
PCR consistió en 12.5 µl del reactivo Go Taq Green Master Mix 2X (promega), 1
µl de cada iniciador (F-sentido y R-antisentido) con una concentración de 0.5 µM
(invitrogen) y 1 µl de DNA templado y se ajustó el volumen de agua (grado
biología molecular) para un volumen final de 25 µl, para cada reacción (1 muestra)
(Figura 6).
Todas las amplificaciones por PCR individual y PCR múltiple se desarrollaron en
un Termociclador (Labnet, Modelo multigen Gradiente).
42
Cuadro 4. Primers utilizados en la PCR múltiple para la amplificación de los genes
de las diferentes categorías de E. coli diarreogénicas.
43
Figura 5. Amplificación de DNA por PCR múltiple de los genes de las
categorías de E. coli causantes de diarrea. (stx1, stx2, eae, bfp, stII, lt, ipah, vir,
daaE, aggr, aafII). PCR múltiple. La línea 1 representa 50 pb en escalera de
DNA. De la línea 2-7 corresponde a las bandas de los productos de amplificación
de DNA de las categorías de E. coli causantes de diarrea (stx1, stx2, eae, bfp,
stII, lt, ipah, vir, daaE, aggr, aafII). La línea 2, EHEC (stx1, stx2, eae); la línea 3,
EPEC (eae, bfp); la línea 4, ETEC (Lt); la línea 5, DAEC (daaE); la línea 6, EIEC
(ipah); la línea 7, EAEC (aggr, aafII). La línea 8 representa 1kbp en escalera de
DNA.
44
Figura 6. Amplificación de DNA por PCR de los genes del serotipo STEC
O157:H7 (rfbEO157, fliCH7). PCR individual. La línea 1, 2 y 3 muestra los
productos de amplificación de controles positivos de rfbEO157. La línea 4 y 6 son
muestras control positivo de fliCH7. La línea 5 corresponde a una muestra
problema de alimento lácteo, y la línea 7 representa un marcador de 1kpb en
escalera de DNA.
45
8. Detección del DNA amplificado
Los productos de amplificación por PCR fueron separados por electroforesis en un
gel de agarosa (promega) al 2% durante 50 min a 90 voltios, las bandas de ADN
fueron teñidas con bromuro de etidio y visualizadas a través de un transluminador
ultravioleta (Ultra violet products, Modelo UV-Translluminators) y analizado con un
sistema de fotodocumentación (Kodak, Modelo Gel Logic 100 imaging system).
9. Purificación DNA
Para la extracción y purificación del DNA de las bacterias gram (-) como E. coli
diarreogénicas, se utilizó el medio enriquecido de LB al 3 % de NaCl. Después
por medio del Kit comercial DNA purification Kit (Wizard Plus SV, promega A1125)
se purificó el DNA bacteriano siguiendo el protocolo recomendado por el
fabricante.
46
IX. RESULTADOS
El presente estudio se llevó a cabo en la Unidad de Investigación de la Facultad
de Medicina en colaboración con el Sector Salud, por lo que se analizaron
muestras de Alimentos y muestras clínicas. Por consiguiente primero se
describirán los resultados obtenidos de alimentos y después los resultados
obtenidos de clínicos.
Este estudio se realizó para determinar la presencia, frecuencia y distribución de
E. coli diarreogénicas en alimentos que se consumen en el Estado de Sinaloa. Se
recolectaron muestras de alimentos que provenían de los diferentes municipios
del Estado de Sinaloa durante los años 2007 al 2008.
El total de muestras de alimentos recolectadas para ser analizadas fueron de
5162, y provenían de los diferentes municipios del estado de Sinaloa. Los
municipios involucrados de norte a sur fueron; Ahome, El Fuerte, Guasave,
Salvador Alvarado, Navolato, Culiacán, Cosalá, Mazatlán, El Rosario y Escuinapa
(Figura 7), en donde la población de los 10 municipios involucrados en el análisis
de alimentos representan el 87.8% (2, 431,453/2, 767,552) de la población total
del Estado de Sinaloa (INEGI).
De 10 municipios involucrados en el envío de muestras de alimentos para su
análisis, se encontró que del municipio de Culiacán se obtuvieron el mayor número
de muestras con un 27.6% (n=1429/5162), seguido de Ahome con un 24.1%
(n=1245/5162), Mazatlán con un 18.5% (n=960/5162), Escuinapa con el 12.1%
(627/5162), y Salvador Alvarado con 8.5% (n=439/5162), mientras que de los
cinco municipios que menos muestras de alimentos se obtuvieron fueron Guasave
con un 7.1% (371/5162), Navolato con el 0.5% (n=26/5162), El Fuerte con el
0.48% (n=25/5162), y por último los municipios de Cosalá con el 0.38%
(n=20/5162) y El Rosario con el 0.38% (n=20/5162) respectivamente.
47
Figura 7. Distribución geográfica de los puntos donde se realizó el muestreo
de Alimentos en el Estado de Sinaloa. Municipios involucrados en el análisis de
alimentos, el cual se llevó acabo en los años 2007 al 2008.
48
Se analizaron un total de 5162 muestras de alimentos que se separaron por grupo
de alimentos de los cuales 1597 (30.9%) fueron de aguas y hielos, 1594 (30.8%)
de alimentos preparados, 669 (12.9%) lácteos y derivados, 656 (12.7%) pescados
y mariscos, el menor número de muestras recibidas correspondió a productos
cárnicos con 646 (12.5%) (Figura 8A). A estas muestras se les realizarón las
determinaciones de coliformes fecales (y/o) totales
(se analizarón de dos
maneras, por el método de placa, y por el método de Número más Probable
(NMP), y coliformes totales Número más Probable (NMP). Estas determinaciones
se realizarón con el objetivo de buscar E. coli. De las 5162 muestras de alimentos
analizadas el 13.4% (692/5162) dieron positivo a las determinaciones de
coliformes fecales (y/o) coliformes totales (Figura 8B). De las 692 muestras de
alimentos contaminadas por coliformes fecales (y/o) coliformes totales, el 28%
(190/669) correspondió a lácteos y derivados, el 24% (156/646) de productos
cárnicos, el 17% (117/656) de pescados y mariscos, el 10% (175/1594) de
alimentos preparados y el menor número de muestras correspondió al grupo de
aguas y hielos con el 3.3% (54/1597) (Figura 8B).
De las muestras de alimentos positivas a coliformes fecales o totales, se aislaron
las probables bacterias de E. coli, utilizando el medio selectivo de Agar
MacConkey.
La identificación de las cepas de E. coli aisladas del medio de Agar MacConkey
se realizó mediante PCR utilizando primers descritos por H.Y. Tsen, 1998 (Figura
4).
De 692 muestras, el 59.53% (412/692) de alimentos que habían dado positivas a
coliformes fecales (y/o) coliformes totales, presentaron E. coli. Los grupos de
alimentos más contaminados fueron los lácteos y derivados (LD) con un 21.3%
(143/669), el grupo de productos cárnicos (CAR) con un 17% (110/646), y el grupo
de alimentos de pescados y mariscos (PM) con un 10.8 % (71/656) (Cuadro 5).
49
Figura 8. Grupos de Alimentos analizados en este estudio. (A) Proporción por
grupos de alimentos analizados n=5162, (B) Proporción durante el año 2007 al
2008 de muestras de alimentos que dieron positivo al análisis de coliformes
fecales (y/ó) coliformes totales n=692.
50
Cuadro 5. Detección y Frecuencia de E. coli en los grupos de alimentos
analizados.
De las n=5162 muestras de alimentos analizadas del Estado de Sinaloa. Se
identificó E. coli con una frecuencia del 8.0 % (n=412/5162) por PCR.
51
La frecuencia de identificación de E. coli en las muestras de alimentos estudiados
en el presente estudio fue del 8.0 % (n=412/5162).
De las 412 muestras de alimentos que dieron positivas a E. coli por PCR. Se les
realizó la amplificación de los genes relacionados con las categorías de E. coli
(Cuadro 4.) Los genes a amplificar de las categorías de E. coli diarreogénicas
fueron para EHEC (stx1, stx2, eae, primers diseñados con el software oligo
versión 7 para el presente estudio), EPEC (eae, bfp, primers diseñados con el
software oligo versión 7 para el presente estudio), y se usaron primers diseñados
por otros investigadores para las categorías de ETEC (STII, Lt), EIEC (ipah, virF),
ADEC (daaE), EAEC (aggr, aafII), el serotipo de EHEC O157:H7 (rfbE O157, fliC
H7) y la enterohemolisina ( hlya) (Figura 5). De los primers diseñados en este
estudio para EHEC (stx1, stx2) y para EPEC (eae, bfp). Se observó la
amplificación esperada en las cepas control.
De estas 412 muestras contaminadas por E. coli, el 13.2% (54/412)
correspondieron a E. coli diarreogénicas o potenciales productoras de diarreas y
el 87% (358/412) no presentaron genes de las categorías buscadas (Figura 9A).
La categoría de E. coli diarreogénicas identificada más frecuentemente fue EPEC
en un 83% (45/54; 9 típicas y 36 atípicas) seguida por STEC con un 9% (5/54),
ETEC con un 4% (2/54) y EAEC 4% (2/54) como se muestra en la figura 9B.
Ninguno de los aislados de E. coli presentaron los genes de virulencia que
corresponden a DAEC o EIEC. El alimento que presento una mayor proporción de
E. coli diarreogénicas fueron los productos lácteos, cárnicos y la comida
preparada, aunque no se observó una tendencia de alguna categoría por algún
grupo de alimento.
La categoría EPEC se encontró en todos los grupos de alimentos analizados en
este estudio (45/412) siendo solo la excepción el grupo de aguas y hielos,
observándose en mayor presencia de esta categoría en el grupo de alimentos de
lácteos y derivados (13/143), seguido de productos cárnicos (11/110), pescados y
52
mariscos (11/71), y por último en alimentos preparados (10/78). Mientras que la
categoría de STEC tuvo presencia en 2 de los 5 grupos de alimentos analizados
(5/412) y en menor cantidad que la categoría de EPEC, observándose una mayor
presencia en lácteos y derivados (3/143) y alimentos preparados con (2/78). La
categoría de ETEC tuvo presencia en 2 de los 5 grupos de alimentos analizados
(2/412) observándose una mayor presencia en lácteos y derivados (1/143) y en
aguas y hielos (1/10). Finalmente la categoría de EAEC sólo se presentó en 1 de
los 5 grupos de alimentos analizados (2/412), teniendo presencia sólo en el grupo
de pescados y mariscos (2/71). Observándose que solo el grupo de lácteos y
derivados presentó tres (EPEC, STEC, ETEC) de las cuatro categorías de E. coli
diarreogénicas que fueron identificadas en este estudio (Cuadro 6).
La frecuencia de los patotipos o categorías de E. coli fue del 8.0% (412/5162),
encontrándose una frecuencia de identificación del 1.1% (54/5162) de cepas
diarreogénicas con relación a la población general de alimentos estudiada durante
los años 2007 al 2008; identificándose principalmente la categoría de EPEC con
un 0.87% (45/5162) y STEC con un 0.09% (5/5162), mientras que la categoría de
ETEC con un 0.03% (2/5162) y EAEC con un 0.03% (2/5162) respectivamente. La
frecuencia de EPEC, STEC y ETEC fue mayor en lácteos y derivados con un
2.54% (17/669), seguido de pescados y mariscos con un 1.98% (13/656) con
EPEC, EAEC, mientras que el grupo de alimentos cárnicos con un 1.70% (11/646)
con las categorías de EPEC, el grupo de alimentos preparados con un 0.75%
(n=12/1594) con la categoría de EPEC y STEC, y finalmente el grupo menos
contaminado fue el de aguas y hielos con un 0.62% (1/1597) con ETEC (Cuadro
7).
53
Figura 9. Proporción de las categorías de E. coli diarreogénicas. A)
Proporción de las cepas no diarreogénicas y diarreogénicas de E. coli detectadas
y aisladas de muestra de Alimentos. B) Proporción por categorías de E. coli
diarreogénicas detectadas y aisladas de muestra de Alimentos. Indicando las
categorías identificadas, DAEC, EAEC, ETEC y EPEC típicas (gen eae y bfp) y
atípicas (gen eae).
54
Cuadro 6. Distribución de las categorías de E. coli diarreogénicas por grupo de
Alimentos en los años 2007 al 2008.
Análisis de las 412 muestras de alimentos donde se identificó E. coli por PCR
múltiple. Los resultados muestran, la presencia de las categorías de E. coli
diarreogénicas (EPEC, EAEC, ETEC y STEC).
55
Cuadro 7. Detección y Frecuencia de las categorías E. coli diarreogénicas en los
alimentos analizados por PCR múltiple en los años 2007 al 2008.
56
Alimentos contaminados con las categorías de E. coli diarreogénicas. Del
grupo de lácteos y derivados, el queso fue el alimento más contaminado por las
categoría de E. coli diarreogénicas con el 31.48% (17/54), teniendo mayor
presencia la categoría de STEC con un 60% (3/5), seguida de ETEC con el 50%
(1/2) y por último EPEC con el 28.8% (13/45). En el grupo de cárnicos, la carne de
mamífero y aves y chorizo y longaniza ambos fueron los alimentos más
contaminados con un 9.25% (5/54), encontrándose a EPEC principalmente con
un 11.11% (5/45) en ambos alimentos. En el grupo de Preparados, las ensaladas
de verduras fue el alimento más contaminado con un 11.1% (6/54), siendo la
categoría de STEC la que más se identificó con un 20% (1/5) seguida de EPEC
con un 11.11% (5/45). En el grupo de pescados y mariscos, el pescado fue el
alimento más contaminado con un 18.5% (10/54), identificándose a EAEC con un
50% (1/2), seguida de EPEC con un 20% (9/45). En el grupo de aguas y hielos
solo hubo presencia de ETEC con un 50% (1/2). Estos datos indican que el
alimento más contaminado por estas categorías (EPEC, STEC y ETEC) fue el
queso fresco (Cuadro 8).
57
Cuadro 8. Distribución de las categorías E. coli diarreogénicas por alimentos.
58
Distribución geográfica de las categorías de E. coli diarreogénicas
identificadas por Municipio en el Estado de Sinaloa en los años 2007 al 2008.
Las muestras de alimentos analizadas en este estudio, provenían de diez de los
18 municipios del estado de Sinaloa. Los municipios involucrados en el análisis de
alimentos fueron: Culiacán, Ahome, Mazatlán, Escuinapa, Salvador Alvarado,
Guasave, Navolato, El Fuerte, Cósala y El Rosario. En donde la población de los
10 municipios involucrados en el análisis de alimentos representan el 87.8% (2,
431,453/2, 767,552) de la población total del Estado de Sinaloa (INEGI). De estos
diez municipios de donde se recolectaron muestras de alimentos los municipios de
Mazatlán, Escuinapa, Navolato, El Fuerte, Cósala y El Rosario no se detectaron
las categorías de E. coli diarreogénicas (Figura 10).
Los municipios en donde se aislaron E. coli en una proporción mayor de las 412
muestras de alimentos que dieron positivas a E. coli, los municipios donde se
identificó E. coli en mayor proporción fueron Guasave con un 15.3% (57/371),
Salvador Alvarado con un 12.7% (56/439), Ahome con un 10% (125/1245)
y
Culiacán con un 7.7% (111/1429). Se aislaron en una proporción menor en
Escuinapa con un 4.7% (30/627) y Mazatlán con un 3.4% (33/960), en estos dos
municipios no se identificaron las categorías de E. coli patógenas pero la
presencia de esta bacteria nos habla de que hay contaminación fecal en los
alimentos que se consumen en estos municipios (Figura 10).
Se identificaron 54 E. coli de las categorías diarreogénicas, EPEC, ETEC , EAEC
y STEC, las cuales fueron detectadas solamente de la parte centro y norte del
Estado de Sinaloa, identificándose en mayor proporción en Guasave con un 2.6%
(10/20) siendo la categorías de EPEC la que se identificó en mayor proporción con
un 2.4 % (9/371), seguido del municipio de Salvador Alvarado donde se
identificaron las categorías de E. coli diarreogénicas en un 1.82% (8/439) siendo
la categorías de EPEC la que se identificó en mayor proporción con el 1.59%
(7/439). En el municipio de Ahome se identificaron con el 1.76% (22/1245) siendo
la categorías EPEC la que se identificó en mayor proporción con el 1.44%
59
(18/1245). Por último en el municipio de Culiacán se identificaron a las categorías
de E. coli diarreogénicas en un 0.97% (14/1429) siendo este el municipio en
donde se identificaron las categorías de E. coli en menor proporción, pero que fue
el municipio que presento las cuatro categorías de E. coli identificadas en este
estudio EPEC, STEC, EAEC y ETEC (Figura 10).
60
Figura 10. Distribución geográfica de las categorías de E. coli diarreogénicas
identificadas por Municipio en el Estado de Sinaloa. En muestras de alimentos
durante los años 2007 al 2008 en muestras de alimentos.
61
Para conocer la frecuencia de E. coli y de cepas diarreogénicas por meses en el
periodo de estudio de los años 2007 al 2008 del presente trabajo, se analizó la
distribución de estas cepas. Cabe mencionar que es importante conocer la
distribución de estas cepas por meses en el estado de Sinaloa, ya que estudios
realizados sugieren que en los meses húmedos y calurosos la presencia de
patógenos en alimentos es mayor. Dado que Sinaloa presenta estas dos
condiciones óptimas de crecimiento.
Al observar la distribución de las cepas E. coli y de cepas diarreogénicas
identificadas en este estudio, se encontró que no hubo una tendencia de
incremento por cada mes, sino más bien un comportamiento similar en cuanto a
la presencia de estas cepas durante los meses del periodo del presente estudio.
(Figura 11).
62
Figura 11. Distribución por meses de E. coli y cepas diarreogénicas en los
años 2007 al 2008.
63
Para determinar la presencia, frecuencia y distribución de E. coli diarreogénicas
en personas que presentaban un cuadro clínico diarreico en el estado de Sinaloa.
Se recolectaron muestras clínicas (heces) de personas que presentaban un
cuadro clínico diarreico de los diferentes municipios del estado de Sinaloa durante
los años 2008 al 2009.
Se recolectaron 117 muestras clínicas de los municipios de Culiacán, Elota, El
Rosario, Guasave, El Fuerte, Escuinapa, Ahome y Navolato (Figura 12). Los 8
municipios involucrados en el análisis de muestras clínicas representan el 70% (1,
940,476/2, 767,552) de la población total del Estado de Sinaloa (INEGI).
El mayor número de muestras clínicas recolectadas se obtuvo de Culiacán con un
26.4% (31/117), seguido de Elota con un 17.09% (20/117). El Rosario con un
17.09% (20/117), Guasave con un 12.8% (15/117),
El fuerte con un 8.5%
(10/117), mientras que de los municipios de Escuinapa y Ahome se obtuvieron la
misma cantidad de muestras con un 7.6% (9/117) en ambos municipios, siendo el
municipio de Navolato donde se obtuvieron el menor número de muestras con un
2.5% (3/117), respectivamente.
64
Figura 12. Distribución geográfica de los puntos donde se tomaron muestras
de personas que presentaban un cuadro clínico diarreico en el Estado de
Sinaloa. 8 municipios involucrados de norte a sur en el análisis de muestras
clínicas de heces, el cual se llevó a cabo en el año 2008 al 2009.
65
Las categorías de E. coli diarreogénicas son los agentes etiológicos más
importante causante de diarrea en los seres humanos, afectan a todas las edades
y estrato social. Se obtuvieron 57 muestras de 0-2 años, 18 muestras de 3-5 años,
11 muestras de 51-99 años, 10 muestras de 6-10 años, 8 muestras de 31-50 años,
7 muestras de 21-30 años, el grupo de edad de menor muestras clínicas de heces
recibidas correspondió al grupo de 11-20 años con 6 muestras (Figura 13).
Del 100% (117) de las muestras clínicas se aislaron las posibles cepas de E. coli
mediante el medio selectivo de Agar MacConkey (Figura 3). Y se identificaron por
PCR individual (Figura 4).
Una vez identificada E. coli, para determinar que cepas de esta corresponden a
las categorías de E. coli diarreogénicas es decir patógenas y que no son solo
parte de la flora normal, se les realizó PCR múltiple con primers previamente
descritos en el Cuadro 4.
Los genes a amplificar de las categorías de E. coli diarreogénicas fueron para
EHEC (stx1, stx2, eae, primers diseñados con el software oligo versión 7 para el
presente estudio), EPEC (eae, bfp, primers diseñados con el software oligo
versión 7 para el presente estudio), y se usaron primers diseñados por otros
investigadores para las categorías de ETEC (STII, Lt), EIEC (ipah, virF), ADEC
(daaE), EAEC (aggr, aafII), el serotipo de EHEC O157:H7 (rfbE O157, fliC H7) y la
enterohemolisina ( hlya) (Figura 5).
66
n=117
Figura 13. Grupos de edad de las muestras clínicas analizadas en este
estudio. Proporción por grupos de edad de muestras clínicas (heces) analizadas,
durante los años 2008 al 2009.
67
Identificación de las categorías de E. coli diarreogénicas. El 26% (31/117) de
las muestras clínicas se les identifico E. coli diarreogénicas en personas que
presentaban un cuadro clínico diarreico, encontrándose que el 74% (86/117)
correspondieron a cepas de E. coli sin genes de virulencia que caracterizan a las
cepas no diarreogénicas es decir no hubo presencia de las categorías de E. coli
(Figura 14A). De las 31 cepas patógenas, el patógeno más frecuentemente
aislado fue EPEC con un 42% (13/31), de las cuales 8 fueron típicas (con el gen
eae y bfp) y 5 atípicas (solo con el gen eae). En menor frecuencia se identificó
EAEC en un 29% (9/31), ETEC en un 26% (8/31) y DAEC en un 3% (1/31) como
se muestra en la figura 14B. Ninguno de los aislados de E. coli presentaron los
genes de virulencia que corresponden a EHEC, STEC ó EIEC.
Distribución y prevalencia por grupo de edad de E. coli diarreogénicas.
Por grupo de edad, se determinó que EPEC (típica y atípica) (19.2%, 11/57) y
EAEC (12%, 7/57) fueron más prevalentes entre los grupos de edad de 0-2 años.
ETEC fue más prevalente en el grupo de edad de 11-20 (33%, 2/6) años, seguido
6-10 (30%, 3/10) y 51-99 años (18%, 2/11). La categoría de DAEC se identificó
únicamente en el grupo de edad de 3-5 años (5%, 1/18). Ninguna de las E. coli
diarreogénicas fueron identificadas en los grupos de edad de 21-30 y 31-50 años.
Los resultados muestran que hay una alta proporción de E. coli productoras de
diarrea o diarreogénicas en pacientes con diarrea aguda ó persistente, en donde
predomina E. coli enteropatógena EPEC (típica) (Cuadro 9). No hubo presencia
de las categorías de EIEC, EHEC ó STEC en las muestras clínicas (heces) que se
analizaron para este estudio.
68
Figura 14. Proporción de las categorías de E. coli diarreogénicas. A)
Proporción de las cepas no diarreogénicas y diarreogénicas de E. coli detectadas
y aisladas de muestra Clínicas (heces). B) Proporción por categorías de E. coli
diarreogénicas detectadas y aisladas de muestra clínicas, indicando las categorías
identificadas, DAEC, EAEC, ETEC y EPEC típicas (gen eae y bfp) y atípicas (gen
eae).
69
Cuadro 9. Distribución de las categorías de E. coli diarreogénicas por grupos de
edad.
70
La prevalencia de EPEC, ETEC, EAEC y DAEC fue mayor en el grupo de edad
de 11-20 años con un 50% (3/6), seguido del grupo de edad de 6-10 años con una
prevalencia del 40% (4/10) y grupo de edad de 0-2 años con un 33.3% (19/57),
siendo estos tres grupos de edad los que presentaron una mayor frecuencia por
estos patógenos. El grupo de edad de 51-99 años presento la menor incidencia
de E. coli diarreogénicas con un 27.2% (3/11), siendo este el cuarto grupo de
edad, que presento una mayor frecuencia por estos. No se identificaron las
categorías de E. coli diarreogénicas en los grupos de edad de 21-30 años y 3150 años (Cuadro 10).
71
Cuadro 10. Detección y Frecuencia de las categorías E. coli diarreogénicas en las
muestras clínicas (heces) analizadas por grupos de edad.
De las 117 muestras de alimentos recibidas se identificaron las categorías de E.
coli con una frecuencia del 26.4 % (n=31/117) por PCR.
72
Distribución geográfica de las categorías de E. coli diarreogénicas
identificadas por Municipio en el Estado de Sinaloa en el año 2008 al 2009 en
personas con un cuadro diarreico. Las muestras clínicas (heces) analizadas en
este estudio, provenían de ocho de los 18 municipios del estado de Sinaloa. Los
municipios involucrados en el análisis de alimentos fueron: Culiacán, Elota, El
Rosario, Guasave, El Fuerte, Escuinapa, Ahome y Navolato. De estos ocho
municipios de donde se recolectaron muestras clínicas (heces), solo en el
municipio de Navolato no se detectaron las categorías de E. coli diarreogénicas
(Figura 15). De las 31 categorías detectadas de E. coli diarreogénicas en este
estudio, las categorías de EPEC, ETEC y EAEC fueron detectadas a lo largo del
Estado de Sinaloa.
Por municipio se identificaron las categorías de E. coli diarreogénicas en mayor
proporción en Elota con un 40% (8/20) y Guasave con un 40% (6/15). En el
municipio de Elota se identificó en mayor proporción la categorías de EPEC con
un 20% (4/20). En Guasave se identificó en mayor proporción la categorías de
EAEC con un 26.6% (4/15) y fue en el único municipio donde se identificó la
categoría de DAEC. En el municipio de El Fuerte se identificaron las categorías de
E. coli diarreogénicas en un 30% (3/10), donde se identificó en mayor proporción
la categoría de EPEC con un 20% (2/10). En Culiacán se identificaron con un
22.5%, siendo la categorías de EPEC la que se identificó en mayor proporción con
un 12.9% (4/31). En Ahome se identificaron con un 22.2% (2/9) siendo las
categorías de EAEC y ETEC las que se identificaron en mayor proporción con un
11.1% (1/9) cada una. En El Rosario se identificaron con un 20% (4/20) siendo las
categorías de EPEC Y ETEC las que se identificaron en mayor proporción con un
10% (2/20) cada una. Y por último el municipio de Escuinapa con el 11.1 % (1/9)
con la categoría de ETEC (Figura 15).
73
Figura 15. Distribución geográfica de las categorías de E. coli diarreogénicas
identificadas por Municipio en el Estado de Sinaloa en el año 2008 al 2009 en
personas con un cuadro diarreico
74
Para conocer la frecuencia de E. coli y de cepas diarreogénicas por meses en el
periodo de estudio de los años 2007 al 2008 del presente trabajo, se analizó la
distribución de estas cepas. Cabe mencionar que es importante conocer la
distribución de estas cepas por meses en el estado de Sinaloa, ya que estudios
realizados sugieren que en los meses húmedos y calurosos la presencia de
patógenos en alimentos es mayor. Dado que Sinaloa presenta estas dos
condiciones óptimas de crecimiento. Se analizó la distribución de la presencia de
E. coli en los meses estudiados y se encontró que no hubo una tendencia de
incremento por cada mes, sino más bien un comportamiento similar en cuanto a
la presencia de estas cepas durante los meses del periodo del presente estudio.
Presentando un ligero incremento en su presencia durante los meses calurosos de
Julio, Septiembre y Octubre (Figura 16).
75
Figura 16. Distribución por meses de las cepas de E. coli diarreogénicas en
los años 2008 al 2009.
76
X. DISCUSIÓN
Las enfermedades diarreicas causadas por las
categorías de E. coli
diarreogénicas siguen siendo una importante causa de mortalidad y morbilidad
mundialmente (Clarke, 2003). Y han sido identificadas como una causa importante
de diarrea infantil y joven en todos los países en desarrollo, pero la incidencia ha
variado en diferentes estudios de más de 40% en Bangladesh (Albert et al., 1995)
a menos del 30% en Jordania (Shehabi et al., 2003). Siendo estos agentes
patógenos en la mayoría de los casos mala mente identificados, posiblemente
debido a las inadecuadas metodologías en la práctica clínica (Abu-Elyazeed et al.,
1999).
En el presente estudio, se analizó la presencia de genes relacionados a virulencia
de las diferentes categorías de E. coli causantes de diarrea en cepas aisladas de
muestras de alimentos (cárnicos, lácteos y derivados, preparados, pescados mariscos y aguas y hielo) y muestras clínicas (heces) de pacientes que
presentaba un cuadro diarreico.
En alimentos el estudio inicial, efectuado a partir de las muestras positivas a
coliformes fecales y totales, demostró que el 60% de las mismas eran positivas a
E. coli. Este resultado demuestra la pobre calidad higiénico sanitaria de estos
productos, que no cumplen lo establecido por las normas nacionales e
internacionales (Instituto Panamericano de Protección de Alimentos y Zoonosis,
(INPPAZ, 1996). En todos los grupos de alimentos fue identificada E .coli. Pero
los lácteos fueron los más contaminados (34.7%), seguidos de los productos
cárnicos (26.6%). Esta contaminación puede ser el resultado de una deficiente
manipulación (Blanco et al.,1996) pero, además, puede estar determinada por
gérmenes procedentes de la flora normal del animal (Barreto et al., 1998).
En este estudio en alimentos encontramos que del total de las cepas de E. coli
aisladas, el 13.1% fueron patógenas (EPEC, STEC, EAEC y ETEC). Este
porcentaje de aislamiento de E. coli patógena en este estudio, muestra
77
claramente la importancia de E. coli como agente productor de gastroenteritis y
como causa de brotes en la población. El grupo patógeno predominante de E. coli
fue EPEC (83%). Siendo EPEC Atípica la que tuvo mayor prevalencia con un
(80%) y EPEC típica con un (20%) resultado que concuerda por lo reportado en la
literatura por Vidal J.E y Canizalez-Roman, 2007 donde sugieren que estudios
epidemiológicos realizados en países en vías de desarrollo, así como en México,
se ha observado que la infección por EPEC tiene una elevada tasa de morbilidad y
mortalidad. Además nuestro resultado de EPEC fue mayor que lo reportado por
Meza y Díaz. 2005 y en otras partes, donde reportan una prevalencia más baja de
EPEC. Esto puede ser debido a que solo dependen de pruebas serológicas y
fenotípicas para el diagnóstico de EPEC y que no utilizan técnicas de biología
molecular como PCR. Mientras que en nuestro estudio dependía de PCR para la
detección de los genes de virulencia. Además divide la EPEC en típica con los
genes (eae y bfp) y atípica solo con el gen (eae). Debido a que este es el primer
estudio en alimentos en Sinaloa como en México, donde se informa de EPEC
típica y Atípica fue difícil comparar nuestros resultados con otros realizados en
nuestro estado de Sinaloa. También es nuestro estudio diseñamos nuestros
propios primer de eae y bfp para la identificación de EPEC en muestras de
alimentos como en muestras clínicas, esto debido a problema en el proceso de
estandarización con los primer de otros autores.
Si bien la frecuencia de cada patógeno varía de estudio en estudio, en general, los
principales patotipos o categorías de E. coli encontrados en este estudio fueron
EPEC, EAEC, ETEC y STEC lo que concuerda
con los estudio regionales y
globales de las E. coli patogenicas en niños (Spano L.C y Sadovsky, 2008). A
pesar de que nuestro estudio fue en alimentos.
En nuestro estudio también se encontró que del grupo de lácteos y derivados el
queso fresco fue el alimento más contaminado presentando (EPEC, STEC y
ETEC) de las cuatro categorías de E. coli causantes de diarrea identificadas en
este estudio. Esto sugiere que las condiciones higiénicas sanitarias de elaboración
78
y de expendio no son de las más óptimas y que el queso fresco puede ser una de
las principales vías de transmisión de estas categorías. Pero lo más importante es
que estamos viendo la presencia de patógenos como es el caso de EPEC, STEC
y ETEC que contaminan este producto convirtiéndolo en un peligro potencial para
la salud de la población. Este resultado es similar al “Estudio retrospectivo de la
incidencia de enterobacterias en alimentos en Sinaloa durante el 2006, realizado
en Laboratorio Estatal de Salud Pública Sinaloa, donde sugieren que el queso
presentan mayor contaminación por enterobacterias, esto refiere a que bacterias
como E. coli están presentes como contaminantes en alimentos, pudiendo con
esto ser los alimentos lácteos y derivados causantes de enfermedades diarreicas
en Sinaloa debido a la contaminación de estos con las categorías de E. coli
diarreogénicas, siendo estos resultados similares a los reportados por CanizalezRoman y Gonzalez-Nuñez, 2009.
En este estudio también se buscó identificar y analizar de manera completa y
minuciosa la categoría de E. coli EHEC (stx1, stx2, eae, hlyA), y principal mente
su serotipo O157:H7 sin lograr aislarla. También es nuestro estudio diseñamos
nuestros propios primer de stx1 y stx2 para la identificación de EHEC en muestras
de alimentos como en muestras clínicas, esto debido a problema en el proceso de
estandarización con los primer de otros autores. Aunque en nuestro país no se
han presentado posibles brotes debido a EHEC ni por el serotipo O157:H7. Si
logramos identificar a la categoría de STEC (stx1 y stx2). Este hallazgo en
importante ya que estos brotes si se han presentado geográficamente cerca de
Sinaloa debido a los brotes que se han presentado en Estados Unidos, tal es el
caso reportado el 12 de octubre del 2006 por la Administración de Drogas y
Alimentos (FDA) y el estado de California donde surgió un brote un brote de E.
coli O157:H7, el cual se detectó en una finca de espinacas. Dicho brote era
proveniente de la materia fecal de ganado de dicha finca, de aquí surge la
inquietud de realizar una evaluación de nuestra situación actual, para conocer la
circulación de estas bacterias en nuestro entorno ya que espinacas u algún otro
alimento, puedan venderse aquí en Sinaloa, por medio de Supermercados
79
internacionales de autoservicio. Estudios realizados muestran, que también se han
presentado brotes por EHEC en diferentes países desarrollados como (Canadá,
Inglaterra y Japón) y en el hemisferio sur (Chile, Argentina, Sudáfrica). Además de
brotes causados principalmente por carne de res mal cocida y contaminada por
EHEC Nataro y Kaper. 1998.
El análisis realizado para detectar EHEC y O157:H7 no arrojó datos que nos
indicaran la presencia de esta categoría ni del serotipo en las muestras de
alimento y muestras clínicas analizadas en este estudio, confirmando con esto que
en Sinaloa al parecer no hay presencia de EHEC, ni del serotipo O157:H7.
En el presente estudio, examinamos también la presencia y la incidencia de las
categorías de E. coli diarreogénicas en personas que presentaban un cuadro
clínico diarreico, pacientes de 3 meses a 99 años, en el Estado de Sinaloa.
Encontramos que de 117 cepas aisladas he identificadas como E. coli, el 26%
fueron patógenas (EPEC, EAEC, ETEC y DAEC). Existiendo una similitud en la
presencia de estas categorías en nuestro estudio en alimentos como en muestras
clínicas (heces), cambiando solo STEC en alimentos y DAEC en muestras
clínicas. El porcentaje de aislamiento de E. coli patógena en este estudio, muestra
claramente la importancia de E. coli como agente productor de gastroenteritis y
como causa de brotes en la población. Encontramos que EPEC, EAEC y ETEC
fueron los patógenos más frecuentes en pacientes con diarrea y deshidratación.
Si bien la frecuencia de cada patógeno varía de estudio en estudio, en general, los
principales patotipos o categorías de E. coli encontrados en este estudio fueron
EPEC, EAEC, ETEC lo que concuerda con los estudio regionales y globales de
las E. coli patogenicas en niños (Spano L.C y Sadovsky, 2008). A pesar de que
nuestro estudio fue en alimentos.
El grupo patógeno predominante de E. coli fue EPEC (42%). Siendo EPEC típica
la que tuvo mayor prevalencia con un (62%) y EPEC Atípica con un (38%),
resultado similar al obtenido en alimentos en cuanto a la mayor frecuencia de
80
EPEC, pero no así en cuanto a las muestras típicas y atípicas. Teniendo una
mayor prevalencia EPEC típica en clínicos que en alimentos. Esto posiblemente
se deba a que el huésped humano presenta condiciones más favorables que
ayuden a la expresión de los genes de EPEC que codifican para la síntesis de sus
múltiples factores de virulencia como son eae y bfp. Las cepas EPEC “atípicas”
que no presentan bfp podrían ser menos virulentas que las “típicas”. Sin embargo,
no se ha demostrado que sean menos patogénicas. Algunos hallazgos en zonas
desarrolladas aportarían evidencia a favor de su participación como agentes
responsables de diarrea en niños y adultos. En brotes de gastroenteritis
transmitidos por agua y alimentos que ocurrieron en Japón se recuperaron cepas
EPEC “atípicas” (Yatsuyanagi y Saito, 2003). Estudios realizados en Reino Unido
mostraron una frecuencia mayor de recuperación de cepas EPEC “atípicas” que
de cepas “típicas” a partir de niños con gastroenteritis (Scotland y Smith, 1996).
En este estudio la categoría EPEC se logró identificar en mayor proporción en
muestras clínicas como en muestras de alimentos, estos datos coinciden con lo
reportado en el estudio de Oundo y Kariuki. 2008. Donde también encontraron, la
presencia de la categoría de EPEC en muestras clínicas. Pudiendo ser esta
categoría la causante de enfermedades diarreicas en Sinaloa, principalmente en
niños menores de seis meses y de dos años. Ya que estudios como el de Clarke y
Haigh 2003, sugiere que la categoría EPEC es uno de los patógenos principales
en los casos de diarrea infantil en países en vías de desarrollo, incluidos México,
así como países desarrollados como Estados Unidos, China y Japón. Esto sugiere
que en muestras clínicas la categoría de EPEC es la que se encuentra con mayor
frecuencia en el mundo.
La categoría de EAEC tuvo una frecuencia del (29%), hallazgo importante ya que
el escaso estudio que hay en México son enfocados EPEC, y con esto
demostramos que hay una alta frecuencia de EAEC, siendo este posible patógeno
causante de diarrea en nuestro país. La categoría de EAEC ha sido implicada
como el agente etiológico causante de diarrea no solo en países en desarrollo
81
como Brasil, sino también como una causa de brotes de gastroenteritis en algunos
países industrializados como Japón (Nessa et al., 2007).
La categoría de ETEC tuvo una frecuencia del (26%). En nuestro estudio no fue
categoría más frecuentemente aislada como si lo reportan otros estudios como lo
descrito por Nataro y colaboradores (1988) y (Nessa et al., 2007) donde
encontraron que la tasa de ETEC fue de 18,5 y 18%. Aun así la proporción
encontrada es muy similar a lo que reportamos en muestro estudio.
La ETEC ha sido implicada como la causa común de infecciones entre los turistas
que visitan Asia, África y América del Sur, y también como un agente causal de
diarrea en los niños en muchos países en desarrollo de Asia, África y América del
Sur (Nessa et al., 2007). Siendo este posible patógeno causante de diarrea en
México. Lo cual se explica por su mecanismo de patogenia, al tener las toxinas
termoestable (ST) y termolábil (LT). Está ultima tiene una gran homología a la
toxina colérica que produce diarrea profusa y deshidratación.
Por último la categoría de DAEC tuvo una frecuencia del (3%), no por esto deja de
ser un importante hallazgo en nuestro estudio, ya que en México se desconoce su
presencia y frecuencia. Resulta todavía más importante este hallazgo ya que se
sabe poco de su mecanismo de patogenicidad, la literatura describe que se ha
caracterizado una fimbria de superficie, conocida como F1845, involucrada en el
fenómeno de adherencia difusa (Bilge et al., 1989). Gracias a este estudio
podremos conocer más acerca de este patógeno su mecanismo de patogenicidad
realizando ensayos de adherencia en células Hep-2. El grupo DAEC se puede
aislar tanto de personas sanas como en personas con diarrea, siendo más
importante en niños de 4 a 5 años.
La incidencia de EPEC, EAEC, ETEC Y DAEC es mayor en el grupo de edad de
0-10 años, posiblemente se deba a que el sistema inmunológico se encuentra
inmaduro, y es más susceptible a contraer diferentes virus y bacterias, es decir,
82
durante los primeros años de vida, el sistema inmunitario está todavía en proceso
de maduración, lo que le hace estar menos preparado para combatir las posibles
infecciones. Esta sugerencia cobra fuerza ya que nuestro estudio no se
identificaron las categorías de E. coli diarreogénicas en los grupos de edad de 2130 años y de 31-50 años, posiblemente debido a que hay un mayor desarrollo de
la inmunidad. Otro hallazgo obtenido en este estudio es que las categorías de
EAEC Y ETEC fueron identificadas en los grupos de edad de 51-99 años, este
dato no resulta extraño debido a que está bien documentado que se produce una
alteración de la respuesta inmune asociada al envejecimiento.
En conclusión, las E. coli diarreogénicas son causa importante de diarrea en
niños en Sinaloa, sin embargo, su diagnóstico no se realiza como trabajo diario
en los laboratorios clínicos. Estos patógenos son altamente heterogéneos esta
idea se sustenta principalmente en que la mayoría de los factores de virulencia
en E. coli están codificados en elementos móviles como plásmidos y fagos
(Moseley et al., 1982), por lo que es posible que estos elementos genéticos
puedan transferirse de una categoría a otra. Por esta razón es necesario
complementar estudios de virulencia y variabilidad alélica, para comprender
mejor el rol de cada patógeno como causa de diarrea. A nivel nacional se
requieren estudios adicionales para determinar la prevalencia en otras regiones
de México, sobre todo en zonas rurales de la sierra y la selva, así como
estudios en casos graves de diarrea en niños hospitalizados, y trabajos que
permitan estudiar la transmisión de estos patógenos en muestras de animales,
agua y alimentos. Pero para lograr esto, es necesario el desarrollo y la
implementación de la técnica de PCR múltiple para la identificación de estos
patógenos mediante la identificación de sus factores de virulencia, permitiendo
con esto el ahorro de tiempo y esfuerzo, y esto ayudará a los investigadores
para aclarar el papel de E. coli diarreogénicas como agentes etiológicos de
enfermedades diarreicas en México.
En nuestro estudio para la identificación de E. coli diarreogénicas se utilizó la
técnica de PCR además del diseño de nuevos primers para la identificación de
83
estos patógenos, logrando la estandarizar de la misma. Esto sugiere que la PCR
es una prueba rápida, confiable e internacionalmente aceptada para la detección e
identificación de microorganismos patógenos presentes en alimentos y humanos
en comparación con las técnicas de identificación basadas en las características
fenotípicas de la bacteria ya que son laboriosas y puede requerir varias semanas
para obtener resultados. A pesar de las reservas existentes respecto a la
aplicación de la PCR en los alimentos, por la presencia de sustancias que puedan
ejercer un efecto inhibitorio sobre la reacción, existencia de tales inhibidores ha
sido reportada por varios autores (Fach et al., 2002, Nevas et al., 2002, Yamada et
al. 1999).
Concluimos que es de suma importancia que exista un control por parte de las
autoridades correspondientes en el ámbito de la salud y que se implementen
medidas necesarias para la prevención de la enfermedades transmitidas por los
alimentos a los humanos de lo contrario seguirán provocando pérdidas ya sean de
vidas o económicas por inhabilidad laboral. Deben tomarse precauciones al
preparar, manipular y almacenar los alimentos siguiendo prácticas sencillas de
higiene pero valiosas al momento de cuidar nuestra salud. Ya que bacterias como
E. coli diarreogénicas y otras de origen fecal, pueden llegar a los alimentos en
cuestión pudiendo afectar posiblemente la salud de los consumidores y
convirtiéndose en los vehículos ideales de estos patógenos a los humanos
causando enfermedades diarreicas no solo en Sinaloa, sino también en México.
84
XI. CONCLUSIONES
1. En las muestras de alimentos obtenidas del Estado de Sinaloa, se determinó
que el 8% presentaban E. coli y se detectó la presencia de cuatro categorías
(EPEC, STEC, EAEC y ETEC) de seis descritas a la fecha de E. coli
diarreogénicas.
2. Por grupo de alimento, se determinó que en Lácteos y Derivados se presentó
el mayor número de categorías de E. coli, identificándose a 3 categorías y a su
vez por alimento individual el queso fresco fue el alimento que presento la
mayor proporción de bacterias patógenas (31.4%) y de Categorías de E. coli
(EPEC, STEC y ETEC).
3. Existe una alta proporción de E. coli productoras de diarrea (26.4%) en
pacientes con diarrea aguda o persistente, en donde predomina E. coli
enteropatógena EPEC (típica).
4. En el grupo de edad de 0-2 años se identificaron la mayor presencia de
categorías de E. coli, presentándose las tres categorías (EPEC, EAEC Y
ETEC).
5. Existen patógenos potenciales de E. coli diarreogénicas (EPEC, ETEC, EAEC
y STEC) en alimentos que se consumen, venden y distribuyen en Sinaloa con
una frecuencia de 1.1% (54/5162), lo cual correlaciona con la presencia de
estos patógenos en humanos (EPEC, ETEC, EAEC y DAEC), pero con una
frecuencia mayor 26.4% que en alimentos.
6. En muestras clínicas las categorías de EPEC, ETEC y EAEC fueron
detectadas a lo largo del estado de Sinaloa. mientras que en muestras de
alimentos se identificaron estas misma categorías y STEC pero solo de la
parte centro y norte del estado de Sinaloa.
85
7. La presencia de cepas diarreogénicas de E. coli EPEC, STEC, EAEC Y ETEC
en los grupos de alimentos, podrían jugar un papel importante en casos de
diarrea presentes en Sinaloa y son un indicador directo de la calidad higiénicosanitaria de los alimentos que circulan en el Estado de Sinaloa.
86
XII. PERSPECTIVAS
1.
Identificar las categorías E. coli causantes de diarrea y el posible serotipo
O157:H7, con la ayuda de PCR. En muestras clínicas del año 2010 y 2011
y en diversos alimentos en el año 2009.
2.
Realizar ensayos de adherencia en células Hep-2 de las cepas de E. coli
diarreogénicas de los años 2007, 2008, 2009,2010 y 2011.
3.
Serotipificar las cepas aisladas de muestras de alimentos de los años 2007,
2008 y 2009. y las de cepas aisladas de muestras clínicas de los años
2008, 2009, 2010 y 2011.
4.
Ensayos de Resistencia antibiótica de las E. coli diarreogénicas
identificadas en los años 2007 al 2011.
87
XIII. REFERENCIAS
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children from northern Jordan.
100
ANEXOS
Anexo 1. MEDIOS DE CULTIVO
A. AGAR SOYA TRIPTICASA (TSA).
1. FUNDAMENTO.
La combinación de caseína y peptona de soya en agar de soya tripticasa hacen al
medio altamente nutritivo por suministro de nitrógeno orgánico, particularmente
los aminoácidos y péptidos de cadena más larga. El cloruro de sodio mantiene el
equilibrio osmótico. Es usado para el aislamiento y cultivo de microorganismos
fastidiosos y no fastidiosos, incluyendo bacterias anaerobias y aerobias.
2. FÓRMULA.
Digerido pancreático de caseína
15.0
g
Digerido papaico de harina de soya
5.0
g
Cloruro de sodio
5.0
g
Agar
15.0 g
pH final..... 7.3  0.2
B. AGAR MACCONKEY
1.
FUNDAMENTO.
Es un medio de plaqueo diferencial para la selección
y recuperación de
Enterobacteriaceae y bacilos Gram negativos entéricos relacionados. Las sales
biliares y el cristal violeta inhiben el crecimiento de bacterias Gram positivas y de
algunas bacterias Gram negativas exigentes.
101
La lactosa es el único hidrato de carbono. Las bacterias fermentadoras de lactosa
producen colonias que tienen distintos tonos de rojo, debido a la conversión del
colorante indicador rojo neutro (rojo con pH por debajo de 6.8) por la producción
de ácidos mixtos.
Las colonias de bacterias no fermentadoras de la lactosa aparecen sin color y
transparentes.
2. FÓRMULA.
Peptona
17.0 g
Polipeptona
3.0 g
Lactosa
10.0 g
Sales biliares
1.5 g
Cloruro de sodio
5 g
Agar
13.5 g
Rojo neutro
0.03 g
Cristal violeta
0.001 g
Agua destilada
1, L
pH final= 7.1
Anexo 2.
A. PREPARACIÓN BUFFER TAE 50X
Agua HPLC
250 mL
2 M tris base
60 g
2 M Ac. Acético
50 Mm EDTA
14,27 mL
4,65g
Colocar todos los componentes en un matraz, disolver, ajustar pH a 8,5.
Esterilizar, etiquetar y guardar en refrigeración.
102
B. PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN TAE 1X
Colocar 7 mL de TAE 50 X más 343 mL de agua HPLC en un matraz y disolver
perfectamente. Etiquetar y guardar en refrigeración.
C. PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN BUFFER DE LISIS
KCl 50 mM
372,5 mg—0,375 g
Tris-HCl 10 Mm
157,6 mg—0,1576 g
MgCl2 1,5Mm
14,26 mg-0,01426 g
Tween-20 0,45 %
450 l
Agua destilada
100 mL
pH 8,5
Pesar Tris-HCl y disolverlo en los 100 mL de agua, ajustar el pH de la solución
hasta llevarlo a 8,5, posteriormente adicionar a la solución los demás
componentes.
Esterilizar nuestra solución por medio de filtración con membrana (con una
porosidad de 45 l). Depositar nuestra solución en un recipiente estéril. Etiquetar y
almacenar en congelación.
D. PREPARACIÓN DE AGAROSA 2 %
Agarosa
0,4 g
TAE 1X
20 mL
Pesar la agarosa y disolver en 20 mL del TAE 1X, disolver y calentar la solución en
una placa de calentamiento moviendo constantemente hasta ebullición. Retirar el
matraz de la placa, esperar unos segundos y utilizar.
E. PREPARACIÓN DE BROMURO DE ETIDIO
Solución stock bromuro de etidio (10 mg/mL) 5 l
Agua HPLC
100 mL
103
F. PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN STOCK BROMURO DE ETIDIO
Tomar una presentación sólida (bolita) del bromuro de etidio la cual tiene una
concentración de 10 mg, y suspenderla en 1 mL de agua.
C1V1 = C2V2
C1 = 10000 g/mL
C2 = 0,5 g/mL
V1 = C2V2 = (0,5 g/mL)(100 mL) = 0,005 mL V1 = 5 l
V2 = 100 mL
C1
10000 g/mL
V1 = ?
En 100 mL de agua HPLC colocar 5 l de la solución stock de bromuro de etidio.
Esta solución nueva colocarla dentro de un recipiente de plástico con tapa
hermética. Cubrirlo con papel aluminio protegiéndolo de la luz y colocarlo en un
lugar apropiado.
G. PREPARACIÓN DE ALCOHOL ETÍLICO AL 70 %
Alcohol etílico
70 mL.
Agua destilada
30 mL.
Mezclar el agua con el alcohol y depositarla en una piceta. Etiquetar y almacenar a
temperatura ambiente.
104