Download Electroforesis horizontal (agarosa)

ELECTROFORESIS DE
AGAROSA
José A. Cardé, PhD
Lab Biol 3306-Genética
Universidad de Puerto Rico-Aguadilla
OBJETIVOS
Luego de haber completado el ejercicio, los estudiantes
estarán capacitados para:
1. Distinguir entre una electroforesis utilizando geles de
poliacrilamida y una electroforesis utilizando geles de
agarosa.
2. Explicar los diferentes parámetros que influyen en la
separación de los fragmentos de DNA.
3. Preparar un gel de agarosa y separar fragmentos de DNA
en el mismo.
4. Estimar el peso molecular de los fragmentos de DNA
productos de la digestión con endonucleasas de restricción.
Introducción
ELECTROFORESIS:
Separación y análisis de macromoléculas
(Proteínas, ADN/ARN) en una matriz gelatinosa al
aplicarles un campo eléctrico
Arne Tiselius
1937
(Nobel 1948)
Moléc. +  cátodo (-)
Moléc. -  ánodo (+)
cátodo
ánodo
SOPORTE
+-
ELECTROFORESIS –
CSHL-DNLC
Animación
FACTORES QUE AFECTAN LA MOBILIDAD
1 Campo eléctrico
Diferencia de potencial (V-voltios): bajo voltaje (10-500
V)
Intensidad (A-amperios): flujo de carga eléctrica.
- depende de V y de R.
- Resistencia: determinada por el soporte.
2 Muestra
Carga o densidad de carga: carga eléctrica/masa de la
molécula
Tamaño: debido al poro de la matriz.
Forma: forma globular vs lineal: avanza más.
FACTORES QUE AFECTAN LA MOBILIDAD
3 Amortiguador
- pH: determina el grado de solvatación y la carga de
las moléculas
generalmente es ligeramente básico  moléculas - Fuerza iónica: generalmente 0.05 o 0.1 M para que no
interfiera
4 Soporte o Matriz
- Adsorción
- Porosidad molecular
- inversamente proporcional a la concentración
Matrices Electroforéticas
Características:
 Gel poroso (tridimensional interno).
 Tiene que permitir el paso de moléculas.
 NO puede estar cargado.
Matriz del gel
Tipos de Soporte (no restrictivo o restrictivo):
no restrictivo (grupo I): papel, almidón, agar, acetato de celulosa.
* poro >>> proteínas.
* separación sólo por CARGA
Electroforesis
de proteínas
Electroforesis
de DNA/RNA
restrictivo (grupo II): acrilamida
* poros = proteínas
* separación por CARGA y TAMAÑO
restrictivo (grupo II): acrilamida, agarosa
* poros = moléculas de DNA/RNA
* separación sólo por TAMAÑO
PAGE – Gel de Poliacrilamida:
Proteinas 0 ácidos Nucleicos
Soporte: (restrictivo)
* Geles de Agarosa  moléculas grandes (0.1-60 kpb)
* Geles de Poliacrilamida  moléculas pequeñas (6-2000 pb)
Electroforesis vertical
Ventajas:
* Gran poder de resolución por
CARGA y por TAMAÑO.
* Químicamente inertes.
* Transparentes (densitograma).
* Estables (pH, fuerza iónica,
temperatura).
* Versatilidad en cuanto al tamaño
de poro.
Aplicaciones:
 Separar proteínas
 Determinar peso molecular de una
proteína
SDS-PAGE
Electroenfoque
 Separar proteínas en función de su pI
 Ver si hay una proteína en concreto
Western Blot
Gel de Agarosa – ácidos Nucleicos
Soporte: (restrictivo)
* Geles de Agarosa  moléculas grandes (0.1-60 kpb)
* Geles de Poliacrilamida  moléculas pequeñas (6-2000 pb)
Electroforesis horizontal (agarosa)
Separación por TAMAÑO
Densidad de carga igual para
todas las moléculas por los
grupos PO4Buena separación, pobre
resolución
GELES DE AGAROSA
Aplicaciones:
 Separar, identificar y purificar fragmentos de
DNA o RNA.
 Determinar tamaño de un fragmento de DNA.
Geles de agarosa
 Separación de cromosomas enteros
 Secuenciación de DNA.
Geles poliacrilamida
 Identificación de regiones de unión a proteínas.
 Detectar la presencia de un gen (o secuencia
específica de DNA) en una muestra.
Southern Blot
 Determinar si se expresa un gen específico
Northern Blot
GELES DE AGAROSA
Electroforesis horizontal
muestra (-)
-
+
Campo eléctrico (DV)
1. Preparar el gel.
2. Aplicación de la muestra.
3. Electroforesis.
4. Detección por tinción con
Bromuro de Etidio (BrEt):
se intercala en el DNA y al
irradiarlo con luz UV emite
fluorescencia.
SOUTHERN BLOT
* Interacción DNA-DNA (complementación).
* Detectar en una mezcla de DNAs una secuencia de DNA
específica (muy sensible).
* Detectar la presencia de un gen, etc.
4. Revelado
1. Electroforesis en geles de
agarosa
moléculas
de DNA
DNA
interés
e-
32P
2. Transferencia a
membrana
moléculas
de DNA
5. Resultado
3. Hibridación con la sonda
radioactiva
Sonda
de DNA
Gel Agarosa
Southern BLOT
Todas los
DNA
DNA
de interés
32P
…TAACGT…
…ATTGCA…
DNA
interés
NORTHERN BLOT
* Interacción RNA-DNA (hibridación).
* Detectar en una mezcla de RNAs una secuencia de RNA
específica (muy sensible).
* Expresión génica.
4. Revelado
1. Electroforesis en geles de
agarosa
2. Transferencia a
membrana
moléculas
de RNA
e-
32P
moléculas
de RNA
Resultado
3. Hibridación con la sonda radioactiva
Sonda
de DNA
RNA
interés
Gel Agarosa
Northern BLOT
Todas los
DNA
RNA
de interés
32P
…TAACGT…
…AUUGCA…
RNA
interés
Determinación de Peso Molecular
Marcadores de peso
molecular:
* Mezcla de diferentes
proteínas pre-teñidas de las
que conocemos el peso
molecular.
* Por comparación y
extrapolación podemos
averiguar el PM de nuestra
proteína.
PESO MOLECULAR: COMO DETERMINARLO?
- Es necesario correr, junto a las muestras de interés
un marcador molecular estándar.
- Este posee de 5 a 10 fragmentos de DNA a los cuales
se les conoce el peso molecular.
- Existe una relación lineal entre el logaritmo del
- peso molecular de las moléculas y la distancia
recorrida en el gel.
- Se crea una curva estándar con distancia de
migración en X y el log10 del peso molecular de los
fragmentos de DNA en Y
- Usando esa curva extrapolar el peso molecular de
aquellos fragmentos de DNA en estudio.
Para crear la curva estándar es necesario:
1) Medir la distancia desde el punto de partida (fosas) del
marcador hasta cada una de las bandas observadas en el
marcador. Estos van en el eje de X.
2) Determinar el log10 del peso molecular de los fragmentos
de DNA que se encuentran en el marcador estándar. Estos van
en el eje de Y.
3) Unir los puntos con un “best fit line”
4) Utilizar la distancia recorrida por las muestras
desconocidas y extrapolar a la línea recta, determinar el log 10
del peso y buscar el log inverso para determinar tamaño en bp.
GEL DE AGAROSA:
PESO MOLECULAR
PREPARACION DE GEL
Preparación del gel de agarosa al 1%
1.Pesar 0.5-0.8 g de agarosa y colocarlos en un matraz de 200
2.Añadir 50-80 ml de amortiguador de la corrida (TBE 1X), se
verá turbia.
3.Cubrir el matraz con un pedazo de papel de aluminio (o
“saran wrap”) para evitar la evaporación al calentar.
4.Calentar la mezcla hasta que se disuelva la agarosa
(hornillas, microondas), se verá transparente.
5. Remover el matraz y dejarlo enfriar hasta ~ 65 ºC.
6.Añadir 2 µl de bromuro de etidio (10 mg/ml).
Preparación de la camara y la Gel
1.
Limpiar y secar el molde y la cámara para la gel.
2.Sellar molde para la gel con cinta adhesiva, o según recomienda
el fabricante. Asegurarse que este bien bien sellada
3.Verter la agarosa (previamente derretida, ahora tibia) en el
molde de electroforesis previamente preparado.
4.Añadir 2 µl de bromuro de etidio (10 mg/ml). Colocar el peine.
5.Esperar 15-20 min a que se solidifique, colocarla en la cámara
de amortiguador.
6.Remover el peine y los sellos.
7.Añadir buffer de corrida (TBE/TAE) hasta cubrir los pozos
completamente.
Preparación de Muestra
Preparación de la Muestra
1.Coloque 20 µl de la muestra de DNA cortado con las
endonucleasas de restricción en un microtubo de 500 µl.
2.Añada la cantidad predeterminada de de amortiguador de la
muestra (“loading buffer”) al mismo tubo.
3. Coloque 10 µl de la muestra del DNA sin cortar con las
endonucleasas de restricción en un microtubo de 500 µl. Añada
la cantidad predeterminada de amortiguador de la muestra.
4.Coloque 5-7 µl de DNA estándar.
5.Sedimente las mezclas centrifugando por 30 segundos.
6.Coloque los dos tubos en hielo hasta que vaya a colocar las
muestras en el gel.
SERVIR MUESTRAS Y CORRIDA
1. Usando pipetas de 2-10 o de 10-100 servir las
muestras en el orden predeterminado
1. Moléculas estándar en carriles estratégicos
2. Muestras desconocidas en carriles
correspondientes
2. Colocar la tapa del tanque de electroforesis y
conectarla a la caja de electricidad. Verificar que los
polos estén correctamente conectados. Encender la
caja.
3. Correr la electroforesis a 50-80 V por 40- 75 minutos.
Observación de Resultados
1. Apagar la caja de electricidad.
1. Remover la gel cuidadosamente
3. Observarla sobre lámpara luz ultravioleta,
fotografiarla.
3. Utilizando una regla, medir las bandas para luego
preparar la curva de log10 del peso molecular vs
distancia.
3. Descartar buffer y la gel de acuerdo a las medidas
correspondientes.
PREGUNTAS
1. Que es resolución? Como se mejora en una gel?
2. Como se cambia el tamaño del poro en una gel?
3. Cuales son los componentes del buffer de corrida?
Su importancia?
4. Cuales son los componentes del buffer de
muestra? Su importancia?
5. Cual es el uso del los marcadores estándar de
peso molecular?
6. En que se parecen y en que difieren el Southern
Blot del Northern Blot? Que pregunta de
investigación contesta cada uno?
REFERENCIAS
Alberts, et, al., (2014). Essential Cell Biology, 3rd Ed, Garland Science Publishing. New York.
Brooker, Robert J. (2014). Genetics Analysis & Principles. (Quinta Edición). New York,
McGraw-Hill Companies, Inc.
Electrophoresis at DNA Learning Center, Cold Spring Harbor Laboratory (Animation)
Agarose Gel Electrophoresis of DNA at Colorado State University
Agarose Gel Electrophoresis of Plasmid DNA at Addgene
Agarose Gel Electrophoresis (PDF)
Agarose Gel Electrophoresis in You Tube by BioRad Laboratories