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MARCADORES MOLECULARES
PRACTICA No 4
ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA
1. Objetivo
Adiestrarse en el empleo de técnicas usadas para evaluar la calidad y la cantidad de
ADN o cualquier producto amplificado, que permitan determinar en un futuro la
cantidad estándar de la muestra que debe ser utilizada en el protocolo de la PCR.
2. Fundamento
Para evaluar la calidad del ADN o cualquier producto amplificado por PCR, se emplea
una electroforesis en gel de agarosa. La electroforesis es un método analítico en el
que se separan biomoléculas, bajo la acción de un campo eléctrico; fue empleado por
primera vez por Tiselius en el año 1937. La electroforesis es la migración de solutos
iónicos en una matriz tamponada sometida a un campo eléctrico; las partículas migran
hacia el cátodo o ánodo (electrodos - y +), dependiendo de la combinación de su
carga, peso molecular y estructura tridimensional. Puesto que la matriz actúa como
un filtro, los fragmentos menores migran más rápidamente en dirección al polo
positivo, mientras que los de mayor longitud migran más lentamente.
La agarosa se extrae del agar, gelifica a temperaturas comprendidas entre 32 - 45 ºC y
funde a temperaturas entre 80 - 95 ºC. Es un producto natural que forma una matriz
inerte, por lo que es posible fijar a su estructura proteínas tales como enzimas,
antígenos o anticuerpos. La ausencia de toxicidad que presenta la hace muy cómoda
para el trabajo y actualmente es una herramienta imprescindible para la separación de
ácidos nucleicos.
Para visualizar el ADN o el producto amplificado en el gel de agarosa, se utiliza el
Bromuro de Etidio, que es un colorante fluorescente que contiene un grupo planar que
se intercala entre las bases de la molécula de DNA de doble cadena en el gel y puede
ser visualizado en un transiluminador de luz UV.
3. Procedimiento
Se va a preparar un gel de agarosa al 1.4%, y se van a correr las muestras de
amplificación del gen Ryr1, extraídas con anterioridad
3.1 Preparación del Gel:
En el Anexo 1 se presenta una relación de las cámaras de electroforesis
horizontales disponibles en el laboratorio, como guía para preparar geles de
diferente volumen y concentración.
Preparación de 100ml de solución de agarosa al 1.4%
En un beaker o matraz de volumen adecuado pesar 1.4g de agarosa para
electroforesis.
Agregar 100 ml de TBE 0.5X
Calentar hasta que la agarosa este disuelta, sin dejar hervir
Dejar enfriar un poco sin dejar coagular
Agregar 2ul de bromuro de etidio a la solución
Preparar la cámara de electroforesis con el peine.
Servir, dejar enfriar-solidificar por 20 minutos.
3.2 Corrida del Gel
Una vez fría y sólida la solución, desmontar el peine y agregar una cantidad
suficiente de TBE 0.5X de modo tal que sobrepase 1mm por encima del gel.
Preparar las muestras a correr con su respectivo buffer. 4uL de muestra + 2uL
de buffer de corrida.
Servir las muestras en cada pozo.
Servir el marcador de Peso/Masa
Conectar la fuente de poder y a 70 voltios por 1 hora.
3.3 Visualización del Gel
Después de corrido el gel a voltaje y tiempo establecidos por el investigador, el
DNA puede ser visualizado sometiendo el gel a luz ultravioleta, debido a la
presencia del Bromuro de etidio, agente que produce luminiscencia.
PRECAUCIÓN: El Bromuro de etidio es una sustancia
altamente mutagénica y cancerígena. Use protección
adecuada y elimine los guantes después de su
manipulación.
MATERIALES PARA EL LABORATORIO
REACTIVOS:
Electroforesis en gel de Agarosa al 1.4%
Agarosa para electroforesis
Buffer de Corrida: TBE 0.5X. Se usa para llenar el tanque de la cámara.
Preparación del buffer concentrado 10X
Buffer TBE 10X (1000 ml de solución)
Trisma Base
Ácido Bórico
EDTA 0.5 M
108 Gr
55 gr
40 ml
Buffer de carga: Proporciona densidad a la muestra, permitiendo que caiga al fondo
del pozo. A su vez, este posee un agente que permite visualizar el frente de corrida.
(Azul de Bromofenol). Se usa aproximadamente en una proporción 10% del volumen
de muestra a cargar.
Buffer de carga
Azúl de Bromofenol
0.025%
Glicerol
60%
Agua destilada
30 ml
Marcador de Peso/ Masa de 50 pb
Solución de Bromuro de Etidio al 0.01%
Bibliografía
1. Alpenfels WF, Engelhorn S, Manis D inventor; Novel Experimental Technology,
assignee. Plastic mold for electrophoresis gel. US patent 5,753,095. 1998 May
19.
2. Gaal O, Medgyesi GA, Vereczkey L. Electrophoresis in the separation of
biological macromolecules. Akademiai Kiado Budapest and John Wiley & Sons.
1984
3. Sambrook J., Fritsch E.F, Maniatis T. Molecular Cloning. A Laboratory Manual.
Second Edition. 1989.
4. Sheer DG, Yamane DK, Hawke DH, Pau-Miau Yuan. The use of micro
preparative electrophoresis of protein/peptide isolations for primary structure
determinations. Peptide Research. 1990; 3 (2)
ANEXO 1. Cámaras De Electroforesis Horizontal
Cantidad Agarosa
Cámara
Volumen
0.80%
1.20%
1.40%
CBS Scientific MGU-152T
18 ml
0,144 gr 0,216 gr 0,252 gr
EC Maxicell EC340
200 ml
1,6 gr
2,4 gr
2,8 gr
CBS Scientific SGE-020-02 (Gel mediano)
200 ml
1,6 gr
2,4 gr
2,8 gr
CBS Scientific MGU-202T
30 ml
0,24 gr
0,36 gr 0,42 gr
CBS Scientific SGE-020-02 (Gel grande)
300 ml
2,4 gr
3,6 gr
Fisher Biotech FB-SB-710
40 ml
0,32 gr
0,48 gr 0,56 gr
Biorad Wide Mini-sub Cell GT
80 ml
0,64 gr
0,96 gr 1,12 gr
4,2 gr