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Biología Molecular
Temas:
7.9 Hibridacion de sondas tipo Southern
7.10 Hibridacion de sondas tipo Northern
Alumno:
José Ulises Montes Amparán.
 Comprender los conceptos y principios básicos de la
hibridación de ácidos nucleicos.
 Explicar los procedimientos de la hibridación tipo
Souther para la identificación de genes y genomas, así
como aplicaciones en diferentes campos y actividades
humanas.
 Explicar los procedimientos de la hibridación tipo
Northem para analizar la expresión de genes, así como
aplicaciones en diferentes campos y actividades
humanas.
 Considerar que las técnicas se basan en metodologías
inflexibles, siendo que éstas son adaptadas a la muestra que
es analizada y a las posibilidades de quien las practica.
 No comprender la naturaleza y propiedades de los ácidos
nucleicos.
 No comprender los fundamentos de la hibridación. molecular.
 No tener clara la diferencia entre métodos de marcaje y
pensar que sólo un tipo de técnica es útil para un propósito
particular.
 Hibridización: Formación de dúplex a partir de cualquier
combinación de ácidos nucleicos.
 Estringencia: Son las condiciones a las cuales
desarrolla la hibridización y la detección del duplex.
se
 Baja estringencia: Permite mayor cantidad de hibridación
pero con menor especificidad (baja temperatura, alta
concentración de sales).
 Alta estringencia: Menor cantidad de hibridación pero
mayor especificidad.
 Copia única: Secuencia de DNA que se encuentra una sola
vez por genoma.
 DNA repetido: Secuencias presentes en más de una copia.
 Dúplex: Estructura de ácidos nucleicos de doble cadena.
 Desnaturalización: Proceso por el cual se generan cadenas
sencillas a partir de un dúplex.
 Reasociación/Renaturalización: Unión de dos secuencias
complementarias por medio de apareamiento de bases.
 Temperatura.
 La concentración de sales.
 Bases no complementarias.
 Longitud del fragmento.
“Es importante tomar en cuente estos factores ya que las
condiciones optimas no son las mismas para cada
experimento.”
 Son oligonucleótidos sintéticos, cDNA, fragmentos de
DNA
genómico
o
RNA
de
cadena
sencilla
complementarias a la región de DNA o RNA blanco.
 Contienen alguna “marca” que
revela su unión
(hibridación) a la secuencia elegida, generalmente se
trata de P32.
 El método tipo Southern o Southern blot fue
desarrollado por E. M. Southern en 1975 para la detección
de genes específicos en el ADN celular.
El ADN es digerido con una
enzima de restricción y los
fragmentos son separados por
tamaños
mediante
una
electroforesis en un gel.
Las bandas de DNA se
visualizan por tinción y se toma
fotografía.
El DNA del gel se fragmenta con HCl y se
desnaturaliza con NaOH.
Posteriormente, el ADN inserto en el gel es
transferido a un filtro de nitrocelulosa, con lo
que en el filtro queda representada una
réplica de la disposición de los fragmentos de
ADN presentes en el gel. .
A continuación el filtro se incuba con la sonda marcada
(radiactivamente o con un fluorocromo); durante la
incubación la sonda se va hibridando a las moléculas de ADN
de cadena sencilla de secuencia complementaria (o muy
parecida).
La sonda unida al fragmento de ADN complementario se
puede visualizar en el filtro de una forma sencilla mediante
una exposición a una película de rayos X para el caso de
sondas radiactivas o con una película sensible a la luz, para
el caso de sondas con fluorocromo
 Caracterizar la identidad de genes específicos.
 Identificar fragmentos de DNA que contienen un gen determinado,
entre una mezcla de muchos fragmentos.
 Investigar la organización molecular de las secuencias genómicas.
 Detectar reorganizaciones y duplicaciones en genes asociados a
enfermedades genéticas humanas y a cáncer.
 Detección de restriction site polymorphism (RSP).
 Detección de mutaciones puntuales mediante RFLP
 El método, tipo northern o northern blot, se utiliza para
identificar ARN a diferencia de l metodo Southern que se
utoliza para identificar ADN.
 Las moléculas de RNA son separadas por electroforesis en
geles desnaturalizantes.
 Las bandas de RNA y marcadores de peso molecular se
visualizan por tinción y se toma fotografía.
 Los bandas del gel se transfieren a membranas de nylon.
 La membrana se seca y se fija.
 Se aplica la sonda previamente marcada.
 Se permite la hibridización a diferentes condiciones de
estringencia en buffer desnaturalizante.
Detecta la presencia de
RNA de uno o varios
tipos celulares o
tejidos,
complementario a la
sonda.
 Proporciona información de la presencia de un transcrito de
RNA complementario a la sonda.
 Es posible examinar patrones de expresión génica.
 Permite detectar cortes y empalmes del mRNA y múltiples
tipos de transcritos provenientes de un solo gen.
 Es posible caracterizar y cuantificar
transcripcional de un gen determinado.
la
actividad
 Alberts, Bruce; Johnson, Alexander; Lewis, Julian; Raff, Martin; Roberts,
Keith; Walter, Peter. Molecular Biology of the Cell. Cuarta edición. New
York. Garland Publishing. 2002.
 Lodish, Harvey; Berk, Arnold; Zipursky, S. Lawrence; Matsudaira, Paul;
Baltimore, David; Darnell, James E. Molecular Cell Biology. New York.
W. H. Freeman & Co. 2000.
 Cooper, Geoffrey M. The Cell – A Molecular Approach. Segunda edición.
Sunderland (MA). Sinauer Associates, Inc. 2000.
 scsie.uv.es/chipsdna/IntroduccionUV-2.pdf
 www.gfmer.ch/Educacion_medica_Es/Pdf/Analisis-geneticamolecular.pdf