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NORTHERN BLOT
NORTHERN BLOT
 Es una técnica de detección de
moléculas de ácido ribonucleico
(ARN) de una secuencia dada
dentro de una mezcla compleja.
• Este método se utiliza muy
frecuente para realizar estudios
de expresión génica.
•
El procedimiento usado en el
Northern bloot es exactamente el
mismo que el del Southern bloot ,
con la diferencia de que el
Northern bloot busca secuencias
en el ARN en vez del ADN
 La técnica consiste en extraer el RNA de las células
pertinentes y su posterior separación por tamaño
mediante electroforesis en gel. Las moléculas de
RNA son transferidas y unidas al filtro, al igual que
en el Southern blot. Después de la hibridación con
una sonda marcada (y posterior a la detección según
el método de marcaje utilizado), las bandas en el gel
indican la ubicación de los tipos de RNA que sean
complementarios a la sonda. Teniendo marcadores
de RNA de tamaño adecuado, se puede conocer el
tamaño de los RNA que se han identificado.
1.Extraccion del RNA
 Se extrae una muestra
de ARN ,“debe tenerse
mucho cuidado para
impedir la degradación
por las ribonucleasas
(ARNasas )para esto las
células y tejidos que
contienen ARN se
homogenizan en una
solución que contenga
inhibidores de ARNasas ,
como el agente
enofropico
isotiacianato de
guanidinio.
Lisis con tiocianato de guanidina →
inactivación de RNasas.
Partición de DNA, RNA y proteínas
en fenol ácido (pH 5-6).
Precipitación con isopropanol +
LiCl2.
 Luego se separa el ADN del ARN y finalmente el ARN
purificado se precipita con etanol. Para el caso del ARN
mensajero se aprovecha la propiedad de que posea cola
de poli-A; en el primer paso el ARN celular total se pasa
por una columna que posee poli-dT unido a una fase
sólida quedando el ARN retenido en fase sólida cuando
se únela poli-dT quedando excluido el resto de ARN
celular.
 Se desnaturalizan la muestra, a menudo la totalidad del
ARN celular, mediante tratamiento con un agente que
puede ser formamida o glioxal, que impide unión por
puente de hidrógeno entre los pares de bases, lo cuál
asegura que todas las moléculas de ARN presenten una
conformación lineal no plegado.
2.Electroforesis
Se separan los ARN de acuerdo con
su tamaño, mediante electroforesis
en gel.
La electroforesis es un método de
laboratorio en el que se utiliza una
corriente eléctrica controlada con la
finalidad de separar biomoléculas
según su tamaño y carga eléctrica a
través de una matriz gelatinosa.
Se usa la electroforesis en gel de
agarosa
3.Transferencia a una membrana
Existen 2 tipos de membranas
a) NITROCELULOSA
• baja capacidad de unión de ácidos nucleicos (80 μg/ cc2)
• frágil
• carga negativa
b) NYLON
• mayor capacidad de unión (400-500 μg/cc2 )
• mayor resistencia
• carga neutra o positiva
Es necesario inmovilizar el RNA en la membrana y esto
se puede conseguir a través de dos maneras:
a) Horno de vacío
Aplicable sólo a membranas de nitrocelulosa
La membrana es tratada por 2 horas a 80 ºC. Al parecer el
RNA forma enlaces hidrofóbicos con la membrana.
b) Irradiación UV
Aplicable sólo a membranas de nylon
La exposición a la luz UV activa las bases T/U haciéndolas
altamente reactivas con los grupos amino de la superficie de la
membrana y formando enlaces covalentes. Aumenta la
estabilidad y permanencia de los ácidos nucleicos en la
membrana
4.GENERACION DE UNA SONDA
Las sondas son fragmentos
monocatenarios de DNA o
RNA marcados con una
molécula reporter, que
pueden ser enzimas,
sustratos antigénicos,
radioisótopos, los que se
pueden unirse con una alta
especificidad a una
secuencia complementaria
de ácido nucleico de cadena
sencilla (diana), a fin de
hacer posible su posterior
detección y de esta manera
la identificación de la
secuencia de ARN de
interés.
5.Hibridacion
 Éste es un proceso de complementación de pares de
bases entre dos hebras sencillas de ADN y ARN, o ARN s
pero cuyo origen es distinto; cuyo fin principal es
conseguir la máxima interacción entre la sonda y la
molécula de ácido nucleico que se quiere detectar.
 PROCEDIMIENTO
La hibridación se lleva a cabo en tres etapas:
a) Pre –Hibridación
b) Hibridación
c) Lavados
Pre Hibridación o bloqueo
¿Por qué?
– La membrana une ácidos nucleicos ,la sonda marcada puede
unirse de forma inespecífica y aumentar el ruido
• ¿Cómo?
– La membrana es incubada con una solución de prehibridación
a la temperatura de hibridación.
– La solución de pre-hibridación contiene compuestos que se
unen inespecíficamente a la membrana previniendo la unión de
la sonda a regiones de la membrana que no contienen su
hebra complementaria.
Hibridación
Se expone el filtro a una zona de ADN con marca radiactiva con la
cuál se produce una hibridación ya que dicha sonda es
complementaria al ARN.
La cadena de mRNA que se quiere cuantificar se une con la sonda
complementaria se hibridizan de forma antiparalela, para forman
una molécula de doble cadena.
Esto se logra sumergiendo la membrana de fijación en un buffer que
contiene la sonda.
Lavado
Al final del período de hibridización, se debe retirar el buffer de
hibridización y lavar los filtros para remover la sonda que está en
exceso, unida de manera inespecífica o unida con poca
complementariedad. Esto se lleva a cabo incubando la membrana
en una solución que carece de sonda marcada y utilizando
condiciones que minimizan la hibridación inespecífica(Estrictez)
 *ESTRICTEZ
 Una medida de la
habilidad de un
ac.nucleico de hebra
simple (sonda) de
discriminar entre
moléculas con las que
comparte un alto o un
bajo grado de
complementariedad
 Para lograr una meyor
estrictezse debe aumentar
la Tº,incluir
formamida,etc
6.Visualizacion
•Captura de la radiación ionizante
por una emulsión
fotográfica
• La membrana es expuesta a un
film por tiempos variables
• El film es revelado y analizado
APLICACIONES
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Esta técnica se ha aplicado en:
Se utiliza para detectar la presencia de moléculas específicas de ARN en una
muestra específica.
Proporciona información sobre moléculas que hibridan. Por ejemplo, su tamaño
molecular.
3.Se usan generalmente para caracterizar la identidad de genes específicos, para
localizar regiones codificantes o regiones reguladoras flanqueantes en secuencias
clonadas. Por ende, sirve para investigar la organización molecular de las
secuencias genómicas.
4.Se utiliza para examinar patrones de expresión génica en tejidos embrionarios y
en adultos.
5.En la detección de cortes y empalmes alternativos del ARNm.
6.También se aplica en la detección de múltiples tipos de transcritos proveniente
de un solo gen.
La transferencia de NORTHERN se utiliza también para caracterizar y cuantificar
la actividad transcripcional de un gen determinado en distintas células, tejidos u
organismos.
Es de suma importancia en el estudio de la modulación de la síntesis de
interleucina 6 en pacientes con artritis reumatoide.
De su análisis se rescata la secuencia y organización molecular.
Es indispensable en el análisis de expresión de receptores que participan en la
síntesis de moléculas en cultivos celulares.
5.En la detección de cortes y empalmes alternativos del
ARNm.
6.También se aplica en la detección de múltiples tipos de
transcritos proveniente de un solo gen.
7.La transferencia de NORTHERN se utiliza también para
caracterizar y cuantificar la actividad transcripcional de un
gen determinado en distintas células, tejidos u organismos.
8.Es de suma importancia en el estudio de la modulación de la
síntesis de interleucina 6 en pacientes con artritis
reumatoide.
9.De su análisis se rescata la secuencia y organización
molecular.
10.Es indispensable en el análisis de expresión de receptores
que participan en la síntesis de moléculas en cultivos
celulares.
VENTAJAS Y DESVENTAJAS
VENTAJAS Y DESVENTAJAS
Ventajas
-La muestra de ARN requiere un mínimo de procesamiento.
-La técnica puede ser fácilmente evaluada (degradación, límite de detección).
-Nos permite reconocer el análisis de mutaciones y alteraciones del RNAm de
enzimas, y en la regulación de la expresión génica de marcadores moleculares de
células leucémicas humanas y moléculas del reconocimiento inmunológico.
DESVENTAJAS
-El costo elevado de su elaboración.
-La reproducibilidad de los datos no siempre es consistente. Este problema se ha resulto
parcialmente haciendo mediciones por duplicado (dos puntos en la matriz que corresponden al
mismos gen).
-Su resultado depende de la sonda que se utilice, de las propiedades químicas de esta.
-Se requiere mucha masa de ARN (se requieren aproximadamente 20ug
de ARN total).