Download 1. Electroforesis en geles de agarosa

José A. Cardé, PhD
Lab Biol 4019
Biología Celular-Molecular
Universidad de Puerto Rico-Aguadilla
Luego de haber completado el ejercicio, el (la) estudiante
estará capacitado para:
 1. Distinguir entre una electroforesis utilizando geles de
poliacrilamida y una electroforesis utilizando geles de
agarosa.
 2. Describir los diferentes parámetros que influyen en la
separación de los fragmentos de DNA.
 3. Preparar un gel de agarosa y separar fragmentos de DNA
en el mismo.
 4. Estimar el peso molecular de los fragmentos de DNA
productos de la digestión con endonucleasas de restricción.

Arne Tiselius
1937
(Nobel 1948)
ELECTROFORESIS Separar y analizar moléculas:
Proteínas ADN/ARN
... en función de su diferente carga eléctrica.
Moléc. +  cátodo (-)
Moléc. -  ánodo (+)
cátodo
SOPORTE
+-
ánodo
ELECTROFORESIS DE ZONA
 MATRIZ
(que retiene las moléculas)
Arne Tiselius
1937
(Nobel 1948)
1 Campo eléctrico
Diferencia de potencial (V-voltios):
bajo voltaje (10-500 V)
alto voltaje (500-10000 V)
Intensidad (A-amperios): flujo de carga eléctrica.
depende de V y de R.
Resistencia: determinada por el soporte.
Temperatura: efecto joule  refrigerantes
2 Muestra
Carga o densidad de carga: carga eléctrica/masa de la molécula
Tamaño: debido al poro de la matriz.
Forma: forma globular vs lineal: avanza más.
3 Amortigudor
pH: determina el grado de solvatación y la carga de las moléculas
generalmente es ligeramente básico  moléc. Fuerza iónica: generalmente 0.05 o 0.1 M para que no interfiera
4 Soporte
Adsorción
Porosidad molecular
Características:
 Gel poroso (tridimensional interno).
 Tiene que permitir el paso de moléculas.
 NO puede estar cargado.
Matriz de l gel
Tipos de Soporte (no restrictivo o restrictivo):
Electroforesis
de proteínas
Electroforesis
de DNA/RNA
no restrictivo (grupo I): papel, almidón, agar, acetato de celulosa.
* poro >>> proteínas.
* separación sólo por CARGA
restrictivo (grupo II): acrilamida
* poros = proteínas
* separación por CARGA y TAMAÑO
restrictivo (grupo II): acrilamida, agarosa
* poros = moléculas de DNA/RNA
* separación sólo por TAMAÑO
Soporte: (restrictivo) :Poliacrilamida
* Polimerización de dos componentes:
Acrilamida + Bisacrilamida
* Variación de la concentración  variación del tamaño de poro
Electroforesis vertical
Ventajas:
* Gran poder de separación(resolución) por CARGA y por
TAMAÑO.
* Químicamente inertes.
* Transparentes (densitograma).
* Estables (pH, fuerza iónica, temperatura).
* Versatilidad en cuanto al tamaño de poro.
Aplicaciones:
 Separar proteínas
 Determinar peso molecular de una proteína
 Separar proteínas oligoméricas
SDS-PAGE
 Separar proteínas en función de su pI
Electroenfoque
 Separar proteínas de mezclas muy complejas
Electroforesis 2D
 Ver si hay una proteína en concreto
Western Blot
Soporte: (restrictivo)
* Geles de Agarosa  moléculas grandes (0.1-60 kpb)
* Geles de Poliacrilamida  moléculas pequeñas (6-2000 pb)
Electroforesis horizontal (agarosa) o vertical (poliacrilamida)
Separación por TAMAÑO
Densidad de carga igual para todas las
moléculas por los grupos PO4-
Aplicaciones:
 Separar, identificar y purificar fragmentos de
DNA o RNA.
 Determinar tamaño de un fragmento de DNA.
Geles de agarosa
 Separación de cromosomas enteros
 Secuenciación de DNA.
Geles poliacrilamida
 Identificación de regiones de unión a proteínas.
 Detectar la presencia de un gen (o secuencia
específica de DNA) en una muestra.
 Determinar si se expresa un gen específico
Southern Blot
Northern Blot
Soporte: (restrictivo) Agarosa
Electroforesis horizontal
muestra (-)
-
+
Campo eléctrico (DV)
1.
2.
3.
4.
Preparar el gel.
Aplicación de la muestra.
Electroforesis.
Detección por tinción con
Bromuro de Etidio (BrEt): se
intercala en el DNA y al irradiarlo
con luz UV emite fluorescencia.
* Interacción DNA-DNA (complementación).
* Detectar en una mezcla una secuencia de DNA específica (muy
4. Revelado
sensible).
DNA
* Detectar la presencia de un gen, etc.
1. Electroforesis en geles de agarosa
interés
2. Transferencia a membrana
moléculas
de DNA
moléculas
de DNA
5. Resultado
3. Hibridación con la sonda radioactiva
Sonda
de DNA
e-
32P
Gel Agarosa
Southern BLOT
Todas los
DNA
DNA
de interés
32P
…TAACGT…
…ATTGCA…
DNA
interés
* Interacción RNA-DNA (hibridación).
* Detectar en una mezcla una secuencia de RNA específica (muy sensible)
4. Revelado
* Expresión génica.
1. Electroforesis en geles de agarosa
RNA
interés
2. Transferencia a membrana
moléculas
de RNA
moléculas
de RNA
Resultado
3. Hibridación con la sonda radioactiva
Sonda
de DNA
e-
32P
Gel Agarosa
Northern BLOT
Todas los
DNA
RNA
de interés
32P
…TAACGT…
…AUUGCA…
RNA
interés
Marcadores de peso
molecular:
* Mezcla de diferentes
proteínas pre-teñidas de las que
conocemos el peso molecular.
* Por comparación y
extrapolación podemos
averiguar el PM de nuestra
proteína.
- El peso molecular del DNA puede ser determinado utilizando la
electroforesis en geles de agarosa.
-Los fragmentos de DNA es necesario correr junto a las muestras
un marcador molecular estándar.
- El marcador molecular estándar posee de 5 a 10 fragmentos de
DNA a los cuales se le conoce el peso molecular.
- Existe una relación lineal entre el logaritmo del peso molecular
de las moléculas y la distancia recorrida en el gel.
-Esta relación permite crear una curva estándar de la distancia
de migración versus el log10 del peso molecular de los
fragmento de DNA que se encuentran en el marcador molecular
estándar.
-Esta curva estándar es utilizada para extrapolar el peso
molecular de aquellos fragmentos de DNA en estudio.
Para crear la curva estándar es necesario:
1) Medir la distancia desde el punto de partida (fosas) del
marcador hasta cada una de las bandas observadas en el
marcador. Se repite lo mismo con los fragmentos de DNA en
estudio.
2) Determinar el log10 del peso molecular de los fragmentos
de DNA que se encuentran en el marcador estándar y trazar en
el eje de Y utilizando papel de gráfica regular.
3) Trazar la distancia recorrida en el eje de X. Al terminar la
gráfica se observa una línea.
4) Utilizar la distancia recorrida por las muestras y extrapolar
a la línea para determinar el peso molecular.
Preparación del gel de agarosa al 1%
1. Pese 0.5 g de agarosa y colóquelos en un matraz de 200
ml. Añada 50 ml de amortiguador de la corrida (TBE 1X).
2. Cubra el matraz con un pedazo de papel de aluminio para
evitar la evaporación del amortiguador.
3. Coloque el matraz en una hornilla y caliente hasta que
toda la agarosa se haya disuelto.
4. Remueva el matraz de la hornilla y déjelo enfriar hasta 65
ºC. Añada 2 µl de bromuro de etidio (10 mg/ml).
5. Vierta la agarosa sobre la caja de electroforesis. Permita
que se solidifique.




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
Sellar molde para la gel con cinta adhesiva
Asegurarse que este bien bien sellada
Disolver 0.8 g de agarosa en 100ml de TBE
Derretir en microondas con incubaciones de
30 segundos hasta que hierva y no se vean
partículas flotando
Dejarla bajar a 55C-60C y servirla en el molde
sellado, colocar peinilla remover burbujas*
* Añadir 1-2µl de EtBr (opcional)

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
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
Dejar solidificar por 10 –15 min, la gel se vera
opaca
Colocar la gel en la camara vaciá
Añadir buffer de corrida TBE hasta cubrir los
pozos completamente
Remover la peinilla
Servir las muestras en un orden
predeterminado
Preparación de la Muestra
6. Coloque 15 µl de la muestra de DNA cortado con las
endonucleasas de restricción en un microtubo de 500 µl.
Añada 5 µl de amortiguador de la muestra (“loading buffer”).
7. Coloque 15 µl de la muestra del DNA sin cortar con las
endonucleasas de restricción en un microtubo de 500 µl.
Añada 5 µl de amortiguador de la muestra.
8. Coloque los dos tubos en hielo hasta que vaya a colocar las
muestras en el gel.
9. Coloque el gel de agarosa dentro del tanque de electroforesis.
10. Añada el amortiguador de la corrida (“running buffer”) al
tanque de electroforesis. Asegúrese de cubrir el gel
completamente.
11. Utilizando una pipetta de 1-10 µl, añada 5 µl del marcador
molecular estándar a la primera fosa del gel.
12. Utilizando una pipetta de 10-100 µl, añada los 20 µl de la
muestra de DNA cortado con las endonucleasas de restricción
(preparada en la parte anterior) a la segunda fosa del ge.
13.Coloque los 20 µl de la muestra de DNA sin cortar con las
endonucleasas de restricción (preparada en la parte anterior) a la
tercera fosa del gel.
14.Continué con el paso 4 y 5 para cada grupo de trabajo.
15.Coloque la tapa del tanque de electroforesis y conéctela a la caja
de electricidad. Verifique que los polos estén correctamente
conectados.
16.Corra la electroforesis a 80 V por 1 hora.




Conectar el power supply 50-100 V y correr la
gel por 45-75 minutos
Remover la gel y observarla en lampara de luz
UV
Fotografiar y medir distancia en la gel
Preparar gráfica de distancia vs log10 del
peso molecular (o bp)
Observación de los resultados
17.Luego de la hora apague la caja de electricidad.
18. Saque el gel de agarosa. Con mucho cuidado colóquelo
sobre la lámpara de luz ultravioleta.
19. Utilizando una regla mida las distancias entre las fosas y las
diferentes bandas observadas.