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Regulación de la transcripción en eucariontes. El control génico en eucarióticos • En organismos multicelulares su propósito es la ejecución de decisiones evolutivas precisas – Los genes convenientes se expresan en células adecuadas durante el desarrollo y la diferenciación. • Es el medio principal para regular la expresión génica en eucariontes. • Los elementos de control se encuentran a varias kilobases del sito de inicio de transcripción. El control génico en eucarióticos • Poseen tres tipos de RNA polimerasas. • Tiene subunidades grandes que tienen homología con b y b´y pequeñas que tiene homología con la a de la RNA pol de bacterias. • Presentan otras subunidades pequeñas. • La RNA pol I sintetiza pre-RNA ribosomal • La RNA pol II sintetiza mensajeros, RNA pequeños nucleares • La RNA pol III sintetiza RNAr 5S, tRNA y RNAs estables y cortos. • RNA polimerasas Subunidad L´ de Pol II • Contiene un extremo carboxilo terminal que es una repetición de la secuencia Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser • Conocido como el dominio carboxiterminal o CTD. • Levaduras contiene 26 repeticiones o más, mamíferos 52 repeticiones otros eucariontes intermedia. CTD • Se fosforila durante la iniciación de la transcripción • Permanece fosforilada durante la transcripción. Foto fosforilación de CTD • • Polimerasa no fosforilada verde Polimerasa fosforilada roja • Núcleos aislados se incuban con 32P-NTP (periodo corto). • Se marcan entre 300-500 nucleótidos del RNA naciente. • Hibridizando el RNA marcado con el DNA clonado para un gen específico, se puede saber cual es la fracción de transcripción de un gen. Identificación de RNA polimerasas de eucariontes • Cromat ografía en DEAE sefadex . Inicio de transcripción. • La RNA pol II suele iniciar la transcripción en un par de bases específicos o alternativos cercanos a una plantilla. • El nucleótido 5´que tienen el capuchón en un mRNA es el nucleótido en dónde inición la transcripción. Iniciador en vez de caja TATA • Algunos genes no presentan caja TATA. • Presentan una secuencia relativamente degenerada con A en +1, Y es una pirimidina, N es cualquier base. 5’Y-Y-A+1-NT/A-Y-Y-Y(3’) Hay genes que no presentan ni caja TATA ni Iniciador • Se presenta en genes de mantenimiento (housekeeping). • Es una región de 20 a 200 pares de base • Da origen a mensajeros con extremos 5´ múltiples. • Son genes que generalmente se transcriben a bajas tasas. • Presentan un segmento de 20 a 50 pb rico en GC • Este sitio es reconocido por un factor de transcripción llamado SP1 Islas CpG • Las secuencias ricas en CG son pocas en el genoma eucariótico • Estas regiones justo antes de un gen presentan una distribución no al azar. • Pueden ser identificadas por su susceptibilidad a la enzima de restricción HpaII. • La presencia de islas CpG sugiere una zona de iniciación de transcripción. El enhancer del SV40 • Estimula la transcripción de proteínas virales en la infección. • Estimula la transcripción de todos los genes eucariontes en que se ha probado. • Funciona en cualquier orientación • Funciona hasta a miles de pares de bases de sitio de iniciación • Está compuesto de muchos elementos individuales que contribuyen individualmente a la actividad. Características de los enhancers • Se han encontrado a más de 50 kilobases del promotor que controlan. • Pueden estar río arriba del promotor, río abajo del promotor, dentro de un intrón o de un exón o hasta después del último exón. • Algunos son específicos de un tipo celular. – En los genes de las inmunoglobulinas en los linfocitos B, hay un enhancer dentro del segundo intrón pero funciona solo en linfos B. Elementos de control cercanos y lejanos • Se creía que eran diferentes • Se pueden invertir su colocación y siguen estimulando la transcripción. • Son célula específico • Ahora se piensa que son un espectro de elementos de control que regulan la transcripción. Resumen • La expresión de los genes que codifican para proteínas en eucariontes están regulado por múltiples regiones de control que actúan en cis. • Algunos de estos elementos de control son cercanos al sitio de inicio y otros lejanos. • Los promotores determinan el sitio de inicio de transcripción y dirigen la unión de la RNA polimentasa II. Resumen • Se han identificado tres tipos de secuencias promotoras en eucariontes. – Caja TATA – Promotores diferentes poco frecuentes – Islas CpG Los elementos proximales • Están dentro de los ≈200 pares de bases. Contiene hasta 20 pares de bases cada uno. • Los enhancers, • Usualmente contienen entre 100 y 200 pb de longitud. Tienen elementos de control individuales de 8 a 20 pb. • Se localizan a más de 200 y hasta decenas de kilobases río arriba o abajo del promotor. • Puede estar dentro de un intron o más lejos del último exón del gen. Aislamiento bioquímico de los factores de transcripción • Una vez que el elemento regulatorio se ha identificado por análisis mutacional, • Se puede: – Identificar a la proteína cognada que se une específicamente a ella. • En esta técnica, un extracto del núcleo se pasa por varias cromatografías y se realiza un footprinting con Dnasa tipo I o un ensayo de cambio en la movilidad electroforética (EMSA) • Las fracciones que contienen proteínas que se unen a elementos regulatorios probablemente contienen factores putativos de transcripción. • La técnica más poderosa para purificar factores de transcripción es la cromatografía de afinidad en dónde se inmovilizan las secuencias de los elementos regulatorios a un soporte. • Si la transcripción del gen reportero es mayor en presencia de l plásmido que codifica para la proteína X, esta es un activador. Si es menor, X es un represor. Clasificación de los dominios de unión al DNA • Proteínas con: – – – – – Homeodominio Proteínas con dedos de zinc Hélice alada (en lengüeta de flecha) Con cremallera o zipper de leucina Con hélice-bucle-hélice Homeodominio • Proteína de Engrailed de Drosophila • Nombre de genes homeóticos (produce la transformación de una parte del cuerpo en otro en el desarrollo. • Región de 60 residuos de aa muy conservada Proteínas con dedos de zinc • Dominio estructurado con un ion Zn2+ en el centro de un plegamiento de residuos de aa. • Secuencia consenso Tyr/Phe-Cys-X2-4-Cys-X3-Phe/Tyr-X5-Leu-X2-His-X3-4-His • La forma de dedo se ve en un diagrama bidimensional • El zinc se fija entre las 2 Cys y la 2 His. • Se le llama dedo C2H2 Proteínas con dedos de zinc • El alfa-hélice que se forma es muy compacto • Se inserta en el surco mayor del DNA • Otro tipo de dedos de zinc C4 se encuentra en otros factores de trascripción (receptores a esteroides-nucleares) • Cys-X2-Cys-X13-Cys-X2-Cys-X14-15-Cys-X5-CysX9-Cys-X2-Cys Proteínas con dedos de zinc • Los dominios C2H2 y C4 son estructuralmente distintos. • Los C2H2 tienen tres dedos repetitivos o más y se fijan como monómeros. • Los C4 tienen en general dos dedos y se fijan como homodímeros o heterodímeros. • Con simetría rotacional doble (fig. siguiente b) Dedos de zinc C2H2 (a)y C4(b) Proteína GL1 Receptor a glucocorticoides Interacción entre Gal4 y el DNA • Proteína con dedos de zinc C6 . • Es un homodímero que se forma por una hélice enrollada . Proteínas con hélice alada • Dominios de fijación de la histona H5 • Se unen al DNA como monómeros • Pueden unirse al DNA Z. Estructura cristalina del dominio de unión al DNA Z de la proteína Dlm-1 unida al DNA. Cremallera o zipper de leucina • Hay un residuo de leucina cada 7 aminoácidos en la región C terminal del dominio de unión. • Se unen al DNA en forma de dímeros, la leucina es necesaria para la dimerización. • Presenta dos a-hélices extendidas que agarran al DNA como pinzas en dos surcos mayores en la región N terminal. • Pueden ser homodímeros o heterodímeros. Interacción de Gnc4 con el DNA Hélice bucle hélice • Un bucle no helicoidal de la cadena polipeptídica separa dos regiones ahelicoidales. • Tienen aminoácidos básicos para aumentar la interacción con el DNA. Interacción de un dominio hélicebucle-hélice con el DNA Los factores de transcripción heterodiméricos aumentan las opciones de control génico. • Cada monómero tiene un dominio de fijación al DNA con especificidad de secuencia equivalente. • No influye en la unión al DNA. • Permite que los dominios de activación asociados con cada monómero se reúnan para formar un solo factor de transcripción. Dominios de activación • Secuencia polipeptídica que activa la transcripción cuando está fusionada a un dominio de fijación del DNA • Muchos dominios pueden activar la transcripción. • Casi el 1% de las proteínas de fusión resultantes (Gal4 y segmento al azar) activaron la transcripción de un gen con UASgal en 5´.